CN102190718B - 重组对虾蛋白sf-p9及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组对虾蛋白SF-P9及制备方法和用途，编码该重组对虾蛋白SF-P9的氨基酸序列及其对应的DNA序列，含该DNA序列的酵母重组基因工程菌株PichiapastorisX-33/pPIC6αA/Pen，CCTCC No：M209126，利用该工程菌株表达重组对虾蛋白SF-P9。本发明还公开了一种对虾蛋白F-P6及制备方法和用途，编码该对虾蛋白Pen6的氨基酸序列及其对应的DNA序列。重组对虾蛋白SF-P9中含有肠激酶位点，经肠激酶酶切后获得对虾蛋白F-P6。对虾蛋白SF-P9和F-P6具有明显的抗细菌、抗真菌和抗病毒感染的生物活性。对虾蛋白SF-P9和F-P6具有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用。对虾蛋白SF-P9和F-P6在制备治疗或预防动物和植物的细菌、真菌和病毒病药物、抗肿瘤药物中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术、药物，以及动物、植物病害防治领域。更具体涉及一种含有对虾肽基因penaeidine的重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen，一种重组对虾蛋白SF-P9的氨基酸序列及其对应的DNA序列，一种对虾蛋白F-P6的氨基酸序列及其对应的DNA序列，以及含对虾蛋白SF-P9和F-P6的药物组合物。同时还涉及一种表达重组对虾蛋白SF-P9的酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen的构建方法，本发明涉及的对虾蛋白SF-P9和F-P6具有明显的抗革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌感染的生物学活性，以及抗真菌感染活性和抗病毒感染的生物学活性，同时还涉及对虾蛋白SF-P9和F-P6具有抑杀肿瘤细胞的生物学活性。对虾蛋白SF-P9和F-P6作为制备治疗或预防动物和植物的细菌、真菌、病毒病和肿瘤病的药物中的用途，同时还涉及对虾蛋白SF-P9和F-P6在医药、化妆品、食品、饲料等产品制剂中的用途。
背景技术
抗菌肽广泛分布于哺乳动物、两栖动物、甲壳动物、软体动物、植物和昆虫等多种生物体内(Ryan et al.,1998,Harder et al.,1997, Chan et al.,1996, Destoumieux et al.,1997,Chan Bae Park., 1997,Francisco et al.,1998， Cociancich et al.,1994)。抗菌肽是特定基因编码的一类小分子多肽，具有广谱高效的抗细菌活性，某些抗菌肽还具有抗真菌、抗原虫、抗病毒、抗肿瘤细胞的功能（张永莲等，2002，Michael C et al., 2003Leuschner et al，2004，Mader et al，2005）。
对虾抗菌肽Penaeidin是普遍存在于对虾中的一类活性物质。在大西洋白对虾（Litopenaeus setiferus）、斑节对虾（Peneaus monodon）、中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）和日本对虾（Penaeus japonicus）等甲壳动物中均有Penaeidins。Penaeidin在虾类的先天免疫应答中具有重要的作用（Bachère et al,2004）。目前，已发现PEN2、PEN3、PEN4（PenBase V2.1）3个亚群（subgroup）。
Penaeidins在一级、二级结构上具有抗菌肽的基本共性，但在结构和生物学功能上的共同特征是：（1）分子量小。（2）都是阳离子肽（等电点分别为9.34，另一个的等电点为9.84）。（3）N-端富含脯氨酸Pro，推测Penaeidins富含脯氨酸的N-端结构介导Penaeidin与靶细胞的相互作用而非直接发挥抗菌活性。同时，Penaeidins的富含脯氨酸结构域决定了抗微生物肽的靶微生物的种类特异性。（4）C-端富含半胱氨酸Cys，C端含有6个半胱氨酸，具有3个分子内二硫键，C端成环状（Destoumieux et al,1997）。C-端富含Cys区域表面具有抗菌活性所必需的疏水性特点，从而Penaeidins具有对革兰氏阳性菌G+和革兰氏阴性菌G-的广谱抗菌活性。（5）Penaeidins C-端区域具有一个保守的几丁质结合模体，具有粘合几丁质的特性（Bachère et al,1999）。Penaeidins通过与真菌细胞壁上的几丁质相互作用而发挥其抗真菌活性。（6）Penaeidins具有翻译后修饰的特性，如成熟Penaeidin-2和Penaeidin-3a的C-端以酰胺化形式存在，这种翻译后修饰可能与稳定蛋白的螺旋结构，增强多肽与细胞膜之间的静电作用相关。（7）Penaeidins的N端和C端可协同作用。Penaeidins的N端带正电，自由伸展，该区域先微弱地锚定到细胞膜上。由于C端具有疏水性，高度稳定，故C端与细胞膜的疏水相互作用加强这种锚定效果。最后，肽链粘贴在细胞膜表面，或者插入膜上的孔洞而发挥作用（Yang et al,2003）。两种结构域的协同作用决定了penaeidin对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的广谱抗菌活性。
对虾肽penaeidin具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤的作用（Destoumieux et al,1999，Cuthbertson et al,2002）。同时，Penaeidin参与噬菌细胞对细菌的识别过程，使细菌凝聚，增强免疫细胞的能力（Munoz et al,2002）。对虾肽penaeidin具有广阔的应用前景。传统抗生素通过阻断大分子生物合成的机制而发挥抗菌活性。目前，致病菌的抗药性日益严重，迫使人们寻找新一代的抗菌药代替抗生素。Penaeidins具有广谱抗菌作用，其抗菌机理独特，不易导致病原体耐药性。同时，Penaeidins分子较小，对热稳定，水溶性好，对宿主无毒副作用。Penaeidins有望成为一类无毒、无残留的新型抗菌、抗病毒、抗肿瘤药物。Penaeidins还可作为一种新型环保的饲料添加剂，并改善养殖水体。
发明内容
在本发明的第一个方面，提供了一种重组对虾蛋白SF-P9，一种表达重组对虾蛋白SF-P9的酵母基因工程菌株，重组对虾蛋白SF-P9的制备方法，一种含有效剂量重组对虾蛋白SF-P9的药物组合物，以及重组对虾蛋白SF-P9在制备治疗或预防抗细菌感染药物、抗真菌感染药物、抗病毒感染药物、抗肿瘤药物中的应用。
本发明的一个目的在于提供了一种重组对虾蛋白SF-P9，该蛋白包括SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
本发明的目的之一在于提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述的重组对虾蛋白SF-P9。较佳的，所述的DNA分子编码包括SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的融合蛋白。更佳的，所述的DNA分子包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明的目的之一在于提供一种含有南美白对虾Penaeidin基因的重组基因工程酵母菌株，其特征在于：该菌株是一种高效、分泌表达重组对虾蛋白SF-P9的重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No: M209126。利用该基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen，可高效、稳定地分泌表达基因工程重组对虾蛋白SF-P9。本发明在构建对虾肽penaeidin基因工程菌株、表达对虾抗菌肽的同时，采取融合蛋白表达方式，选择毕赤酵母X-33宿主，构建了对虾肽penaeidin分泌型表达载体，构建了毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen。利用毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen，分泌表达了重组融合对虾蛋白SF-P9。
本发明的目的之一是在于提供了一种表达重组对虾蛋白SF-P9的酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen的构建方法，方法简便，操作方便，该宿主细胞包含重组对虾蛋白SF-P9的核苷酸序列。本发明通过基因工程技术，采用酵母基因工程菌株制备对虾抗菌肽，具有生产步骤简单、成本低、产量高的特征。这种毕赤酵母表达体系具有外源基因——对虾肽penaeidin整合稳定、分泌表达重组融合对虾蛋白SF-P9、发酵工艺成熟、宿主细胞能迅速生长进行高密度发酵的优点。本发明通过筛选获得高效分泌表达重组融合对虾蛋白SF-P9的毕赤酵母基因工程菌株，通过优化毕酵母发酵条件提高重组融合对虾蛋白SF-P9的表达量。
本发明的目的之一还在于提供一种重组对虾蛋白SF-P9的制备方法。利用重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen，表达重组对虾蛋白SF-P9。采用Ni2+柱亲和层析法，获得纯化的基因工程重组对虾蛋白SF-P9。该表达量高，并且是分泌、融合表达，安全性高，利于产业化生产。
本发明的目的之一是在于提供一种具有生物活性的重组对虾蛋白SF-P9，其分子量为约9.1 kDa。该蛋白具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均具有明显的抗菌活性；对真菌的感染均具有明显的抗真菌活性；对病毒的感染具有明显的抗病毒活性；具有明显的抑制肿瘤细胞生长的活性。
本发明的目的之一在于提供了一种药物组合物，该组合物包含有效剂量的上述重组对虾蛋白SF-P9，以及药学上可接受的增效剂、乳化剂、稳定剂、粘附剂、稀释剂或赋形剂或胶囊剂或载体。
本发明还涉及重组对虾蛋白SF-P9在制备治疗或预防细菌感染药物中的应用
本发明还涉及重组对虾蛋白SF-P9在制备治疗或预防真菌感染药物中的应用。
本发明还涉及重组对虾蛋白SF-P9在制备治疗或预防病毒感染药物中的应用。
本发明所制备的对虾蛋白SF-P9是一种融合蛋白。对虾蛋白SF-P9具有抗细菌、抗真菌、抗病毒等微生物的生物学活性，对虾蛋白SF-P9对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒等均具抑制作用，并且对虾蛋白SF-P9在很低的浓度下即可抑制微生物生长。因此，对虾蛋白SF-P9可替代传统抗生素，作为新一代的抗菌药和抗病毒药来源，对提高生物医药、畜产品品质，推动绿色生物科技的发展具有非常重要的意义和广阔的应用前景。
本发明还涉及重组对虾蛋白SF-P9在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。
本发明所制备的对虾蛋白SF-P9具有抑制肿瘤细胞生长、对肿瘤细胞具有杀伤或抑制作用的生物学活性。因此，对虾蛋白SF-P9可作为一种新型抗肿瘤药物，用于各种恶性肿瘤的治疗，具有广阔的开发应用前景。
在本发明的第二个方面，提供了一种对虾蛋白F-P6，对虾蛋白F-P6的制备方法，一种含有效剂量对虾蛋白F-P6的药物组合物，以及对虾蛋白F-P6在制备治疗或预防抗细菌感染药物、抗真菌感染药物、抗病毒感染药物、抗肿瘤药物中的应用。
本发明的一个目的在于提供了一种对虾蛋白F-P6，该蛋白包括SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
本发明的目的之一在于提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述的对虾蛋白F-P6。较佳的，所述的DNA分子编码包括SEQ ID No.4所示的氨基酸序列的融合蛋白。更佳的，所述的DNA分子包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
本发明的目的之一在于提供一种对虾蛋白F-P6的制备方法。采用肠激酶切割对虾蛋白SF-P9，制备对虾蛋白F-P6。
本发明的目的之一是在于提供一种具有生物活性的对虾蛋白F-P6，其分子量为约6.3 kDa。该蛋白具有广谱抗细菌作用；对真菌的感染均具有明显的抗菌活性；对病毒的感染具有明显的抗病毒活性；具有明显的抑制肿瘤细胞生长的活性。
本发明的目的之一在于提供了一种药物组合物，该组合物包含有效剂量的上述对虾蛋白F-P6，以及药学上可接受的增效剂、乳化剂、稳定剂、粘附剂、稀释剂或赋形剂或胶囊剂或载体。
本发明涉及对虾蛋白F-P6在制备治疗或预防细菌感染药物中的应用
本发明涉及对虾蛋白F-P6在制备治疗或预防真菌感染药物中的应用。
本发明涉及对虾蛋白F-P6在制备治疗或预防病毒感染药物中的应用。
本发明所制备的对虾蛋白F-P6具有抗细菌、抗真菌、抗病毒等微生物的生物学活性。因此，对虾蛋白F-P6可替代传统抗生素，作为新一代的抗菌药和抗病毒药来源。
本发明涉及对虾蛋白F-P6在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。
本发明所制备的对虾蛋白F-P6具有抑制肿瘤细胞生长、对肿瘤细胞具有杀伤或抑制作用的生物学活性。的生物学活性。因此，对虾蛋白F-P6可作为一种新型抗肿瘤药物，用于各种恶性肿瘤的治疗，
在本发明的另一方面，提供了一种药物组合物。本发明的药物组合物包括有效剂量的对虾蛋白SF-P9或者对虾蛋白F-P6，以及药学上可接受的增效剂、乳化剂、稳定剂、粘附剂、稀释剂或赋形剂或胶囊剂或载体。因此，组合物可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、凝胶剂、纳米制剂等。组合物可制成单元或多元剂型，各种剂型包含为了产生所期望的治疗或者预防效果的预定量活性成分——对虾蛋白SF-P9或者对虾蛋白F-P6，以及合适的药剂学稀释剂或赋形剂或胶囊剂等。
该药物组合物在医药、化妆品、食品、饲料等产品制剂中，可根据具体情况采用有效剂量的对虾蛋白SF-P9或者对虾蛋白F-P6。其中，本发明涉及的对虾蛋白SF-P9和F-P6具有明显的抗细菌、抗真菌和抗病毒感染活性。对虾蛋白SF-P9和F-P6具有抑杀肿瘤细胞的生物学活性。对对虾蛋白SF-P9和F-P6可应用于治疗或预防动物和植物的细菌、真菌、病毒病和肿瘤病，以及医药、化妆品、食品、饲料等产品制剂中。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
本发明以南美白对虾为材料，提取总RNA，设计特异引物P1和P2。上游引物P1： 5' GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3'。下游引物P2：5’ TCTAGAGCCTTGTCATCGTCATCTCCTTTTACTAAGTGACAACA 3’。通过RT-PCR、PCR扩增，得到其Penaeidin成熟肽编码区序列，核苷酸序列为：
tacaggggcg gttacacagg cccgataccc aggccaccac ccattggaag accaccgttc 60
agacctgttt gcaatgcatg ctacagactt tccgtctcag atgctcgcaa ttgctgcatc 120
aagttcggaa gctgttgtca cttagtaaaa gga 153
在本发明的一个实施方案中，提供了一种编码重组对虾蛋白SF-P9对应的核酸，其序列为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
在本发明的一个实施方案中，本发明所提供的一种重组对虾蛋白SF-P9，其序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。该蛋白为基因工程融合蛋白，其N端氨基酸是：EF。其C端氨基酸是：DDDDKALEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH。其中含有Penaeidin成熟肽编码区所对应的氨基酸序列： YRGGYTGPIPRPPPIGRPPFRPVCNACYRLSVSDARNCCIKFGSCCHLVKG
在本发明的一个实施方案中，所用pPIC6αA质粒多克隆位点下游带有His.Tag，表达的重组对虾蛋白SF-P9为分泌的融合蛋白，其分子质量约9.1 kDa。
在本发明的一个实施方案中，通过PCR引物的设计，在对虾Penaeidin成熟肽编码区下游引入肠激酶位点。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种宿主细胞——Pichia pastoris X33，该宿主细胞基因组包含编码本发明所述的重组对虾蛋白SF-P9的核苷酸序列，或者包含编码本发明所述的重组对虾蛋白SF-P9的DNA片断。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种毕赤酵母重组基因工程菌株，该菌株分类命名为毕赤酵母X-33/pPIC6αA/Pen Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen。保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2009年6月20日，保藏编号：CCTCC No: M209126。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种表达重组对虾蛋白SF-P9的毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen的制备方法。它包括下列步骤：
A、南美白对虾总RNA的提取及cDNA第一条链的合成：采集南美白对虾血淋巴，获得血细胞，提取总RNA，并按Promega公司Universal Riboclone cDNA Synthesis System试剂盒操作手册进行，反转录合成cDNA第一条链。
B、PCR扩增Penaeidin基因：以反转录合成的cDNA第一条链为模板，上游引物P1：5’GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3’ (下划线处为内切酶EcoRI位点)。下游引物P2：5’TCTAGAGCCTTGTCATCGTCATCTCCTTTTACTAAGTGACAACA 3’ (下划线处为内切酶XbaI位点)。利用PCR仪扩增，获得获得191 bp目的基因片段。
C、重组质粒pGEM-T/Pen的构建和鉴定：回收PCR产物，将PCR 产物连接到pGEM-T（购自Promega公司）载体上，转化E.coli JM109（购自Invitrogen公司）感受态细胞，涂布于含X-gal 、IPTG和Amp抗性的LB平板上进行蓝白斑筛选，用PCR 和限制性内切酶酶切鉴定、DNA 测序分析鉴定重组质粒pGEM-T/Pen。
D、重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen的构建和鉴定：用EcoRI和XbaI分别双酶切质粒pPIC6αA（购自Invitrogen公司）和质粒pGEM-T/Pen DNA，将Penaeidin基因定向插入质粒pPIC6αA，转化E. coli JM109感受态细胞，在含300μg/ml杀稻瘟素（Blasticidin）的LB平板上筛选阳性克隆，获得大肠杆菌菌株E.coli JM109（pPIC6αA/Pen）。用PCR、限制性内切酶酶切鉴定和DNA 测序分析鉴定重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen。
E、重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen转化Pichia pastoris X-33，获得毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen。
a. 重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen DNA的线性化：制备质粒pPIC6αA/Pen DNA 15-20μg，经RNaseA消化，然后用限制性内切酶Sac I进行酶切线性化，沉淀过夜。
b. Pichia pastoris X-33感受态细胞的制备：挑取Pichia pastoris X-33单菌落，（Pichia pastoris X-33购自Invitrogen公司。）接种于5mlYPD中，30℃、260rpm振摇培养过夜，离心收集菌体，经0.1M LiCl处理制备Pichia pastoris X-33感受态细胞。
c. 转化：采用线性化的重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen DNA转化Pichia pastoris X-33感受态细胞，涂布于含300μg/ml杀稻瘟素（Blasticidin）的YPD平板上。30℃，培养2~3天，观察单菌落的形成。同时，按同样方法转化线性化空载体质粒pPIC6αA，作为阴性对照。
F. 毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen的筛选与鉴定：提取毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen基因组，以Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen基因组DNA为模板，用酵母醇氧化酶通用引物p5′AOX1 与p3′AOX1进行PCR鉴定，同时设Pichia pastoris X-33/pPIC6αA基因组DNA和Pichia pastoris X-33基因组DNA两个对照。
毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen的鉴定结果结果表明目的基因penaeidin已被准确地整合到毕赤酵母Pichia pastoris X-33基因组的特定位点中。
G. 测序结果表明penaeidin基因已正确定向整合到毕赤酵母Pichia pastoris X-33基因组的特定位点中。一种基因工程表达、分离和纯化的重组对虾蛋白SF-P9，其序列为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。一种基因工程表达、分离和纯化的重组对虾蛋白SF-P9对应的核酸，其序列为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种利用毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen表达对虾蛋白SF-P9的方法。它包括下列步骤：
A、挑取毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen单菌落，接种于25ml BMGY培养液中。28℃，300rpm，培养至OD600=2.0~6.0。用灭菌离心管，5000rpm离心10min，收集菌体，转接到100mL BMMY液体培养基中。
B、28℃、300rpm 振摇培养96 h，其中每隔12 h按培养液的0.5%体积补充无水甲醇，诱导表达重组对虾蛋白SF-P9。
C、诱导6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h后，分别取样， 15,000rpm 离心10min，收集发酵上清，上清样品于-80℃低温冷冻保存。
D、采用16％Tricine-SDS-PAGE和Western Blot方法，检测对虾蛋白SF-P9的表达。16％Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明，毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen在甲醇诱导前无表达。阴性对照毕赤酵母菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA经甲醇诱导后72h，无表达。毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen经甲醇诱导后24、48、72、96 h后，均表达了基因工程重组对虾蛋白SF-P9，SF-P9分子量与预期相符，为约9.1 kDa。毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen经甲醇诱导24h后，开始少量表达基因工程重组对虾蛋白SF-P9。随着诱导时间延长，诱导48、72h后，SF-P9表达量逐渐增大，72h表达量达到最大。
Western Blot的实验结果表明毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen经甲醇诱导，表达了基因工程重组对虾蛋白SF-P9。该蛋白质带能和兔抗南美白对虾penaeidin蛋白抗血清发生特异性反应，所设对照Pichia pastoris X-33/pPIC6αA蛋白质带均不能与兔抗南美白对虾penaeidin蛋白抗血清反应。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种制备对虾蛋白SF-P9的方法。它包括下列步骤：
A、挑取毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen单菌落，接种于25ml BMGY培养液中。28℃，300rpm，培养至OD600=2.0~6.0。用灭菌离心管，5000rpm离心10min，收集菌体，转接到100mL BMMY液体培养基中。
B、28℃、300rpm 振摇培养96 h，其中每隔12 h按培养液的0.5%体积补充无水甲醇。
C、诱导72 h后，15,000rpm 离心10min，收集发酵上清，上清样品于-80℃冷冻保存。
D、上清样品用1×Binding Buffer透析、然后用0.45μm的滤膜过滤。样品循环方式通过Ni++柱，使带有6×His的蛋白样品流动相充分与Ni++柱中的Ni++相结合。分别采用1×Binding Buffer；60mM咪唑； 100mM咪唑； 150mM咪唑梯度洗涤留在柱内的少量样品和与Ni++柱结合的非目的蛋白。用1×Elute Buffer洗脱与Ni++柱结合的目的蛋白，分部收集。
E、采用16％Tricine-SDS-PAGE和Western Blot方法，用考马斯亮蓝R250染色检测样品中重组对虾蛋白SF-P9。实验结果表明纯化样品有约为9.1 kDa的单一特异性蛋白质SF-P9条带。
在本发明的实施方案中，检测了对虾蛋白SF-P9的生物活性。对虾蛋白SF-P9具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的感染均具有明显的抗菌活性；对真菌的感染均具有明显的抗菌活性；对病毒的感染具有明显的抗病毒活性；具有明显的抑制肿瘤细胞生长的活性。
在本发明的一个实施方案中，采用噻唑蓝（MTT）法和管碟法，检测对虾蛋白SF-P9对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的活性。MTT法检测对虾蛋白SF-P9的抗细菌活性实验结果表明，对虾蛋白SF-P9不仅对革兰氏阳性菌有很好的抑杀作用，对革兰氏阴性细菌也有广谱抑菌特性。其中，对虾蛋白SF-P9对枯草芽孢杆菌的MIC值约为0.028μmol/L；对副溶血弧菌的MIC值约为0.028~0.056μmol/L；对短小芽孢杆菌、副溶血弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌的MIC值在0.028~0.056μmol/L之间；对金黄色葡萄球菌的MIC值在0.089~0.112μmol/L之间；对大肠杆菌JM109的MIC值在0.056~0.112μmol/L之间；对苏云金芽孢杆菌的MIC值为约为0.099μmol/L。
管碟法测定对虾蛋白SF-P9的抗细菌活性的抑菌效价实验结果表明，对藤黄微球菌Micrococcus luteus，1U杆菌肽标准样品的抑菌圈直径为3.0cm，3.125μg/mL Amp的抑菌圈直径为2.7cm，0.446μmol/L对虾蛋白SF-P9的抑菌圈直径为3.1cm。0.446μmol/L对虾蛋白SF-P9与1U的杆菌肽及3.125μg/mL的Amp活性相当。
在本发明的一个实施方案中，采用药敏纸片法和双碟法，检测对虾蛋白SF-P9抗真菌的生物活性。采用药敏纸片法检测对虾蛋白SF-P9抗真菌活性试验表明，对虾蛋白SF-P9对黑曲霉有较强的抑制作用。Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen在1.5%甲醇诱导下，表达有活性的对虾蛋白SF-P9，16μmol/L对虾蛋白SF-P9纯品对该黑曲霉有抑制活性。
双碟法测定对虾蛋白SF-P9抗黑曲霉IC50的实验结果表明对虾蛋白SF-P9对黑曲霉具有明显的抗菌活性和很好的抑制效果。对虾蛋白SF-P9抗黑曲霉IC50值为0.586μmol/L。上层培养基分别含有0.000μmol/L、0.064μmol/L、0.128μmol/L、0.256μmol/L、0.512μmol/L和1.024μmol/L对虾蛋白SF-P9，其对应的的各平皿菌苔直径分别为4.50cm、4.50cm、4.3cm、3.9cm、3.7cm、2.2cm (上述数据为重复5次实验的平均值)。
在本发明的一个实施方案中，检测了对虾蛋白SF-P9对流感病毒（A型H3N2）增殖的影响，对虾蛋白SF-P9对流感病毒（A型H3N2）在鸡胚中的增殖具有明显的抑制作用。
在本发明的一个实施方案中，采用MTT法测定测对虾蛋白SF-P9对人肝肿瘤细胞系HepG2细胞生长的影响。对虾蛋白SF-P9对HepG2细胞生长影响的实验结果表明，不同浓度的对虾蛋白SF-P9作用肿瘤细胞HepG2 24h后的实验结果表明，随着对虾蛋白SF-P9浓度的增加，抑制率逐渐增加。40μg/mL对虾蛋白SF-P9可抑杀50.31%的HepG2细胞，20 μg/mL对虾蛋白SF-P9可抑杀11.92%的HepG2细胞，30μg/mL对虾蛋白SF-P9可抑杀43.17%的HepG2细胞，60μg/mL对虾蛋白SF-P9可抑杀65.80%的HepG2细胞。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种编码对虾蛋白F-P6对应的核酸，其序列为SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。
在本发明的一个实施方案中，本发明所提供的一种对虾蛋白F-P6，其序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。该蛋白为融合蛋白，其C端氨基酸是：DDDDK。其中含有Penaeidin成熟肽编码区所对应的氨基酸序列：YRGGYTGPIPRPPPIGRPPFRPVCNACYRLSVSDARNCCIKFGSCCHLVKG。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种采用肠激酶切割对虾蛋白SF-P9，制备对虾蛋白F-P6的方法。它包括下列步骤：
A、Ni-NTA Superflow柱亲和层析法纯化得对虾蛋白SF-P9纯品，调整其浓度为100μg/mL；
B、取1支1.5 mLEppendorf管，依次加入以下样品：90μL对虾蛋白SF-P9，10μL 10×酶切缓冲液（10×酶切缓冲液：500 mM Tris-HCl, pH 8.0 (22°C) , 10 mM CaCl2, 1% Tween-20；称取60.5g Tris-base，溶于950 mL去离子水中，浓HCl调节pH至8.0，加1.47g CaCl2·2H2O、10mL Tween-20，混匀，定容至1L。室温存放。），反应体积100μL，加入0.60unit肠激酶。37℃保温4小时（h）。
C、收集酶切后样品，置-20℃保存备用。采用16％Tricine-SDS-PAGE和Western Blot方法，用考马斯亮蓝R250染色检测样品中对虾蛋白F-P6。实验结果表明，在0.60 unit/100μL肠激酶、37℃、酶切4h的条件下，酶切对虾蛋白SF-P9，可制备特异性的、分子量约为6.3 kDa对虾蛋白F-P6。一种分离和纯化的对虾蛋白F-P6，其序列为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列。一种分离和纯化的对虾蛋白F-P6对应的核酸，其序列为SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。
在本发明的实施方案中，检测了对虾蛋白F-P6的生物活性。对虾蛋白F-P6具有广谱抗菌作用，对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均具有明显的抗菌活性；对真菌的感染均具有明显的抗菌活性；对病毒的感染具有明显的抗病毒活性；具有明显的抑制肿瘤细胞生长的活性。
在本发明的一个实施方案中，采用噻唑蓝（MTT）法和管碟法，检测对虾蛋白F-P6对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的活性。MTT法检测对虾蛋白F-P6的抗细菌活性实验结果表明，对虾蛋白F-P6对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.095~0.120μmol/L；对短小芽孢杆菌的MIC值为0.033~0.063μmol/L；对苏云金芽孢杆菌的MIC值约为0.115μmol/L；对枯草芽孢杆菌的MIC值约为0.031μmol/L；对溶藻弧菌的MIC值约为0.036μmol/L；对副溶血弧菌的MIC值为0.033~0.062μmol/L；对鼠伤寒沙门氏菌的MIC值为0.030~0.064μmol/L；对大肠杆菌JM109的MIC值为0.063~0.121μmol/L；对铜绿假单胞菌的MIC值为0.036~0.067μmol/L。
在本发明的一个实施方案中，检测了对虾蛋白F-P6对流感病毒（A型H3N2）增殖的影响，对虾蛋白F-P6对流感病毒（A型H3N2）在鸡胚中的增殖具有明显的抑制作用。
在本发明的一个实施方案中，采用MTT法测定测对虾蛋白F-P6对人肝肿瘤细胞系HepG2细胞生长的影响。对虾蛋白F-P6对HepG2细胞生长影响的实验结果表明，不同浓度的对虾蛋白F-P6作用肿瘤细胞HepG2 24h后的实验结果表明，随着对虾蛋白F-P6浓度的增加，抑制率逐渐增加。40μg/mL对虾蛋白F-P6可抑杀51.02%的HepG2细胞，20 μg/mL对虾蛋白F-P6可抑杀12.06%的HepG2细胞，30μg/mL对虾蛋白F-P6可抑杀45.98%的HepG2细胞，60μg/mL对虾蛋白F-P6可抑杀67.42%的HepG2细胞。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
（1）抗菌肽是由生物体特定基因编码产生的一类小分子多肽，天然对虾肽penaeidin的天然产量有限，从对虾中获取对虾肽penaeidin步骤复杂，产量极低。目前主要是通过基因工程技术和化学合成方法获得抗菌肽。但是，如果采用化学合成方法获得对虾肽penaeidin，则步骤复杂、产量低、成本较高。随着分子生物学和生物技术的发展，人们利用基因工程技术生产抗菌肽已经取得了一定的进展。Durvasula 等[Durvasula RV , Gumbs A, Panackal A, et al. Prevention of insectbone disease : an approach using transgenic symbiotic bacteria[J ] . Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94 :3274 - 3278.]在昆虫细胞内表达了cecropin A 和cecropin B。王志兴等[王志兴, 贾士荣. 抗菌肽分泌型载体的构建及转基因马铃薯中蛋白的胞外分泌. 农业生物技术学报, 1996 , 4 (3) :277- 286.]将抗菌肽cecropinB 基因通过构建嵌合基因方式导入马铃薯，延迟了植株青枯病的发生，降低了病情指数。因此，本发明通过基因工程技术，采用酵母基因工程菌株制备对虾抗菌肽，具有生产步骤简单、成本低、产量高的特征。
（2）对虾肽penaeidin抗菌广谱，采用基因工程技术，宿主表达的抗菌肽可能会对宿主本身产生抑制作用，达不到理想的高效表达结果。因此，本发明在构建对虾肽penaeidin基因工程菌株、表达对虾抗菌肽的同时，采取融合蛋白表达方式，选择毕赤酵母X-33宿主，构建了对虾肽penaeidin分泌型表达载体，构建了毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen。利用毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen，分泌表达了重组融合对虾蛋白SF-P9。这种毕赤酵母表达体系具有外源基因——对虾肽penaeidin整合稳定、分泌表达重组融合对虾蛋白SF-P9、发酵工艺成熟、宿主细胞能迅速生长进行高密度发酵的优点。本发明通过筛选获得高效表达重组融合对虾蛋白SF-P9的毕赤酵母基因工程菌株，通过优化毕酵母发酵条件提高重组融合对虾蛋白SF-P9的表达量。
（3）本发明所制备的对虾蛋白SF-P9是一种融合蛋白。对虾蛋白SF-P9具有抗细菌、抗真菌、抗病毒等微生物感染的生物学活性，对虾蛋白SF-P9对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、病毒等均具抑制作用，并且对虾蛋白SF-P9在很低的浓度下即可抑制微生物生长。因此，对虾蛋白SF-P9可替代传统抗生素，作为新一代的抗菌药和抗病毒药来源，对提高生物医药、畜产品品质，推动绿色生物科技的发展具有非常重要的意义和广阔的应用前景。
（4）本发明所制备的对虾蛋白SF-P9具有抑制肿瘤细胞生长、对肿瘤细胞具有杀伤或抑制作用的生物学活性。因此，对虾蛋白SF-P9可作为一种新型抗肿瘤药物，用于各种恶性肿瘤的治疗，具有广阔的开发应用前景。
（5）本发明所制备的对虾蛋白F-P6具有抗细菌、抗真菌、抗病毒等微生物感染的生物学活性。因此，对虾蛋白F-P6可替代传统抗生素，作为新一代的抗菌药和抗病毒药来源。
（6）本发明所制备的对虾蛋白F-P6具有抑制肿瘤细胞生长、对肿瘤细胞具有杀伤或抑制作用的生物学活性。因此，对虾蛋白F-P6可作为一种新型抗肿瘤药物，用于各种恶性肿瘤的治疗，
（7）本发明所采用的毕赤酵母基因工程表达系统是一种安全的表达系统。目前已经成功地采用毕赤酵母表达系统表达了多种医用的蛋白质，安全无毒，对人、畜及环境无毒无害。
（8）本发明所采用的毕赤酵母基因工程表达系统利于对虾蛋白SF-P9产业化生产。目前，已经有成型的发酵设备和生产方法，有利于实现产业化生产。
附图说明
本发明的上述和其它目的，特点和优势可显而易见地从下面对本发明优选实施例的详细描述和附图示出的内容得到，不同视图中相同的参考符号代表相同的部分。附图并不一定是按比例示出，其重点在于说明本发明的实施和效果。
图1为一种重组质粒pGEM-T/Pen的PCR和酶切鉴定图谱
泳道1，DL2000；泳道2，PCR 产物；泳道3，pGEM-T/Pen/EcoR I+Hind III；泳道4，pGEM-T/Pen /EcoRI；泳道5，pGEM-T/Pen plasmid；泳道6, marker III.
图2为一种重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen的构建过程图
图3为一种毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen的鉴定图谱
泳道1，marker DL2000；泳道2，ddH2O为模板，以P1和P2为引物的PCR产物；泳道3，酵母菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA基因组DNA为模板，以P1和P2为引物的PCR产物；泳道4，毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen基因组DNA为模板，以P1和P2为引物的PCR产物；泳道5，ddH2O为模板，以p5′AOX1 Pichia primer和p3′AOX1 Pichia primer为引物的PCR产物。泳道6，毕赤酵母菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA基因组DNA为模板，以p5′AOX1 Pichia primer和p3′AOX1 Pichia primer为引物的PCR产物。泳道7，毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen基因组DNA为模板，以p5′AOX1 Pichia primer和p3′AOX1 Pichia primer为引物的PCR产物。
图4为一种16％Tricine-SDS-PAGE检测重组对虾蛋白SF-P9表达的图谱
泳道1，Pichia pastries X-33/pPIC6αA经甲醇诱导72小时；泳道2，蛋白质Marker；泳道3，Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen经甲醇诱导96h；泳道4，Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen经甲醇诱导72h；泳道5，Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen经甲醇诱导48h；泳道6，Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen经甲醇诱导24h；泳道7，Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen诱导前。
图5为一种Western blot检测重组对虾蛋白SF-P9的图谱
泳道1，蛋白质Marker；泳道2，Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen经甲醇诱导72h的发酵液；泳道3，经Ni-NTA亲和层析纯化获得的重组对虾蛋白SF-P9；泳道4，泳道2转NC膜的Western blot对应条带；泳道5，泳道3转NC膜的Western blot对应条带。
图6为一种对虾蛋白F-P6的制备和Western blot鉴定图谱
泳道1为蛋白Marker；泳道2为纯化得到的对虾蛋白SF-P9；泳道3为对虾蛋白SF-P9经肠激酶酶切后得到的对虾蛋白F-P6；泳道4为泳道3转PVDF膜的Western blot对应条带。
图7为一种管碟法测定对虾蛋白SF-P9的抗细菌活性效价的图谱
1为空白组0.02M PBS, pH7.4；2为对照组3.125μg/mL Amp；3为对照组杆菌肽（1U）；4为样品组0.446μmol/L对虾蛋白SF-P9。
图8为一种药敏纸片法检测对虾蛋白SF-P9抗黑曲霉活性的图谱
1为两性霉素（AmB）50mg/mL；2为Pichia pastries X-33/pPIC 6αA在1.5%甲醇终浓度下诱导36h的发酵上清液；3为Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen在1.5%甲醇终浓度下诱导36h的发酵上清液；4为经Ni-NTA亲和层析纯化的16μmol/L对虾蛋白SF-P9。
图9为一种双碟法测定对虾蛋白SF-P9抗黑曲霉IC50的图谱
1~3号皿中培养基上层分别加入了对虾蛋白SF-P9。其中，1号皿上层培养基含有0.000μmol/L对虾蛋白SF-P9，1号皿菌苔直径为4.5cm；2号皿上层培养基含有0.512μmol/L对虾蛋白SF-P9，2号皿菌苔直径为3.7cm；3号皿上层培养基含有1.024μmol/L对虾蛋白SF-P9，3号皿菌苔直径为2.2cm。
图10为一种对虾蛋白SF-P9对肿瘤细胞HepG2生长的影响图谱
图11为一种对虾蛋白F-P6对肿瘤细胞HepG2生长的影响图谱。
具体实施方式
通过结合下述具体实施例，阐明本发明。但是，应理解的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 南美白对虾Penaeidin基因的扩增和克隆
1. 扩增引物的设计和合成：
根据对虾肽pen-2基因，设计一对引物P1和P2，引物由上海生工生物工程有限公司合成，经PAGE纯化。P1和P2的核苷酸序列分别为：上游引物P1： 5' GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3'。下游引物P2：5’ TCTAGAGCCTTGTCATCGTCATCTCCTTTTACTAAGTGACAACA 3’。
2. 南美白对虾总RNA的提取及cDNA第一条链的合成：
将南美白对虾饲养于通氧22℃的水箱中待用。选取蜕皮间期健康虾，用DEPC处理过的灭菌水漂洗后，用2.5mL一次性注射器从虾的腹窦处收集血淋巴750μL，加入等体积的抗凝剂(pH7.0)，镜检记数，取细胞含量为1×107的血淋巴于4℃、800g离心15min，移去上清，收集血细胞。按照Qiagen公司 RNeasy Mini Kit的产品说明书提取总RNA。将提取到的RNA溶液贮存于-80℃，以备用。
以Oligo(dT)15为引物，采用Promega公司的Universal Riboclone cDNA Synthesis System试剂盒，按照操作手册进行，反转录合成cDNA第一条链。具体操作步骤如下：将以下试剂加入到经DEPC浸泡并灭菌处理过的PCR反应管中：25mM MgCl2，4μL；10×反转录缓冲液，2μL；10mM dNTP 混合物，2μL；重组的RNasin?核糖核酸酶抑制剂，0.5μL；24U/μL AMV 反转录酶，0.8μL；0.5μg/μL Oligo(dT)15 引物1μL；总RNA，3μL；无核酸酶的水，2.7μL。反应条件为：42℃，1小时；95℃，5分钟；3℃，5分钟。将合成的cDNA第一链存放于-80 ℃备用。
3. 南美白对虾penaeidin（简称pen）基因的PCR扩增：
按照Reverse Transcription Reaction试剂盒操作手册，以反转录合成的cDNA第一条链为模板，PCR扩增目的基因Penaeidin。PCR反应体系：10×reaction buffer，5μL；1.5mM MgCl2，3μL；0.2mM dNTP，1μL；20pmol上游引物P1，1μL；20pmol下游引物P2，1μL；5U /μL Taq DNA聚合酶1 μL；模板6 μL；加无菌水至终体积为50 μL。PCR反应条件： 95℃， 5min；94℃，30ｓ；53℃，45ｓ；72℃ 30s（35个循环）；72℃，5 min。PCR扩增目的基因Penaeidin产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，有一约为191bp DNA带，与预测结果相符。
4. 南美白对虾pen基因的克隆：
（1）PCR产物的回收：
采用DNA胶回收试剂盒（Omega公司产品），按照Omega公司DNA胶回收试剂盒说明书回收目的基因片段。具体操作步骤如下：
① PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳(1×TAE)，用紫外灯观察电泳情况，当要回收的DNA带与其他带完全分离时，停止电泳，在紫外灯下用刀片切下欲回收带，用PCR产物纯化试剂盒纯化。
②在Eppendorf管中将胶捣碎，加入等体积的溶胶液Binding Buffer，65℃水浴7min，其间每2min轻摇Eppendorf管一次直至胶完全融解。
③将融解的样品加入层析柱中，12000rpm离心1min，弃去液体。
④加300μL Binding Buffer，离心弃去液体。
⑤加750μL Washing Buffer，离心弃去液体。
⑥重复步骤⑤1次。
⑦空柱子12000rpm离心1min以甩干液体。
⑧将柱子放于1.5mL Eppendorf管，加入30μL Elution buffer，37℃保温2min，12000rpm离心1min，收集离心液，贮存于-20℃。
（2）目的基因pen片段克隆入pGEM-T载体，构建重组质粒pGEM-T/Pen：
将以上纯化的PCR产物克隆于pGEM-T载体，pGEM-T载体购自Promega公司。反应体系为：2×Ligation buffer，5.0μL；pGEM-T载体，0.5μL；PCR 产物，4.0μL；T4 DNA ligase，0.5μL；无加菌ddH2O至10μL。在冰上混合上述液体，16℃连接15h。
（3）质粒的转化：
①感受态细胞的制备：采用冷氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。挑取单个E.coli JM109菌落，接种于5mL LB培养基中，37℃、220rpm培养过夜，次日取上述菌液按比例1：100再接种于50mL LB培养液中，37℃，220rpm振荡，待菌液OD值为0.6时，取1.5mL菌液加入无菌的Eppendorf离心管中，4,000rpm离心10min，弃上清。加入800μL冰预冷的0.1M氯化钙，轻轻振荡重悬菌体沉淀，冰浴30min。 4,000rpm离心10min，弃上清。加入100μL冰预冷的0.1M氯化钙重悬沉淀，4℃保存，7～10天内使用。
②质粒转化E.coli JM109感受态细胞：取上述连接产物10μL加入100μL感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴60分钟，42℃热休克90秒，再置冰浴2分钟，加入390μL 新鲜LB液体培养基，37℃，150rpm轻摇，50min。取100μL菌液涂布于含5-溴-4氯-3吲哚-D-半乳糖苷（X-gal，Promega公司产品）、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG，，Promega公司产品）和Amp抗性的LB 平板上，37 ℃培养过夜，观察结果，进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落，快速提取质粒进行PCR和酶切鉴定。
（4）重组质粒pGEM-T/Pen的鉴定：
随机挑取10 个单克隆白斑，扩大培养后用质粒提取试剂盒（Qiagen公司产品）抽提质粒。
①重组质粒pGEM-T/Pen的PCR鉴定：
以重组质粒pGEM-T/Pen DNA为模板，用实施例1中的引物P1、P2扩增，PCR产物为191bp，与预测结果相符，表明目的基因penaeidin已克隆入pGEM-T载体中。重组质粒pGEM-T/Pen的PCR鉴定结果见附图1。
②重组质粒pGEM-T/Pen的酶切鉴定：
酶切反应体系：质粒15μl；10×M buffer 2μl；EcoRI 1μl；XbaI 1μl；H2O：1μl ；总体积 20μl。37℃水浴酶切4小时，然后进行1.2%琼脂糖凝胶鉴定。重组质粒pGEM-T/Pen经EcoRI+XbaI 双酶切，得到约3000bp 和191bp 的预期DNA片断，pGEM-T/Pen经EcoRI单酶切，得到单一约3190bp的预期DNA片断。重组质粒pGEM-T/Pen的酶切鉴定结果见附图1。
（5）核苷酸序列测定：
质粒pGEM-T/Pen DNA经PCR 和酶切鉴定后，随机选取阳性克隆送北京华大基因公司进行DNA 测序分析。pGEM-T/Pen质粒经全自动测序分析，pen基因核苷酸序列为：
tacaggggcg gttacacagg cccgataccc aggccaccac ccattggaag accaccgttc 60
agacctgttt gcaatgcatg ctacagactt tccgtctcag atgctcgcaa ttgctgcatc 120
aagttcggaa gctgttgtca cttagtaaaa gga 153
实施例2 重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen的构建和鉴定
1. 重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen的构建：
提取重组质粒pGEM-T/Pen，用EcoRI和XbaI双酶切，得到目的片段Pen；同样酶切pPIC6αA 空载体。将双酶切后得到的Pen与空载体pPIC6αA DNA片断在T4DNA连接酶的作用下16℃过夜，得到重组质粒pPIC6αA/Pen。
连接反应体系如下：
pPIC6αA载体DNA片断：2μl；penaeidin DNA片断：10μl；T4 DNA buffer：1.5μl；T4 DNA连接酶：1.5μl。
用该重组质粒pPIC6αA/Pen转化大肠杆菌E.coli JM109感受态细胞，在含300μg/ml杀稻瘟素（Blasticidin）的LB平板上筛选阳性克隆，获得大肠杆菌菌株E.coli JM109（pPIC6αA/Pen）。采用裂解法，提取质粒pPIC6αA/Pen DNA（参见分子克隆实验指南（第三版））。
2. 重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen的鉴定：
用PCR、限制性内切酶酶切鉴定和DNA 测序分析鉴定重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen。
（1）重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen的PCR鉴定：
以质粒pPIC6αA/Pen DNA为模板，用实施例1中的引物P1、P2扩增，PCR产物为约191 bp，与预测结果相符，表明目的基因Penaeidin已克隆入pPIC6αA载体中。
（2）重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen的酶切鉴定：
酶切反应体系：质粒15μl；10×M buffer 2μl；EcoRI 1μl；XbaI 1μl；H2O：1μl ；总体积20μl。37℃水浴酶切4小时，然后进行1.2%琼脂糖凝胶鉴定。
重组质粒pPIC6αA/Pen经EcoRI和XbaI 双酶切，得到约3400bp 和191bp 的预期DNA片断。
（3）重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen的测序结果：
将重组质粒pPIC6αA/Pen DNA送上海联众生物工程有限公司进行DNA 测序分析。采用DNA双脱氧法测定核苷酸序列，测序引物为T7启动子引物，全自动测序分析。测序结果表明pen基因已正确定向插入穿梭质粒pPIC6αA/Pen中。
重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen的构建过程见附图2。
实施例3 重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen转化Pichia pastoris X-33
1. 重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen DNA的线性化：
小量制备重组质粒pPIC6αA/Pen DNA15-20μg，用RNaseA在37℃消化30 min，然后在60μL体系中用限制性内切酶Sac I进行酶切线性化，37℃水浴锅中保温4h后，用苯酚：氯仿（25：24）抽提一次，氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，加0.1体积的3M的乙酸钠（pH5.2）、2.5倍体积的无水乙醇，混匀置于-20℃沉淀过夜，4℃、12000rpm离心20min，弃上清，用超纯水配置的75%的乙醇洗2次，自然晾干后，用5-10μL TE溶液溶解沉淀，-20℃保存备用。用限制性内切酶Sac I酶切线性化载体质粒pPIC6αA，作为阴性对照。
用超纯水分别配置1M LiCl和50% PEG，分别用0.22μm微孔滤膜过滤除菌；用1.5mL Eppendorf管分装，密封，4℃保存备用。将鲑鱼精担体DNA用TE（pH8.0）配成2mg/mL的溶液，沸水中水浴加热5min，然后立即插在冰上直接使用或-20℃保存备用。
2. Pichia pastoris X-33感受态细胞的制备：
用无菌牙签挑取一酵母Pichia pastoris X-33单菌落，接种于5mL YPD中，30℃、260rpm振摇培养过夜，第二天取200μL酵母菌液接种于20mL YPD，30℃、280rpm 振摇培养到OD600为0.6~0.8时，转至无菌离心管，室温（20-25℃以下相同）、4000rpm离心10min，去上清，收集菌体，用25ml无菌ddH2O重悬，室温、4000rpm离心10min，去上清，收集菌体，再用1ml无菌ddH2O重悬，转到1.5mL的Eppendorf管中，室温、4000rpm离心10min，去上清，收集菌体，加1mL 0.1M LiCl重悬菌体，12,000g离心15 sec，弃尽上清，用400μL 0.1M LiCl重悬菌体，用1.5mL的Eppendorf管，每管100μL分装使用，该酵母感受态细胞即制即用。
3. 转化：
将以上制备的100μL酵母感受态细胞，12,000g离心15 sec，弃尽上清，向该Eppendorf管中严格按以下顺序加入试剂：240 μl 50% PEG，36 μl 1 M LiCl，25 μl 2 mg/ml鲑鱼精担体DNA和50μl线性化的pPIC6αA/Pen DNA（无菌水中）。
在漩涡振荡器上剧烈振动大约1min，使各试剂成分充分混合均匀，细胞充分悬浮后；将混合液在30℃条件下静置孵育30min，接着42℃热激20~25min，然后室温下6,000-8,000rpm离心5 min，弃上清，用1mL YPD重悬细胞，30℃、200 rpm 振摇培养，1 h后取细胞培养液100μl涂布于含300μg/ml 杀稻瘟素（Blasticidin）的YPD平板上。（YPD培养基的配制：10 g酵母抽提物，20 g蛋白胨完全溶解后定容至900 ml。固体培养基另加20 g琼脂粉，蒸汽高压15磅灭菌20 min，用前加100 ml 过滤除菌的20%葡萄糖。）将平板放于30℃培养箱，培养2~3天，观察单菌落的形成。将该经转化的菌株命名为毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen。
同时，按同样方法转化线性化空载体质粒pPIC6αA，获得毕赤酵母菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA，作为阴性对照。
实施例4 毕赤酵母重组基因工程菌株
Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen的鉴定
1. 酵母基因组的提取：
从YPD平板上挑取酵母单菌落，分别接种于3ml YPD培养液中，将1.5ml过夜培养液转到1.5ml的Eppendorf管中，室温、12000rpm离心1min，弃上清，将细胞重悬于50μL STES缓冲液中；向酵母悬液中加入50μL酸洗过的玻璃珠。每管加入20μL TE（pH7.6），然后加入60μL苯酚：氯仿（25：24），盖紧盖子。先振荡1min，使有机相和水相充分混合，然后每振荡30sec就将Eppendorf管插在冰上，重复振荡6次。室温、12000rpm离心8min，将上层的水相转移到1.5ml的Eppendorf管中，分别加1/10体积的3 mol/L的NaAc（pH5.3）、2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀20min，4℃、12000rpm下离心10min，去上清，沉淀用75%（体积比）乙醇洗涤1次，12000rpm离心2min，去上清，空气干燥沉淀后，将沉淀溶解于40μL TE Buffer（pH7.6），-20℃冻存备用。取5μL该酵母基因组DNA样品作琼脂糖电泳检测。
2. PCR鉴定：
由上海生工生物工程公司分别合成酵母醇氧化酶通用引物p5′AOX1 Pichia primer 和p3′AOX1 Pichia primer。引物p5′AOX1 Pichia primer序列为：5′GCAAATGGCATTCTGACATCC 3′；引物p3′AOX1 Pichia primer序列为：5′GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3′，
取1~10μL毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen基因组DNA样品作为PCR鉴定的模板。采用酵母醇氧化酶通用引物p5′AOX1 Pichia primer 与p3′AOX1 Pichia primer为引物，进行PCR鉴定。同时，采用实施例1中的引物P1、P2进行PCR鉴定。PCR反应条件为:95℃ 5 min，94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 2 min 30 s, 30个循环后，72℃ 10min。
毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen的鉴定结果见附图3，实验结果表明目的基因penaeidin已被准确地整合到毕赤酵母Pichia pastoris X-33基因组的特定位点中。
3. 测序鉴定：
制备酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen基因组DNA，送上海联众生物工程有限公司进行DNA 测序分析。采用DNA双脱氧法测定核苷酸序列，测序引物为酵母醇氧化酶通用引物p5′AOX1 Pichia primer 和p3′AOX1 Pichia primer，全自动测序分析。测序结果表明penaeidin基因已正确定向整合到毕赤酵母Pichia pastoris X-33基因组的特定位点中。
对虾蛋白SF-P9对应的核酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
对虾蛋白SF-P9的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
经上述筛选、鉴定正确的毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen，保藏于中国典型培养物保藏中心，该菌株在中国典型培养物保藏中心保藏编号为：CCTCC No: M209126。
实施例5 基因工程对虾蛋白SF-P9的表达
利用毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen表达基因工程重组对虾蛋白SF-P9。
1. 培养基和试剂的配制：
YP培养基的配制：称取10g酵母抽提、20g蛋白胨，用600mL 双蒸水完全溶解后后，加双蒸水定容到700mL。121℃灭菌20 min。
10×YNB培养基的配制：称取34g不含氨基酸且不含(NH4)2SO4的YNB(酵母氮源)，100g (NH4)2SO4完全溶解在800mL双蒸水中，使YNB完全溶解，定容到1000mL，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。
500×B的配制： 20mg生物素（Biotin），用1mM NaOH完全溶解后，用双蒸水定容至100mL，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
10×M的配制：将200mL甲醇和800mL双蒸水混合均匀，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。
10×G的配制：将100mL甘油和900mL双蒸水混合均匀，115℃灭菌15min，4℃保存。
10×PBS (1M磷酸钾缓冲液，pH6.0)的配制：将132 mL 1M K2HPO4和868 mL 1M KH2PO4混合均匀，KOH或H3PO4调至pH6.0。121℃灭菌20 min，4℃保存。
BMGY培养基的配制：70 mL YP培养基，10 mL 10×YNB培养基，10 mL 10×PBS，10 mL 10×G，200 μL 500×B。
BMMY培养基的配制：70 mL YP培养基，10 mL 10×YNB培养基，10 mL 10×PBS，10 mL 10×M，200 μL 500×B。
2. 挑取毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen单菌落，接种于25ml BMGY培养液中。28℃，300rpm，培养至OD600=2.0~6.0。用灭菌离心管，5000rpm离心10min，收集菌体，转接到100mL BMMY液体培养基中。
3. 28℃、300rpm 振摇培养96 h，其中每隔12 h按培养液的0.5%体积补充无水甲醇，诱导表达重组对虾蛋白SF-P9。
4. 诱导6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h后，分别取样， 15,000rpm 离心10min，收集发酵上清，上清样品于-80℃低温冷冻保存。
实施例6 对虾蛋白SF-P9的检测
采用16％Tricine-SDS-PAGE和Western Blot方法，检测毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen经甲醇诱导的样品中重组对虾蛋白SF-P9的表达。同时，设经甲醇诱导表达72小时的Pichia pastoris X-33/pPIC6αA样品作为阴性对照。
1. 16％Tricine-SDS-PAGE的检测：
16％Tricine-SDS-PAGE实验操作参照《分子克隆》（Joe Sambrook, David Russell et al., Molecular Cloning: A Laboratry Manual, Cold Spring Harbor Lab [CSHL] Press, 2001）进行。样品中加入4×Tricine样品缓冲液。（4×Tricine样品缓冲液的配制：在5mL 2×Tris/HCl, pH7.0中溶解1.2g SDS，加入0.6g β-巯基乙醇，3 g甘油，5mg考马斯亮蓝G-250，补加双蒸水至终体积10mL。用0.45μm滤膜过滤。）用考马斯亮蓝染液染色。（考马斯亮蓝染液配制：0.25g考马斯亮蓝G-250，100mL乙酸，900 mL双蒸水，充分溶解后用Whatman 1号滤纸过滤。）用10%醋酸液脱色。16％ Tricine-SDS-PAGE实验检测结果见附图4所示。
16％Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明，毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen在甲醇诱导前无表达。阴性对照毕赤酵母菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA经甲醇诱导后72h，无表达。毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen经甲醇诱导后24、48、72、96 h后，均表达了基因工程重组对虾蛋白SF-P9，SF-P9分子量与预期相符，为约9.1 kDa。毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen经甲醇诱导24h后，开始少量表达基因工程重组对虾蛋白SF-P9。随着诱导时间延长，诱导48、72h后，SF-P9表达量逐渐增大，72h表达量达到最大。
2. Western Blot的检测：
采用Western Blot方法，实验操作参照《分子克隆》进行，具体操作如下：
检测毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen经甲醇诱导的样品中重组对虾蛋白SF-P9的表达，并设经甲醇诱导表达72小时的Pichia pastoris X-33/pPIC6αA样品作为阴性对照。
（1）转膜：
A. 浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中（电转液的制备：Tris 3.0g，Gly 14.4g， M-OH 200ml，加去离子水至1,000ml。加入3.6 ml 10% SDS 180μl。）。将滤纸浸入转移液中。
B. 取胶：将18％ SDS-PAGE胶卸下，左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧三张滤纸。用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分。
C. 转膜：采用干转方法。用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。
（2）封闭及杂交：
A. 封闭：将NC膜从电转槽中取出，用去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，在30ml TBST中加入3g脱脂牛奶混匀，将NC膜置于封闭液中封闭过夜。
B. 结合一抗：一抗为兔抗南美白对虾penaeidin蛋白抗血清。将封闭过夜的NC膜用双蒸水漂洗几次后置于30 ml TBST中，并加入15μl一抗，室温轻摇一小时。
C. 洗涤：一抗孵育结束后，用PBST漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
D. 结合二抗：二抗为辣根过氧化物酶交联的羊抗兔IgGs。将NC膜置于30ml TBST中，并加入3μL二抗，室温轻摇一小时。
E. 重复步骤C。
F. 室温以PBS洗膜15 min。
G. 在10mL ddH2O中按顺序依次加入DAB显色液，后将膜浸泡于DAB显色液中10-30 min，直至蛋白条带出现。
H. 以PBS清洗以终止显色反应。
Western Blot的检测结果见附图5。实验结果表明毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen经甲醇诱导，表达了基因工程重组对虾蛋白SF-P9。该蛋白质带能和兔抗南美白对虾penaeidin蛋白抗血清发生特异性反应，所设对照Pichia pastoris X-33/pPIC6αA蛋白质带均不能与兔抗南美白对虾penaeidin蛋白抗血清反应。
实施例7 对虾蛋白SF-P9的制备
采用Ni2+柱亲和层析法，获得纯化的基因工程重组对虾蛋白SF-P9。具体操作方法如下：
（1）挑取毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen单菌落，接种于25ml BMGY培养液中。28℃，300rpm，培养至OD600=2.0~6.0。用灭菌离心管，5000rpm离心10min，收集菌体，转接到100mL BMMY液体培养基中。
（2）28℃、300rpm 振摇培养96 h，其中每隔12 h按培养液的0.5%体积补充无水甲醇。
（3）诱导72 h后，15,000rpm 离心10min，收集发酵上清，上清样品于-80℃冷冻保存。
（4）上清样品用1×Binding Buffer透析（8X Binding Buffer配制： 4 M NaCl, 160 mM Tris-HCl, 40 mM imidazole, pH 7.9）、然后用0.45μm的滤膜过滤。用1×Binding Buffer定容至100ml Ni++柱层析样品。用10床1×Binding Buffer，20床无菌水清洗柱床；用10床1×Charge Buffer（5mM NiSO4），结合Ni++；再用10床1×Binding Buffer平衡柱床。样品循环方式通过Ni++柱，使带有6×His的蛋白样品流动相充分与Ni++柱中的Ni++相结合。分别采用50床1×Binding Buffer；75床60mM咪唑；75床100mM咪唑；30床150mM咪唑梯度洗涤留在柱内的少量样品和与Ni++柱结合的非目的蛋白。用1×Elute Buffer（4X Elute Buffer的配制：4 M imidazole, 2 M NaCl, 80 mM Tris-HCl, pH 7.9）洗脱与Ni++柱结合的目的蛋白，分部收集，1mL/管。
（5）Ni++柱用1×Elute Buffer继续洗脱，洗脱柱中全部蛋白；再用1×Strip Buffer（4X Strip Buffer的配制： 2 M NaCl, 400 mM EDTA, 80 mM Tris-HCl, pH 7.9）洗柱子。
（6）采用实施例6中所述的16％Tricine-SDS-PAGE和Western Blot方法，用考马斯亮蓝R250染色检测样品中重组对虾蛋白SF-P9。结果如附图5所示。实验结果表明纯化样品有约为9.1 kDa的单一特异性蛋白质SF-P9条带。
实施例8 对虾蛋白F-P6的制备和鉴定
采用肠激酶酶切对虾蛋白SF-P9，制备对虾蛋白F-P6。肠激酶是一种切割位点高度专一的丝氨酸蛋白酶，其识别序列为DDDDK，在赖氨酸残基的C-端切割多肽。具体方法如下：
1. Ni-NTA Superflow柱亲和层析法纯化得对虾蛋白SF-P9纯品，调整其浓度为100μg/mL；
2. 取1支1.5 mLEppendorf管，依次加入以下样品：90μL对虾蛋白SF-P9，10μL 10×酶切缓冲液（10×酶切缓冲液：500 mM Tris-HCl, pH 8.0 (22°C) , 10 mM CaCl2, 1% Tween-20；称取60.5g Tris-base，溶于950 mL去离子水中，浓HCl调节pH至8.0，加1.47g CaCl2·2H2O、10mL Tween-20，混匀，定容至1L。室温存放。），反应体积100μL，加入0.60unit肠激酶。37℃保温4小时（h）。
3. 收集酶切后样品，置-20℃保存备用。采用实施例6中所述的16％Tricine-SDS-PAGE和Western Blot方法，用考马斯亮蓝R250染色检测样品中对虾蛋白F-P6。结果如附图6所示。实验结果表明，在0.60 unit/100μL肠激酶、37℃、酶切4h的条件下，酶切对虾蛋白SF-P9，制备了特异性的、分子量约为6.3 kDa对虾蛋白F-P6。
对虾蛋白F-P6的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
对虾蛋白F-P6对应的核酸序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
实施例9 样品中蛋白质含量的确定
收集的对虾蛋白SF-P9和F-P6样品装入经处理的透析袋中，放入盛有1000mL PBS缓冲液(PH6.9)烧杯中，4℃透析、过夜。采用Bradford法确定对虾蛋白SF-P9 SF-P9和F-P6的含量，用mg/mL标定。
Bradford法具体操作如下：
（1）将0、1、2、3、4、5、6 μL 1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）标准溶液依次加入酶标微孔板中，用PBS补足50 μL。
（2）向每孔中加入200μL Bradford试剂工作液( 0.1％考马斯亮蓝G250，5％乙醇，8.5％磷酸)。振荡、混匀后，室温放置2分钟。
（3）用酶标仪测BSA蛋白各浓度的OD570值(λ=570nm)。以BSA蛋白质浓度为横坐标，以BSA蛋白各浓度的OD570值为纵坐标制作标准曲线。
（4）用同样方法测定样品的OD570值，用标准曲线中确定样品的浓度。
实施例10 对虾蛋白SF-P9和F-P6抗细菌的生物活性测定
采用噻唑蓝（MTT）法和管碟法，检测对虾蛋白SF-P9和F-P6对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的活性。实验菌种包括：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、副溶血弧菌（Bibrio Parahemolyticus）、大肠杆菌JM109（Escherichia coli JM109）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、、鼠伤寒沙门氏菌（salmonella typhimurium）（中国典型培养物保藏中心提供）。
1. MTT法检测对虾蛋白SF-P9和F-P6的抗细菌活性
（1）将受试细菌培养过夜，用生理盐水调整细菌浓度至2-7×105 CFU/mL。
（2）用无菌微量加样器向无菌96孔微孔板中每孔加入稀释菌液50 μL，再分别在各孔中加入待测样品50 μL，混匀。同时，设ddH2O作为阴性对照、氨苄青霉素（Amp）作为阳性对照。每种样品设3个复孔。37℃恒温培养箱，培养12-16 h。
（3）分别在各孔中加入10 μL 5 mg/mL的噻唑蓝（MTT）溶液，37℃恒温培养箱中培养2-4 h至反应完全。
（4）分别在各孔中加入90μL 二甲基亚砜（DMSO），反复吹打混匀，使蓝色晶体充分溶解，在570nm处测量OD值。
（5）计算存活率。存活率=（A570样品处理/A570空白处理）× 100%。
（6）MTT法检测对虾蛋白SF-P9的抗细菌活性结果详见表1。实验结果表明，对虾蛋白SF-P9不仅对革兰氏阳性菌有很好的抑杀作用，对革兰氏阴性细菌也有广谱抑菌特性。其中，对虾蛋白SF-P9对枯草芽孢杆菌的MIC值约为0.028μmol/L；对副溶血弧菌的MIC值约为0.028~0.056μmol/L；对短小芽孢杆菌、副溶血弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌的MIC值在0.028~0.056μmol/L之间；对金黄色葡萄球菌的MIC值在0.089~0.112μmol/L之间；对大肠杆菌JM109的MIC值在0.056~0.112μmol/L之间；对苏云金芽孢杆菌的MIC值为约为0.099μmol/L。对虾蛋白F-P6对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.095~0.120μmol/L；对短小芽孢杆菌的MIC值为0.033~0.063μmol/L；对苏云金芽孢杆菌的MIC值约为0.115μmol/L；对枯草芽孢杆菌的MIC值约为0.031μmol/L；对溶藻弧菌的MIC值约为0.036μmol/L；对副溶血弧菌的MIC值为0.033~0.062μmol/L；对鼠伤寒沙门氏菌的MIC值为0.030~0.064μmol/L；对大肠杆菌JM109的MIC值为0.063~0.121μmol/L；对铜绿假单胞菌的MIC值为0.036~0.067μmol/L。
表1 对虾蛋白SF-P9和F-P6抗细菌活性测定
2. 管碟法检测对虾蛋白SF-P9的抗细菌活性：
（1）指示菌菌液的制备：用接种环挑取保存的菌种转接至含新鲜营养琼脂培养基斜面，28℃恒温培养箱培养20~28h，用灭菌生理盐水将菌苔洗下，分光光度计OD600 ，备用。
（2）双碟的制备：将已配好的培养基加热融化，倒入无菌平底双碟内，水平静置，凝固。将加热融化后的培养基置于50℃左右的水浴锅内，加入菌液使其终浓度为2~7×105 CFU/mL，吸取10mL加入已凝固的的底层培养基上，水平静置，凝固。
（3）培养：每批样品取双碟3只，每碟安放牛津杯4只，将已制备好的阳性对照组（杆菌肽标样1U、Amp3.125μg/mL）、空白对照组（0.02M PBS，pH7.4）和样品液200μL分别间隔滴入牛津杯中，盖上灭菌干燥的陶瓦圆盖。将放置牛津杯的培养皿平稳移入恒温培养箱36℃±1℃，16h-28h。
（4）抑菌圈测量：将培养好的双碟取出，倒出牛津杯，盖上玻盖，按编号排好次序，用抑菌圈测量仪或游标卡尺测量抑菌圈的直径，并记录其数值。
（5）计算：
第一碟：K B A P
第二碟：K B A P
第三碟：K B A P
（K：空白对照0.02M PBS，pH7.4所致的抑菌圈直径；B：杆菌肽标准液1U所致的抑菌圈直径；A：氨苄青霉素（3.125μg/mL）所致的抑菌圈直径；P：对虾蛋白SF-P9所致的抑菌圈直径）
若EB≈EP （95%≤EB/EP≤105%）
效价（U/mL）=杆菌肽标样效价×样品稀释倍数
若EA≈EP （95%≤EB/EP≤105%）
效价（μg/mL）=氨苄青霉素浓度×样品稀释倍数
（EK：PBS所致的抑菌圈直径总和；EB：杆菌肽标准液所致的抑菌圈直径总和；EA：氨苄青霉素所致的抑菌圈直径总和；EP：样品液所致的抑菌圈直径总和）
（6）管碟法测定对虾蛋白SF-P9的抗细菌活性的抑菌效价结果见图7。实验结果表明，对藤黄微球菌Micrococcus luteus，1U杆菌肽标准样品的抑菌圈直径为3.0cm，3.125μg/mL Amp的抑菌圈直径为2.7cm，0.446μmol/L对虾蛋白SF-P9的抑菌圈直径为3.1cm。0.446μmol/L对虾蛋白SF-P9与1U的杆菌肽及3.125μg/mL的Amp活性相当。
实施例11 对虾蛋白抗真菌的生物活性测定
采用药敏纸片法和双碟法，检测对虾蛋白抗真菌的生物活性。实验菌种——黑曲霉（Aspergillus niger）（中国典型培养物保藏中心提供）。
1. 药敏纸片法检测对虾蛋白SF-P9抗真菌活性：
（1）用接种针将活化的供试菌接至含新鲜PDA固体培养基的平皿中心。（1 L PDA培养基的制备：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂15~20g。将马铃薯去皮切块，蒸馏水中煮沸30min，纱布过滤。加入葡萄糖和琼脂，加热融化，补加蒸馏水至1000mL。分装，121℃高压蒸汽灭菌20min。）
（2）28℃恒温培养72~96h直至供试菌长至直径为5~6cm的规则圆形菌苔。
（3）围绕距菌苔边缘0.5cm的位置均匀贴上直径为0.625cm的无菌滤纸片，每滤纸片上滴加20μL待测样品。
（4）28℃恒温培养24~72h直至供试菌菌苔外缘将空白对照组的滤纸片完全包围，而在样品组可明显观察到因抗真菌作用而形成的星形锯齿外缘。
（5）采用药敏纸片法检测对虾蛋白SF-P9抗真菌活性试验表明，对虾蛋白SF-P9对黑曲霉有较强的抑制作用，结果见图8。Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen在1.5%（体积比）甲醇诱导下，表达有活性的对虾蛋白SF-P9，16μmol/L对虾蛋白SF-P9纯品对该黑曲霉有抑制活性。
2. 双碟法检测对虾蛋白SF-P9抗真菌的IC50：
（1）双碟的制备：倒下层，将已配好的PDA新鲜固体培养基加热融化，倒平板（每皿12~15mL），水平静置，使之凝固；倒上层，将加热融化后的PDA新鲜固体培养基置于50℃左右的水浴锅内，依浓度梯度加入待测样品，使对虾蛋白SF-P9终浓度为（0.000μmol/L、0.064nmol/mL、0.128μmol/L、0.256μmol/L、0.512μmol/L、1.024μmol/L），无菌吸管吸取5mL加入已凝固的底层培养基上，水平静置，凝固。
（2）接菌：用接种针将活化的供试菌接至双碟的中心。
（3）培养：28℃恒温培养72-96h直至空白对照组中供试菌长至直径为6~7cm的规则圆形菌苔。
（4）计算：抑菌活性 = % = [(Sk- Sp)/Sk] ×100%：
Sk：空白对照组供试菌菌苔面积
Sp：样品组供试菌菌苔面积
IC50：供试菌在28℃恒温培养72h，样品组菌苔面积较空白组菌苔面积减少50%所需对虾蛋白SF-P9的量定义为IC50。
（5）双碟法测定对虾蛋白SF-P9抗黑曲霉IC50的实验结果见附图9。根据公式
% = [(Sk- Sp)/Sk] ×100%，计算得出对虾蛋白SF-P9抗黑曲霉IC50值为0.586μmol/L。（Sk代表空白对照组的菌苔面积；Sp代表样品组的菌苔面积；
代表样品组相对空白对照组，菌苔面积增减的多少)。上层培养基分别含有0.000μmol/L、0.064μmol/L、0.128μmol/L、0.256μmol/L、0.512μmol/L和1.024μmol/L对虾蛋白SF-P9，其对应的的各平皿菌苔直径分别为4.50cm、4.50cm、4.3cm、3.9cm、3.7cm、2.2cm (上述数据为重复5次实验的平均值)。该实验结果表明对虾蛋白SF-P9对黑曲霉具有明显的抗菌活性和很好的抑制效果。
实施例12 对虾蛋白SF-P9和F-P6抗病毒的生物活性测定
依据戴华生编著的《病毒学实验诊断技术》，检测对虾蛋白SF-P9和F-P6抗流感病毒的生物活性。
1. 毒种和样品：
流感病毒毒种：A型H3N2流感病毒毒种由中国典型培养物保藏中心提供。对虾蛋白SF-P9样品、对虾蛋白F-P6样品和Pichia pastoris X-33/pPIC6αA抽提液样品经0.22μm微孔滤膜过滤、除菌。
2. 按下表2所示依次将样品接入鸡胚尿囊腔：（病毒效价为480）
表2 接入鸡胚尿囊腔样品
注：以上各组中分别加入10,000U/ml的青霉素及链霉素各10μL。
表2中，病毒（流感病毒A型H3N2）与样品37℃混合，37℃静置3小时后，将各组样品按每只鸡胚0.15mL接入9-11日龄尿囊腔，每组接5只鸡胚。
3. 鸡胚尿囊腔接种具体操作如下：
（1）取孵育9-11天的鸡胚，照视、划出气室及胚胎位置，在距气室底边0.5cm处的卵壳上表明开孔记号。以酒精消毒开孔处，然后钻一小孔，再用酒精消毒。
（2）注射针头由小孔刺入0.5-1cm，注射器向钝头方向倾斜45°，注射0.15mL上述各组样品后用封口膜封口。置35℃孵育48小时。自接种起每日检视一次，于24小时内死亡的多为非特异性因素致死，应及时剔出。
（3）解剖及收获：
在接种48小时后收获。收获前将鸡胚于4℃冰箱过夜，将鸡胚冻死，血液凝固，以免收获时红血球流出，影响收获的病毒滴度。
经冰冻鸡胚消毒后，用无菌镊子轻轻揭去气室部的卵壳，揭去壳膜，然后用移液枪通过绒毛尿囊腔吸出尿囊液。将收取的尿囊液置无菌小瓶内于-20℃保存。
4. 鸡胚尿囊液效价的测定：
表2中各组样品分别接种9-11日龄鸡胚尿囊腔，48小时后收获鸡胚尿囊液并测定其血凝效价。
（1）取一干净的血凝板，标记所要测定的标本名称。
（2）于第2孔加入0.9mL 0.85%生理盐水，从第3孔至第10孔各加0.2mL 0.85%生理盐水。第1孔中加入0.2mL尿囊液，第2孔中加入0.1mL尿囊液，反复吹打7至8次混匀。
（3）从混匀的第2孔中吸入0.2mL至第3孔，再从第3孔中吸0.2mL至第4孔，依次类推作倍比稀释，直至第9孔，第10孔为红血球对照，即不加尿囊液。各孔液体量均为0.2mL，多余的弃去。
（4）从第10孔开始，于每孔加入0.2mL 1% 红细胞悬液。相混后置室温30-60 min后观察结果。结果以++++、+++、++、+、±和—表示。具体判定如下：
A. 一层红细胞均匀地铺于孔上者为++++。
B. 基本同上，但边缘不整齐，铺的面积稍小些者为+++。
C. 红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为++。
D. 红细胞形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝块者为+。
E. 红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑并有立体感，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动像人的眼泪滴样者为—。
F. 结果以+为终点，亦即一个凝集单位。
5. 对虾蛋白SF-P9和F-P6抗流感病毒生物活性测定
对虾蛋白SF-P9和F-P6抗流感病毒血凝效价测定结果见表3。
表3 尿囊液流感病毒血凝效价测定
上述血凝试验结果表明，对虾蛋白SF-P9和F-P6分别与流感病毒混合后接种鸡胚，对虾蛋白SF-P9和F-P6均对流感病毒（A型H3N2）在鸡胚中的增殖具有明显的抑制作用。
实施例13 对虾蛋白SF-P9和F-P6抑制肿瘤细胞生长
的生物活性测定
采用MTT法测定测对虾蛋白SF-P9和F-P6对人肝肿瘤细胞系HepG2细胞生长的影响。具体操作方法如下：
（1）取一瓶在37℃，5%CO2培养箱中培养的对数生长期HepG2细胞，PBS洗一遍，（PBS的配制：8.00g NaCl， 0.20g KCl，1.56g Na2HPO4?H2O，0.20g KH2PO4充分溶解于ddH2O后，调pH至7.2，定容至1L，121℃灭菌30min。）用含有EDTA的0.25%胰酶（购自HyClone公司）37℃处理 1 min-2 min，弃去胰酶，用含血清的细胞培养基将细胞稀释到密度为105个/mL。
（2）取无菌96孔微孔板，每孔中加入100μL稀释后的细胞悬液。放入37℃，5% CO2培养箱中培养至细胞汇合度至70%左右；
（3）设空白组3个孔，每孔中加入100μL无血清细胞培养基。设每种样品为5组浓度，每组设置3个孔，每孔中加入100μL用无血清培养基稀释到一定浓度的对虾蛋白SF-P9和F-P6样品溶液。放入37℃，5%CO2培养箱中培养24 h。
（4）各孔分别加入MTT溶液10μL，（5mg/mL MTT溶液的配制：0.5gMTT[（3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名噻唑蓝）]粉末充分溶解于ddH2O后，定容至100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光贮存）。放入37℃，5% CO2培养箱中孵育4 h。
（5）吸净各孔液体后，向各孔中加入100μL 二甲基亚砜，反复吹打混匀至蓝紫色晶体充分溶解，注意避免气泡；
（6）打开Molecular Devices SpectraMax M2微孔板检测系统的SoftMax Pro v5.01操作系统，选用“终点法检测”（获得在单一时间点的样品检测值），设置检测波长为570nm；
（7）实验重复3次，按照下面的公式计算抑制率，并计算平均抑制率、分析结果。
抑制率=1-[样品处理组的OD570 /空白对照OD570]× 100%
对虾蛋白SF-P9对HepG2细胞生长的影响结果见图10。不同浓度的对虾蛋白SF-P9作用肿瘤细胞HepG2 24h后的实验结果表明，随着对虾蛋白SF-P9浓度的增加，抑制率逐渐增加。40μg/mL对虾蛋白SF-P9可抑杀50.31%的HepG2细胞，20 μg/mL对虾蛋白SF-P9可抑杀11.92%的HepG2细胞，30μg/mL对虾蛋白SF-P9可抑杀43.17%的HepG2细胞，60μg/mL对虾蛋白SF-P9可抑杀65.80%的HepG2细胞。
对虾蛋白F-P6对HepG2细胞生长的影响结果见图11。不同浓度的对虾蛋白F-P6作用肿瘤细胞HepG2 24h后的实验结果表明，随着对虾蛋白F-P6浓度的增加，抑制率逐渐增加。40μg/mL对虾蛋白F-P6可抑杀51.02%的HepG2细胞，20 μg/mL对虾蛋白F-P6可抑杀12.06%的HepG2细胞，30μg/mL对虾蛋白F-P6可抑杀45.98%的HepG2细胞，60μg/mL对虾蛋白F-P6可抑杀67.42%的HepG2细胞。
序列表(SEQUENCE LISTING)
<110> 武汉大学
<120> 重组对虾蛋白SF-P9及制备方法和应用
<130> 重组对虾蛋白SF-P9及制备方法和应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 246
<212> DNA
<213> 重组DNA
<220>
<221> pen gene
<222> (7)..(159)
<223>
<400> 1
gaattctaca ggggcggtta cacaggcccg atacccaggc caccacccat tggaagacca 60
ccgttcagac ctgtttgcaa tgcatgctac agactttccg tctcagatgc tcgcaattgc 120
tgcatcaagt tcggaagctg ttgtcactta gtaaaaggag atgacgatga caaggctcta 180
gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat 240
cattga 246
<210> 2
<211> 81
<212> PRT
<213> 多肽
<220>
<221> SF-P9 PEPTIDE
<222> (1)..(81)
<223>
<220>
<221> Pen-2 PEPTIDE
<222> (3)..(53)
<223>
<400> 2
Glu Phe Tyr Arg Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ile Pro Arg Pro Pro Pro
1 5 10 15
Ile Gly Arg Pro Pro Phe Arg Pro Val Cys Asn Ala Cys Tyr Arg Leu
20 25 30
Ser Val Ser Asp Ala Arg Asn Cys Cys Ile Lys Phe Gly Ser Cys Cys
35 40 45
His Leu Val Lys Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ala Leu Glu Gln Lys Leu
50 55 60
Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His
65 70 75 80
His
<210> 3
<211> 174
<212> DNA
<213> 重组DNA
<220>
<221> pen gene
<222> (7)..(159)
<223>
<400> 3
gaattctaca ggggcggtta cacaggcccg atacccaggc caccacccat tggaagacca 60
ccgttcagac ctgtttgcaa tgcatgctac agactttccg tctcagatgc tcgcaattgc 120
tgcatcaagt tcggaagctg ttgtcactta gtaaaaggag atgacgatga caag 174
<210> 4
<211> 58
<212> PRT
<213> 多肽
<220>
<221> F-P6 PEPTIDE
<222> (1)..(58)
<223>
<220>
<221> Pen-2 PEPTIDE
<222> (3)..(53)
<223>
<400> 4
Glu Phe Tyr Arg Gly Gly Tyr Thr Gly Pro Ile Pro Arg Pro Pro Pro
1 5 10 15
Ile Gly Arg Pro Pro Phe Arg Pro Val Cys Asn Ala Cys Tyr Arg Leu
20 25 30
Ser Val Ser Asp Ala Arg Asn Cys Cys Ile Lys Phe Gly Ser Cys Cys
35 40 45
His Leu Val Lys Gly Asp Asp Asp Asp Lys
50 55
Claims (15)
1.一种基因工程表达、分离和纯化的重组对虾蛋白SF-P9，其序列为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。
2.一种基因工程表达、分离和纯化的重组对虾蛋白SF-P9对应的核酸，其序列为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。
3.一种表达重组对虾蛋白SF-P9的基因工程菌株，其特征在于：所述的菌株是酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen，CCTCC No: M209126。
4.权利要求3所述的一种表达重组对虾蛋白SF-P9的酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen的构建方法，其步骤是：
A、南美白对虾总RNA的提取及cDNA第一条链的合成：采集南美白对虾血淋巴，获得血细胞，提取总RNA，并按Promega公司Universal Riboclone cDNA Synthesis System试剂盒操作手册进行，反转录合成cDNA第一条链；
B、PCR扩增Penaeidin基因：以反转录合成的cDNA第一条链为模板，上游引物P1：5’GAATTCTACAGGGGCGGTTACACA 3’，下游引物P2：5’TCTAGAGCCTTGTCATCGTCATCTCCTTTTACTAAGTGACAACA 3’，利用PCR仪扩增，获得获得191 bp目的基因片段；
C、重组质粒pGEM-T/Pen的构建和鉴定：回收PCR产物，将PCR 产物连接到pGEM-T载体上，转化E.coli JM109感受态细胞，涂布于含X-gal 、IPTG和Amp抗性的LB平板上进行蓝白斑筛选，用PCR 和限制性内切酶酶切鉴定、DNA 测序分析鉴定重组质粒pGEM-T/Pen；
D、重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen的构建和鉴定：用EcoRI和XbaI分别双酶切质粒pPIC6αA和质粒pGEM-T/Pen DNA，将Penaeidin基因定向插入质粒pPIC6αA，转化E. coli JM109感受态细胞，在含300μg/ml杀稻瘟素的LB平板上筛选阳性克隆，获得大肠杆菌菌株E.coli JM109（pPIC6αA/Pen），用PCR、限制性内切酶酶切鉴定和DNA 测序分析鉴定重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen；
E、重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen转化Pichia pastoris X-33，获得毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen；
a. 重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen DNA的线性化：制备质粒pPIC6αA/Pen DNA 15-20μg，经RNaseA消化，然后用限制性内切酶Sac I进行酶切线性化，沉淀过夜；
b. Pichia pastoris X-33感受态细胞的制备：挑取Pichia pastoris X-33单菌落，接种于5mlYPD中，30℃、260rpm振摇培养过夜，离心收集菌体，经0.1M LiCl处理制备Pichia pastoris X-33感受态细胞；
c. 转化：采用线性化的重组穿梭质粒pPIC6αA/Pen DNA转化Pichia pastoris X-33感受态细胞，涂布于含300μg/ml杀稻瘟素的YPD平板上，30℃，培养2~3天，按同样方法转化线性化空载体质粒pPIC6αA，作为阴性对照；
F、 毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen的筛选与鉴定：提取毕赤酵母重组基因工程菌株Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen基因组，以Pichia pastoris X-33/pPIC6αA/Pen基因组DNA为模板，用酵母醇氧化酶通用引物p5′AOX1 与p3′AOX1进行PCR鉴定，同时设Pichia pastoris X-33/pPIC6αA基因组DNA和Pichia pastoris X-33基因组DNA两个对照；
G、 测序结果表明penaeidin基因已正确定向整合到毕赤酵母Pichia pastoris X-33基因组的特定位点中。
5.权利要求1所述的一种重组对虾蛋白SF-P9在制备治疗或预防细菌感染药物中的应用。
6.权利要求1所述的一种重组对虾蛋白SF-P9在制备治疗或预防真菌感染药物中的应用。
7.权利要求1所述的一种重组对虾蛋白SF-P在制备治疗或预防病毒感染药物中的应用。
8.权利要求1所述的一种重组对虾蛋白SF-P在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。
9.一种分离和纯化的对虾蛋白F-P6，其序列为SEQ ID NO.4所示氨基酸序列。
10.一种分离和纯化的对虾蛋白F-P6对应的核酸，其序列为SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。
11.权利要求9所述的一种制备对虾蛋白F-P6的方法，其步骤是：
A、Ni-NTA Superflow柱亲和层析法纯化得对虾蛋白SF-P9，调整其浓度为100μg/mL；
B、取1支1.5 mLEppendorf管，依次加入以下样品：90μL对虾蛋白SF-P9，10μL 10×酶切缓冲液，反应体积100μL，加入0.60unit肠激酶，37℃保温4小时；
C、收集酶切后样品，置-20℃保存备用，采用16％Tricine-SDS-PAGE和Western Blot方法，用考马斯亮蓝R250染色检测样品中对虾蛋白F-P6，在0.60 unit/100μL肠激酶、37℃、酶切4h的条件下，酶切对虾蛋白SF-P9，制备分子量为6.3 kDa对虾蛋白F-P6。
12.权利要求9所述的一种对虾蛋白F-P6在制备治疗或预防细菌感染药物中的应用。
13.权利要求9所述的一种对虾蛋白F-P6在制备治疗或预防真菌感染药物中的应用。
14.权利要求9所述的一种对虾蛋白F-P6在制备治疗或预防病毒感染药物中的应用。
15.权利要求9所述的一种对虾蛋白F-P6在制备治疗或预防肿瘤药物中的应用。
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