CN105441469B - 重组昆虫蜕皮激素失活基因Bbsp::egt及其杀虫真菌剂 - Google Patents

重组昆虫蜕皮激素失活基因Bbsp::egt及其杀虫真菌剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组昆虫蜕皮激素失活基因Bbsp::egt及其杀虫真菌剂，其含有编码球孢白僵菌（Beauveria bassiana）几丁质酶的信号肽序列(Bbsp)与编码舞毒蛾核型多角体病毒（Lymantria dispar nuclepolyhedrovirus，以下简称LdMNPV）蜕化类固醇尿苷5’‑二磷酸‑葡糖基转移酶基因(egt)，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。采用分子生物学技术转入球孢白僵菌（Beauveria bassiana）中获得正确遗传转化菌株。本发明所获得的重组Bbsp::egt菌株可干扰昆虫体内激素系统正常运作，降低昆虫对杀虫真菌球孢白僵菌的免疫抵抗能力，加速真菌对宿主的击倒，从而提高杀虫真菌毒力。

Description

重组昆虫蜕皮激素失活基因Bbsp::egt及其杀虫真菌剂
技术领域
本发明涉及一种新的重组蜕化类固醇尿苷5’-二磷酸-葡糖基转移酶编码基因Bbsp::egt，具体地说含有编码球孢白僵菌（Beauveria bassiana）几丁质酶的信号肽（Bbsp）和编码舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV）蜕化类固醇尿苷5’-二磷酸-葡糖基转移酶基因(egt)的重组序列。
本发明涉及表达上述重组序列的真菌表达载体。
本发明还涉及表达上述重组载体的杀虫真菌剂。
背景技术
传统农业生产中频繁使用的DDT、除虫菊酯等化学杀虫剂大部分都会严重地改变生态系统结构，并对人体有害，甚至会集中在食物链中，对人类的健康产生潜在威胁。因此，在此背景下，对环境安全的生物杀虫剂受到人们越来越多的关注。真菌是控制自然界昆虫种群数量的主要因素，已被开发成为真菌杀虫剂，成为化学杀虫剂的重要补充。真菌杀虫剂具有对环境安全、可持续性强等优点。然而鉴于真菌杀虫活性的发挥需要一系列复杂的过程，真菌杀虫剂往往具有致死寄主速度慢，对环境条件要求高等缺点，严重制约了它农药市场的应用及推广（Harry C et al.,2014）。因此,如何提高这些生物杀虫剂的效率，并研究其作用机理已成为该领域的一个研究重点。
有研究表明，昆虫的生长发育及免疫反应受到体内蜕皮激素20E的调控。丛林等发现（丛林，2013），合成蜕皮激素的相关基因Nvd的突变，可造成幼虫取食停止，并在进入下一龄期前死亡；桔小实蝇突变体体内蜕皮激素的水平严重降低会导致胚胎后期的发育停滞，表皮不分化，头部不褪化，背合不全和后肠畸形环化甚至死亡。此外，20E也能提高昆虫的免疫或解毒能力。将外源20E处理6龄取食期棉铃虫，发现血细胞密度在处理12h后增加了2倍，细胞间的粘连作用增强，吞噬率提高了近15%（柴连琴，2015），暗示20E一定程度上参与了昆虫免疫反应的正调控。邹凤鸣（邹凤鸣，2010）发现，较高浓度20E处理家蚕后，体内参与内源性和外源性底物的解毒代谢的一类谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）表现出显著的上调表达，表明20E提高了昆虫的解毒能力。以上研究显示，蜕皮激素20E广泛参与了昆虫生长发育、免疫、解毒等生理生化反应，在体内滴度的降低可能导致昆虫的发育受阻或死亡。因此，如能在真菌侵染宿主的过程中降低昆虫体内20E水平，则可能会有助于真菌击倒宿主。来自LdMNPV病毒的egt基因产物能以昆虫蜕皮激素20E为底物，在其分子上添加糖基使20E失活，从而降低20E水平。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种重组昆虫蜕皮激素失活基因Bbsp:egt。
本发明还提供所述重组昆虫蜕皮激素失活基因Bbsp:egt应用于杀虫真菌剂，干扰宿主昆虫的相关激素水平，降低昆虫的免疫抵御能力，以此改良杀虫真菌球孢白僵菌的杀虫效力，解决昆虫病原真菌侵染效率低的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种重组昆虫蜕皮激素失活基因Bbsp:egt，其特征在于，含有一段融合基因，所述融合基因由来源于球孢白僵菌（Beauveria bassiana）编码几丁质酶的分泌型信号肽（Bbsp）基因与来源于舞毒蛾核型多角体病毒（Lymantria dispar nuclepolyhedrovirus，以下简称LdMNPV）编码蜕化类固醇尿苷5’-二磷酸-葡糖基转移酶的egt基因融合构成Bbsp::egt；融合基因Bbsp::egt具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
进一步，所述 Bbsp::egt的真菌表达载体构建方法，包括如下步骤：
1）Bbsp::egt基因的合成
在LdMNPV病毒egt基因前端加入一段球孢白僵菌（Beauveria bassiana）编码几丁质酶的信号肽（Bbsp）基因序列（N端31个氨基酸），两端分别添加Xba I酶切位点后人工合成Bbsp::egt片段，将Bbsp::egt片段克隆到puc57-simple载体后，筛选获得测序正确的克隆载体并将其命名为puc57-simple-Bbsp::egt；
2）Bbsp::egt真菌表达载体的构建
利用常规分子生物学方式将Bbsp::egt片段构建到超量表达载体puc-bar-Pgpda上；
首先Xba I单酶切puc57-simple-Bbsp::egt，获得约1.8kb的Bbsp::egt目标片段，克隆进经Xba I单酶切并去磷酸化处理的puc-bar-Pgpda线性化载体（约5.5kb）；重组载体转入大肠杆菌DH5α，以P1/P2为引物进行方向筛选（P1引物位于启动子Pgpda区域，P2引物位于Bbsp::egt内部，因而正向转化子扩增出约0.8kb片段，反之则无法形成扩增条带）后，获得puc-bar-Pgpda-Bbsp::egt重组表达载体,其上游含有一个真菌组成性启动子Pgpda，质粒图谱如图1所示。筛选方向所用引物序列如下：
P1: 5’-ACGCACCAGAGCTTCGTAGT- 3’
P2: 5’-TCCATTCCATCTCGAGCTTCA-3’
筛选所用PCR反应体系：5.0 μL 2×Taq mix，1μL模板(约30ng)，0.5 μL P1，0.5 μL P2，3.0 μL dH2O，总体积10 μL；
筛选所用PCR反应参数：95℃ (5min)； 30 circles: 95℃ (30sec), 56℃ (30min), 72℃ (1min)；72℃(5min)；
3）真菌的遗传转化及鉴定
芽孢子遗传转化参照Fan等人的方法（Fan et al.,2011）；以引物P1与P2进行PCR验证获得16个正向转化子，结果如图2；PCR反应体系：5.0 μL 2×Taq mix，1μL模板(约30ng)，0.5 μL P1，0.5 μL P2，3.0 μL dH2O，总体积10 μL；
PCR反应参数：95℃ (5min)； 30 circles: 95℃ (30sec), 56℃ (30 sec), 72℃ (1min)；72℃(5min)；
4）球孢白僵菌转化子中Bbsp::egt表达量的测定
为获得Bbsp::egt高水平表达的真菌转化子，无菌条件下接种各转化子于1/2SDY液体培养基，26℃摇床培养3天，抽滤取菌丝体提取RNA，经反转录合成cDNA（TaKaRa，PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser）,以此为模板进行 Real-time PCR。实验获得两个Bbsp::egt高水平表达转化子，分别命名为F1、F2（图3）。RT引物P3/P4序列如下:
P3: 5’-CACTCCGTCTTCGACAACAA-3’
P4: 5’-ACGTCGTAGGGCATCATCTT-3’
RT-PCR反应体系：5.0 μL Universal SYBR Green Supermix（Bio-RAD），4.0 μLcDNA，0.5 μL P3，0.5 μL P4，总体积10 μL；
RT-PCR反应参数：95℃ (3 min)； 36 circles: 95℃ (10sec), 56℃ (20sec),72℃ (20sec)。
本发明还提供一种杀虫真菌剂，含有一段融合基因Bbsp::egt，所述融合基因由来源于球孢白僵菌（Beauveria bassiana）编码几丁质酶的分泌型信号肽（Bbsp）基因与来源于舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV）的蜕皮激素失活基因egt融合构成，主要包含权利要求1或2所述的重组昆虫蜕皮激素失活基因。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明提供一种重组昆虫蜕皮激素失活基因Bbsp:egt，包含重组Bbsp::egt真菌表达载体，构建球孢白僵菌分泌型信号肽Bbsp与egt的融合基因，导入球孢白僵菌中组成性表达，实现基因的跨种结合，使真菌在侵染宿主的过程中打破激素分泌的平衡，干扰正常生理生化反应的正常运作，降低宿主昆虫对病原真菌的免疫抵御能力，提高真菌在宿主血腔中的增殖速度，从而增强真菌的杀虫效果。
进一步，将LdMNPV病毒egt基因与杀虫真菌球孢白僵菌相结合，可有效提高真菌生防制剂的防治效果，并有利于研究杀虫真菌的侵染致病机理，因此具有较强的理论与应用价值。
2、本发明中，egt参与了20E-EH-ETH的生长发育调节反应链。20E在昆虫的生长发育过程中扮演重要的角色，调节着昆虫的蜕皮、蛹化等过程。此外，20E还能促进生殖功能（Wu et al.，2006；Liu et al.，2009）、免疫反应等。有资料显示，20E处理后的6龄棉铃虫血细胞密度增加，细胞间的粘连作用增强，吞噬率提高约15%（柴连琴，2015）。egt基因的编码产物蜕化类固醇尿苷5’-二磷酸-葡糖基转移酶能失活20E。含有egt基因的杆状病毒能引起家蚕幼虫龄期延长，体躯肥大，直到停止就食后仍不能入眠的现象（王厚伟等，2000）。上述研究表明，egt可能通过抑制20E的活性，造成昆虫体内激素水平发生紊乱。据此，我们在真菌中导入融合基因Bbsp::egt，使真菌在侵染宿主的过程中，分泌egt编码蛋白，造成宿主激素水平紊乱，干扰宿主免疫反应，从而提高真菌的杀虫效果。通过该方法可获得高效的真菌杀虫剂，并为微生物农药的改良提供了新思路。
附图说明
图1 为本发明重组昆虫蜕皮激素失活基因Bbsp:egt的质粒图谱。
图2 为本发明Bbsp:egt的球孢白僵菌转化子菌丝PCR验证结果。
图3 为本发明Bbsp:egt各真菌转化子RT-PCR筛选结果。
图4 为本发明Bbsp:egt两真菌转化子的生物测定结果。
图5 为侵染4天后试虫抗菌相关基因表达情况。
图6 为试虫体内蜕皮激素20E的含量变化情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
本发明涉及一种重组昆虫蜕皮激素失活基因Bbsp:egt，所述基因由来源于编码球孢白僵菌（Beauveria bassiana）几丁质酶的分泌型信号肽（Bbsp）与来源于舞毒蛾核型多角体病毒（LdMNPV）编码蜕化类固醇尿苷5’-二磷酸-葡糖基转移酶的egt基因融合构成。其具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
另外，本发明还提供一种杀虫真菌转化菌株，本发明所构建的质粒载体可进行杀虫真菌遗传转化，获得可表达本发明重组蜕皮激素抑制子的杀虫真菌转化菌株，其中杀虫真菌可以是球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）、黄绿绿僵菌（Metarhizium flavoviride）、布氏白僵菌（Beauveria brongniartii）、玫烟色拟青霉（Paecilomyces fumosoroseus）、汤普森被毛孢（Hirsutella thompsonii）或粉拟青霉（Paecilomyces farinosus）等。本发明构建了球孢白僵菌转化菌株。
以下具体实施中，所用的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。
一、Bbsp::egt基因的合成及真菌表达载体构建
【实施例1】
1.Bbsp::egt基因的克隆合成
在LdMNPV病毒egt基因前端加入一段球孢白僵菌（Beauveria bassiana）几丁质酶的信号肽序列，两端分别添加Xba I酶切位点后人工合成，将Bbsp::egt克隆到puc57-simple载体后，获得测序正确的克隆载体并将其命名为puc57-simple-Bbsp::egt。
2.超量表达载体的构建
利用常规分子生物学方式将Bbsp::egt片段构建到超量表达载体puc-bar-Pgpda上。首先Xba I单酶切puc57-simple-Bbsp::egt，获得约1.8kb的Bbsp::egt目标片段，克隆进经Xba I单酶切并去磷酸化处理的puc-bar-Pgpda线性化载体（约5.5kb）。重组载体转入大肠杆菌DH5α，以P1/P2为引物进行方向筛选（P1引物位于启动子Pgpda区域，P2引物位于Bbsp::egt内部，因此正向转化子扩增出约0.8kb片段，反之则无法形成扩增条带）后，获得puc- bar-Pgpda-Bbsp::egt重组表达载体,其上游含有一个真菌组成性启动子Pgpda，质粒图谱如图1所示。筛选方向所用引物序列如下：
P1: 5’-ACGCACCAGAGCTTCGTAGT-3’
P2: 5’-TCCATTCCATCTCGAGCTTCA-3’
筛选所用PCR反应体系：5.0 μL 2×Taq mix，1μL模板(约30ng)，0.5 μL P1，0.5 μL P2，3.0 μL dH2O，总体积10 μL；
筛选所用PCR反应参数：95℃ (5min)； 30 circles: 95℃ (30sec), 56℃ (30min), 72℃ (1min)；72℃(5min)；
3．真菌遗传转化及鉴定
真菌的遗传转化参照Fan等人的方法（Fan et al.,2011）。以引物P1与P2进行PCR验证获得16个正向转化子，结果如图2。
PCR反应体系：5.0 μL 2×Taq mix，1μL模板(约30ng)，0.5 μL P1，0.5 μL P2，3.0μL dH2O，总体积10 μL；
PCR反应参数：95℃ (5min)； 30 circles: 95℃ (30sec), 56℃ (30 sec), 72℃ (1min)；72℃(5min)。
经上述步骤获得16个正向转化子，结果如图2。
4．Bbsp::egt表达量检测
为获得Bbsp::egt高水平表达的真菌转化子，无菌条件下接种各转化子于1/2SDY液体培养基，26℃摇床培养3天，抽滤取菌丝体提取RNA，经反转录合成cDNA（TaKaRa，PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser）,以此为模板进行 Real-time PCR。实验获得两个Bbsp::egt高水平表达转化子，分别命名为F1、F2（图3）。RT引物P3/P4序列如下:
P3: 5’-CACTCCGTCTTCGACAACAA-3’
P4: 5’-ACGTCGTAGGGCATCATCTT-3’
RT-PCR反应体系：5.0 μL Universal SYBR Green Supermix（Bio-RAD），4.0 μLcDNA，0.5 μL P3，0.5 μL P4，总体积10 μL；
RT-PCR反应参数：95℃ (3 min)； 36 circles: 95℃ (10sec), 56℃ (20sec),72℃ (20sec)。
二、转化子的毒力测定
【实施例2】
为阐明Bbsp::egt基因高水平表达对球孢白僵菌菌株毒力的影响，采用大蜡螟幼虫为试虫进行生物测定。将转化子F1、F2同野生型（wt）接种于PDA固体培养基，26℃恒温培养20天，刮取分生孢子分散于0.05%吐温80溶液中，制得浓度为2×107孢子/ml的孢悬液。大蜡螟每盘30只分装，每三盘为一组设为平行实验，未加入孢子的0.05%吐温80溶液为阴性对照。采用体壁侵染的方式接种真菌，即每30只试虫浸没于30ml孢悬液中，20s后取出控水6-7s。侵染结束后每12h统计试虫存活率。
经测定，发现Bbsp::egt转入后球孢白僵菌的毒力发生提升，半致死时间相对野生型（wt，LT50= 125.34h）分别缩短了21.7%（F1，LT50=98.172h）和12.1%（F2，LT50=110.124h），存活率趋势结果如图4所示。
三、昆虫血淋巴中抗菌相关基因表达水平的检测
【实施例3】
资料及前期实验的观察表明，Bbsp::egt参与昆虫的免疫调节。为阐明昆虫接种转化菌株后对病原菌的抵抗能力变化，选取七个昆虫抗菌相关基因进行表达水平的检测，分别是：Ferritin、Gallerimycin、Cecropin、Gloverin、GST、PGRP-A、PGRP-B, β-actin为内参基因。其中，PGRP-A、PGRP-B编码肽聚糖识别蛋白，这一类蛋白 可作为模式识别分子对入侵病原物的保守结构特异性识别，模式识别后，昆虫的免疫系统就会启动；Gallerimycin、Cecropin、Gloverin编码昆虫体内三种不同抗菌肽；Ferritin、GST分别编码铁蛋白和谷胱甘肽巯基转移酶，前者是一种铁离子储存和转运的蛋白质，参与昆虫免疫的黑化反应能产生一些醌及活性氧等有害物质，活性氧物质存在的情况下，游离的铁离子会产生毒性，而铁蛋白的出现能够将铁离子转运或储存，减弱对宿主昆虫的伤害，后者是一种有效清除活性氧的解毒酶，二者共同表征昆虫的解毒代谢能力。测试侵染后第4天试虫体内上述基因的表达情况。Real-time PCR反应体系及反应参数如下：
反应体系：5.0 μL Universal SYBR Green Supermix（Bio-RAD），4.0 μL cDNA，0.5 μL P3，0.5 μL P4，总体积10 μL；
反应参数：95℃ (3 min)； 36 circles: 95℃ (10sec), 56℃ (20sec), 72℃(20sec)。
免疫抗菌相关基因RT引物序列如下：
基因名称 序列 类型及参与反应
β-actin-F: 5’- ATCTGGCATCACACCTTCTACAACG- 3’ 内参基因
β-actin-R: 5’- GACATACATAGCCGGGGAGTTGAAG- 3’ 内参基因
Gallerimycin-F： 5’-TATCATTGGCCTTCTTGGCTG-3’ 抗菌肽
Gallerimycin-R： 5’-GCACTCGTAAAATACACATCCGG- 3’ 抗菌肽
Cecropin-F： 5’-ATTTGCCTGCATCGTAGCG-3’ 抗菌肽
Cecropin-R： 5’-CTTGTACTGCTGGACCAGCTTTT- 3’ 抗菌肽
Gloverin-F： 5’-ATGCACGGTCCTACAGCGATTC- 3’ 抗菌肽
Gloverin-R： 5’-GCCTTGTGCAGATATTTCGCCATT- 3’ 抗菌肽
Ferritin-F: 5’-CGGCTGAACGCAAGAACTACACAGT- 3’ 解毒代谢
Ferritin-R: 5’-ATGCTGACTGTTCCTGGTGGCTT-3’ 解毒代谢
GST-F： 5’-AGCGAGGGCTCTCAACCTAAATCTT-3’ 解毒代谢
GST-R： 5’-ATTCCCATAGGGAGAATCCATCGTC- 3’ 解毒代谢
PGRP-A-F： 5’-ACAAAAAGTCCTTGGGAATCGCAT-3’ 识别蛋白
PGRP-A-R： 5’- TCAGATGACCATTCTCAACACCACACT- 3’ 识别蛋白
PGRP-B-F： 5’- TCAGGTGAAACGCTCAATGATAGATGC- 3’ 识别蛋白
PGRP-B-R： 5’-TCTAAGTTCGCCAGTTGACGGTGT-3’ 识别蛋白
Real-time PCR结果如图5所示。由图可见，接种野生型后，各识别蛋白、解毒蛋白及抗菌肽的转录被激活而出现高表达，但接种Bbsp::egt转化子后，该类基因的激活及转录程度明显降低，证明Bbsp::egt抑制了试虫的免疫反应。
四、昆虫血淋巴中蜕皮激素含量的检测
【实施例4】
为分析外源基因Bbsp::egt是否可造成蜕皮激素20E的失活，以不同处理的试虫血淋巴为底物，利用ELISA双抗夹心的方法测定血淋巴中活性20E的含量，以表征转化子对试虫蜕皮激素的抑制作用。检测结果如图6。图中可见，与野生型菌株相比，试虫被Bbsp::egt转化子侵染后，体内活性蜕皮激素20E的含量出现下降趋势，证明Bbsp::egt可实现对试虫蜕皮激素20E的失活。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管申请人参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围的，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
<110> 西南大学；
<120> 重组昆虫蜕皮激素失活基因Bbsp::egt及其杀虫真菌剂；
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1776
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO.1核苷酸序列
<400> 1
atggctcctt ttcttcaaac cagcctcgcg ctccttccat tgttggcttc cactatggtc 60
agcgcctcgc ccttggcgcc gcgagccggc accatgagat cacgtttcga tcgtgctcca 120
aggaatgatg tcacgcctaa ggcttctggt cagcgtgtcc gtggcgaccc atctcctcgt 180
gctcgtggcc tatataaata tggtacgcgt ggtcgtcctt ctctcgttga cgattcgact 240
cgtcgtaacg acaccatgac cgcatatttg attgtttttt gtttgtgctg ctggtcggct 300
gctcgttccg ccaatatcct ggcctatttt cccaccccct cgtacagcca ccaattggtg 360
ttcagggctt acgtggaact gttggctgag cgtggccacg ccgtcacggt gatcaggcct 420
ctgacgcgtg tcgatttcaa tcgtaacgcc ggcaacttga ccacgattga tttggacgga 480
gacggcctgc tgcttttgat gaaggcttct acgacgcatc gtaagagagg catcgtcgct 540
gacacggaca cggtcaccgc tgacaactac gaagctctgg tgcgtatggt tgaccgtcag 600
attcactcgg agccctttca acgtcacctg aagagcgccc gtcgtggcta cgacctgctg 660
gtggtcgagg ctttcgtgga ctacgctctg atcgcttcgc acctgttcgg agacgtgccc 720
gtcgtgcaga tcagctcggg ccacgctacc gccgagaact ttgagacgat gggcgctacg 780
tctcgtcacc cccgttacta tcccaacctg tggcgtttca atttcggccc tctgagcgtg 840
tgggacggcg tgcgtgagct gtacaccgaa ctcaggcttc agcgtgagtt cggcctgctg 900
gctgatcgac aggacgcttt gctgaagcgt cgtttcggcc ctgaggctcc tggtctgcgt 960
gagttgcgtt cgcgtgtccg tctgctgttt gtgaacgtcc actccgtctt cgacaacaac 1020
cgtcctgtgc ctcctagcgt gcagtatttg ggcggtctgc atctgcacga tcgacgtgct 1080
gagcccctgt cggaggccgt ggcccgattc ttggacgagt cgcgtcgtgg agtcgtgtac 1140
gtcagcttcg gctcgggcct cgccacggag gacatggacg ctgacatggc tgctgctctg 1200
ctcgacgctt tcaagatgat gccctacgac gtgctgtgga agcacgacgg tcgtgtggac 1260
ggcttgacca ttcccgccaa cgtgttcgtc cagaaatggt tcgcccagtt cgaggtgctt 1320
cagcacaaaa acgtcaaggc cttcgtcacg caggctggcg tgcaatcgac ggacgaggct 1380
gtcgagaatc tggtgcctct cgtgggcgtg cctctcatgg gagaccaggc tttcaacgct 1440
caccgatacg tcgagctggg catcggcgtc gccctggacg ctacgcgtct caccgctgcc 1500
gacctggctc gtgccgtcga gcaggtgacc tcggaccgtg cctatcgaga gaacctggag 1560
cgtttgcgtc gtctgttgcg acaccagtgc gcttctccta cgcacaaggc tgtttggtac 1620
acggagcacg ctctgcgtcg tgacggcgac gccctcaaaa ccaaagctgc caacgtggac 1680
tacgccgagt attgcatgtc cgacttgttg gctcccctgc tgagcgtgtc gctcatgtct 1740
catctgcact cgctgattcg aatgttcgtt tggtga 1776
<210> 2
<211> 591
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO.2氨基酸序列
<400> 2
MAPFLQTSLA LLPLLASTMV SASPLAPRAG TMRSRFDRAP RNDVTPKASG QRVRGDPSPR 60
ARGLYKYGTR GRPSLVDDST RRNDTMTAYL IVFCLCCWSA ARSANILAYF PTPSYSHQLV 120
FRAYVELLAE RGHAVTVIRP LTRVDFNRNA GNLTTIDLDG DGLLLLMKAS TTHRKRGIVA 180
DTDTVTADNY EALVRMVDRQ IHSEPFQRHL KSARRGYDLL VVEAFVDYAL IASHLFGDVP 240
VVQISSGHAT AENFETMGAT SRHPRYYPNL WRFNFGPLSV WDGVRELYTE LRLQREFGLL 300
ADRQDALLKR RFGPEAPGLR ELRSRVRLLF VNVHSVFDNN RPVPPSVQYL GGLHLHDRRA 360
EPLSEAVARF LDESRRGVVY VSFGSGLATE DMDADMAAAL LDAFKMMPYD VLWKHDGRVD 420
GLTIPANVFV QKWFAQFEVL QHKNVKAFVT QAGVQSTDEA VENLVPLVGV PLMGDQAFNA 480
HRYVELGIGV ALDATRLTAA DLARAVEQVT SDRAYRENLE RLRRLLRHQC ASPTHKAVWY 540
TEHALRRDGD ALKTKAANVD YAEYCMSDLL APLLSVSLMS HLHSLIRMFV W 591
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P1引物
<400> 3
acgcaccaga gcttcgtagt 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2引物
<400> 4
tccattccat ctcgagcttc a 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P3引物
<400> 5
cactccgtct tcgacaacaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P4引物
<400> 6
acgtcgtagg gcatcatctt 20

Claims (2)

1.一种重组昆虫蜕皮激素失活基因Bbsp::egt，其特征在于，所述Bbsp::egt具有如SEQID NO. 1所示的核苷酸序列，并且编码如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，所述Bbsp::egt由来源于球孢白僵菌编码几丁质酶的分泌型信号肽基因与来源于舞毒蛾核型多角体病毒编码蜕化类固醇尿苷5’-二磷酸-葡糖基转移酶的基因融合构成。
2.一种杀虫真菌剂，其特征在于，有效成分为具有权利要求1所述重组昆虫蜕皮激素失活基因Bbsp::egt的球孢白僵菌。
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杀虫真菌的遗传改良策略;范艳华;《第四届全国微生物资源学术暨国家微生物资源平台运行服务研讨会论文集》;20121126;第32页，参见正文 *

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