CN104988170B - 一种融合抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种融合抗菌肽及其制备方法和应用，是将天蚕素抗菌肽B（cecropin B,CB）和鲎素抗菌肽tachyplesin I（TP I）串联构建了一种融合抗菌肽CB‑TP I，通过优化天蚕素抗菌肽CB基因与鲎素抗菌肽TP I基因，插入真菌特异性双T‑DNA安全表达载体中；转染真菌，生产融合抗菌肽的转基因菌丝，提取的融合抗菌肽抗菌能力有显著提高，用量少，不存在耐药性问题。生产的融合抗菌肽菌丝经过低温烘干，可直接制备成饲料添加剂，省略了蛋白质分离纯化过程，各批次间质量差异小、产量大、成本低。可以增加畜禽的抵抗力，减少抗生素的使用，具有广泛的社会效益和经济效益。

Description

一种融合抗菌肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种融合抗菌肽，具体涉及的是天蚕素抗菌肽B和鲎素抗菌肽TP I融合；其制备方法采用食药用菌菌丝体生物反应器生产融合抗菌肽CB-TP I，尤其涉及金针菇、平菇、灵芝和蛹虫草为制备真菌，属于基因工程和生物医药技术领域。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial Peptides)是生物体产生的一种具有强抗菌作用的阳离子多肽，是生物先天免疫系统的重要组成，它具有广谱性、高效性、稳定性等特点，其本身不易产生耐药性。它不仅具有杀菌作用，还能抑杀真菌、寄生虫、病毒以及肿瘤细胞，且对正常细胞毒性较小，因此，抗菌肽极有可能成为一种新的抗生素替代品。

天蚕素抗菌肽（cecropins）早在1980年就被发现，它是从蚕蛹中分离得到的第一个抗菌肽。目前，已经发现超过1700种抗菌肽，而天蚕素是研究最为清楚、效果最为明显的抗菌肽，是最具潜力的抗生素替代品之一。天蚕素利用N端所带的正电荷与原核细胞的细胞膜磷脂双分子层密集的负电荷静电相吸，C端柔性的插入疏水区，在两亲性α-螺旋的作用下，在原核细胞膜上形成4nm的离子通道，离子通道的形成改变了细胞膜内外的渗透压，细胞膜内物质大量外渗，致细菌细胞死亡，起到杀菌作用。有些天蚕素通过干扰信号传导通路而间接发生，影响病毒基因转录。天蚕素对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等主要致病菌有很强的杀灭作用。

鲎素是海洋节肢动物一鲎体内产生的一类抗菌蛋白，抗菌谱广，且具有很高的抑菌活性，在较低浓度下即可抑制革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的生长，但 Tachyplesin I对宿主的细胞无伤害作用。现已知道，鲎素抗菌作用机制是通过形成通道，选择性破坏细胞膜来杀灭细菌的，因而不易产生耐药性。实验研究发现，它对多种饲料有害微生物包括致病性和相对致病性饲料细菌、饲料霉菌等均有高效的杀菌作用，有望成为一种新型高效、环保的绿色添加剂应用于饲料的保鲜防腐。

生物反应器是利用转基因技术或代谢调控技术在生物个体生产高附加值蛋白质和代谢产物，或者改造植物某种功能成分使之更适于人类利用的一种生物制药和蛋白生产技术。其中，被称为“天然生物反应器”的植物表达体系正在引起工业和医学界越来越多的关注，目前已成为生产高附加值的口服疫苗、医用蛋白、单克隆抗体的重要途径，是国外生物产业的研发热点之一。但目前动植物生物反应器仍然存在转基因困难、生长周期长、分离纯化困难、成本高及因担心基因漂移而造成的环境释放困难等问题。食药用真菌生物反应器作为动植物生物反应器的完美补充，具有基因转化容易、生长周期短、无需在室外环境中释放等优点，是具有重要开发价值的生物反应器受体系统。

发明内容

本发明的目的是为提高抗菌肽的抗菌能力而提供一种融合抗菌肽。

一种融合抗菌肽基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

一种融合抗菌肽，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

一种表达载体pCB130NG-CB-TP I，它是：

1）用HindIII和EcoRI双酶切pCAMBIA1300载体，去除MCS区，经DNA聚合酶Klenow酶补平后，用T4连接酶连接形成中间载体pCB130-1；

2）在pCB130-1的SphI位点处引入SEQ ID NO.1所示的基因，包含左右边界序列和多克隆位点，构建成中间载体pCB130-2；

3）pCB130-2分别在PstI酶切位点处引入真菌特异性启动子GPD，在SacI与EcoRI酶切位点之间引入Nos终止子，构建成真菌特异性双T-DNA表达载体，命名为pCB130NG；

4）经Xbal和 SacI，在pCB130NG中插入SEQ ID NO.4所示的基因。

一种食药用真菌菌丝，它是将一种表达载体pCB130NG-CB-TP I，转染至食药用原生质中，用液体培养基培养菌丝，离心收集菌丝，烘干或冻干粉碎。

一种融合抗菌肽的生产方法，提取所述的一种食药用真菌菌丝总蛋白，将蛋白上清液直接加载His-tag亲和柱中，用50mM/L咪唑洗脱杂蛋白至1-2倍柱体积，再用100mM/L咪唑洗脱表达的融合蛋白，收集并浓缩融合抗菌肽CB-TP I，在23℃条件下孵育12小时进行肠激酶的酶切反应，利用截留分子量为10Kd以上的透析袋进行蛋白透析，将得到的透析液中的抗菌肽进行浓缩，得到纯化后的融合抗菌肽CB-TP I纯品。

一种食药用真菌菌丝在生产动物饲料抗菌及蛋白质添加剂中的应用。

本发明提供了一种融合抗菌肽及其制备方法和应用，是将天蚕素抗菌肽B（cecropin B, CB）和鲎素抗菌肽tachyplesin I（TP I）串联构建了一种融合抗菌肽CB-TPI，通过优化天蚕素抗菌肽CB基因与鲎素抗菌肽TP I基因，主要是适宜真菌表达的密码子偏爱性，设计合成了所述融合抗菌肽的DNA序列，并将其构建到真菌特异性双T-DNA安全表达载体中；利用PEG转化法转化食药用菌原生质体，这里涉及的真菌主要是金针菇、平菇、蛹虫草和灵芝，再生后，获得转基因的食药用真菌子实体；利用PCR筛选出只含目的基因而不含选择标记基因的子实体个体，培养至T2代，获得稳定表达融合抗菌肽CB-TP I基因的转基因食药用真菌。提取的融合抗菌肽抗菌能力有显著提高，用量少，不存在耐药性问题，通过转基因食药用真菌菌丝的发酵培养，制备产融合抗菌肽的转基因菌丝。利用本发明生产的融合抗菌肽菌丝经过低温烘干，可直接制备成饲料添加剂，省略了蛋白质分离纯化过程，各批次间质量差异小、产量大、成本低。本开发产品的应用，可以增加畜禽的抵抗力，减少抗生素的使用，具有广泛的社会效益和经济效益。

附图说明

图1真菌特异性双T-DNA安全表达载体pCB130NG示意图；

图2 pUC57-CB-TP I载体和pCB130NG载体酶切结果；

图3 pCB130NG-CB-TP I菌液PCR鉴定结果；

图4 转基因蛹虫草菌丝的PCR检测；

图5转基因蛹虫草的PCR检测。

具体实施方式

实施例1. 真菌特异性双T-DNA安全表达载体的构建

利用pCAMBIA1300载体作为基础载体，首先通过HindIII和EcoRI双酶切，去除MCS区，经DNA聚合酶Klenow酶补平后，用T4连接酶连接形成中间载体pCB130-1。接下来，通过基因合成技术在中间载体的SphI位点处引入一段序列（SEQ ID NO.1），包含左右边界序列和多克隆位点，构建成中间载体pCB130-2。在此载体基础上，通过PCR技术及酶切与连接方法，分别在PstI酶切位点处引入真菌特异性启动子GPD（SEQ ID NO.2），在SacI与EcoRI酶切位点之间引入Nos终止子（SEQ ID NO.3），构建成真菌特异性双T-DNA表达载体，命名为pCB130NG，该载体示意图见图1。

实施例2. 融合抗菌肽CB-TPI的设计

为了提高抗菌肽的抑菌活性，将天蚕素抗菌肽B（cecropin B, CB）和鲎素抗菌肽tachyplesin I（TP I）串联一起进行构建，并且将鲎素抗菌肽的C末端进行酰胺化处理；同时，为使两个抗菌肽表达后在空间上隔开，在两基因之间添加甘氨酸-脯氨酸Linker；为便于表达后的检测，在TP I基因的3’末端加上His标签。得到的融合抗菌肽CB-TP I的氨基酸序列为C序列。

实施例3. 融合抗菌肽CB-TPI真菌表达载体的构建

根据真菌对密码子的偏爱性，对融合抗菌肽的核苷酸序列进行密码子优化，利用人工合成方法将该序列(SEQ ID NO.3)插入到载体pUC57上，并在序列两端添加酶切位点Xbal和SacI。

将pUC57-CB-TP I载体和本研究组改造后的真菌特异性表达双T-DNA安全表达载体pCB130NG（图1），分别用Xbal和SacI酶切（图2），回收酶切产物后，经连接、转化、鉴定（图3），获得融合抗菌肽CB-TPI真菌表达载体pCB130NG-CB-TP I。

实施例4. 转CB-TPI基因蛹虫草子实体的获得

1.蛹虫草原生质体的提取与转化：

（1）蛹虫草菌丝体的培养：将蛹虫草菌丝体于优化的固体PDA培养基培养9天，然后再接种于150mL液体PDA培养基，26-28℃、100-130r/min，250mL摇瓶振荡暗培养4天，直至长成生长量较多、大小均匀、状态良好的菌丝球。

（2）原生质体的制备：用0.6mol/L的甘露醇配制混合酶液，即溶壁酶和蜗牛酶复合添加，总量为3.0-4.0%，比例为1:1；按照菌丝体重量：酶液=1:6-10的比例酶解菌丝，酶解温度为34℃，酶解时间2.5-4小时；以无菌脱脂棉过滤除去残余蛹虫草菌丝体，5000g离心10min，收集原生质体。

（3）蛹虫草原生质体转化：将原生质体浓度调节到1-5×10⁷个/ml，载体质粒的添加量为25-30µg，混合均匀后，置于冰上5-10min后，加入30µl PEG 缓冲液（25% PEG4000，50mmol/L CaCl₂，10mmol/L Tris-HCl，pH7.5），冰浴15-20min，再加入250µl PEG 缓冲液，室温放置20min，加入1ml的MYG培养液，1000g离心5min，弃掉上清液，用1ml MYG培养液回溶原生质体。

2. 蛹虫草阳性转化菌丝的筛选和鉴定：

（1）蛹虫草阳性转化菌丝的筛选：经转化后的原生质体，在MYG培养液中培养5天后，均匀涂布于含有15-25mg/L潮霉素的MYG固体平板上，生长7天后，抗性转化子即可长出。继续培养抗性转化子，菌丝直径长到2cm左右时，将单个菌落接种到新的抗性PDA固体平板上（含有15-25mg/L潮霉素），培养至菌丝长满板。

（2）蛹虫草抗性转化菌丝的DNA提取：收集阳性转化菌丝，按照DNA提取试剂盒(爱思进生产)操作说明，提取抗性菌丝的基因组DNA。

（3）蛹虫草阳性转化子的鉴定：以抗性菌丝基因组DNA为模板，CB-TP I基因5’端序列（TCTAGAATGCGCTGGAAGATCT）和3’端序列（GAGCTCTTAGTGGTGGTGATGG）为引物，退火温度选择58℃，设计PCR反应。反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出目的基因条带的菌丝，即为转基因阳性转化子（图4）。

3.转基因蛹虫草子实体的筛选和获得：

（1）配制瓶料及接种：培养阳性转化菌丝作为菌种，配制蛹虫草培养料（大米45g，营养液45ml，营养液配方/L：蔗糖30g，蛋白胨150 g，硫酸镁0.5g ，磷酸二氢钾1.5g ，维生素B1 0.015 g，2,4-D 0.002 g），灭菌接种后，进行发菌和子实体培养管理。

（2）发菌：发菌温度控制在20-23℃，黑暗培养，持续15d左右，菌丝即可吃透培养料，完成营养生长。

（3）子实体培养：菌丝体成熟后，由白色逐渐转为桔黄色，此时，室内应增加光照，白天利用自然散射光，保持200勒克斯，晚间可利用日光灯作光源，每天应不少于10h光照，以促使菌丝体转色和刺激原基形成。待料面突起，并形成小米粒状原基时，要适当通风，补充新鲜空气，保持室内温度18℃-22℃，并提高空气相对温度至80%-85%。如湿度太大，易使培养基提早失水而影响产量。蛹虫草有较强的趋光性，因此在子实体形成后，应根据情况适当调整培养瓶与光源的相对方向，或调整室内光源方向，以保证子实体的正常生长形态，从而提高产量，形成橘黄色或橘红色的顶部略膨大的呈棒状的子座(子实体)。待子实体不再生长，其顶端出现许多小刺时，表明已成熟。

（4）筛选：采取蛹虫草子实体提取基因组DNA，使用PCR技术筛选出只含有目的基因而无筛选标记的转基因蛹虫草（图5）。继续培养至T2代。

实施例5. 转基因蛹虫草菌丝的发酵培养

发酵培养获得重组融合抗菌肽CB-TP I：以筛选获得的转基因蛹虫草为母种，培养制得转基因蛹虫草菌丝作为发酵菌种，用PDA液体培养基为发酵液，按照菌种：发酵液=1:100的比例接种，发酵温度为28℃，大量制备蛹虫草菌丝体。离心收集蛹虫草菌丝体，离心力为1000g，将所获菌丝体低温烘干，即得到可饲的重组融合抗菌肽CB-TP I。

实施例6. 融合抗菌肽的活性检测

用转CB-TP I基因菌丝作为材料，提取总蛋白。将蛋白上清液直接加载在His-tag亲和柱中，用50mM/L咪唑洗脱杂蛋白至1-2倍柱体积，再用100mM/L咪唑洗脱表达的融合蛋白，收集并浓缩融合抗菌肽CB-TP I。

将上述获得的融合蛋白在23℃条件下孵育12小时进行肠激酶的酶切反应，添加酶量为每毫克融合蛋白加入2-3单位的肠激酶。利用截留分子量为10Kd以上的透析袋进行蛋白透析，将得到的透析液中的抗菌肽进行浓缩，得到纯化后的融合抗菌肽CB-TP I纯品。

采用平板稀释法测定抗菌肽的最小抑菌浓度（MIC），所设计的融合抗菌肽CB-TP I对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有体外抑菌活性，且抑菌活性较单独的天蚕素B和鲎素都有显著提高（表1）。

<110> 吉林农业大学

<120> 一种融合抗菌肽及其制备方法和应用

<160> 4

<210> 1

<211> 103

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

gtaaacctaa gagaaaagag cgtttaaagc ttctgcaggt cgactctaga ggatccccgg 60

gtaccgagct cgaattctgg caggatatat tgtggtgtaa aca 103

<210> 2

<211> 913

<212> DNA

<213> 人工

<400> 2

cgttcgtgac tcgcaatatc agtgcataat tgatgtctat caccgcagac acattcccta 60

cacgcaaccg catccctcga cattgaaccc cgtcgcatca tattctccgt cccttccatt 120

tacttcctcg atctcaatat agttctcgat gacgctgaat tcgttgccct caagggtctt 180

cgagccttcg acgtcgacaa tgcacgcgca gaatggagtg tgcgtaaaca tactttgact 240

atctactgtt aaccgctgta tggcttgaga cgtgtacaca ctgctgctct ctctcatatc 300

aaaggacttc tataaataga tctcaaccag tggcaaccgt tcttcaaatg tcatattttg 360

gtacgctgga gcagagtctc ttgtgcctgc actccgcacc accgacctcc tgatcgaatc 420

tcgagtacct cgatatcgag atggccgtgt gctacgacct tttccattac tccgtcaggc 480

tgtctacgat gtgtatcacg atatgggttg ggcctggggt tcaagttcca ctgttgaacc 540

agtgccccca tgttacctct ggaatcgtta tctcggtggt gtctgcgggg atatattcag 600

tgcgctaaaa acggaataca gctcgtctcc gtcttcctct cgggtcaaag ttacaaagaa 660

aggtggctaa atgtctggac atgaggtatt tgcatgacga aacgtctcca ctctcggagg 720

gttggcgcct aacaggatcg gctcacacaa ctgctgacaa gctagatctt gagtgagctt 780

ctaagctttt acacgacgat tacggcgagt cggtcctgtc cttctcatga agcgtgggac 840

tttcacgata tggcggtatt gatcatctaa tcacgccgtc ctatataaac ccctgcctcc 900

tctttcaccc gca 913

<210> 3

<211> 256

<212> DNA

<213> 人工

<400> 3

gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60

atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120

atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180

gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240

atgttactag atcggg 256

<210> 4

<211> 195

<212> DNA

<213> 人工

<400> 4

atgcgctgga agatcttcaa gaagatcgag aagatgggcc gcaacatccg cgacggcatc 60

gtcaaggccg gtcctgccat cgaggtcctc ggttccgcca aggccatcgg ccctggccct 120

aagtggtgct tccgcgtctg ctaccgcggc atctgctacc gccgttgccg caatcaccac 180

catcaccacc actaa 195

<210> 1

<211> 64

<212> PRT

<213> 人工

<400> 1

Met Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile

5 10 15

Arg Asp Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile Glu Val Leu Gly Ser

20 25 30

Ala Lys Ala Ile Gly Pro Gly Pro Lys Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr

35 40 45

Arg Gly Ile Cys Tyr Arg Arg Cys Arg Asn His His His His His His

50 55 60 64

Claims (6)

1.一种融合抗菌肽基因，它的碱基序列如序列表SEQ ID NO.4所示。

2.一种融合抗菌肽，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示。

3. 一种表达载体pCB130NG-CB-TP I，它是：

1）用HindIII和EcoRI双酶切pCAMBIA1300载体，去除MCS区，经DNA聚合酶Klenow酶补平后，用T4连接酶连接形成中间载体pCB130-1；

2）在pCB130-1的SphI位点处引入SEQ ID NO.1所示的基因，包含左右边界序列和多克隆位点，构建成中间载体pCB130-2；

3）pCB130-2分别在PstI酶切位点处引入真菌特异性启动子GPD，在SacI与EcoRI酶切位点之间引入Nos终止子，构建成真菌特异性双T-DNA表达载体，命名为pCB130NG；

4）经Xbal和 SacI酶切，在pCB130NG中插入SEQ ID NO.4所示的基因。

4.一种食药用真菌菌丝，它是将权利要求3所述的一种表达载体pCB130NG-CB-TP I，转染至食药用真菌原生质中，用液体培养基培养菌丝，离心收集菌丝，烘干或冻干粉碎。

5.一种融合抗菌肽的生产方法，提取权利要求4所述的一种食药用真菌菌丝总蛋白；将蛋白上清液直接加载His-tag亲和柱中，用50mM/L咪唑洗脱杂蛋白至1-2倍柱体积，再用100mM/L咪唑洗脱表达的融合蛋白，收集并浓缩融合抗菌肽CB-TP I，在23℃条件下孵育12小时进行肠激酶的酶切反应，利用截留分子量为10Kd以上的透析袋进行蛋白透析，将得到的透析液中的抗菌肽进行浓缩，得到纯化后的融合抗菌肽CB-TP I纯品。

6.权利要求4所述的一种食药用真菌菌丝在生产动物饲料抗菌添加剂中的应用。