CN103320461A - 在Pichia pastoris中组成型表达靶向抗菌肽AgPlectasin的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达靶向抗菌肽AgPlectasin的方法。本发明利用GAP启动子替换载体pPICAgPlectasin中的AOX启动子，构建组成型重组表达载体pGAPAgPlectasin并转化毕赤酵母X-33，获得的重组酵母经发酵培养，能够分泌产生AgPlectasin。本发明首次实现靶向抗菌肽AgPlectasin在毕赤酵母中组成型表达，经120小时培养后发酵液中总蛋白浓度达到532.4mg/L；发酵液上清经G25脱盐和SP离子交换层析后能够得到目标产物纯品，产量为118.37mg/L；经Genetools分析其纯度为93.27%。抑菌实验表明AgPlectasin对金黄色葡萄球菌ATCC标准菌株有很强抑制作用，AgPlectasin的MIC介于0.09-1.47μM。本发明所述方法获得的AgPlectasin可应用于抗菌药物、食品添加剂、化妆品、饲料添加剂等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。

Description

在Pichia pastoris中组成型表达靶向抗菌肽AgPlectasin的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及利用组成型启动子P_GAP在重组毕赤酵母中高效表达靶向抗菌肽AgPlectasin的方法。

背景技术

菌丝霉素Plectasin是Mygind研究组利用从欧洲北部松林中分离出的腐生子囊类真菌Pseudoplectania nigrella构建cDNA文库，通过BLASTX和SSEARCHp序列相似性搜索程序，筛查到的具有高效抗G⁺菌活性抗菌肽。Plectasin基因编码含有95个氨基酸残基的多肽序列，其1-23是信号肽序列，24-55位为前导肽序列，56-95位为成熟肽（Plectasin）序列。Plectasin理论分子量为4407.9Da，具有六个组氨酸（His）和五个赖氨酸（Lys），在不同pH环境中，由于组氨酸解离状态不同，Plectasin的净电荷数在+1到+3之间变化(Mygind等，Plectasin is a peptide antibiotic with therapeutic potential from asaprophytic fungus.Nature,2005,437(7061):975-980)。

Plectasin对革兰氏阳性细菌具有强烈杀伤作用。Mygind等研究了Plectasin对130余株不同来源肺炎链球菌的抑制作用，发现对于青霉素敏感或抗性菌株，最小杀菌浓度（MIC）均在0.028-1.818μM之间，MIC₅₀为0.227μM。Gottlieb等（2008）研究Plectasin对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）杀菌能力，MIC值介于0.227和7.273μM，MIC₅₀为1.82μM(Gottlieb等，Antimicrobial peptides effectively kill abroad spectrum of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureusstrains independently of origin,sub-type,or virulence factor expression.BMC Microbiol,2008,8(1):205-214)。此外，Novozymes以Plectasin为母体，经易错PCR构建突变文库，从274个突变体中筛选到抗菌性能大幅提高的突变体NZ2114，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）临床分离菌株平均MIC仅为0.227μM，并且对耐万古霉素肠球菌（VRSA）也具有很强的抑制作用，MIC值仅为0.455-0.91μM。此外，杀菌动力学实验证明，Plectasin具有高效杀菌能力，5×MIC Plectasin在5h内能够杀灭99.9%供试病原菌。小鼠腹腔感染模型显示，10mg/kgPlectasin5h内杀菌效率相当于70mg/kg万古霉素，腹腔中病原菌数量减少3个数量级（相当于99.9%杀菌效率）。7天后对照组小鼠全部死亡，按10mg/kg Plectasin给药的小鼠存活率依给药频度不同介于80-100%。NZ2114在兔心内膜炎感染模型中的治疗效果也得到相似结论，10mg/kg NZ2114即可大于或等于15mg/kg万古霉素或12mg/kg达托霉素疗效，3天后相关脏器（肾脏，脾脏）中病原菌的数量减少99%以上(Xiong等，Efficacy of NZ2114,a novel plectasin-derived cationicantimicrobial peptide antibiotic,in experimental endocarditis due tomethicillin-resistant Staphylococcus aureus.Antimicrobial Agents andChemotherapy,2011,55(11):5325-5330)。

中国农业科学院饲料研究所基因工程室结合菌丝霉素（Plectasin）高效杀菌能力和金黄色葡萄球菌信息素AgrD特异性设计靶向抗菌肽AgPlectasin并已实现在毕赤酵母中的甲醇诱导分泌表达和纯化。靶向性实验表明，重组靶向抗菌肽AgPlectasin（rAgP）金黄色葡萄球菌ATCC标准菌株MIC在0.09μM到1.47μM之间，对其它类型供试菌株如表皮葡萄球菌、地衣芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌和乳酸链球菌等均未表现出明显抑制作用，MIC值大于23.66μM。进一步针对临床分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）实验结果表明：rAgP对20株临床分离MRSA菌株具有很强抑制作用，MIC值在0.37μM到2.96μM之间，其中MIC₅₀为0.74μM，效果与万古霉素（MIC₅₀：0.67μM）相当；rAgP MBC值为MIC值的1-2倍，在0.37μM到2.96μM之间。杀菌动力学研究显示在MH培养基中，2×或4×MIC rAgP能够使S.aures ATCC25923和ATCC43300活菌数量显著下降，10小时杀菌效率超过99%；rAgP在人体血液中杀菌效果与MH培养基中效果相似，4×MIC rAgP10小时内能够导致目标病原菌S.aures ATCC25923数量（Log₁₀CFU/mL）由4.253降低至0.954；S.aures ATCC43300数量由4.196下降至1.611，杀菌效率超过99%，并且不出现病原菌再次生长的翘尾效应。此外，rAgP溶血性与母体抗菌肽Plectasin相比未发生明显改变，浓度高达512μg/mL rAgP仅造成1.1%人血红细胞发生溶血，生物安全性好(Mao等，Design,expression,and characterization of a novel targetedplectasin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.AppliedMicrobiology and Biotechnology,2013,97:3991-4002)。以上特点使得rAgP具有开发成为新一代靶向药物的潜力。

毕赤酵母表达系统因具有分泌表达、易于培养、拥有真核生物蛋白修饰系统等优势成为目前使用广泛的异源蛋白表达系统(Li等，Expression of recombinant proteins in Pichia pastoris.AppliedBiochemistry and Biotechnology,2007,142(2):105-124)。但是，目前常用的甲醇脱氢酶启动子（PAOX）在表达目标产物时需添加具有生物安全性争议性的甲醇。3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子（PGAP）是一种组成型启动子，文献报道异源蛋白分泌效率与AOX启动子相当(Waterham等，Isolation of the Pichia pastorisglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and useof its promoter.Gene,1997,186(1):37-44)，具有目的基因伴随细胞生长表达，不需进行诱导(Tang等，Pichia pastoris fermentation forphytase production using crude glycerol from biodiesel production as thesole carbon source.Biochemical Engineering Journal,2009,43(2):157-162)；表达过程中不存在碳源阻遏效应(Cos等，Operationalstrategies,monitoring and control of heterologous protein production inthe methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters:Areview.Microbial Cell Factories,2006,517-37)；适合进行连续发酵生产(Potvin等，Bioprocess engineering aspects of heterologous proteinproduction in Pichia pastoris:A review.Biochemical Engineering Journal,2012,64(0):91-105)等特点。

ApPlectasin是具有理想抗菌活性的菌丝霉素衍生物，尚未见到利用毕赤酵母GAP启动子组成型表达ApPlectasin的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用GAP启动子组成型表达靶向抗菌肽AgPlectasin的方法。

为实现本发明目的，本发明提供了一种表达载体，其含有毕赤酵母组成型启动子GAP、位于启动子下游的编码信号肽的核苷酸序列、编码靶向抗菌肽AgPlectasin的基因序列和TAA，TAG终止子序列，所述编码靶向抗菌肽DNA序列5’端具有酵母Kex2切割识别序列AAGAGA。

其中，所述靶向抗菌肽AgPlectasin为将金黄色葡萄球菌信息素序列AgrD连接至菌丝霉素Plectasin N-端，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。

优选地，所述编码靶向抗菌肽AgPlectasin的基因序列按照酵母密码子偏爱性进行优化，具有如SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列。

毕赤酵母组成型启动子GAP的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。

前述表达载体中，在编码信号肽的核苷酸序列的3’端连接有XhoI酶切位点；在编码靶向抗菌肽AgPlectasin DNA序列的3’端连接有NotI酶切位点。

前述表达载体中，载体所用信号肽为α-因子分泌信号肽（α-MF），酿酒酵母转化酶信号肽（SUC2），毕赤酵母碱性磷酸酶信号肽（PHO1）或所需表达基因自身信号肽序列。

前述表达载体中，载体所利用Kex2切割位点氨基酸信息为KR，或在Kex2切割位点N/C-端添加EAEA及其相似序列。

优选地，所述载体为重组表达载体pGAPAgPlectasin，其构建方法包括如下步骤：

（1）设计并合成如下基因片段：在甘油醛3’-磷酸脱氢酶启动子(GAP启动子)序列5’端添加酶切位点BglII，在3’端依次添加α-因子分泌信号肽序列和XhoI酶切位点；

（2）用限制性内切酶BglII和XhoI分别对合成的基因片段和载体pUC57进行双酶切，回收pUC57载体片段和GAP启动子+α-因子分泌信号肽片段，连接，得到载体pUCGAP；

（3）用限制性内切酶BglII和XhoI分别对载体pUCGAP和pPICAgPlectasin进行双酶切，回收pPICAgPlectasin载体片段和GAP启动子+α-因子分泌信号肽片段，连接，得到含有GAP启动子+α-因子分泌信号肽序列的AgPlectasin重组表达载体pGAPAgPlectasin。

步骤（1）中，合成的基因片段，其核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。

本发明还提供了含有上述重组表达载体的宿主细胞。

优选地，所述宿主细胞为酵母属细胞；进一步优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母基因工程菌；最优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母X-33基因工程菌。

其中，所述宿主细胞含有分泌通路因子（如Bip,PDI,Sec63,YDJ1p,Ssa1p等）共表达系统。

本发明还提供了重组毕赤酵母X-33基因工程菌PichiapastorisX-33/GAPAgP，其通过如下方法构建：将重组表达载体pGAPAgPlectasin用限制性内切酶AvrII作线性化处理，然后转化毕赤酵母X-33，获得重组毕赤酵母X-33基因工程菌。

本发明进一步提供了一种在重组毕赤酵母中表达靶向抗菌肽AgPlectasin的方法，其是将获得的重组毕赤酵母PichiapastorisX-33/GAPAgP发酵培养，分泌产生靶向抗菌肽AgPlectasin。

所述发酵培养的方法为转化子摇瓶水平组成型表达培养或转化子发酵罐高密度组成型表达培养。

其中，转化子摇瓶水平组成型表达培养的方法如下：

挑取阳性转化子（重组毕赤酵母Pichia pastorisX-33/GAPAgP），接种至YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养18-20h；0.5-1%接种量转接至50mL YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养1d后，以4层灭菌纱布替换玻璃纸封口膜包裹摇瓶口，30℃，250rpm振荡培养3-5d至发酵结束。

其中，转化子发酵罐高密度组成型表达培养的方法如下：

（1）种子液的制备及接种上罐

挑取阳性转化子（重组毕赤酵母Pichia pastorisX-33/GAPAgP），接种至含100μg/mL Zeocin的YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养18-20h；0.5-1%接种量转接至YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养至OD600为4-6，火焰保护下接种至SARTORIUS发酵罐中（含基础盐培养基，其中PMT1终浓度为4.8‰）；维持发酵罐转速800rpm，pH5.0，通气量8L/min，溶氧维持于20%以上，培养温度29℃；

（2）菌体的补料生长和产物的组成型表达

观测溶氧值缓慢下降（18-20h）后突然上升，调整发酵液pH值为5.5，转速为1000rpm并开始补加含有12‰PMT1的50%葡萄糖，补加过程由0h的1mL L^-1h^-1线性增加到6h的3-3.5mL L^-1h^-1，直至5天后发酵结束。

其中，步骤（1）中使用的基础盐培养基配方为：45g/L葡萄糖、50g/L NH₄H₂PO₄、20g/L K₂SO₄、15g/L MgSO₄7H₂O、6g/L KH₂PO₄、0.4g/L CaSO₄和1.5g/L KOH。

本发明还提供了由上述基因工程菌分泌的靶向抗菌肽AgPlectasin的纯化方法，其包括对发酵液进行脱盐、冷冻干燥、复溶、离子交换层析等步骤。

具体地，靶向抗菌肽AgPlectasin的纯化方法包括如下步骤：

（1）G25除盐

收集发酵上清液，冻干后去离子水复溶，Bradford法测定蛋白浓度，4℃，13000rpm离心5min后取上清；在AKTA上用脱盐柱Sephadex G-25进行除盐，上样量4mL，流速8mL/min，除盐后冻干；

（2）阳离子交换层析纯化

Bradford法测定蛋白浓度，4℃，13000rpm离心5min后取上清；将HiTrap SP FF阳离子交换柱利用磷酸盐缓冲液A液平衡5-10个柱体积后上样，上样量为500μL；进样完毕后，利用含有1M NaCl的50mM，pH5.7的磷酸盐洗脱缓冲液B液进行梯度洗脱；

洗脱步骤为：70%A液，30%B液，洗脱5个柱体积；40%A液，60%B液，洗脱5个柱体积；100%B液，洗脱5个柱体积；利用UV215nm监测洗脱情况并收集洗脱峰。

本发明还提供了由所述方法纯化获得的靶向抗菌肽AgPlectasin在制备抗菌药物、食品添加剂、化妆品、饲料添加剂中的应用。

本发明还提供了一种利用GAP启动子在毕赤酵母中组成型表达重组靶向抗菌肽AgPlectasin的方法。本发明利用GAP启动子替换载体pPICAgPlectasin中的AOX启动子，构建组成型重组表达载体pGAPAgPlectasin并转化毕赤酵母X-33；获得的重组酵母经发酵培养，能够分泌产生AgPlectasin。

本发明首次实现靶向抗菌肽AgPlectasin在毕赤酵母中组成型表达，产物随菌体生长而积累，经120小时培养后发酵液中总蛋白浓度达到532.4mg/L，可实现规模化生产；发酵液上清经G25脱盐和SP离子交换层析后能够得到目标产物纯品，产量为118.37mg/L；经Genetools分析其纯度为93.27%。抑菌实验表明AgPlectasin对金黄色葡萄球菌ATCC标准菌株有很强抑制作用。AgPlectasin的MIC介于0.09-1.47μM。本发明所述方法获得的靶向抗菌肽AgPlectasin可应用于抗菌药物、食品添加剂、化妆品、饲料添加剂等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中重组表达载体pGAPAgPlectasin示意图。

图2为本发明实施例1中含有pGAPAgPlectasin的大肠杆菌DH5α重组子菌落PCR电泳图，其中，M:DNA分子量Marker；1-10：含有pGAPAgPlectasin的大肠杆菌重组子。

图3为本发明实施例2中线性化重组表达载体电泳图，其中，M:DNA marker;1-4：pGAPAgPlectasin线性化产物。

图4为本发明实施例2中基因组中整合有pGAPAgPlectasin的重组酵母菌落PCR电泳图，其中，M:DNA Marker，1-5：含有pGAPAgPlectasin的毕赤酵母X-33重组子。

图5为本发明实施例3中AgPlectasin摇瓶水平组成型表达Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中，M：超低分子量蛋白Marker；1-5：不同阳性转化子诱导96小时发酵液上清；6：空载体诱导96小时发酵液上清。

图6为本发明实施例4中发酵罐水平组成型表达AgPlectasin的Tricine-SDS-PAGE检测，M：超低分子量蛋白Marker；1-8：10μL培养0，24，48，72，84，96，108，120小时的发酵液上清。

图7为本发明实施例4中发酵罐水平组成型表达AgPlectasin的抑菌活性检测，1-11：30μL培养0，12，24，36，48，60，72，84，96，108，120小时的发酵液上清；供试菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923。

图8为本发明实施例4中发酵罐水平组成型表达AgPlectasin菌体湿重和发酵液上清总蛋白浓度曲线。

图9为本发明实施例5中AgPlectasin的分离纯化，M：超低分子量蛋白Marker；1-3：10μL纯化后AgPlectasin。

图10为本发明实施例5中AgPlectasin纯化后的MALDI-TOFMS分析。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring HarborLaboratory Press,1989）。

以下实施例中使用的酶和试剂：限制性内切酶、pfuDNA聚合酶、T4DNA连接酶等分别购自Biolabs、Invitrogen和Promega公司。四种dNTP购自Promega公司。DNA和蛋白质分子量标准为Biolabs产品。其它常规试剂采用进口分装或国产分析纯。

以下实施例中涉及的培养基和缓冲液配方：

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸提取物5g/L，NaCl10g/L；固体LB培养基则加入2%的琼脂糖。

低盐LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸提取物5g/L，NaCl5g/L；固体低盐LB培养基则加入2%的琼脂粉。

MH培养基：酪蛋白水解物17.5g/L，牛肉浸粉5g/L，淀粉1.5g/L。

MHA培养基：固体MH培养基则加入2%的琼脂粉。

YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸提取物10g/L，葡萄糖20g/L；固体YPD培养基则加入2%琼脂粉。

YPDS培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸提取物10g/L，山梨醇182.2g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L。

有关LB培养基、低盐LB、MH、YPD、YPDS等培养基的使用参照Invitrogen毕赤酵母操作手册。

20mM磷酸盐缓冲液（A液）：0.465g Na₂HPO₄，2.917g NaH₂PO₄，加去离子水至950mL，置于磁力搅拌器至完全溶解后调pH5.7，定容至1000mL。

1M NaCl20mM磷酸盐缓冲液（B液）：0.465g Na₂HPO₄，2.917g NaH₂PO₄，58.44g NaCl，加去离子水至950mL，置于磁力搅拌器至完全溶解后调pH5.7，定容至1000mL。

以下实施例中涉及的基因扩增及转化子鉴定方法为PCR法及DNA测序法。

以下实施例中涉及的蛋白检测方法为Tricine-SDS-PAGE，参照(

H.Tricine–SDS-PAGE.Nat protoc,2006,1(1):16-22)。

以下实施例中涉及的蛋白质浓度测定方法为考马斯亮蓝法。

以下实施例中涉及的蛋白分子量的确定方法为MALDI-TOFMS法。

以下实施例中涉及的蛋白纯化的方法为基于离子层析法。

以下实施例中涉及的发酵方法为高密度发酵法。

以下实施例中涉及的菌种和质粒见表1：其中，重组载体pPICAgPlectasin为中国农业科学院饲料研究所基因工程室构建并参见发表文章(Mao等，Design,expression,and characterization of anovel targeted plectasin against methicillin-resistant Staphylococcusaureus.Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97:3991-4002)。

表1供试菌种和质粒

实施例1毕赤酵母组成型表达载体pGAPAgPlectasin的构建

（1）设计并合成如下基因片段：依据Invitrogen公司提供的甘油醛3’-磷酸脱氢酶启动子(GAP)序列，分别在序列5’端添加酶切位点BglII，在3’端依次添加α-因子分泌信号肽序列和XhoI酶切位点，将设计的基因序列送交上海生工生物工程有限公司合成，合成的基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，GAP启动子序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示；

（2）用限制性内切酶BglII和XhoI分别对合成的基因片段和载体pUC57进行双酶切，回收pUC57载体片段和GAP启动子+α-因子分泌信号肽片段，连接，得到载体pUCGAP；

（3）用限制性内切酶BglII和XhoI分别对载体pUCGAP和pPICAgPlectasin进行双酶切，回收pPICAgPlectasin载体片段和GAP启动子+α-因子分泌信号肽片段，连接，得到含有GAP启动子+α-因子分泌信号肽序列的AgPlectasin重组表达载体pGAPAgPlectasin，载体主要信息如图1所示。

重组载体pPICAgPlectasin为中国农业科学院饲料研究所基因工程室构建并参见发表文章(Mao等，Design, expression, andcharacterization of a novel targeted plectasin against methicillin-resistantStaphylococcus aureus. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013,97: 3991 -4002)。

载体pGAPAgPlectasin详细构建过程：利用限制性内切酶BglII和XhoI分别对pUCGAP和pPICAgPlectasin进行双酶切，酶切体系和条件如下：

以上酶切体系加样完毕后于37℃反应3个小时，2%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件：120 V，30 min。电泳完毕在紫外灯下利用手术刀分别切割pPICAgPlectasin载体片段与GAP启动子+α-因子分泌信号肽片段对应电泳条带并利用天根生物技术有限公司胶回收试剂盒进行DNA片段回收，按试剂盒提供说明书的相关细节进行操作。

利用琼脂糖凝胶电泳检测回收片段并使用定量软件（GeneTools）进行初步定量，按照片段/载体（3:1）的摩尔比例使用T4 DNA连接酶进行连接，体系和条件如下：

以上连接体系加样完毕后于金属浴22℃反应2小时，转化E.coliDH5α。转化操作细节如下：

1）连接产物加入100 μL E.coli DH5α感受态细胞，冰浴30 min；

2）42℃热激90 s，立即冰浴2-3 min；

3）加入900 μL 37℃预热的LB低盐培养基，37℃，80-100 rpm恢复培养1 h；

4）5000 rpm离心2 min，吸去700 μL上清；

5）重悬菌体后取100-200 μL涂布含有25 μg/mL Zeocin的LB低盐固体培养基；

6）37℃倒置培养12-16 h。

挑取阳性转化子，根据GAP启动子和AgPlectasin序列设计引物，进行菌液PCR验证转化子正确性，引物序列、PCR体系、条件如下：

引物序列：GAPF: AGATCTTTTTTGTAGAAATGTCTTG（SEQIDNo.5）

GAPR: GCGGCCGCCTATTAGTAACACTTAC（SEQ IDNo.6）

PCR体系：

PCR条件：

2%琼脂糖凝胶电泳检测阳性转化子菌液PCR产物，电泳条件：120V，30min。15%甘油管保存含有重组表达载体的E.coli并提取质粒为线性化电转P. pastoris准备，相关实验细节按照质粒提取试剂盒（天根生物科技有限公司）说明书操作。

PCR扩增结果显示在700-900 bp左右处出现目的条带（图2），与理论大小(759 bp)相符合。挑取阳性转化子进一步测序验证，将序列信息与设计相符的重组载体命名为pGAPAgPlectasin。

实施例2含pGAPAgPlectasin重组酵母菌株的构建

2.1重组载体pGAPAgPlectasin的线性化

利用AvrII对组成型重组表达载体pGAPAgPlectasin进行酶切，酶切体系和反应条件如下：

以上酶切体系加样完毕后于37℃反应3个小时，2%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件：120V，30min。电泳完毕检测重组表达载体正确线性化后利用DNA回收试剂盒回收线性化的重组表达载体pGAPAgPlectasin。

电泳结果显示，重组载体线性化效果好（图3），几乎不存在未切割载体和星号活性，大小在5000bp与3000bp之间，与理论大小（3224bp）相符。

2.2线性化载体的毕赤酵母电转化与鉴定

1）挑取YPD平板上的X-33单菌落，接种至10mL YPD液体培养基，30℃，250rpm，过夜培养；

2）取50μL过夜培养液接种至100mL YPD液体培养基，30℃，250rpm，培养至OD₆₀₀吸光值为1.2；

3）50mL培养物，4℃，4000rpm，5min离心后加入50mL无菌水重悬；

4）4℃，4000rpm，5min离心后加入25mL无菌水重悬；

5）4℃，4000rpm，5min离心后加入2mL1M山梨醇重悬；

6）4℃，4000rpm，5min离心后加入100μL1M山梨醇重悬后即为X-33感受态细胞（以上6步操作须在冰上操作，动作轻柔）；

7）预混80μL X-33感受态细胞和5-10μg线性化载体，转移至冰上预冷的0.2cm电转杯中，冰上放置5min后电转仪操作（1200V，25μF，400Ω）；

8）立即加入1mL1M山梨醇，混匀；

9）30℃温育1-2h；

10）取100μL温育后的X-33细胞涂布含有100μg/mL Zeocin的YPDS平板，30℃倒置培养2-4天。

挑取YPDS平板上的单菌落接种至100μg/mL Zeocin的YPD液体培养基中，30℃，250rpm，过夜培养。取1mL过夜培养物4℃，12000rpm，5min离心后PBS重悬，沸水浴10min，快速放置于-70℃30 min，立即再次沸水浴10 min，4℃，12000 rpm，5 min离心后取上清作为模板进行PCR验证阳性转化子，PCR体系与条件如下：

PCR体系：

PCR条件：

2%琼脂糖凝胶电泳检测阳性转化子菌液PCR产物，电泳条件：120V，30min。将大小正确的阳性转化子一一对应转移至含有100μg/mL Zeocin的YPD平板上以备进一步表达。

结果显示，转化子阳性克隆率高，重组酵母PCR条带大小在700-900bp左右（图4），均与理论大小（759 bp）相符，表明目的基因已整合到酵母基因组中，获得重组酵母PichiapastorisX-33/GAPAgP。

实施例3摇瓶水平组成型表达AgPlectasin重组酵母菌株筛选

3.1转化子摇瓶水平组成型表达

挑取阳性转化子，接种至YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养18-20h；0.5-1%接种量转接至50mL YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养1天后，以4层灭菌纱布替换玻璃纸封口膜包裹摇瓶口，30℃，250rpm振荡培养3-5天至发酵结束。

3.2重组酵母发酵液抗菌活性检测

抑菌圈实验分析(Zhang等，Expression of plectasin in Pichiapastoris and its characterization as a new antimicrobial peptide againstStaphyloccocus and Streptococcus.Protein Expression and Purification,2011,78(2):189-196)被用来检测重组酵母发酵液抗金黄色葡萄球菌活性。S.aureus ATCC25923作为受试菌。挑取S.aureusATCC25923单菌落接种于10mLMH培养基中，37℃，250rpm培养OD600nm=0.4，1%接种量转移至50mLMH培养基中，混匀，迅速倒19cm×19cm的方形培养皿中，待凝固后，在培养基表面小心放置牛津杯，加入50μL发酵液上清。

3.3重组酵母发酵液抗菌效价检测

二倍稀释法，将样品用无菌水进行二倍梯度稀释，每个稀释梯度取10μL点至已接种S.aureus ATCC25923的MHA平板，能够形成明显抑菌圈的最高稀释度的倒数为一个rAgP效价单位，样品的rAgP效价为：稀释度×100，单位为AU/mL(O’Keeffe等，Characterization and heterologous expression of the genes encodingenterocin a production,immunity,and regulation inenterococcusfaecium DPC1146.Applied and Environmental Microbiology,1999,65(4):1506-1515；Liu等，Controlling Listeria monocytogenes i nCottage cheese through heterologous production of enterocin A byLactococcus lactis.Journal of Applied Microbiology,2008,104(4):1059-1066)。

3.4重组酵母分泌蛋白水平Tricine-SDS-PAGE检测

对所获得的高活性重组酵母菌株进一步采用Tricine-SDS-PAGE分析重组AgPlectasin表达水平，电泳方法参照(

,2006)。

电泳结果显示，培养重组酵母Pichia pastorisX-33/GAPAgP能够组成型分泌表达目标蛋白AgPlectasin，条带大小在4.6-10kDa（图5），与理论大小（5.4kDa）相符。空载体对照在此处未发现条带（图5），发酵液中最高总蛋白浓度为117.3mg/L，效价为4800AU/mL。

实施例4发酵罐水平高密度发酵表达重组AgPlectasin

1）种子液的制备及接种上罐

挑取阳性转化子，接种至含100μg/mL Zeocin的YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养18-20h；0.5-1%接种量转接至YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养至OD₆₀₀为4-6，火焰保护下接种至SARTORIUS发酵罐中（含基础盐培养基，PMT1终浓度为4.8‰）。维持发酵罐转速800rpm，pH5.0，通气量8L/min，溶氧维持于20%以上，培养温度29℃。

基础盐培养基配方为：45g/L葡萄糖、50g/L NH₄H₂PO₄、20g/LK₂SO₄、15g/L MgSO₄7H₂O、6g/L KH₂PO₄、0.4g/L CaSO₄和1.5g/LKOH。

2）菌体的补料生长和产物的组成型表达

观测溶氧值缓慢下降（约18-20h）后突然上升，调整发酵液pH值为5.5，转速为1000rpm并开始补加含有12‰PMT1的50%葡萄糖，补加过程由0h的1mL L^-1h^-1线性增加到6h的3-3.5mL L^-1h^-1，直至5天后发酵结束。发酵液上清抗菌活性、抗菌效价和重组蛋白分泌水平检测按实施例3.2、3.3和3.4操作。

从接种开始，每隔12h取样，检测菌体湿重和蛋白表达情况分析，及抗菌活性分析。图6为5L发酵罐水平组成型表达AgPlectasin的Tricine-SDS-PAGE检测。图7为5L发酵罐水平组成型表达AgPlectasin的抑菌活性检测。图8为5L发酵罐水平组成型表达AgPlectasin菌体湿重和发酵液上清总蛋白浓度曲线。结果显示随着菌体持续生长（120h达到最大值300.45g/L），发酵液上清抑菌能力逐步增强（图7），抑菌效价在120小时达到最大值19200AU/mL。目的蛋白AgPlectasin持续大量表达并积累（图6箭头所示），发酵液中总蛋白浓度也持续上升，96h达到最大值532.4mg/L（图8）。

实施例5重组AgPlectasin的纯化

1）G25除盐

收集发酵上清液，冻干后去离子水复溶，Bradford法测定蛋白浓度，4℃，13000rpm离心5min后取上清。在AKTA上用脱盐柱Sephadex G-25（Bed volume，53ml；GE Healthcare）进行除盐，上样量4mL，流速8mL/min，除盐后冻干。

2）阳离子交换层析纯化

Bradford法测定蛋白浓度，4℃，13000rpm离心5min后取上清。将HiTrap SP FF阳离子交换柱（长度25mm，内径7mm，GEHealthcare）利用A液平衡5-10个柱体积后上样，上样量为500μL。进样完毕后，利用含有1M NaCl的50mM，pH5.7的磷酸盐洗脱缓冲液（B液）进行梯度洗脱。洗脱步骤为：70%A液，30%B液，洗脱5个柱体积；40%A液，60%B液，洗脱5个柱体积；100%B液，洗脱5个柱体积。利用UV215nm监测洗脱情况并收集洗脱峰，Tricine-SDS-PAGE和抑菌圈实验检测rAgP纯化情况。

如图9所示，经G25脱盐和SP阳离子纯化后，能够得到具有单一条带的AgPlectasin纯品，产量为118.37mg/L。经Genetools分析纯度为93.27%。

图10为MALDI-TOF MS分析纯化后AgPlectasin分子量。如图10所示，AgPlectasin组成型表达发酵液上清纯化后分子量为5411.0Da，与理论分子量（5411.2Da）相符。

实施例6重组AgPlectasin抗金黄色葡萄球菌活性检测

6.1MIC实验

重组AgPlectasin和万古霉素对病原菌的最小抑菌浓度（MIC）参照Tian等（Tian等，Expression of antimicrobial peptide LH multimersin Escherichia coli C43(DE3).Applied Microbiology and Biotechnology,2009,83(1):143-149）建立的微量肉汤稀释法，根据具有情况略有改动，操作细节如下：

1）挑取供试菌株（S.aures ATCC25923，S.aures ATCC6538，S.aures ATCC29213，S.aures ATCC43300）单克隆至MH培养基，37℃，250rpm，振荡过夜培养；

2）将抗菌药物（AgPlectasin和万古霉素）按2倍梯度系列稀释至1.5mL无菌离心管中，浓度分别是终浓度的10倍；

3）以1%的接种量分别将供试菌株转接至MH液体培养基中37℃，250rpm振荡培养至0.5个麦氏标准比浊；

4）稀释供试菌培养液1000倍（最终菌体浓度为10⁵CFU/mL左右），转移至无菌细胞培养板中，每孔含稀释后菌液90μL；

5）加入稀释后的药物10μL，每个浓度3个平行样，并预留无药物阴性对照孔。加无菌培养板板盖，封口膜封闭后37℃静止培养至阴性对照空出现肉眼可见的明显浑浊菌液。将细胞培养板取出，观测结果，MIC值是能够明显抑制受试菌株生长的最小浓度。如出现跳孔或平行样间结果不一致情况，则重新测试。

6.2MBC实验：

在MIC及前后各3个浓度梯度和阴性对应孔内取培养液10μL，稀释合适倍数后涂布MHA平板，37℃静止培养16-18个小时后取出计算菌落数，将菌落数低于对照菌液99.9%的对应浓度定义为最小杀菌浓度（MBC）。测定结果如表2所示。

表2AgPlectasin对金黄色葡萄球菌活性检测结果

由表2可知，AgPlectasin对金黄色葡萄球菌有较强抑制作用。AgPlectasin对金黄色葡萄球菌的MIC介于0.09-1.47μM。AgPlectasin抑菌能力强于万古霉素，同时，AgPlectasin对病原菌MBC是MIC值的1-2倍，因此可推断AgPlectasin（rAgP）对临床分离MRSA的作用是直接杀灭而非简单抑制病原菌生长(Gottlieb等，ntimicrobialpeptides effectively kill a broad spectrum of Listeria monocytogenes andStaphylococcus aureus strains independently of origin,sub-type,orvirulence factor expression.BMC Microbiol,2008,8(1):205-214)。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种表达载体，其特征在于，含有毕赤酵母组成型启动子GAP、位于启动子下游的编码信号肽的核苷酸序列、编码靶向抗菌肽AgPlectasin的基因序列和TAA，TAG终止子序列，所述编码靶向抗菌肽DNA序列5’端具有酵母Kex2切割识别序列AAGAGA。

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述靶向抗菌肽AgPlectasin为将金黄色葡萄球菌信息素序列AgrD连接至菌丝霉素Plectasin N-端，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示；优选地，所述编码靶向抗菌肽AgPlectasin的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，载体所用信号肽为α-因子分泌信号肽α-MF，酿酒酵母转化酶信号肽SUC2，毕赤酵母碱性磷酸酶信号肽PHO1或所需表达基因自身信号肽序列。

4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体在编码信号肽的核苷酸序列的3’端连接有XhoI酶切位点；在编码靶向抗菌肽AgPlectasin DNA序列的3’端连接有NotI酶切位点。

5.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，载体所用Kex2切割位点氨基酸信息为KR，或在Kex切割位点N/C-端添加EAEA及其相似序列。

6.根据权利要求1-5任一项所述的载体，其特征在于，所述载体为重组表达载体pGAPAgPlectasin，其构建方法包括如下步骤：

（1）设计并合成如下基因片段：在甘油醛3’-磷酸脱氢酶启动子GAP序列5’端添加酶切位点BglII，在3’端依次添加α-因子分泌信号肽序列和XhoI酶切位点；

（2）用限制性内切酶BglII和XhoI分别对合成的基因片段和载体pUC57进行双酶切，回收pUC57载体片段和GAP启动子+α-因子分泌信号肽片段，连接，得到载体pUCGAP；

（3）用限制性内切酶BglII和XhoI分别对载体pUCGAP和pPICAgPlectasin进行双酶切，回收pPICAgPlectasin载体片段和GAP启动子+α-因子分泌信号肽片段，连接，得到重组表达载体pGAPAgPlectasin。

7.含有权利要求1-6任一项所述表达载体的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞为酵母属细胞；进一步优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母基因工程菌；最优选地，所述宿主细胞为毕赤酵母X-33基因工程菌。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有分泌通路因子Bip、PDI、Sec63、YDJ1p或Ssa1p共表达系统；优选地，所述宿主细胞为重组毕赤酵母X-33基因工程菌PichiapastorisX-33/GAPAgP，其构建方法为将权利要求6所述的重组表达载体pGAPAgPlectasin用限制性内切酶AvrII作线性化处理，然后转化毕赤酵母X-33，获得重组毕赤酵母X-33基因工程菌。

9.一种在重组毕赤酵母中表达靶向抗菌肽AgPlectasin的方法，其特征在于，其是将权利要求8所述的重组毕赤酵母PichiapastorisX-33/GAPAgP发酵培养，分泌产生靶向抗菌肽AgPlectasin。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的方法为转化子摇瓶水平组成型表达培养或转化子发酵罐高密度组成型表达培养；

其中，转化子摇瓶水平组成型表达培养的方法如下：

挑取阳性转化子，接种至YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养18-20h；0.5-1%接种量转接至50mL YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养1d后，以4层灭菌纱布替换玻璃纸封口膜包裹摇瓶口，30℃，250rpm振荡培养3-5d至发酵结束；

其中，转化子发酵罐高密度组成型表达培养的方法如下：

（1）种子液的制备及接种上罐

挑取阳性转化子，接种至含100μg/mL Zeocin的YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养18-20h；0.5-1%接种量转接至YPD液体培养基，30℃，250rpm振荡培养至OD600为4-6，火焰保护下接种至含基础盐培养基及终浓度为4.8‰PMT1的SARTORIUS发酵罐中；维持发酵罐转速800rpm，pH5.0，通气量8L/min，溶氧维持于20%以上，培养温度29℃；

（2）菌体的补料生长和产物的组成型表达

观测溶氧值下降后突然上升，调整发酵液pH值为5.5，转速为1000rpm并开始补加含有12‰PMT1的50%葡萄糖，补加过程由0h的1mL L^-1h^-1线性增加到6h的3-3.5mL L^-1h^-1，直至5天后发酵结束。

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