CN107058368A - 一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法，包括：利用蛹虫草自身的HSP70启动子构建菌丝霉素的过表达载体，经过农杆菌介导的转化，转入蛹虫草的菌株中，通过抗性筛选获得转基因菌株。本发明得到的菌株与野生型菌株相比，对原核大肠杆菌和金黄的葡萄球菌有明显的抑菌作用，其具有替代抗生素的潜在利用价值。

Description

一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法

技术领域

本发明属于转基因技术领域，特别涉及一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法。

背景技术

抗菌肽是进化上高度保守、普遍存在的天然免疫系统因子，具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤等多种生物学活性，且不易形成耐药性和药物残留。抗菌肽(Antibacterialpeptides，ABPs)又称抗微生物肽(Antimicrobial peptides，AMPs)或宿主防御肽(hostdefense peptides，HDPs)，是生物体经诱导产生的具有广谱抗菌活性和免疫调节活性的一类小分子多肽，属于机体非特异性防御系统的固有组成部分，几乎存在于所有生命形式(昆虫、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物、植物以及人体)中。抗菌肽通常由12～50个氨基酸组成，相对分子质量一般在4kDa左右。研究发现，抗菌肽具有快速杀菌和广谱抗菌活性，包括抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、多重耐药细菌、真菌、寄生虫、包膜病毒和肿瘤细胞，并且能通过趋化树突状细胞、单核细胞和记忆T细胞，在先天性免疫和获得性免疫反应之间起到桥梁作用，并通过启动获得性免疫系统提高机体抵抗微生物感染的能力。迄今为止，已发现超过1500种抗菌肽。

菌丝霉素Plectasin是2005年从腐生子囊菌的分泌蛋白中分离出的首例真菌防御素。菌丝霉素的成熟功能片段只有40个氨基酸,其分子量约为4.4KDa，其空间结构由一个a螺旋和两个反相平行的β一折叠组成是典型的防御素CSaβ结构。其生物学活性主要表现为对革兰氏阳性菌有较强的杀菌作用，尤其是对肺炎链球菌、脓性链球菌、金黄色葡萄球菌等，有与青霉素、万古霉素相当的抗菌作用。此外，菌丝霉素在体外抑菌试验、动物试验及一些临床试验中表现出无细胞毒性、无溶血性、脑脊液渗透性好等优势，且不易使(包括对传统抗生素抵抗在内的)病原菌产生耐药性，因此作为新一代抗生素替代物具有相当大的治疗潜力。

作为传统中药，虫草的研究和应用一直备受关注。虫草是由子囊菌门(Ascomycoa)，肉座菌目(Hypocreales)，麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草属(Cordyceps)真菌的孢子寄生于昆虫幼虫身上并由夏季从虫体生出子实体所形成的菌虫复合体。其中最著名的是寄生于高山蝙蝠蛾(Hepialusarmoricanus)幼虫的冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)和寄生于鳞翅目蛹的蛹虫草(Cordycepsmilitaris)(Sungetal.,2007)。虫草具有多种药用功效，包括：抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗炎症、杀虫、抗微生物、降血脂血糖、抗衰老、神经保护、肾保护等功能，在肿瘤治疗、器官移植、肝肾移植和心脏保护等方面具有重要作用。其主要成分包括四类：1)核苷酸、2)多糖、3)多肽和糖蛋白、4)甾醇和萜烯。虫草素作为一种新型的广谱抗菌素有抗病毒、抗肿瘤作用。以其特有的抗菌抗病毒活性，已引起全球科技发达国家的高度重视。目前，我国蛹虫草产量达到市值15亿，包括直接食用及深加工产品。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法，该方法得到的菌株与野生型菌株相比，对原核大肠杆菌和金黄的葡萄球菌有明显的抑菌作用，其具有替代抗生素的潜在利用价值。

本发明的一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法，包括：

(1)收集PDA上蛹虫草菌丝，提取DNA；利用引物扩增得到蛹虫草HSP70基因的启动子片段，将片段构建到PDHt-bar上，得到载体PDHt-HSP；

(2)合成菌丝霉素抗菌肽片段，酶切，连接到上述PDHt-HSP上，得到PDHt-HSP-ple载体；

(3)利用上述PDHt-HSP-ple载体转化农杆菌，将蛹虫草孢子和得到的农杆菌菌株共培养，经诱导和筛选得到转基因菌株。

所述步骤(1)中的HSP70基因的启动子片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

所述步骤(1)中的引物为PR1：CGGAATTCCCCCTAAATCACAAGCTTGGTCCG；

PR2：TCCCCCGGGGTTGGCGGCTTCTGTGTGTGTA。

所述步骤(1)中的PDHt-bar的序列如SEQ ID NO.2所示。

所述步骤(2)中的菌丝霉素抗菌肽片段的序列(Ple序列)如SEQ ID NO.3所示。

所述步骤(2)中的合成菌丝霉素抗菌肽片段所用引物为

F：TCCCCCGGGATGGGCTTCGGCTGCAACGG；

R：CGGGATCCTTAGTAGCACTTGCAAACAAAAC。

所述步骤(2)中的酶切位点为SmaI/BamHI。

所述步骤(3)中的共培养采用含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基。

所述步骤(3)中的诱导和筛选采用含300μg/mL头孢霉素和300μg/mL草铵膦的M-100培养基。

所述步骤(3)中得到的转基因菌株在复合培养基SDB中培养，25℃、220rpm振荡培养，液体发酵3天；超声破碎，离心获取蛋白，定量并检测蛋白的抑菌活性。

有益效果

本发明通过转基因的方法获得了转天蚕素抗菌肽的蛹虫草菌株，该菌株与野生型菌株相比，对原核大肠杆菌和金黄的葡萄球菌有明显的抑菌作用，其具有替代抗生素的潜在利用价值；每年蛹虫草生产产生大量的菌渣，很大一部分菌渣直接作为动物饲料使用，如果利用该菌株，将会为养殖业带来不可估量的价值，这为蛹虫草的进一步应用提供了更为广泛的前景。

附图说明

图1为载体构建的PCR图；其中，1为DL-2000；2、8为本发明得到的转基因菌株；4-6为CM01野生型菌株；

图2为蛋白标准曲线图；

图3为野生型菌株、突变菌株的抑菌活性试验；其中，a为PBS；b为CM01野生型菌株；c为本发明得到的转基因菌株；d为Amp抗生素；

图4为野生型菌株、突变菌株的抑菌圈直径。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。蛹虫草菌株所用培养基：

PDA培养基：购自碧迪医疗器械(上海)有限公司。配方：马铃薯淀粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂粉15.0g/L。

SDB培养基：购自碧迪医疗器械(上海)有限公司。配方：动物组织胃蛋白酶消化物5.0g/L，胰酶消化酪蛋白胨5.0g/L，葡萄糖20.0g/L。

M-100培养基：M-100Salt Solution 62.5mL/L，葡萄糖10g/L，KNO₃ 3g/L，琼脂粉15g/L。做覆盖用时，琼脂粉减为0.75g/L。M-100Salt Solution：KH₂PO₄ 16g/L，Na₂SO₄ 4g/L，KCl 8g/L，MgSO₄.7H₂O 2g/L，CaCl₂ 1g/L，M-100Trace Element Solution 8mL/L。

M-100Trace Element Solution：H₃BO₃ 0.06g/L，MnCl₂·4H₂O 0.14g/L，ZnCl₂0.40g/L，

Na₂MoO₄·2H₂O 0.04g/L，FeCl₃·6H₂O 0.10g/L，CuSO₄·5H₂O 0.40g/L。

细菌菌株所用培养基：

LB培养基：购自MDBio(青岛生工生物科技有限公司)。配方：Tryptone 10g/L，NaCl10g/L，Yeastextract 5g/L。若要配制固体培养基，则再添加15g/L琼脂粉。

农杆菌诱导培养基IM(液体)：2.5×MM Salt Solution 400mL/L，葡萄糖1.8g/L，甘油5mL/L，加水定容至940mL。高压灭菌并冷却至50℃后，每升加入40mL 1M MES(pH5.5，过滤除菌)，20mL10m MAS(乙酰丁香酮，DMSO(二甲基亚砜)配制，过滤除菌)。若配置固体培养基，葡萄糖减为0.9g/L，并加入琼脂粉15.0g/L。

2.5×MM Salt Solution：KH₂PO₄ 3.625g/L，K₂HPO₄ 5.125g/L，MgSO₄.7H₂O1.250g/L，NaCl 0.375g/L，CaCl₂·2H₂O 0.165g/L，FeSO₄·7H₂O 0.0062g/L(先配制6.2g/L的溶液，用时移取1mL)，(NH₄)₂SO₄ 1.250g/L。

实施例1

过表达载体的构建：

(1)收集PDA上蛹虫草菌丝，提取DNA；利用引物PR1/PR2扩增得到蛹虫草HSP70基因的启动子片段，利用酶切位点EcroR I/SmaI，酶切、消化、连接PDHt-bar，获得重组载体PDHt-HSP；

PR1：CGGAATTCCCCCTAAATCACAAGCTTGGTCCG；

PR2：TCCCCCGGGGTTGGCGGCTTCTGTGTGTGTA。

PCR反应体系为：

试剂reagent	体积(μL)
		PCR Magic Mix 2.0	25
Primer1	2
		Primer2	2
Template DNA	3
		ddH2O	18
Total	50

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸3min，共30个循环；最后在72℃下补平10min，10℃保存。

(2)利用引物上游引物Ple for TCCCCCGGGATGGGCTTCGGCTGCAACGG；下游引物Ple-BamH I-revCGGGATCCTTAGTAGCACTTGCAAACAAAAC扩增获得Ple序列。利用酶切位点SmaI/BamH I，酶切、消化、连接，获得重组载体PDHt-HSP-ple。

实施例2

同源重组载体蛹虫草中的转化

(根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化)

1)从LB平板(含50μg/mL卡那霉素)上挑选一新鲜培养的含PDHt-HSP-ple载体的农杆菌

AGL-1单菌落，接种于5mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，220rpm，28℃过夜培养。

2)次日离心收集菌体，用等体积的液体诱导培养基IM重悬，移取适量的重悬液至5mL液体诱导培养基IM使OD660＝0.14-0.2。

3)28℃、220rpm振荡培养4-6h，菌液浓度至OD660＝0.5-0.8之间即可。

4)蛹虫草孢子的培养和收集：在超净工作中，将在PDA培养基上活化好(25℃，20d)的新鲜菌丝转移至均质仪中，加入50mLSDB液体培养基，均质30s(低速10s，高速10s，低速10s)后，移取10mL至100mLSDB液体培养基中，25℃，150rmp，摇床培养7d至芽生孢子量达到10⁸-10⁹。无纺布过滤收集芽生孢子，储存在4℃待用，一个月内可用。

5)取上述农杆菌菌液和用0.05％Tween20稀释至1×10⁶个/mL的孢子悬液各100μL充分混匀后涂布于IM平板，28℃共培养2d。

6)加入1mL 0.05％Tween20溶液至上述平板，用涂布器充分洗涤(刮取)混匀共培养物。将洗涤下来的培养物按每板200μL均匀涂布在含300μg/mL头孢霉素和300μg/mL草铵膦的

M-100培养基上，25℃培养3～5d至转化子出现，即得转基因菌株。

7)挑取转化子至含300μg/mL头孢霉素的M-100培养基上，待其长至直径为1-2cm时小量提取基因组进行PCR验证，PCR产物回收，测序，具体序列为：

ATGGGCTTCGGCTGCAACGGCCCCTGGGACGAGGACGACATGCAGTGCCACAACCACTGCAAGTCCATTAAGGGCTACAAGGGCGGTTACTGCGCTAAAGGCGGTTTTGTTTGCAAGTGCTACTAA。

实施例3

转基因菌株的抑菌效果检测

1)菌丝培养

分别收集野生型菌株和实施例2的转基因菌株的新鲜孢子悬浮液，浓度调至10⁸个/mL，吸取300μL，接种到100mL的SDB培养基中，25℃、150rmp摇床培养3d；

2)过滤收集菌丝，冷冻干燥，-80℃保藏备用；

3)菌丝在PBS缓冲液中，匀浆破碎，4℃、8000rmp离心5min，收集上清液；

4)蛋白定量采用Bradford法。

抑菌实验：将保存于-80℃大肠杆菌DH5a用接种环接种于5mL的LB培养基中，37℃、250rpm摇床过夜培养10-12小时。将过夜培养的大肠杆菌按1％的比例接种到新鲜的LB培养基中,37℃、250rpm摇床培养约2小时至对数生长中期。

加样及活性检测：10μL PBS和Amp(50μg/1mL)分别做阴性和阳性对照，10μg的转基因菌株提取蛋白及野生型蛹虫草的提取蛋白，分别点在同一块平板上，37℃在恒温培养箱中培养12-16小时，观察抑菌圈大小。

由图3和4可知，过表达菌株的蛋白提取液的抑菌活性要高于野生型菌株的蛋白提取液。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市农业科学院

<120> 一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法

<130> 1

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1898

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagacagctc catatcgcat cgtcgcacat aagcgaagcg gcggcaggct atcagcgcgc 60

agagccatct ctcagggtag aggccaagcc agtgaccctt ctggcctgag agttcgacac 120

cattgcaagc tttgggaacg caaccggcat caagcagtta cgtggctacc taactagctg 180

gatggaagca tctgtagacg acccatggcc cccgcatgag tcgtttcgga tgggcgggta 240

gcagtaggct gaagaggctg ttgggccgtg acggaaggag actgaaccca agtgaatgaa 300

tgtagagctt attaggcgaa gttgagtgaa gctcgcctac ttaggcgact ggatttcctt 360

tcaacatgga accgccgagc tccaaatttt tcatcgggcc cctaaatcac aagcttggtc 420

cgtttgccgt ctcattgtcc attacgaccg gaatcgagga gccacaaaat tttcgtcact 480

gattgtcatg ttttttcttt cttcgaccgg cgcgccccgc cgttgtgctt ggttgcttgg 540

gcacggctgc agccacaggc ggctggtaca gtggtacgta ccggctctgt atctgcgccc 600

caccatctgc cacacaagga aggcggagct ccgttcgttg cctcgccact gcagagcttt 660

ccgcgagctg ccttgcaacg gggcgctatc tggtaattgg atctgacaga cgtcaagaac 720

cagggaattt tcgttggccg gggaagcaat gtgagggaaa ttatccgttt gcggcagggc 780

ggtgagcgcg atacccagcc acgtttcgtt cggagcgctt cgttcgattc gggtcgcggg 840

gtaatacaaa cagagctcgg ctgcatgtgt gagaagccac ctctagcgtt aatgggacag 900

ctgggaatgc atcgtaaaaa agatttcgag actcgctggt cgcttcgagg cagatccatc 960

gctttcgaac cttgctgtag ctccgtcaat ggaggcgttc tggaaagccc tcaccagccc 1020

actatgacgc ctgttccaac aatcgccgcg ttggaggggc atgcgggtga caaaaaaaag 1080

gccggacacg taagtctaca ctctattaaa actaggaaaa ggaaaagcgg aattagcata 1140

agtataagca agataagaaa tataagcaaa ataggaaata taagcaatat aagaaaaata 1200

ggaagaataa ggaagaggtt agtattccta accggcgggt tactatgtct tggtgagggg 1260

cagaaggtaa aaaatagagg tggggccgta aagtactcag tacctccata caccgccata 1320

aggcggctcc aaaaggcacg ggtgaatgta ctcgggactt gctcgggtgc cccgcggtgg 1380

aagagtgaag tagctcatcg aaaactggtg ctccgtgatg gaagcccaaa gtgaagacag 1440

tgagaggcga acaagaaaag agcgcagaag acactcacgt tacccaggtt actcacccgc 1500

aaggttgcgc aggaagacga ccgccttttg taaaagaatc tggtgggtgc gtccagcacc 1560

ctgcagctct cttcaggtag ctccagcaag ctccagctgt tgccagagac ttccacaggc 1620

ccctgccaca ctctagtggg ctccgctgga aaagtttcga agcacataga agcgcccgct 1680

tcttcttatt tagatgcatc ctactcacca agaattgtct attagctttt ctctcatttc 1740

attctcacac acacattata ccccctcttc aatccatcat cgagaggaag aactagctct 1800

cctgcttgct cccattttca aacacactcg agtgtttatt ttctcttcaa catcccaaaa 1860

cccctcctcc cctccataca cacacagaag ccgccaac 1898

<210> 2

<211> 7076

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 180

ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgctaga gcagcttgag cttggatcag 240

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aacctaagag aaaagagcgt ttattagaat aacggatatt taaaagggcg tgaaaaggtt 360

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ctttgatcca acccctccgc tgctatagtg cagtcggctt ctgacgttca gtgcagccgt 480

cttctgaaaa cgacatgtcg cacaagtcct aagttacgcg acaggctgcc gccctgccct 540

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accggagaca ttacgccatg aacaagagcg ccgccgctgg cctgctgggc tatgcccgcg 660

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cagagtaaat gagaaatgaa taaatgagta gatgaatttt agcggctaaa ggaggcggca 2520

tggaaaatca agaacaacca ggcaccgacg ccgtggaatg ccccatgtgt ggaggaacgg 2580

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ccaagcccga ggaatcggcg tgacggtcgc aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg 2700

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gaatcccggc aaccgccggc agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc caagggcgac 2880

gagcaaccag attttttcgt tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga tagtcgcagc 2940

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aaccggaacc cgtacattgg gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa 3900

gtgactgata taaaagagaa aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt 3960

aaaactctta aaacccgcct ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac agccgaagag 4020

ctgcaaaaag cgcctaccct tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg 4080

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cgcggacaag ccgcgccgtc gccactcgac cgccggcgcc cacatcaagg caccctgcct 4200

cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac 4260

agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt 4320

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taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 4800

ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 4860

tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 4920

gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 4980

ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 5040

aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 5100

aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 5160

agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 5220

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 5280

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgcattc taggtactaa 5340

aacaattcat ccagtaaaat ataatatttt attttctccc aatcaggctt gatccccagt 5400

aagtcaaaaa atagctcgac atactgttct tccccgatat cctccctgat cgaccggacg 5460

cagaaggcaa tgtcatacca cttgtccgcc ctgccgcttc tcccaagatc aataaagcca 5520

cttactttgc catctttcac aaagatgttg ctgtctccca ggtcgccgtg ggaaaagaca 5580

agttcctctt cgggcttttc cgtctttaaa aaatcataca gctcgcgcgg atctttaaat 5640

ggagtgtctt cttcccagtt ttcgcaatcc acatcggcca gatcgttatt cagtaagtaa 5700

tccaattcgg ctaagcggct gtctaagcta ttcgtatagg gacaatccga tatgtcgatg 5760

gagtgaaaga gcctgatgca ctccgcatac agctcgataa tcttttcagg gctttgttca 5820

tcttcatact cttccgagca aaggacgcca tcggcctcac tcatgagcag attgctccag 5880

ccatcatgcc gttcaaagtg caggaccttt ggaacaggca gctttccttc cagccatagc 5940

atcatgtcct tttcccgttc cacatcatag gtggtccctt tataccggct gtccgtcatt 6000

tttaaatata ggttttcatt ttctcccacc agcttatata ccttagcagg agacattcct 6060

tccgtatctt ttacgcagcg gtatttttcg atcagttttt tcaattccgg tgatattctc 6120

attttagcca tttattattt ccttcctctt ttctacagta tttaaagata ccccaagaag 6180

ctaattataa caagacgaac tccaattcac tgttccttgc attctaaaac cttaaatacc 6240

agaaaacagc tttttcaaag ttgttttcaa agttggcgta taacatagta tcgacggagc 6300

cgattttgaa accgcggtga tcacaggcag caacgctctg tcatcgttac aatcaacatg 6360

ctaccctccg cgagatcatc cgtgtttcaa acccggcagc ttagttgccg ttcttccgaa 6420

tagcatcggt aacatgagca aagtctgccg ccttacaacg gctctcccgc tgacgccgtc 6480

ccggactgat gggctgcctg tatcgagtgg tgattttgtg ccgagctgcc ggtcggggag 6540

ctgttggctg gctggtggca ggatatattg tggtgtaaac aaattgacgc ttagacaact 6600

taataacaca ttgcggacgt ttttaatgta ctgaattaac gccgaattaa ttcgggggat 6660

ctggatttta gtactggatt ttggttttag gaattagaaa ttttattgat agaagtattt 6720

tacaaataca aatacatact aagggtttct tatatgctca acacatgagc gaaaccctat 6780

aggaacccta attcccttat ctgggaacta ctcacacatt attatggaga aacttggcaa 6840

gctgctctag ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 6900

ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 6960

ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 7020

tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacg 7076

<210> 3

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgggcttcg gctgcaacgg cccctgggac gaggacgaca tgcagtgcca caaccactgc 60

aagtccatta agggctacaa gggcggttac tgcgctaaag gcggttttgt ttgcaagtgc 120

tactaa 126

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cggaattccc cctaaatcac aagcttggtc cg 32

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcccccgggg ttggcggctt ctgtgtgtgt a 31

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcccccggga tgggcttcgg ctgcaacgg 29

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgggatcctt agtagcactt gcaaacaaaa c 31

Claims (9)

1.一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法，包括：

(1)收集PDA上蛹虫草菌丝，提取DNA；利用引物扩增得到蛹虫草HSP70基因的启动子片段，将片段构建到PDHt-bar上，得到载体PDHt-HSP；

(2)合成菌丝霉素抗菌肽片段，酶切，连接到上述PDHt-HSP上，得到PDHt-HSP-ple载体；

(3)利用上述PDHt-HSP-ple载体转化农杆菌，将蛹虫草孢子和得到的农杆菌菌株共培养，经诱导和筛选得到转基因菌株。

2.根据权利要求1所述的一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的HSP70基因的启动子片段的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的引物为PR1：CGGAATTCCCCCTAAATCACAAGCTTGGTCCG；

PR2：TCCCCCGGGGTTGGCGGCTTCTGTGTGTGTA。

4.根据权利要求1所述的一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的PDHt-bar的序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求1所述的一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的菌丝霉素抗菌肽片段的序列如SEQ ID NO.3所示。

6.根据权利要求1所述的一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的合成菌丝霉素抗菌肽片段所用引物为

F：TCCCCCGGGATGGGCTTCGGCTGCAACGG；

R：CGGGATCCTTAGTAGCACTTGCAAACAAAAC。

7.根据权利要求1所述的一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的酶切位点为SmaI/BamHI。

8.根据权利要求1所述的一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的共培养采用含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基。

9.根据权利要求1所述的一种在蛹虫草中过表达菌丝霉素抗菌肽的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的诱导和筛选采用含300μg/mL头孢霉素和300μg/mL草铵膦的M-100培养基。