CN103555756A

CN103555756A - 一种利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法

Info

Publication number: CN103555756A
Application number: CN201310521629.6A
Authority: CN
Inventors: 查向东; 马利娟; 赵大伟; 余忠丽; 车媛媛; 徐雪娇
Original assignee: HUBEI XIPU BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HUBEI XIPU BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-10-29
Filing date: 2013-10-29
Publication date: 2014-02-05

Abstract

本发明公开了一种利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，包括如下步骤：（1）提供抗菌肽LfcinB基因序列，α信号肽基因序列；（2）构建酵母细胞中表达抗菌肽LfcinB的重组质粒pYES2-α-LfcinB；（3）重组质粒pYES2-α-LfcinB转化酿酒酵母INVSC1细胞；（4）筛选转化菌，鉴定；（5）培养转化菌，获得抗菌肽LfcinB；（6）抗菌肽LfcinB的鉴定。本发明方法所表达的抗菌肽对大肠杆菌DH5α ，和枯草芽孢杆菌有明显的抑菌效果。

Description

一种利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程领域，涉及酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法。

背景技术

目前，由于抗生素在临床中被大量使用，产生严重的耐药性问题。人类急需新型的药物来代替抗生素，抗菌肽是一类小分子两亲性多肽，长度一般小于50个氨基酸。来源于自然界中的各种细菌、植物和动物，分布广泛。因其抗菌机理独特，不易产生耐药性，并且有水溶性好，热稳定性强，抗菌谱广，有望成为传统抗生素的替代品。牛乳铁蛋白肽LfcinB是牛乳铁蛋白经胃蛋白酶作用后从N-末端释放的大小为25个残基组成的结构域，是近年来发现的一种新型抗菌肽，具备抗病毒、抗肿瘤、抗氧化和调节机体的免疫和提高肠道对铁离子的吸收等作用，其抗菌活性比乳铁蛋白高400多倍，具有重要的应用价值。LfcinB来源于动物本身，氨基酸序列为FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF，其中不含稀有氨基酸和外源化学成分，是一种健康安全的产品，LfeinB具有营养生理调节作用，提高幼龄动物的免疫机能，改善动物肠道微生态环境，促进动物健康的作用，它不会使细菌产生抗药性，也不会残留于畜产品中，具有替代抗生素的巨大潜能。其具有传统抗生素没有的作用效果。

抗菌肽的表达体系目前有以下几个来源。天然抗菌肽虽然来源广泛，但是在生物体内产量小，难于分离纯化，成本高。化学合成抗菌肽虽然周期短、工程量小、能随意组合氨基酸残基，但存在消旋化问题，并且生产成本昂贵。基因工程技术主要通过原核表达和真核表达途径，具有操作简单，易于分离和纯化，且生产成本低等特点，使其具有规模化、产业化生产的潜力，成为近些年来的研究热点。

原核表达体系以大肠杆菌表达体系为主，是目前掌握最为成熟的表达系统，其优点是生长周期短，表达产量较高，成本相对低廉。但表达抗菌肽具有以下缺点：原核表达需破碎细胞释放抗菌肽，增加了生产成本和分离纯化的难度；其持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，添加融合头融合表达虽然能够减少毒性，但需切割融合头，步骤繁琐；原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。

酵母表达系统既有原核生物生长快、操作简单的优点，又有真核生物对蛋白质进行翻译后修饰的优点。酿酒酵母遗传背景清楚，易操作；酿酒酵母与日常生活密切，安全，无毒素，对生物和环境不会构成威胁；可进行蛋白翻译后加工；可进行分泌表达，易于纯化；工艺简单成本较低等特点。目前未见大量关于酿酒酵母分泌表达抗菌肽的报道，本方法对抗菌肽的真核表达研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，包括以下步骤：

（1) 提供抗菌肽LfcinB基因序列，α信号肽基因序列；

（2) 构建酵母细胞中表达抗菌肽LfcinB的重组质粒pYES2-α-LfcinB；

（3) 重组质粒pYES2-α-LfcinB转化酿酒酵母INVSC1细胞；

（4) 筛选转化菌，鉴定；

（5) 培养转化菌，获得抗菌肽LfcinB；

（6) 抗菌肽LfcinB的鉴定。

所述步骤（1）中，所述的抗菌肽LfcinB基因序列如SEQ ID NO:2所示。

所述步骤（1）中，所述的α信号肽基因序列是以质粒pPICZαA中α信号肽为模板，以F2：5′CCCAAGCTTACGATGAGATTTCCTTCAAT3′（SEQ ID NO:5）和R2：5′GCTCTAGA GAATTC AGCTTCAGCCTCTCTT3′（SEQ ID NO:6）为引物PCR获得。

所述步骤（3）中，重组质粒转化方法是电转化法，采用Bio-red公司电转化仪预设PIC程序。

所述步骤（4）中，筛选转化菌方法是用酵母尿嘧啶缺陷型最小合成培养基平板培养的方法筛选。

所述步骤（5）中，培养条件为30℃，200rpm/min，7-9天。

所述步骤（5）中，所述的抗菌肽LfcinB存在于培养酵母菌INVSC1的菌液上清。

所述步骤（6）中，所述的抗菌肽LfcinB的鉴定方法是Tricine-SDS-PAGE。

本发明的有益效果在于：1）通过酿酒酵母分泌表达获得抗菌肽LfcinB；2）表达的抗菌肽对大肠杆菌DH5α，和枯草芽孢杆菌有明显的抑菌效果。

附图说明

图1为重组质粒pYES2-α-LfcinB的构建过程示意图。

图2为α-factor基因的PCR产物的电泳图，其中，泳道M为DNA Marker D （2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp），泳道1为α-factor的PCR产物。

图3为抗菌肽LfcinB基因的PCR产物的电泳图，其中，泳道M为DNA Marker D （2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp），泳道1为抗菌肽LfcinB的PCR产物。

图4为工程菌诱导上清Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中，泳道M为Protein Marker（66kDa，45kDa，35kDa，27kDa，20kDa，14.4kDa，9.5kDa，6.5kDa，4.1kDa），泳道1为诱导上清25ul，泳道2为未诱导上清25ul。

图5为工程菌诱导上清对大肠杆菌DH5α和枯草芽孢杆菌活性检测图，其中，5A中培养皿上的菌株为大肠杆菌DH5α，5B中培养皿上的菌株为枯草芽孢杆菌，图中1为10ug 氨苄青霉素，2为工程菌诱导96 200ul上清，3为工程菌未诱导96h 200ul上清，4 无菌ddH₂O。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，但并不局限于此，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，如无特殊说明，通常按照常规方法操作，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社) ，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例中所用大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α，枯草芽孢杆菌为本实验室保存。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）INVSc1购自Invitrogen公司。pYES2表达载体购自Invitrogen公司。pPICZαA表达载体（Invitrogen公司）为本实验室保存。

实施例：

1. 抗菌肽LfcinB序列的获得：

抗菌肽LfcinB氨基酸序列为：FKCRRWQWRMKK LGA PSITCVRRAF（SEQ ID NO:1），依照酿酒酵母密码子偏好性，优化后的碱基序列：TTTAAATGTAGAAGATGGCAATGGAGAATGAAAAAATTGGGTGCTCCATCTATTACT TGTGTTAGAAGAGCTTTT（SEQ ID NO:2），设计模板和上下游引物。

引物和模板序列如下：

LfcinB F1：5’ CCGCTCGAGAAAAGATTTAAATGTAG 3’ （SEQ ID NO:3），

LfcinB R1：3’ GGAATTCTTAAAAAGCTCTTCTAACACAAG 5’ （SEQ ID NO:4）。

LfcinB模板：5’TTTAAATGTAGAAGATGGCAATGGAGAATGAAAAAATTGGGTGCTCCATCTATTACT TGTGTTAGAAGAGCTTTT3’（SEQ ID NO:2）。

上游引入Xho I限制性酶切位点，下游引入EcoR I限制性酶切位点。

PCR扩增抗菌肽LfcinB基因，PCR反应条件：94℃ 5min，94℃ 30s ～62℃ 30s - 72℃ 1min，30个循环，72℃ 10min。1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。扩增产物经回收纯化后-20℃保存备用。

2. α信号肽序列的获得：

以本实验室保存的pPICZαA质粒为模板，设计上下游引物；

F2：5′CCCAAGCTTACGATGAGATTTCCTTCAAT3′（SEQ ID NO:5）

R2：5′GCTCTAGA GAATTC AGCTTCAGCCTCTCTT3′（SEQ ID NO:6）

上游引入Hind III限制性酶切位点，下游部分引入Xba I和EcoR I限制性酶切位点,同时为了避免信号肽切割不完全的现象出现，去除了Ste13切割位点，仅保留Kex2切割位点。

PCR扩增α信号肽：PCR反应条件：94℃ 5min，94℃ 30s - 60℃ 30s - 72℃ 1min，30个循环，72℃ 10min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。扩增产物经回收纯化后-20℃保存备用。

3. 分泌表达载体pYES2 – α的构建：

将pYES2质粒和PCR扩增后回收的α信号肽进行Hind III和Xba I双酶切反应，产物经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，T4连接酶，16℃ 1h进行连接反应后，转化大肠杆菌DH5α菌株，转化菌落经菌液PCR鉴定后测序验证。

4. 分泌表达型重组质粒pYES2- α -LfcinB的构建

将抗菌肽LfcinB PCR回收产物与pYES2-α表达载体进行Xho I和EcoR I双酶切反应，产物经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，T4连接酶，16℃，1h进行连接反应后，转化大肠杆菌DH5α菌株，转化菌落经菌液PCR鉴定后测序验证。

5. 重组质粒pYES2- α - LfcinB转化酿酒酵母INVSc1

(1)制备酿酒酵母INVSc1感受态细胞

①接种30 μl酿酒酵母INVSc1冻存甘油菌至3 ml YPD液体培养基中，30℃，200 rpm，过夜震荡活化。

②转接500 μl过夜活化的酿酒酵母INVSc1菌液到50 mlYPD液体培养基中，30℃，200 rpm，震荡培养至OD₆₀₀为1.1左右。

③4℃、1500 g、5 min，离心收集细胞，用50 ml预冷的无菌水轻轻吹吸悬浮细胞。

④4℃、1500 g、5 min，离心，用25 ml预冷的无菌水悬浮细胞。

⑤4℃、1500 g、5 min，离心，用25 ml预冷的山梨醇轻轻吹吸悬浮细胞。

⑥4℃、1500 g、5 min，离心，用2 ml预冷的山梨醇悬浮细胞。

⑦4℃、1500 g、5 min，离心，用200 μl预冷的山梨醇悬浮细胞，分装到两管2 ml的EP管中，每管100 μl。

(2) 转化pYES2 – α -LfcinB质粒质粒到酿酒酵母INVSc1感受态细胞中:

①吸取10 μl pYES2 – α - LfcinB质粒加入到100 μl酿酒酵母INVSc1感受态细胞中，混合均匀，加至预冷的电击杯中。

②冰上放置5 min。

③根据电击仪推荐的酿酒酵母参数设置，进行点击。

④立即向电击杯中加入500 μl预冷的山梨醇溶液，混合均匀。

⑤全部吸出均匀涂于SC- U平板。

⑥置于30℃恒温培养箱中，直至长出单克隆。

(3)菌落PCR反应筛选阳性菌落。从SC- U平板上选5个单菌落做编号标记，用枪头挑取少量菌体加到PCR体系中，PCR反应条件：94℃ 5min，94℃ 30s - 62℃ 30s - 72℃ 1min，30个循环，72℃ 10min。1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，筛选出阳性菌落。

6. 抗菌肽LfcinB酿酒酵母工程菌的表达：

(1)诱导工程菌表达重组LfcinB结构域，具体步骤如下：

①转接200 μl 抗菌肽LfcinB酿酒酵母工程菌至20 ml SC- U液体培养基中， 30℃，200 rpm，过夜活化。

②测量菌液的OD₆₀₀值（Y），按公式X=(Y*20)/0.4，计算将菌液的OD₆₀₀稀释到0.4所需的SC- U诱导培养基量（X）。

③4℃、1500×g、离心5 min，弃上清，按第二步中计算出的X值加入SC- U诱导培养基，吹吸悬浮，混合均匀。

④30℃， 200 rpm，振荡培养7-9天。取1 ml菌液，4℃、1500×g、离心5 min，留上清。

(2)丙酮沉淀浓缩重组LfcinB结构域，具体步骤如下：

①取1 ml上清加入5 ml -20℃预冷的丙酮。

②静置-20℃冰箱中2 h。

③4℃，12000 rpm，离心10 min，轻轻弃去上清。

④沉淀置于通风处自然风干。

(3) Tricine – SDS - PAGE电泳检测表达结果.

7. 抗菌肽LfcinB结构域的活性检测：

E.coli DH5α和枯草芽孢杆菌于37℃，180 rpm，过夜培养。测菌液的OD₆₀₀值，将其稀释到0.5个麦氏单位（1.5×10⁸CFU/ml）。

吸取200 μl菌液，均匀涂布于没有抗生素的LB平板上，轻轻放置牛津杯。

吸取诱导上清200ul加入牛津杯中，对照为无菌水、SC-U诱导培养基、未诱导上清、AMP，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，次日观察抑菌效果。由图5可见，本发明表达的抗菌肽对大肠杆菌DH5α，和枯草芽孢杆菌有明显的抑菌效果。

<110> 湖北希普生物科技有限公司

<120> 一种利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu Gly Ala Pro

1 5 10 15

Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe

20 25

<210> 2

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tttaaatgta gaagatggca atggagaatg aaaaaattgg gtgctccatc tattacttgt 60

gttagaagag ctttt 75

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgctcgaga aaagatttaa atgtag 26

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggaattctta aaaagctctt ctaacacaag 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccaagctta cgatgagatt tccttcaat 29

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctctagaga attcagcttc agcctctctt 30

Claims

1.一种利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，包括以下步骤：

（1）提供抗菌肽LfcinB基因序列，α信号肽基因序列；

（2）构建酵母细胞中表达抗菌肽LfcinB的重组质粒pYES2-α-LfcinB；

（3）重组质粒pYES2-α-LfcinB转化酿酒酵母INVSC1细胞；

（4）筛选转化菌，鉴定；

（5）培养转化菌，获得抗菌肽LfcinB；

（6）抗菌肽LfcinB的鉴定。

2.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述的抗菌肽LfcinB基因序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，其特征在于所述步骤（1）中，所述的α信号肽基因序列是以质粒pPICZαA中α信号肽为模板，以F2：5′CCCAAGCTTACGATGAGATTTCCTTCAAT3′（SEQ ID NO:5）和R2：5′GCTCTAGA GAATTC AGCTTCAGCCTCTCTT3′（SEQ ID NO:6）为引物PCR获得。

4.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，其特征在于所述步骤（3）中，重组质粒转化方法是电转化法，采用Bio-red公司电转化仪预设PIC程序。

5.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，其特征在于所述步骤（4）中，筛选转化菌方法是用酵母尿嘧啶缺陷型最小合成培养基平板培养的方法筛选。

6.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，其特征在于所述步骤e中，培养条件为30℃，200rpm/min，7-9天。

7.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，其特征在于所述步骤（5）中，所述的抗菌肽LfcinB存在于培养酵母菌INVSC1的菌液上清。

8.根据权利要求1所述的利用酿酒酵母分泌表达抗菌肽LfcinB的方法，其特征在于所述步骤（6）中，所述的抗菌肽LfcinB的鉴定方法是Tricine-SDS-PAGE。