KR20160004110A

KR20160004110A - 이산화탄소 유래 숙신산 생산을 위한 균주 및 이를 이용한 이산화탄소 유래 숙신산 생산 방법

Info

Publication number: KR20160004110A
Application number: KR1020140082576A
Authority: KR
Inventors: 우한민; 이정석; 엄영순; 공경택; 민병권; 하정명; 김연제; 심상준
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2014-07-02
Filing date: 2014-07-02
Publication date: 2016-01-12
Also published as: KR101608078B1; US20160002677A1

Abstract

본 발명은 이산화탄소를 이용하여 성장하는 미세조류에 축적되어 있는 전분을 글루코오스로 전환하지 않고 직접적인 탄소원으로 이용하여 숙신산을 생산할 수 있는 균주 및 이를 이용하여 숙신산을 생산하는 방법에 관한 것으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ( Corynebacterium glutamicum) BL-1-pBlAmyS(KCTC 12585BP) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1-pSbAmyA(KCTC 12587BP)로 이루어진 군에서 선택된 하나인 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주를 제공한다. 또한, 본 발명의 구현예들에서는 상기 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주를 전분을 포함하는 배지에 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 이산화탄소로부터 숙신산을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

이산화탄소 유래 숙신산 생산을 위한 균주 및 이를 이용한 이산화탄소 유래 숙신산 생산 방법{Strain for producing succinate from carbon dioxide and method for succinate production using the strain}

본 발명은 숙신산 생산 균주를 미세조류 바이오매스를 탄소원으로 이용하도록 유전공학적으로 개량하고, 이를 이용하여 이산화탄소 유래 숙신산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

지구 온난화 문제가 심각해지면서 대기중의 CO₂ 농도를 줄이기 위한 방법 중 하나로 미세조류를 이용하는 방법이 주목받고 있다. 미세조류는 현재 바이오디젤 생산, 화장품의 원료 등 의약품과 기능성 물질 개발에 다양하게 활용되고 있다. 또한 미세조류는 물과 빛이 있으면 성장에 큰 문제가 없고 재생가능하며 지속가능한 바이오매스로 생장시 세포 내에 전분(starch)을 비롯한 다양한 탄수화물(carbohydrate)를 축적한다. 이 때문에 비싼 원료가격과 수확량이 제한된다는 문제가 있는 목질계 바이오매스(lignocellulosic biomass)를 대체할 수 있는 미세조류 바이오매스(microalgal biomass)를 이용하여 다양한 화학제품을 생산하는 기술에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰은 다양한 아미노산과 핵산을 생산하는 미생물 균주로써 현재 산업적으로 널리 이용되고 있는 균주이다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생균주(wild type)의 경우 탄소원으로 포도당(glucose)과 자당(sucrose)은 이용할 수 있으나 목당(xylose)과 셀로비오스(cellobiose), 전분(starch)를 이용하지 못하므로, 미세조류 바이오매스로부터 코리네박테리움 글루타미쿰을 발효시키기 위하여는 당화과정이 별도로 필요하다. 따라서 탄소사이클이 느리며, 당화과정에서 발효저해물이 발생한다는 문제가 있다.

종래 기술로 대한민국등록특허공보 제10-1339960호는 그물말과 조류를 바이오매스로 이용하여 유기산을 생산할 수 있는 미생물에 대한 것으로, 코리네박테리움 글루타미쿰과 다른 미생물을 사용하고 있지만 이 미생물 역시 배지에서 배양시 효소를 이용한 당화과정을 거쳐야하는 공정상의 문제가 있다. 또한, 미국특허공개공보 제2012-0315678호도 미세조류 바이오매스로부터 미생물을 발효시키는 방법에 대한 것으로, 이 역시 미세조류에 축적되어 있는 전분을 글루코오스로 전환하여 미생물을 발효시키는 별도의 전처리 과정이 필요하다는 문제가 있다.

대한민국등록특허공보 제10-1339960호 (2013.12.04) 미국특허공개공보 제2012-0315678호 (2012.12.13)

"Efficient aerobic succinate production from glucose in minimal medium with Corynebacterium glutamicum", Litsanov et al., Microbial Biotechnology (2012) 5(1), 116-128

본 발명은 이산화탄소를 이용하여 성장하는 미세조류에 축적되어 있는 전분을 추가당화효소를 사용하지 않고, 유전공학적으로 개량하여 전분을 직접적인 탄소원으로 이용하여 숙신산을 생산하는 균주 및 그 제조방법과 이를 이용하여 이산화탄소유래 숙신산을 생산하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 구현예들에서는, 코리네박테리움 글루타미쿰( Corynebacterium glutamicum) BL-1-pBlAmyS(KCTC 12585BP) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1-pSbAmyA(KCTC 12587BP)로 이루어진 군에서 선택된 하나인 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주를 제공한다.

또한, 본 발명의 구현예들에서는 상기 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주의 제조방법으로, TorA 신호 펩타이드를 AmyA의 코딩 시퀀스(coding sequence)에 부착하여 torA-SbAmyA(서열번호 1) 또는 TorA 신호 펩타이드를 AmyS의 코딩 시퀀스에 부착하여 torA-BlAmyS(서열번호 2)를 제조하는 단계; 상기 torA-SbAmyA(서열번호 1) 또는 torA-BlAmyS(서열번호 2)를 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1에서 발현가능한 벡터에 삽입하고, 이를 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL -1에 유전자 재조합하는 단계; 및 상기 삽입한 torA-SbAmyA(서열번호 1) 또는 torA-BlAmyS(서열번호 2)를 모균주내에서 과발현시키는 단계를 포함하는 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예 들에서는 상기 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주 를 전분을 포함하는 배지에 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 이산화탄소로부터 숙신산을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주는 이산화탄소를 빠른 탄소사이클을 통해 생물학적으로 전환하여 전분을 축적하는 미세조류 바이오매스를 발효함으로써 이산화탄소 유래 숙신산을 생산할 수 있어, 지구 온난화에 기여할 수 있다. 상기 미세조류 바이오매스에 축적된 전분을 직접적인 탄소원으로 하여 생장하므로, 전분의 당화를 위한 전처리 과정이 불필요하고, 전처리 과정에서 발생하는 발효저해물의 생성도 방지할 수 있다. 상기 미세조류 바이오매스는 대량생산이 가능하므로 경제적이다. 기존의 곡물유래 탄소화물을 당화하여 유기산 등을 생산하는 공정이 곡물가격 상승에 대한 영향을 받고 탄소사이클이 느리다는 문제를 해결할 수 있다.

또한, 본 발명의 숙신산 생산균주에 의해 생산된 숙신산은 식품 포장재료 등에 사용되는 PBS(Poly(butylene Succinate)) 등의 제조에 사용되므로, 고부가 바이오 화학제품 생산에 유용하다.

도 1은 본 발명의 구현예들에 따라 이산화탄소로부터 숙신산을 생산하는 일련의 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따라 코리네박테리움 글루타미쿰 발현벡터인 pBbEB1c-rfp 벡터에 torA-SbAmyA(서열번호 1)(왼쪽), torA-BlAmyS(서열번호 2)(오른쪽)을 삽입한 모습을 나타낸 도이다.
도 3 은 0.5% 전분이 첨가된 최소배지에서 코리네박테리움 글루타미쿰 야생균주의 생장곡선 및 전분 농도 분석결과를 나타낸 도이다(●: OD, ■: 전분 농도).
도 4a 내지 도 4c는 각각 0.5% 전분이 첨가된 배지에서 발현벡터 pBbEB1c만 삽입된 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032(도 4a), 타겟 유전자 AmyA(도 4b), 타겟유전자 AmyS(도 4c)가 삽입된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 생장곡선 및 전분 농도 분석결과를 나타낸 도이다(●: OD, ■: 전분 농도).
도 5는 0.5% 전분 및 0.5% 글루코스가 첨가된 배지에서 발현벡터 pBbEB1c만 삽입된 숙신산 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1-pBbEB1c, 타겟 유전자 AmyA가 삽입된 숙신산 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1-pSbAmyA, 타겟유전자 AmyS가 삽입된 숙신산 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1-pBlAmyS의 생장곡선을 나타낸 도이다.
도 6은 0.5% 전분 및 0.5% 글루코스가 첨가된 배지에서 발현벡터 발현벡터 pBbEB1c만 삽입된 숙신산 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1-pBbEB1c, 타겟 유전자 AmyA가 삽입된 숙신산 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1-pSbAmyA, 타겟유전자 AmyS가 삽입된 숙신산 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1-pBlAmyS의 숙신산 생산량을 분석결과를 나타낸 도이다.
도 7은 미세조류 바이오매스로부터 분리된 0.2% 총 당(sugar)이 첨가된 최소배지에서 발현벡터 pBbEB1c만 삽입된 숙신산 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1-pBbEB1c, 타겟 유전자 AmyA가 삽입된 숙신산 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1-pSbAmyA, 타겟유전자 AmyS가 삽입된 숙신산 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1-pBlAmyS의 생장곡선을 나타낸 도이다.
도 8은 미세조류 바이오매스로부터 분리된 0.2% 총 당(sugar)이 첨가된 배지에서 발현벡터 pBbEB1c만 삽입된 숙신산 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1(BL-1-pBbEB1c), 타겟 유전자 AmyA가 삽입된 숙신산 생산 균주인 코리네박테리 움 글루타미쿰 BL-1-pSbAmyA, 타겟유전자 AmyS가 삽입된 숙신산 생산 균주인 코리 네박테리움 글루타미쿰 BL-1-pBlAmyS의 숙신산 생산량 분석결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 구현예들은 코리네박테리움 글루타미쿰( Corynebacterium glutamicum) BL-1-pBlAmyS(KCTC 12585BP) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1-pSbAmyA(KCTC 12587BP)로 이루어진 군에서 선택된 하나인 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주를 제공할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주는 이산화탄소를 이용하여 성장하는 미세조류 바이오매스에 축적된 전분을 직접적인 탄소원으로 하여 생장하는 균주이며, 하기의 제조방법에 의해 제조된 균주일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 구현예들에 따른 상기 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주의 제조방법은 TorA 신호 펩타이드를 AmyA의 코딩 시퀀스(coding sequence)에 부착하여 torA-SbAmyA(서열번호 1) 또는 TorA 신호 펩타이드를 AmyS의 코딩 시퀀스에 부착하여 torA-BlAmyS(서열번호 2)를 제조하는 단계; 상기 torA-SbAmyA(서열번호 1) 또는 torA-BlAmyS(서열번호 2)를 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1에서 발현가능한 벡터에 삽입하고, 이를 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL -1에 유전자 재조합하는 단계; 및 상기 삽입한 torA-SbAmyA(서열번호 1) 또는 torA-BlAmyS (서열번호 2)를 모균주내에서 과발현시키는 단계를 포함할 수 있다.

상기 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 (ACCESSION NC_006958, VERSION NC_006958.1 GI: 62388892) 균주를 숙신산을 생산할 수 있도록 개량한 균주이다.

상기 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1 균주에 대한 정보는 참고문헌 "Efficient aerobic succinate production from glucose in minimal medium with Corynebacterium glutamicum", Litsanov et al., Microbial Biotechnology (2012) 5(1), 116-128에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 통합된다. 상기 문헌에 따르면, 코리네박테리움 글루타미쿰의 야생균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 숙신산을 생산하기 위해 숙신산 탈수소효소를 암호화하는 sdhCAB 유전자를 제거하면 숙신산을 생산할 수 있지만 이와 동시에 부산물인 아세트산이 많이 생산된다는 문제가 있다고 기재되어 있다. 또한, 코 리네박테리움 글루타미쿰 BL-1균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 아세트산 생산경로(acetate-producing pathways) 관련 유전자들을 제거하여 숙신산의 생산효율을 높였다고 기재되어 있다. 그러나, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1 균주는 미세조류와 같이 전분이 포함된 바이오 매스에서 생장하기 위하여는 전분이 글루코스 등으로 전환되어야 한다는 문제가 있다. 이에 반해, 본 발명은 torA-SbAmyA(서열번호 1) 또는 torA-BlAmyS(서열번호 2)로 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1 균주를 형질전환시킴으로써 전분이 포함된 미세조류 바이오매스를 탄소원으로 하여 숙신산을 생산할 수 있는 균주를 제공하여 상기 기존의 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1 균주의 문제점을 해결하였다.

이때 상기 AmyA및 AmyS는 알파-아밀라아제(α-amylase)를 발현하는 유전자로서, 본 발명의 구현예들에 따른 균주는 상기 알파-아밀라아제를 발현하는 유전자를 포함함으로써 전분을 탄소원으로 직접적으로 이용하여 생장할 수 있다. 상기 AmyA 및 AmyS는 알파-아밀라아제를 발현하여 가용성 전분을 분해하여 글루코스(glucose)로 전환시킬 수 있다(하기 화학식 1 참조). 이때 상기 TorA 신호 펩타이드는 상기 AmyA 및 AmyS의 코딩 시퀀스에 부착되어 AmyA 및 AmyS에 의해 발현된 알파-아밀라아제를 균주의 세포 밖으로 분비시켜주므로, 전분을 포함하는 미세조류 바이오매스를 탄소원으로 이용하여 숙신산을 생산할 수 있다. 일 구현예로서, 상기 AmyA 는 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 상기 AmyS 는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)에서 유래한 것을 예로 들 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주는 전분을 탄소원으로 하여 생장하여 숙신산을 생산하는 균주이다. 일 구현예에 따른 상기 전분은 미세조류 바이오매스에 축적된 전분이다. 미세조류 바이오매스에는 셀룰로오스, 지질 성분 이외에 다양한 탄수화물이 세포 내에 축적되어 있으며 생장속도가 빠르다. 구체적으로 상기 미세조류는 구성성분 중 약 60%가 탄수화물이고 그 중 약 30%가 전분인 것으로 알려져 있다. 상기 미세조류는 전분을 축적하는 미세조류라면 제한되지 않고 모두 포함되며, 구체적인 예로는 Chlorella vulgaris , Chlorella sorokiniana, Chlorella sorokiniana , Chlamydomonas reinhardtii UTEX 90 등을 들 수 있다. 본 발명의 구현예들에 따른 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주는 상기와 같이 전분을 탄소원으로 직접적으로 이용할 수 있으므로, AmyA 및 AmyS를 포함하지 않는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL -1에 대하여 전분이 포함된 배지에서 약 3배 이상 증가한 숙신산 생장률을 나타낼 수 있다.

본 발명의 구현예들에 따른 상기 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주에서, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1에서 발현가능한 벡터는 pBbEB1c-rfp(서열번호 4; ACCESSION KJ021042, VERSION KJ021042.1 GI: 605098424)를 예로 들 수 있으나, 이외에도 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1에서 상기 torA-SbAmyA(서열번호 1) 또는 torA-BlAmyS(서열번호 2)의 발현에 이용할 수 있는 것이라면 그 종류에 한정되지 않는다. 도 2 는 본 발명의 일 구현예에 따라 코리네박테리움 글루타미쿰 발현벡터인 pBbEB1c-rfp 벡터에 AmyA 및 TorA 신호 펩타이드(torA-SbAmyA, 왼쪽), AmyS 및 TorA 신호 펩타이드(torA-BlAmyS, 오른쪽)을 삽입한 모습을 본 발명의 참조로서 나타낸 도이다.

또한, 본 발명의 구현예들은 상기 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주를 전분을 포함하는 배지에 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 이산화탄소로부터 숙신산을 생산하는 방법을 제공할 수 있다. 일 구현예에 따른 상기 전분을 포함하는 배지는 전분을 포함하는 최소배지를 예로 들 수 있으며, 또는 이산화탄소가 고정화된 미세조류 바이오매스의 파쇄물을 포함하는 배지일 수 있다. 본 발명의 구현예들에 따른 상기 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주는 이산화탄소를 탄소원으로 하는 미세조류 바이오매스를 이용한 미생물 발효를 위한 모균주로 코리네박테리움 글루타미쿰 BL -1을 사용할 수 있으며, 상기 모균주의 세포 내에 알파-아밀라아제를 발현시킨 후 TorA 신호 펩타이드가 이를 세포 밖으로 분비시켜 전분을 포함하는 미세조류 바이오매스를 탄소원으로 이용하여 숙신산을 생산할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.

[실험예 1] 전분이 첨가된 배지에서 코리네박테리움 글루타미쿰 야생균주의 생장 확인

코리네박테리움 글루타미쿰 야생균주 (Corynebacterium glutamicum ATCC13032)의 배양시 전분의 첨가에 따른 생장을 확인하기 위한 실험을 하기와 같이 수행하였다.

배양액은 최소배지인 CgXII 배지에 탄소원으로 0.5% 전분(starch, sigma)을 첨가하였다. 이때, 상기 CgXII 배지(pH　7) 의 조성(per liter)은 20　g (NH₄)₂SO₄, 5　g우레아(urea), 1　g KH₂PO₄, 1　g K₂HPO₄, 0.25　g MgSO₄ _·7H₂O, 10　mg FeSO₄ _·7H₂0, 10　mg MnSO₄ _·7H₂0, 1　mg ZnSO₄ _·7H₂0, 0.2　mg CuSO₄, 0.02　mg NiCl₂ _·6H₂0, 0.2　mg 비오틴(biotin), 0.42　mg 티아민(thiamine), 0.03　mg 프로토카테츄에이트(protocatechuate) 이다.

배양은 250mL 배플 삼각 플라스크(baffled Erlenmeyer flask)에 배양액 50mL에 시작

을 1로 하여 접종 후 30℃에서 56시간 동안 배양하였다. 배양 결과, 도 3에서와 같이 전분을 첨가한 배지에서는 야생균주의 생장이 관찰되지 않았다.

또한 각각의 배양시간 별로 배양액 내의 전분의 농도변화를 알아보기 위해 루골 용액(Lugol’s solution)을 이용하여 배양액 분석을 진행하여 전분의 농도를 정량하였다. 구체적으로, 루골용액(Sigma)을 준비한 후 14000 rpm에서 10분간 원심분리하여 샘플을 준비하였다. 그 다음, 전분의 농도를 정량하기 위하여 표준곡선(0.05, 0.5, 1, 2, 5 g/L)을 작성하고, 1.5ml EP튜브를 사용하여 상기 샘플의 1ml 상등액과 0.1ml 루골 용액을 혼합한 혼합물을 제조하였다. 전분 농도가 1 g/L 이상일 루골용액이 전분과 결합하여 형성된 침전물이 많이 형성되므로 10배 희석을 하였다. 큐벳트(cuvette)에 상기 침전물이 포함된 혼합물을 옮기고 530nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 흡광도를 측정하기 전에 볼텍싱(vortexing)을 해주었다. 측정된 O.D값을 상기 작성한 표준곡선에 대입하여 전분의 농도를 정량하였다. 분석 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 배지에 넣어준 전분의 농도변화가 나타나지 않았다.

[실험예 2] 전분을 탄소원으로 생장하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 제조

균주가 전분을 탄소원으로 이용할 수 있도록 하기 위한 타겟유전자의 선정

본 발명의 구현예들에 따라 전분을 이용가능하게 하기 위한 알파-아밀라아제를 암호화하는 유전자를 선정하기 위해 문헌을 조사하였다. 문헌 조사 결과, 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis)의 AmyA 유전자와 아직 코리네박테리움 글루타미쿰에서 사용된 예가 보고되지 않은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)의 AmyS 유전자를 타겟유전자로 선택하였다. 상기 선택된 타겟유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰에 알맞게 코돈 최적화를 진행하여, 코돈 최적화된 AmyA 유전자 및 코돈 최적화된 AmyS 유전자를 각각 얻었다. 이때 상기 코돈 최적화는 DNA2.0의 GENE DESIGNER 프로그램을 사용하여 진행하였으며, 하기 표 1 은 상기 문헌 조사를 통하여 선정된 타겟유전자 정보를 나타낸 것이다.

유전자 이름	발현 단백질	균주 이름	참고 문헌
AmyA	알파-아밀라아제	스트렙토코커스 보비스	Tateno et al., AMB 2007
AmyS	알파-아밀라아제	바실러스 리케니포미스	Sibakov M., Eur. J. Biochem. 145:567-572(1984)

숙신산 생산균주의 제조

상기 타겟 유전자가 세포 내에서 발현이 잘되었을 때 이를 세포 밖으로 분비하기 위해, 상기 코돈 최적화된 AmyA 유전자 및 코돈 최적화된 AmyS 유전자를 코딩하는 두 염기서열에 각각 TorA 신호 펩타이드(서열번호 3)를 부착하였다. 상기 TorA 신호펩타이드가 부착된 두 염기서열을 torA-SbAmyA(서열번호 1)와 torA-BlAmyS(서열번호 2)라고 하며, 이 두 염기서열은 Genscript에서 제작이 가능하다.

그 다음, pBbEB1c-rfp벡터(서열번호 4)의 효소자리(enzyme site)인 EcoRI / BamHI site에 제한효소 EcoRI(서열번호 5, 제조사: Fermentas) 및 BamHI(서열번호 6, 제조사: Fermentas)를 사용하여 rfp(서열번호 7)를 잘라낸 다음 rfp 자리에 torA-SbAmyA와 torA-BlAmyS를 각각 삽입하였다.

본 발명의 일 구현예에 따른 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1 및 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1의 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 각각 torA-SbAmyA(서열번호 1) 또는 torA-BlAmyS(서열번호 2)를 형질전환시킨 후 IPTG induction을 통해 유전자를 과발현시켰다. 마지막으로, 각 균주들을 0.5% 전분(sigma)이 첨가된 CgXII배지에서 배양하였다.

상기 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1에 torA-SbAmyA(서열번호 1) 또는 torA-BlAmyS(서열번호 2)를 각각 형질전환시킨 균주를 BL-1-pSbAmyA(실시예 1) 및 BL-1-pBlAmy(실시예 2), 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 각각 torA-SbAmyA 또는 torA-BlAmyS를 형질전환시킨 균주를 Cg - pSbAmyA 및 Cg - pBlAmyS라 하였다. 그리고 상기 제조한 균주와 별로도, torA-SbAmyA 또는 torA-BlAmyS를 삽입하지 않은 pBbEB1c벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 각각 도입하여, 이를 대조군으로 하였다.

[실험예 3] 전분이 첨가된 배지에서의 타겟 유전자들이 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 생장 확인

본 발명의 구현예에 따른 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주의 전분이 첨가된 배지에서의 생장을 확인하기에 앞서, 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1의 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 torA-SbAmyA(서열번호 1) 또는 torA-BlAmyS(서열번호 2)를 유전자 재조합하여 삽입한 균주의 생장특성을 먼저 확인하는 실험을 실시하였다.

구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 균주에 각각 torA-SbAmyA 및 torA-BlAmyS를 각각 형질전환시킨 균주인 Cg-pSbAmyA , Cg-pBlAmyS 와 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 타겟유전자 없이 pBbEB1c만 삽입한 균주 cg-pBbEB1c를 0.5% 전분(sigma)이 첨가된 CgXII배지에서 각각 배양하였다. 배양하면서 시간에 따른 OD₆₀₀값을 비교하였다. 그 결과 Cg-pBlAmyS 의 최종 OD값이 4.62로 가장 높았고, Cg-pSbAmyA 의 OD값은 1.98였다. 그러나, cg-pBbEB1c의 경우 1.14로 거의 생장하지 않았다. 도 4a 내지 도 4c는 시간에 대한 상기 OD₆₀₀값의 로그값을 각각 나타낸 것이다. 상기 결과로부터, 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1 균주와 이를 개량한 본원발명의 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주도 상기 결과와 유사한 생장특성을 보일 것을 예측할 수 있다.

또한, 각각의 배양시간 별로 배양액 내의 전분의 농도변화를 알아보기 위해 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 루골 용액을 이용하여 배양액 분석을 진행하였다. 배양액 분석 결과, 가장 생장이 빨랐던 Cg-pBlAmyS 는 배양 시작 6시간 후에 대부분의 전분이 소비된 것을 확인하였고 Cg-pSbAmyA의 경우 어느 정도의 생장이 진행된 이후 전분의 농도가 변화하지 않았다(도 4a 내지 도 4c 참조).

[실험예 4] 전분과 포도당이 첨가된 배지에서 타겟 유전자들이 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1 균주의 생장 및 숙신산 생산 확인

본 발명의 구현예에 따른 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주의 미세조류 바이오매스에서의 생장특성을 확인하기 위해, 하기의 실험을 실시하였다.

구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1 균주에 각각 torA-SbAmyA 및 torA-BlAmyS를 각각 형질전환시킨 균주인 BL-1-pSbAmyA(실시예 1) 및 BL-1-pBlAmyS(실시예 2)와 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1에 타겟유전자 없이 pBbEB1c만 삽입한 균주인 BL-1-pBbEB1c(비교예 1)를 0.5% 전분(sigma) 및0.5% 글루코오스가 첨가된 CgXII배지에서 각각 배양하였다. 배양하면서 시간에 따른 OD₆₀₀값을 비교하였다. 그 결과 BL-1-pSbAmyA (실시예 1) 및 BL-1-pBlAmyS (실시예 2)의 최종 OD값이 모두 10으로 매우 높았으나, BL-1-pBbEB1c(비교예 1)의 경우 6.57로 30%로 낮은 생장률을 나타내었다(도 5 참조). 이는 BL-1-pBbEB1c(비교예 1)의 경우 배지내에 포함된 전분을 제외한 글루코스만을 탄소원으로 이용하여 생장하였기 때문이다.

또한, 각각의 배양시간 별로 상기 실시예 1 및 2, 비교예 1의 숙신산 생산량을 알아보기 위해, 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 루골 용액을 이용하여 배양액 분석을 진행하였다. 배양액 분석 결과, BL-1-pSbAmyA (실시예 1)이 약 1.6 g/L로 가장 높은 숙신산 생산량을 나타내었으며, BL-1-pBlAmyS(실시예 2)도 약 1.44 g/L을 나타내었다. 그러나, BL-1-pBbEB1c(비교예 1)은 약 0.47 g/L로 매우 낮은 값을 나타내었으며, 이는 본 발명에 따른 균주인 실시예 1 및 2이 BL-1-pBbEB1c(비교예 1)과 달리 배지내 전분을 탄소원으로 이용하였음을 의미한다(도 6 참조).

[실험예 5] 미세조류 바이오매스가 첨가된 배지에서 타겟 유전자들이 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1 균주의 생장 및 숙신산 생산 확인

본 발명의 구현예에 따른 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주의 전분이 첨가된 배지에서의 생장특성을 확인하기 위해, 하기의 실험을 실시하였다.

구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1 균주에 각각 torA-SbAmyA 및 torA-BlAmyS를 각각 형질전환시킨 균주인 BL-1-pSbAmyA (실시예 1) 및 BL-1-pBlAmyS 실시예 2)와 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1에 타겟유전자 없이 pBbEB1c만 삽입한 균주인 BL-1-pBbEB1c(비교예 1)를 미세조류 바이오매스로서 녹조류인 Chlamydomonas reinhardtii UTEX 90 샘플로부터 분리된 0.2% 총 당(sugar)이 첨가된 CgXII배지에서 각각 배양하였다. Chlamydomonas reinhardtii는 한국생명공학 연구원의 미생물자원센터에서 분양받을 수 있다. 이때 상기 미세조류 바이오매스의 조성 중 60%는 탄수화물, 이외에는 단백질 및 지질 등이 포함되어 있으며, 상기 탄수화물 중 30%는 전분, 나머지 70%는 D-글루코오스, L-푸코오스, L-람노스, D-아라비노스, D-갈락토오스, D-만노스 등이 포함되어 있다.

배양하면서 시간에 따른 OD₆₀₀값을 비교하였다. 그 결과 pBbEB1c-torA-SbAmyA (실시예 1) 및 pBbEB1c-torA-BlAmyS(실시예 2)의 최종 OD값이 모두 4.1로 높았으나, BL-1-pBbEB1c(비교예 1)의 경우 2.26으로 50%로 낮은 생장률을 나타내었다(도 7 참조). 이는 상기 비교예 1과 달리 본원발명이 미세조류내에 포함된 전분을 직접적인 탄소원으로 이용하여 생장하였기 때문이다.

또한, 각각의 배양시간 별로 상기 실시예 1 및 2, 비교예 1의 숙신산 생산량을 알아보기 위해, 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 루골 용액을 이용하여 배양액 분석을 진행하였다. 배양액 분석 결과, pBbEB1c-torA-SbAmyA (실시예 1)이 약 0.5 g/L로 가장 높은 숙신산 생산량을 나타내었으며, pBbEB1c-torA-BlAmyS(실시예 2)도 약 0.49 g/L을 나타내었다. 그러나, BL-1-pBbEB1c(비교예 1)은 약 0.15 g/L로 매우 낮은 값을 나타내었으며, 이는 본 발명에 따른 균주인 실시예 1 및 2이 BL-1-pBbEB1c(비교예 1)과 달리 배지내 전분을 탄소원으로 효율적으로 이용하였기 때문이다(도 8 참조).

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<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Strain for producing succinate from carbon dioxide and method for succinate production using the strain <130> 14P236IND <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2244 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> torA-SbAmyA consisting of TorA sequence expressing torA signal peptide and SbAmyA sequence expressing alpha-amylase <400> 1 catatgaaca ataacgatct ctttcaggca tcacgtcggc gttttctggc acaactcggc 60 ggcttaaccg tcgccgggat gctggggccg tcattgttaa cgccgcgacg tgcgactgcg 120 gcgcaagcgg cggatgaaca ggtgtccatg aaggatggca ccatcctgca cgcatggtgc 180 tggtccttca acaccatcaa ggataacatg caggcaatca aggatgcagg ctacacctcc 240 gtgcagacct ccccaatcaa caccgtggtg gcaggcgaag gcggcaacaa gtccctgaag 300 aactggtact accagtacca gccaaccatc tacaagatcg gcaactacca gctgggcacc 360 gaagaagaat ttaaggaaat gaaccgcgtg gcagatcagt acggcatcaa gatcatcgtg 420 gatgcagtgc tgaaccacac cacctccgat tacaaccaga tttcccagga aatcaagaac 480 atcccaaact ggacccacgg caacaccctg atctccgatt 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1500 tccgaaccag tggtgatcaa ctccgaaggc tggggcgagt tccacgtgaa cggcggctcc 1560 gtgtccatct acgtgcagcg ctaa 1584 <210> 3 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> torA sequence which expresses torA signal peptide <400> 3 catatgaaca ataacgatct ctttcaggca tcacgtcggc gttttctggc acaactcggc 60 ggcttaaccg tcgccgggat gctggggccg tcattgttaa cgccgcgacg tgcgactgcg 120 gcgcaagcgg cg 132 <210> 4 <211> 6808 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> vector pBbEB1c-rfp <400> 4 gacgtcgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa 60 gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat 120 gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg 180 aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg 240 gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc 300 ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc 360 agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac 420 aatcttctcg cgcaacgcgt 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Claims

코리네박테리움 글루타미쿰 ( Corynebacterium glutamicum) BL-1-pBlAmyS(KCTC 12585BP) 및 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1-pSbAmyA(KCTC 12587BP)로 이루어진 군에서 선택된 하나인 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주.
제 1 항에 있어서, 상기 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주는 이산화탄소를 이용하여 성장하는 미세조류 바이오매스에 축적된 전분을 직접적인 탄소원으로 하여 생장하는 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주.
제 1 항에 있어서, 상기 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주는 유전자 AmyA 및 AmyS를 포함하지 않는 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL -1에 대하여 전분이 포함된 배지에서의 생장률이 3배 이상 증가한 균주인 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주의 제조방법으로,
TorA 신호 펩타이드를 AmyA의 코딩 시퀀스(coding sequence)에 부착하여 torA-SbAmyA(서열번호 1) 또는 TorA 신호 펩타이드를 AmyS의 코딩 시퀀스에 부착하여 torA-BlAmyS(서열번호 2)를 제조하는 단계;
상기 torA-SbAmyA(서열번호 1) 또는 torA-BlAmyS(서열번호 2)를 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL-1에서 발현가능한 벡터에 삽입하고, 이를 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 BL -1에 유전자 재조합하는 단계; 및
상기 삽입한 torA-SbAmyA(서열번호 1) 또는 torA-BlAmyS(서열번호 2)를 모균주 내에서 과발현시키는 단계를 포함하는 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주의 제조방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 이산화탄소 유래 숙신산 생산균주를 전분을 포함하는 배지에 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는 이산화탄소로부터 숙신산을 생산하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 전분을 포함하는 배지는 이산화탄소가 고정화된 미세조류 바이오매스의 파쇄물을 포함하는 배지인 이산화탄소로부터 숙신산을 생산하는 방법.