CN107670023A

CN107670023A - V12cbd蛋白及其编码基因的一种新用途

Info

Publication number: CN107670023A
Application number: CN201710935099.8A
Authority: CN
Inventors: 危宏平; 杨航
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2017-10-10
Filing date: 2017-10-10
Publication date: 2018-02-09
Anticipated expiration: 2037-10-10
Also published as: CN107670023B

Abstract

本发明涉及生物制剂领域，公开了一种能结合金黄色葡萄球菌的V12CBD蛋白及其编码基因的一种新用途。本发明提供的新用途是V12CBD蛋白及其编码基因在制备治疗与预防葡萄球菌感染的药物中的应用，V12CBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，V12CBD蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。实验表明，V12CBD与金黄色葡萄球菌结合后能抑制细菌在上皮细胞的粘附和入侵，增强金黄色葡萄球菌对巨噬细胞的敏感性；V12CBD能活化巨噬细胞，增强机体的免疫功能；预防性注射V12CBD以及包含有V12CBD的融合蛋白质能显著提高金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率。因此，V12CBD能单独或者作为添加剂与不同形式的试剂和溶液配伍，用于葡萄球菌的治疗与预防性治疗，具有广泛的应用前景。

Description

V12CBD蛋白及其编码基因的一种新用途

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，具体涉及肠球菌裂解酶PlyV12的细胞壁结合域V12CBD蛋白及其编码基因的一种新用途。

背景技术

葡萄球菌是一类球形的革兰氏阳性细菌，能引起人和动物的很多疾病，同时也是医院感染常见的病原菌之一。由于葡萄球菌的广泛耐药性，尤其是耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现和世界范围的传播，金黄色葡萄球菌引起的感染已成为院内和社区获得性感染中的主要致病菌，致死率较高，危害巨大。由于新型抗生素开发的缓慢以及葡萄球菌疫苗的缺乏，针对葡萄球菌发展新型抗菌药物具有非常重要的意义。金黄色葡萄球菌在上皮细胞的粘附和入侵是其发起感染的第一步，这是在金黄色葡萄球菌表面特异蛋白与宿主上皮细胞之间的相互作用下发生的。巨噬细胞作为机体抵御病原体入侵的第一道防线，会对入侵的病原体进行吞噬和杀灭。但是，金黄色葡萄球菌由于具有特殊的肽聚糖结构以及菌体表面修饰，如荚膜多糖，壁磷壁酸等，能够逃逸巨噬细胞的免疫清除。因此，金黄色葡萄球菌的免疫逃逸是其感染难治愈和高致死率的帮凶。

噬菌体裂解酶是双链DNA噬菌体感染宿主细菌后晚期表达的一种细胞壁水解酶，用于水解宿主细菌的细胞壁释放子代噬菌体。裂解酶通常具有模块化的结构，即包括N-端的催化功能域(CD)和C-端的细胞结合功能域(CBD)。这两个功能域相对独立，具有比较明确的功能。之前的研究表明，CD功能域主要体现为肽聚糖水解活性，而CBD功能域则具有与特定把细菌特异性识别的功能。但只具有CBD结合功能的蛋白质对细菌生长和感染的影响迄今为止未见任何报道。

发明内容

本发明的目的是提供肠球菌裂解酶PlyV12的细胞壁结合域V12CBD蛋白及其编码基因的一种新用途。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

肠球菌裂解酶PlyV12的细胞壁结合域V12CBD蛋白的新用途，所述V12CBD蛋白应用于制备治疗与预防葡萄球菌感染的药物，所述V12CBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述V12CBD蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述V12CBD蛋白通过提高宿主巨噬细胞杀菌能力来预防葡萄球菌感染。

进一步地，所述V12CBD蛋白通过结合葡萄球菌来降低细菌毒力来治疗葡萄球菌感染。

进一步地，所述V12CBD蛋白通过与噬菌体裂解酶催化域、抗菌肽和细菌抗原中的任一种或多种氨基酸片段融合成新的蛋白质来预防葡萄球菌感染。

本发明另一方面公开了V12CBD蛋白的制备方法。所述V12CBD蛋白可利用常规的基因工程的制备方法获得。例如：通过PCR扩增相应的编码基因序列，经克隆筛选和测序鉴定正确后，利用pET28a(+)质粒构建原核表达载体，将鉴定正确的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选获得阳性转化子，再以IPTG诱导表达，对以胞内可溶性表达的V12CBD蛋白进行亲和层析纯化，即得。

本发明首次公开了V12CBD蛋白用于制备治疗与预防葡萄球菌感染的药物的新用途。实验表明，所述V12CBD蛋白与金黄色葡萄球菌结合后能抑制细菌与上皮细胞的粘附和入侵，能提高细菌对巨噬细胞的敏感性；V12CBD蛋白还能活化巨噬细胞，增强其对金黄色葡萄球菌的吞噬和杀灭能力；V12CBD蛋白不仅能用于金黄色葡萄球菌感染的治疗，还能用于预防金黄色葡萄球菌感染。因此，V12CBD能单独或者作为添加剂与不同形式的试剂和溶液配伍，用于葡萄球菌的控制与预防性治疗。

附图说明

图1为V12CBD抑制金黄色葡萄球菌与上皮细胞粘附结果示意图。

图2为V12CBD抑制金黄色葡萄球菌入侵上皮细胞的结果示意图。

图3为V12CBD提高金黄色葡萄球菌对巨噬细胞敏感性的结果示意图。

图4为V12CBD降低金黄色葡萄球菌体内毒力的结果示意图。

图5为V12CBD增强巨噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌的结果示意图。

图6为V12CBD增强巨噬细胞杀灭金黄色葡萄球菌的结果示意图。

图7为V12CBD诱导巨噬细胞细胞因子分泌的结果示意图。

图8为不同浓度的V12CBD细胞毒性的结果示意图。

图9为V12CBD用于金黄色葡萄球菌感染小鼠治疗的结果示意图。

图10为V12CBD预防性治疗金黄色葡萄球菌感染小鼠的结果示意图。

图11为融合有V12CBD片段的蛋白质Ply187N-V12C预防性治疗金黄色葡萄球菌感染小鼠结果示意图。

具体实施方式

以下通过实例来具体说明本发明的某些实施例，但不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

实施例1、V12CBD的克隆表达

1.在上海生工生物工程有限公司全序列合成裂解酶PlyV12基因DNA序列。以合成的序列为模板，以下两条序列为引物，通过常规PCR扩增得到V12CBD基因序列，并通过常规分子克隆方法将目标片段连入pET28a(+)表达载体后，转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。引物设计如下：

Upper：5-GACGGAATTCTTAAACGGTGGAAGCACTCCTCCAAAAC-3EcoRI

Down：5-TCGCCTCGAGTTACTTAAATGTACCCCATGCTTCCTTACC-3XhoI

2.V12CBD的表达纯化。

将表达菌株BL21(DE3)/pET-V12CBD接种到500mL的培养基中37℃震荡培养，待OD₆₀₀长到0.6～0.8时，添加IPTG至0.2mM，然后将培养基转入16℃诱导表达16～20小时。培养结束后，收集菌体并超声破碎，破碎液10000g离心30min，取上清过0.22μm滤膜，然后按照常规方法通过his标签亲和纯化，收集250mM洗脱液并透析于PBS缓冲液中，过滤后置于-20℃备用。

实施案例2、V12CBD抑制金黄色葡萄球菌与上皮细胞粘附结果的验证

将金黄色葡萄球菌N315与不同浓度(0μg/ml、25μg/ml、100μg/ml)的V12CBD蛋白在37℃孵育1h，用PBS洗涤3次后将金黄色葡萄球菌加到铺有上皮细胞A549的孔板中，37℃共培养1h。用PBS洗涤3次后，裂解细胞，涂平板计算每孔细菌数，所得到的结果如图1所示。

结果显示，随着V12CBD蛋白浓度的增加，与V12CBD孵育后的金黄色葡萄球菌粘附到上皮细胞上的数量明显减少，表明V12CBD蛋白使金黄色葡萄球菌与上皮细胞粘附能力受到抑制。

实施案例3、V12CBD抑制金黄色葡萄球菌入侵上皮细胞结果的验证

将金黄色葡萄球菌N315与不同浓度(0μg/ml、25μg/ml、100μg/ml)的V12CBD蛋白在37℃孵育1h，用PBS洗涤3次后将金黄色葡萄球菌加到铺有上皮细胞A549的孔板中，37℃共培养1h。PBS洗涤3次后，加入1mg/ml的庆大霉素处理2h以杀灭粘附在细胞表面的细菌。用PBS洗涤3次后裂解细胞，涂平板计算每孔细菌数，所得到的结果见如图2所示。

结果显示，随着V12CBD蛋白浓度的增加，与V12CBD孵育后的金黄色葡萄球菌入侵到上皮细胞里面的数量明显减少，表明V12CBD蛋白使金黄色葡萄球菌N315入侵上皮细胞能力受到抑制。

实施例4、V12CBD提高金黄色葡萄球菌对巨噬细胞敏感性结果的验证

将不同浓度的V12CBD(0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)分别与金黄色葡萄球菌N315在37℃孵育1h，用PBS洗涤3次后将三组金黄色葡萄球菌N315分别与巨噬细胞RAW264.7混合，37℃共培养4h。裂解细胞后涂平板计算每孔细菌数，所得到的结果如图3所示。

结果显示，与V12CBD蛋白孵育后的金黄色葡萄球菌在巨噬细胞中的存活率降低，且V12CBD蛋白的浓度越高，金黄色葡萄球菌在巨噬细胞中的存活率降低越明显，表明V12CBD蛋白能提高金黄色葡萄球菌对巨噬细胞的敏感性。

实施例5、V12CBD降低金黄色葡萄球菌体内毒力结果的的验证

将金黄色葡萄球菌N315与不同浓度的V12CBD(100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml)在37℃孵育0.5h，并用PBS洗涤3次，腹腔注射6周大的BALB/c雌性小鼠，每天观测小鼠的存活率，所得到的结果如图4所示，其中图A表示金黄色葡萄球菌N315与PBS共孵育，图B表示金黄色葡萄球菌N315与100μg/ml的V12CBD共孵育，图C表示金黄色葡萄球菌N315与200μg/ml的V12CBD共孵育,图D表示金黄色葡萄球菌N315与40000μg/ml的V12CBD共孵育。

结果显示，V12CBD蛋白能有效提高金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率，且V12CBD蛋白浓度越高，金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率越高。

实施例6、V12CBD增强巨噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌结果的验证

将巨噬细胞RAW264.7与不同浓度的V12CBD(0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)在37℃共培养24h，用PBS洗涤3次后加入带荧光染料标记的金黄色葡萄球菌与之共培养1h。PBS洗涤3次后，离心收集巨噬细胞，用流式细胞术检测巨噬细胞的荧光强度，所得到的结果如图5所示。

结果表明，用V12CBD蛋白刺激后的巨噬细胞具有更强的吞噬金黄色葡萄球菌的能力，表现为带荧光的细胞比例提高，且随着V12CBD蛋白的浓度提高，巨噬细胞吞噬金黄色葡萄球菌的能力越强。

实施例7、V12CBD增强巨噬细胞杀灭金黄色葡萄球菌结果的验证

将巨噬细胞RAW264.7与不同浓度的V12CBD(0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml)在37℃共培养24h，用PBS洗涤3次后加入金黄色葡萄球菌与之共培养4h。裂解细胞后涂平板计算每孔细菌数，所得到的结果如图6所示。

结果显示，被V12CBD蛋白刺激后的巨噬细胞中金黄色葡萄球菌存活率显著降低，且随着V12CBD蛋白浓度升高，噬细胞中金黄色葡萄球菌存活率降低越明显，因此，V12CBD蛋白能增强巨噬细胞杀灭金黄色葡萄球菌的能力。

实施例8、V12CBD诱导巨噬细胞细胞因子分泌结果的验证

将巨噬细胞RAW264.7与不同浓度的V12CBD(0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)在37℃分别共培养8小时和24小时，用PBS洗涤3次后裂解细胞，并提取细胞总RNA。用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测每组处理中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及iNOS mRNA的水平，并与同样条件下GAPDH的表达量作比较，所得到的结果如图7所示。

结果显示，V12CBD蛋白刺激巨噬细胞RAW264.7后的8小时，iNOS mRNA的表达量明显上调；而刺激24h后，IL-1β，IL-6，TNF-α以及iNOS mRNA的水平也均上调，表明V12CBD能刺激巨噬细胞分泌炎性细胞因子。

实施例9、V12CBD细胞毒性结果的验证

分别将Caco-2细胞和CHO细胞以每孔5×10³的浓度接种到96孔板中，培养24小时后，向孔板中添加不同浓度的V12CBD蛋白(0～1mg/mL)继续培养24小时。培养结束后，用CCK-8试剂盒检测每孔细胞的活力，并以没有加V12CBD蛋白的孔中细胞的活力作为对照计算细胞的相对活力，所得到的结果如图8所示。

结果显示，以没有加V12CBD蛋白的孔中细胞的活力作为对照时，0～1mg/mL的V12CBD蛋白均没有观察到明显的细胞毒性。

实施例10、V12CBD用于金黄色葡萄球菌感染小鼠治疗结果的验证

实验中所用小鼠为6周大的BALB/c雌性鼠。分别向15只实验小鼠腹腔注射2.5×10⁸金黄色葡萄球菌临床分离菌株T23。3小时后，将小鼠分为三组，每组5只。实验组小鼠腹腔分别注射6mg/kg、12mg/kg的V12CBD蛋白，对照组则注射等体积的PBS缓冲液。每天观测小鼠的存活率，所得到的结果如图9所示。

结果显示，V12CBD蛋白能有效提高金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率，且在一定范围内，V12CBD蛋白浓度越高，越有利于提高金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率。

实施例11、V12CBD预防性治疗金黄色葡萄球菌感染小鼠结果的验证

实验中所用小鼠为6周大的BALB/c雌性鼠。将实验小鼠随机分为两组，一组腹腔注射12mg/kg的V12CBD蛋白(14只)，另外一组腹腔注射等体积的PBS溶液。24h后，每组小鼠腹腔注射2×10⁸金黄色葡萄球菌临床分离菌株T23，每天观测小鼠的存活率，所得到的结果如图10所示。

结果显示，预防性注射一定浓度的V12CBD蛋白能有效提高金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率。

实施例12、包含有V12CBD片段的蛋白质Ply187N-V12C预防性治疗金黄色葡萄球菌感染小鼠结果的验证

由于单独的V12CBD蛋白质预防性注射具有很好的预防效果，我们进一步地试验了本实验室前期构建的一个融合有V12CBD片段蛋白质Ply187N-V12C(Construction ofachimeric lysin Ply187N-V12C withextended lytic activity againststaphylococciand streptococci,Microbial Biotechnology,2015,8(2):210-20)是否也能预防金黄色葡萄球菌的感染。该蛋白质前期研究只是报道了其在体外有直接杀金黄色葡萄球菌等菌的效果。

实验中所用小鼠为6周大的BALB/c雌性鼠。将实验小鼠随机分为两组，一组腹腔注射12mg/kg的Ply187N-V12C蛋白(5只)，另外一组腹腔注射等体积的PBS溶液。24h后，每组小鼠腹腔注射2×10⁸金黄色葡萄球菌临床分离菌株T23，每天观测小鼠的存活率，所得到的结果如图11所示。

结果显示，预防性注射一定浓度的包含有V12CBD片段的Ply187N-V12C蛋白也能有效提高金黄色葡萄球菌感染小鼠的存活率。

序列表

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

<120> V12CBD蛋白及其编码基因的一种新用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 507

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttaaacggtg gaagcactcc tccaaaacca aacactaaga aagtaaaagt acttaaacac 60

gctaccaact ggtctccatc aagtaaaggt gcaaaaatgg caagttttgt caaaggcggt 120

acatttgaag ttaaacaaca acgaccaatt tcttattctt actctaatca agaatacttg 180

attgtaaata aaggaacagt acttggatgg gttctttccc aagacattga aggtggatat 240

ggttcagata gagttggggg aagcaaacct aaactacctg ccggatttac gaaggaagaa 300

gctacgttta ttaatggtaa tgctcctatt actactcgta agaataaacc aagcttatct 360

tctcaaacag ctacaccatt gtatccggga caatctgtaa gataccttgg ttggaaatct 420

gctgagggat acatctggat ttatgcaaca gatggacgtt acatccctgt acgacctgta 480

ggtaaggaag catggggtac atttaag 507

<210> 2

<211> 169

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Asn Gly Gly Ser Thr Pro Pro Lys Pro Asn Thr Lys Lys Val Lys

1 5 10 15

Val Leu Lys His Ala Thr Asn Trp Ser Pro Ser Ser Lys Gly Ala Lys

20 25 30

Met Ala Ser Phe Val Lys Gly Gly Thr Phe Glu Val Lys Gln Gln Arg

35 40 45

Pro Ile Ser Tyr Ser Tyr Ser Asn Gln Glu Tyr Leu Ile Val Asn Lys

50 55 60

Gly Thr Val Leu Gly Trp Val Leu Ser Gln Asp Ile Glu Gly Gly Tyr

65 70 75 80

Gly Ser Asp Arg Val Gly Gly Ser Lys Pro Lys Leu Pro Ala Gly Phe

85 90 95

Thr Lys Glu Glu Ala Thr Phe Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ile Thr Thr

100 105 110

Arg Lys Asn Lys Pro Ser Leu Ser Ser Gln Thr Ala Thr Pro Leu Tyr

115 120 125

Pro Gly Gln Ser Val Arg Tyr Leu Gly Trp Lys Ser Ala Glu Gly Tyr

130 135 140

Ile Trp Ile Tyr Ala Thr Asp Gly Arg Tyr Ile Pro Val Arg Pro Val

145 150 155 160

Gly Lys Glu Ala Trp Gly Thr Phe Lys

165

Claims

1.肠球菌裂解酶PlyV12的细胞壁结合域V12CBD蛋白的新用途，其特征在于：所述V12CBD蛋白应用于制备治疗与预防葡萄球菌感染的药物，所述V12CBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的肠球菌裂解酶PlyV12的细胞壁结合域V12CBD蛋白的新用途，其特征在于：所述V12CBD蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的肠球菌裂解酶PlyV12的细胞壁结合域V12CBD蛋白的新用途，其特征在于：所述V12CBD蛋白通过提高宿主巨噬细胞杀菌能力来预防葡萄球菌感染。

4.根据权利要求1所述的肠球菌裂解酶PlyV12的细胞壁结合域V12CBD蛋白的新用途，其特征在于：所述V12CBD蛋白通过结合葡萄球菌来降低细菌毒力来治疗葡萄球菌感染。

5.根据权利要求1所述的肠球菌裂解酶PlyV12的细胞壁结合域V12CBD蛋白的新用途，其特征在于：所述V12CBD蛋白通过与噬菌体裂解酶催化域、抗菌肽和细菌抗原中的任一种或多种氨基酸片段融合成新的蛋白质来预防葡萄球菌感染。