CN101886081A - 克氏原螯虾甲壳肽基因及其编码的甲壳肽与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码从克氏原螯虾中克隆的抗菌肽——甲壳肽的基因序列，并提供其重组表达与纯化方法。本发明还公开了从克氏原螯虾中克隆的抗菌肽——甲壳肽的氨基酸序列。本发明还提供了该基因序列的用途，甲壳肽的用途。可以利用本发明的克氏原螯虾甲壳肽基因制备酵母表达载体，转染毕赤酵母获得工程菌株，诱导表达获得具有抗菌活性的重组蛋白。利用本发明获得的重组的甲壳肽可用于抗菌的饲料添加剂、食品保存、动植物基因转化和药物开发。

Description

克氏原螯虾甲壳肽基因及其编码的甲壳肽与应用

技术领域

本发明涉及一种甲壳肽基因及其编码的蛋白与应用，尤其涉及一种克氏原螯虾甲壳肽(Crustin)基因及其编码的甲壳肽与所述基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用，属基因工程技术领域。

背景技术

众所周知，无脊椎动物虽然不存在适应性免疫，但它们具有强大的先天免疫防御反应，包括细胞和体液免疫，依靠这些防御反应清除或消灭病原。体液免疫的主要效应分子包括抗菌肽、酚氧化酶依赖性黑化系统和凋亡相关基因系统等；其中抗菌肽是多种生物体内产生的可以抑制或杀死病原微生物的肽类或蛋白，是无脊椎动物重要的体液免疫效应分子，是生物机体在抵御病原微生物的防御反应过程中所产生的一类物质，是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障。

与传统抗菌药物相比，抗菌肽具有以下优点：①稳定性高，在100℃加热10min条件下仍能保持一定活力，且对较大的离子强度和较低或较高的pH值都有较强的抗性；②它对正常真核细胞几乎没有毒性，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞；③抗菌谱广，除了抗细菌外，有的抗菌肽还能作用于真菌、原虫、病毒及癌细胞等；④由于抗菌肽的作用靶标主要是细菌的细胞膜，因此病原菌不易对其产生耐药性；⑤不像其他抗生素那样由于死亡的细菌释放内毒素而间接引起败血症，抗菌肽能够与内毒素结合从而减少或避免脓毒性冲击。因而极有希望将抗菌肽开发成为一类新型的广谱高效抗菌药物。另外，抗菌肽还可以应用到食品工业，能快速抑制微生物的生长，人、畜食后易被体内蛋白酶水解消化且无毒副作用，在酸性条件下活性很强，具有良好的溶解性和稳定性，是一种极具发展前景的新型食品防腐剂。抗菌肽在农业工程上也有应用，利用昆虫抗菌肽培育具有抗病菌品种的作物，可大大减少农药用量，降低环境污染指数，生产出绿色农产品。昆虫抗菌肽被认为是最有发展前景的绿色饲料添加剂，抗菌肽可促进动物生长，提高动物抗病能力，且不容易产生耐药性。应用抗菌肽转基因工程技术，把特异的抗菌肽基因转入畜禽特定细胞让其表达，从而产生抗病新品种。可以预见，抗菌肽及其基因工程产品在医药卫生、食品工业、畜牧业及农业等方面将发挥极为重要的作用，抗菌肽的市场应用前景必将更为广阔。

甲壳肽(Crustins)是广泛存在于节肢动物的一类抗菌肽，最初在草食蟹中分离得到的。甲壳肽的C端有一个比较保守的乳清酸蛋白结构域。根据氨基酸序列的不同，甲壳肽可以分类为三类：即I型、II型和III型甲壳肽。I型甲壳肽在信号肽区和乳清酸蛋白结构域之间有一个半胱氨酸富含区。II型甲壳肽除了半胱氨酸富含区和乳清酸蛋白结构域之外，还有一个甘氨酸富含区，III型甲壳肽含有一个乳清酸蛋白结构域和富含脯氨酸和精氨酸的模体。I型甲壳肽主要存在于在鲎和淡水小龙虾中；II型和III型甲壳肽在对虾中发现的比较多。甲壳肽一般具有对革兰氏阳性菌的抑菌活性。

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)，俗称淡水小龙虾，是我国重要的水产养殖品种。小龙虾味道鲜美，磷、钙、铁等元素含量高，蛋白含量高，而脂肪含量低，是一种营养价值很高的经济型水产养殖品种。而且小龙虾的虾壳的提取物在工业、农业、医药和化工业中有着广泛的应用价值，因此，小龙虾的疾病预防和治疗方面的研究格外重要。小龙虾对环境的适应能力较强，对各种流行性的疾病有一定的抵抗能力，鉴于此，研究小龙虾的抗菌肽对于我们了解虾类的抗病机制有着重要的作用。

诸多研究表明，在虾类等节肢动物中存在多种可以抵抗外界病原微生物的蛋白或肽类，如对虾素、甲壳肽(crustins)等，但是在相关的报导中，未见有克氏原螯虾的甲壳肽基因的报导。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种编码从克氏原螯虾中克隆的抗菌肽——甲壳肽的基因序列，并提供其重组表达与纯化方法。本发明的另一个目的是提供从克氏原螯虾中克隆的抗菌肽——甲壳肽的氨基酸序列。本发明还提供了该基因序列的用途，甲壳肽的用途。

本发明的克氏原螯虾甲壳肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中所示信息为：

(a)序列特征：

*长度：576碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：克氏原螯虾(Procambius clarkii)

(f)序列描述：SEQ ID NO.1

atgctgcgcg tgctggtgtt gtccatgctg gtggtggcgg ccctcggcca ccttccccga 60

cccaagcccc cacagccggg ctgtaactac tactgcacca agcccgaggg cccaaacaag 120

ggcgccaagt actgctgcgg tccccagttc cttcccctaa ttagggaaga aaagcacaat 180

ggtttctgtc ctcctcctct caaggactgc acaagaatcc taccacctca ggtgtgcccc 240

catgacggac attgtcccat aaaccagaag tgttgctttg acacctgtct cgacctccat 300

acctgcaagc ctgcacactt ttacatcaat tagcttgaga ggaatagcgt agtcgccgct 360

cctctgtgtg gcacttcaag atggatctaa gtcaatgatg attccctgag ctgaactaca 420

acaatgctgt gcttataggt tgttggctcg cttgttcact ttgtattgtt tggtgtttat 480

tttaaaggaa tatatgtttc atgtataaat gagaggagtt ttgtctatta aataaaaata 540

ctttccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                           576。

本发明的克氏原螯虾甲壳肽基因编码的甲壳肽多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中所示信息为：

(a)序列特征

*长度：110氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ ID NO.2

Met Leu Arg Val Leu Val Leu Ser Met Leu Val Val Ala Ala Leu

                  5                  10                 15

Gly His Leu Pro Arg Pro Lys Pro Pro Gln Pro Gly Cys Asn Tyr

                 20                  25                 30

Tyr Cys Thr Lys Pro Glu Gly Pro Asn Lys Gly Ala Lys Tyr Cys

                 35                  40                 45

Cys Gly Pro Gln Phe Leu Pro Leu Ile Arg Glu Glu Lys His Asn

                 50                  55                 60

Gly Phe Cys Pro Pro Pro Leu Lys Asp Cys Thr Arg Ile Leu Pro

                 65                  70                 75

Pro Gln Val Cys Pro His Asp Gly His Cys Pro Ile Asn Gln Lys

                 80                  85                 90

Cys Cys Phe Asp Thr Cys Leu Asp Leu His Thr Cys Lys Pro Ala

                 95                 100                 105

His Phe Tyr Ile Asn

                110。

本发明还提供了所述的SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的变异体，它编码具有少于8个氨基酸改变的同源变异蛋白，而且氨基酸改变是保守性氨基酸改变，例如：Tyr²⁹→Trp；Gly³³→Ala；Phe⁴⁷→Trp；Thr⁵⁶→Ser；Arg⁵⁷→Lys；Asp⁷⁹→Glu。

本发明的克氏原螯虾甲壳肽cDNA的克隆方法是：利用克氏原螯虾的鳃组织构建cDNA文库，然后进行随机测序，对所得序列进行相似性比对，得到了甲壳肽的cDNA的部分序列，然后进行3’和5’端快速扩增，获得全长序列。

可以利用本发明的克氏原螯虾甲壳肽基因制备原核表达载体，转化大肠杆菌，表达具有抗菌活性的重组蛋白。

可以利用本发明的克氏原螯虾甲壳肽基因制备酵母表达载体，转染毕赤酵母获得工程菌株，诱导表达获得具有抗菌活性的重组蛋白。例如：将获得的克氏原螯虾甲壳肽基因克隆到pPIC9K载体，转染毕赤酵母Pichia pastoris KM71，进行诱导表达，纯化；并利用获得重组蛋白进行抑菌实验。其抗菌谱和最小抑菌浓度(以菌体不生长的浓度为最小抑菌浓度)见表1。

表1：克氏原螯虾甲壳肽最小抑菌浓度

由表1可以看到，甲壳肽既对革兰氏阳性菌有抑制活性，又对革兰氏阴性菌有抑制活性。

利用本发明的克氏原螯虾甲壳肽基因通过基因工程方法将其转入作物，可以获得具有抗菌能力的作物。

利用本发明获得的重组的甲壳肽可用于抗菌的饲料添加剂、食品保存、动植物基因转化和药物开发。

附图说明

图1为重组克氏原螯虾甲壳肽纯化后的电泳图；

其中，M：分子量标记，1.诱导前表达菌株，2.诱导后表达菌株，3.纯化的重组甲壳肽。

图2为甲壳肽在毕赤酵母中的表达电泳图；

其中，C诱导前上清液，1甲醇诱导表达第一天上清液，2甲醇诱导表达第二天上清液，甲醇诱导表达第4天上清液，M分子量标记。

图3为重组甲壳肽对鳗弧菌和枯草杆菌的抑菌活性示意图，其中，(a)：鳗弧菌；(b)：枯草杆菌；1氨苄青霉素(阳性对照)，2培养基(阴性对照)，牛血清白蛋白(阴性对照)，4重组甲壳肽。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明：

实施例1：克氏原鳌虾甲壳肽cDNA的克隆

1)总RNA的提取：采用现有技术一步法提取总RNA。

2)cDNA第一链合成：4微升总RNA，加1微升SmartF(5’-TAC GGC TGC GAGAAGACGACA GAA GGG-3’)和1微升Oligoanchor R(5’-GAC CAC GCG TAT CGA TGT CGA CT₁₆(A/C/G)-3’)，72℃反应5分钟，后加5倍Buffer 4微升，dNTP 1.25微升，RNA酶抑制剂0.625微升，1微升MMLV逆转录酶，无RNase的灭菌水12.875微升42℃反应60分钟，70℃10分钟终止反应。

3)PCR反应：链式聚合酶反应(PCR)试剂与条件：

首先将下列试剂混在一起：

●10xTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(μl)

●模板cDNA                1μl

●正向引物(10mM)          1μl

●反向引物(10mM)          1μl

●脱氧核苷酸混合物(dNTP)  4μl

●Taq DNA聚合酶           0.25μl

●灭菌水                  37.75μl

                                            

●总体积                  50μl

根据克氏原鳌虾文库随机测序所得的序列设计的引物为：

正向引物：F1 5’GTC CTA GAG TTC ACC TGC AGC 3’

反向引物：R1 5’CTC ATT TGT CGT AGC TCT GAG 3’

PCR反应条件为：首先94℃变性2分钟，然后进入下列循环：94℃30秒，53℃45秒，72℃45秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。

4)反应产物纯化：利用德国奎因(QIAGEN)公司产品QIAquick Gel Extraction Kit，操作步骤按产品说明书进行。

5)克氏原鳌虾甲壳肽cDNA克隆：取纯化产物3微升，连接于pMD 18-T载体(TaKaRa公司产品)。转化到大肠杆菌DH5α菌株，在含有氨苄青霉素(100微克/毫升)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)和异丙基硫代半乳糖苷(IPTG 0.1摩尔/毫升)的平板生长过夜，挑取3个白斑，在LB液体培养基(5毫升，含100微克/毫升安苄青霉素)中培养过夜。

6)质粒纯化：收取过夜培养菌液2毫升，离心(6000转/分，3分钟)收集细胞。用微量DNA纯化试剂盒(Wizard plus SV Minipreps DNA Purification System，美国普洛麦格Promega公司)纯化质粒，纯化步骤按说明书进行。

7)序列测定与同源检索：取纯化质粒4微升，用载体引物T7进行全自动测序(本工作在上海生工公司完成)。将所得序列与基因库序列比较。

8)克氏原鳌虾甲壳肽cDNA 3’端快速扩增

根据得到的抗菌肽基因片段，正向引物F1和anchor R引物(5’-GAC CAC GCG TATCGA TGT CGA C3’)进行cDNA 3’端快速扩增，操作步骤按宝生物3’RACE试剂盒说明书进行。

取血细胞总RNA约20μg，其他试剂的调制和反应条件按说明书进行。用特异性引物F3与3’接头进行3’端PCR扩增，采用56℃退火，其余与上述的PCR扩增程序相同，对所得产物按前述方法进行克隆、验证和测序。

9)克氏原鳌虾甲壳肽cDNA 5’端克隆

以上述cDNA为模板，以试剂盒提供的5’PCR(5’-TAC GGC TGC GAG AAG ACG ACAGAA-3’)引物和反向引物R1为引物进行PCR扩增，获得克氏原鳌虾甲壳肽cDNA的5’序列。

将3’和5’端序列拼接，即获得SEQ ID NO.1所示克氏原鳌虾甲壳肽cDNA基因全长核苷酸序列。

实施例2：原核重组表达载体构建、表达与纯化

(1)根据克氏原螯虾甲壳肽的序列(去掉信号肽序列)和表达载体pPET30a(Novagen公司)的克隆位点，设计引物：

Cru-pET F：5′TAC TCA GAA TTC CAC CTT AAA CGA CCC AAG CC 3′(EcoRI)

Cru-pET R：5′TAC TCA CTC GAG CTA ATT GAT GTA AAA GTG TGC 3′(XhoI)

本发明选择了pET30a克隆位点的EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切位点，因此，设计引物时在上游引物引入了EcoR Ⅰ酶切位点，下游引物上引入了Xho Ⅰ酶切位点。

(2)基因扩增、克隆与重组质粒筛选

以pMD-18T-Lec为模板，用上述引物进行PCR反应，扩增条件为：94℃，2min预变性；94℃，30s，56℃，45s，72℃，45s，35个循环；72℃延伸10min。

2％的琼脂糖凝胶电泳PCR产物检测：

将PCR产物作制备电泳，用UNIQ-5 Column DNA Gel Extraction Kit(上海生工产品)回收、纯化PCR产物，经过EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ内切酶酶切，切下两端带有Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ内切酶位点的家蝇防御素成熟肽cDNA片段，同样表达载体pET30a经过EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ内切酶酶切，暴露出多克隆位点两端的Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ内切酶位点。然后，将酶切后的扩增产物与表达载体用T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，LB+Amp平板PCR筛选阳性克隆。挑取PCR筛到的菌落，37℃振荡扩增培养并抽提质粒，EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切与测序验证后，即为重组表达质粒pET30a-Lec。接转化E.coli表达菌株BL21DE3感受态细胞，涂布LB+Amp平板，37℃倒置过夜培养。

(3)筛选表达菌株

从上述LB+Amp平板上挑取5个单克隆菌落，2ml LB+Amp液体培养基37℃振荡过夜培养，次日，取20μl过夜培养液加入到2ml LB+Amp液体培养基中转培养，37℃振荡培养3h，至OD₆₀₀在0.5～0.7之间，然后加入IPTG至终浓度为1mmol，继续37℃振荡培养诱导表达4h。诱导前，从不同样品中取出0.5ml菌液，电泳检测时以未诱导菌株为对照。

表达完后，各取0.5ml菌液，5 000r/min离心5min收集细胞，包括未诱导菌株的样品，重悬于100μl去离子水中，以此为电泳样品作12.5％的SDS-PGAE。根据电泳结果是否存在诱导表达的重组甲壳肽的条带，鉴定重组表达菌株。选取表达量高的菌株进行下面的大规模表达和纯化。

(5)重组甲壳肽表达与纯化

挑取表达菌株单克隆在LB+Amp液体培养基中37℃过夜振荡培养，次日，按照体积比1∶100加入到100ml LB+Amp培养基中转培养，37℃振荡培养3h后，再加入IPTG至终浓度为1mmol，再37℃振荡诱导培养4h。诱导前取出0.5ml的菌液，作为诱导前对照样品。诱导培养完后，菌液在合适的离心管中7 000r/min离心10min收集细胞，细胞重悬于5ml预冷的1×PBS，加入50μl 20％的Triton X-100，充分混匀后冰浴30min。超声波破碎细胞，超声循环为：超声1秒(s)；间隔1s；全程40s。重复4次，每次间隙时将菌液在冰浴中混匀，避免局部温度太高，使蛋白质变性。最后，将破碎后的菌液10000r/min离心15min，收集上清液和沉淀，上清液和沉淀分别留样、备用。

重组蛋白以包含体的形式存在，以常规方法经过包含体纯化、复性和常规的组氨酸标签亲和层析，即获得到了重组蛋白——重组甲壳肽，电泳(SDS-PAGE)结果如图1所示。该重组蛋白的分子量与根据序列预测的分子量大小一致。另外，我们利用组氨酸标签抗体进行免疫印迹实验，也证明所得到的重组蛋白就是SEQ ID NO.2序列所述的蛋白。

(6)重组蛋白活性测定

采用平板抑菌的方法，重组表达的甲壳肽显示出对少数革兰氏阳性菌有抑菌活性。

实施例3：甲壳肽在毕赤酵母中的重组表达与抑菌活性测定

(1)pPIC9K(Invetrogen公司)重组表达载体的构建

本发明选择了pPIC9K克隆位点的EcoR Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点，因此，设计引物时在上游引物引入了EcoR Ⅰ酶切位点，下游引物上引入了Not Ⅰ酶切位点：

Cru-pPIC F：5′TAC TCA GAA TTC CAC CTT AAA CGA CCC AAG CC 3′(EcoRI)

Cru-pPIC R：5′TAC TCA GCGGCCGC CTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATG ATGATT GAT GTA AAA GTG TGC 3′(NotI)

以克氏原螯虾血细胞cDNA为模板，用常规PCR方法扩增得到甲壳肽成熟肽的序列，并将PCR扩增产物纯化。然后用EcoR I、Not I双酶切pPIC9K及Crustin的PCR扩增片断。酶切后的质粒作制备电泳，将大小为300bp的基因片段和切开后的载体从胶上切下，UNIQ-5柱式胶回收试剂盒回收。回收得到的基因片段和表达载体用T4DNA连接酶16℃连接过夜，然后转化大肠杆菌DH5α。铺平板。从平板上挑取单克隆，进行利用上述表达引物进行PCR筛选。然后将阳性克隆接种于5mL LB+Amp液体培养基中37℃振荡培养过夜，次日，取一部分菌液加入10％甘油后-70℃保种。其余用来提取质粒(Crustin-pPIC9K质粒)。将上述新鲜提取的质粒均以EcoR I和Not I进行双酶切验证。

(2)转化KM71感受态细胞并筛选重组转化子

首先将载体线性化：将Crustin-pPIC9K重组质粒和pPIC9K空质粒分别进行Sal I酶切，酚/氯仿抽提纯化。

酶切反应体系20μL，冰浴上操作，如表2所示：

表2

10×Buffer      2μL

Sal I           1μL

质粒            15μL

                               

加ddH₂O至       20μL

37℃水浴，酶切3小时。用1％琼脂糖电泳检测确认酶切完全后，酚氯仿抽提线性化的质粒，去除酶蛋白，最后将线性化的质粒溶于10μL去离子水中，-20℃储存备用。

PEG法转化KM71酵母感受态细胞：酶切完全的纯化质粒转化酵母KM71感受态细胞。转化方法如下：将10μL线性化的重组载体和4μL担体DNA加入到冰冻状态的酵母感受态细胞KM71，冰上混匀。然后37℃水浴5min，期间混匀一至两次。再加入1.5mL Buffer B，仔细混合，30℃水浴1hr，5,000rpm离心10min。弃上清液，在1.5mL Buffer C中悬浮细胞，5,000rpm离心10min。去掉大部分上清液，留200μL左右，轻轻悬起细胞。用三角玻棒将细胞涂布在MD(Minimal Dextrose Medium：1.34％YNB；4×10-5％Biotin；2％Dextrose，1.5％agar)平板上，28℃-30℃倒置培养2-3天。

(3)筛选重组转化子

PCR筛选重组的阳性克隆，挑取MD平板上的单菌落进行PCR筛选，同时保种在MD平板上。PCR用前引物为载体上α-Factor F，后引物R为Crustin基因的特异性引物。将阳性克隆接种于5mL YPD液体培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium：1％Yeast Extract；2％Peptone2％Dextrose(glucose))中，28℃振荡培养。加入10％甘油后-80℃保存菌种。

(4)多拷贝筛选

将在YPD培养基中28℃振荡培养过夜的阳性克隆的菌液，以接种环划线于含0.5、1.0、2.0mg/ml梯度浓度G418抗生素的YPD平板上，28℃倒置培养，挑取单菌落PCR筛选。

(5)重组蛋白的表达

将含有重组的菌株接入50mL BMGY液体培养基(Buffered Glycerol-complex Medium：1％yeast extract，2％tryptone，100mM磷酸缓冲液(pH＝6.0)，1.34％YNB，4×10^-5％biotin，1％glycerol或者0.5％methanol)中，28℃、250～300rpm振荡培养至OD600＝2～6(约18～24hrs)，5,000rpm离心收集细胞，弃上清，25mL BMMY重悬细胞，取1mL离心留上清作诱导前对照，添加100％甲醇至终浓度0.5％，继续28～30℃振荡培养，每24hrs取样1mL离心留上清-20℃保存，进行SDS-聚丙烯酰胺凝电泳检测甲壳肽的表达(如图2所示)。诱导表达结束后(4天)，将培养液5,000rpm离心20分钟，最后将上清液用His标签柱亲和纯化。

(6)重组蛋白活性测定

牛津杯法检测Cru1和Cru2抗菌活性：5mlLB液体培养基37℃200rpm过夜培养鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌；2.5.2取3-5μl菌加至8ml 50℃的液态PB固体培养基中，混匀，作为上层胶铺平板，1.5％琼脂作为下层胶；2.5.3牛津杯法测定甲壳肽的抗菌活性，加入100μl发酵液，Lys做阴性对照，100μlAMP(0.025mg/ml)作为阳性对照；30℃过夜培养，观察抑菌圈大小。

液体生长抑制方法：分别取测试菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌等单菌落LB过夜培养液，用LB液体培养基稀释到OD₆₀₀＝0.01(约10⁶左右)为测试菌液。取100μl测试菌液分别与10倍稀释的重组甲壳肽样品混匀，于96孔培养板30℃振荡培养，5小时后每隔2h用酶标仪测A₆₃₀吸收值，用Microsoft Excel处理数据，绘制生长曲线图，以氨苄青霉素和洗脱液(Elution Buffer)为对照。

抑菌实验结果：重组甲壳肽对多种细菌有抑菌活性，其抑菌圈如图3所示，其抗菌谱和最小抑菌浓度(以菌体不生长的浓度为最小抑菌浓度)如表1所示。

序列表

SEQ ID NO.1

<110>山东大学

<120>克氏原螯虾甲壳肽基因及其编码的甲壳肽多肽与应用

<141>2010-5-14

<160>2

<210>1

<211>576

<212>cDNA

<213>克氏原螯虾(Procambius clarkii)

<221>克氏原螯虾甲壳肽基因

<222>(1)…(576)

<400>1

atgctgcgcg tgctggtgtt gtccatgctg gtggtggcgg ccctcggcca ccttccccga 60

cccaagcccc cacagccggg ctgtaactac tactgcacca agcccgaggg cccaaacaag 120

ggcgccaagt actgctgcgg tccccagttc cttcccctaa ttagggaaga aaagcacaat 180

ggtttctgtc ctcctcctct caaggactgc acaagaatcc taccacctca ggtgtgcccc 240

catgacggac attgtcccat aaaccagaag tgttgctttg acacctgtct cgacctccat 300

acctgcaagc ctgcacactt ttacatcaat tagcttgaga ggaatagcgt agtcgccgct 360

cctctgtgtg gcacttcaag atggatctaa gtcaatgatg attccctgag ctgaactaca 420

acaatgctgt gcttataggt tgttggctcg cttgttcact ttgtattgtt tggtgtttat 480

tttaaaggaa tatatgtttc atgtataaat gagaggagtt ttgtctatta aataaaaata 540

ctttccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                           576

 

SEQ ID NO.2

<210>2

<211>110

<212>PRT

<221>克氏原螯虾甲壳肽基因编码的甲壳肽

<222>(1)…(110)

<400>2

Met Leu Arg Val Leu Val Leu Ser Met Leu Val Val Ala Ala Leu

                  5                  10                 15

Gly His Leu Pro Arg Pro Lys Pro Pro Gln Pro Gly Cys Asn Tyr

                 20                  25                 30

Tyr Cys Thr Lys Pro Glu Gly Pro Asn Lys Gly Ala Lys Tyr Cys

                 35                  40                 45

Cys Gly Pro Gln Phe Leu Pro Leu Ile Arg Glu Glu Lys His Asn

                 50                  55                 60

Gly Phe Cys Pro Pro Pro Leu Lys Asp Cys Thr Arg Ile Leu Pro

                 65                  70                 75

Pro Gln Val Cys Pro His Asp Gly His Cys Pro Ile Asn Gln Lvs

                 80                  85                 90

Cys Cys Phe Asp Thr Cys Leu Asp Leu His Thr Cys Lys Pro Ala

                 95                  100                105

His Phe Tyr Ile Asn

                110

Claims (7)

1.一种克氏原螯虾甲壳肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中所示信息为：

(a)序列特征：

*长度：576碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：克氏原螯虾(Procambius clarkii)

(f)序列描述：SEQ ID NO.1

atgctgcgcg tgctggtgtt gtccatgctg gtggtggcgg ccctcggcca ccttccccga 60

cccaagcccc cacagccggg ctgtaactac tactgcacca agcccgaggg cccaaacaag 120

ggcgccaagt actgctgcgg tccccagttc cttcccctaa ttagggaaga aaagcacaat 180

ggtttctgtc ctcctcctct caaggactgc acaagaatcc taccacctca ggtgtgcccc 240

catgacggac attgtcccat aaaccagaag tgttgctttg acacctgtct cgacctccat 300

acctgcaagc ctgcacactt ttacatcaat tagcttgaga ggaatagcgt agtcgccgct 360

cctctgtgtg gcacttcaag atggatctaa gtcaatgatg attccctgag ctgaactaca 420

acaatgctgt gcttataggt tgttggctcg cttgttcact ttgtattgtt tggtgtttat 480

tttaaaggaa tatatgtttc atgtataaat gagaggagtt ttgtctatta aataaaaata 540

ctttccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                           576。

2.权利要求1所述的克氏原螯虾甲壳肽基因编码的甲壳肽多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中所示信息为：

(a)序列特征

*长度：110氨基酸

*类型：氨基酸

*链型：单链

*拓扑结构：线性

(b)分子类型：蛋白质

(c)序列描述：SEQ ID NO.2

Met Leu Arg Val Leu Val Leu Ser Met Leu Val Val Ala Ala Leu

                  5                  10                 15

Gly His Leu Pro Arg Pro Lys Pro Pro Gln Pro Gly Cys Asn Tyr

                 20                  25                 30

Tyr Cys Thr Lys Pro Glu Gly Pro Asn Lys Gly Ala Lys Tyr Cys

                 35                  40                 45

Cys Gly Pro Gln Phe Leu Pro Leu Ile Arg Glu Glu Lys His Asn

                 50                  55                 60

Gly Phe Cys Pro Pro Pro Leu Lys Asp Cys Thr Arg Ile Leu Pro

                 65                  70                 75

Pro Gln Val Cys Pro His Asp Gly His Cys Pro Ile Asn Gln Lys

                 80                  85                 90

Cys Cys Phe Asp Thr Cys Leu Asp Leu His Thr Cys Lys Pro Ala

                 95                 100                 105

His Phe Tyr Ile Asn

                110。

3.权利要求2所述的SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的变异体，其特征在于：它编码具有少于8个氨基酸改变的同源变异蛋白，而且氨基酸改变是保守性氨基酸改变。

4.权利要求1所述的克氏原螯虾甲壳肽基因在制备具有抗菌能力的作物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：其方法是：构建含有甲壳肽基因的重组载体，然后将其导入受体细胞，诱导表达，进而培养得到具有抗菌能力的作物植株。

6.权利要求1所述的克氏原螯虾甲壳肽基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：其方法是：通过基因重组技术使克氏原螯虾甲壳肽基因在大肠杆菌、酵母或昆虫型核多角体病毒中进行表达，获得具有抗菌活性的重组蛋白。

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