CN107988126A

CN107988126A - 包含增加丙酮酸磷酸二激酶活性的基因修饰的重组微生物及其用途

Info

Publication number: CN107988126A
Application number: CN201710951438.1A
Authority: CN
Inventors: 李弘顺; 姜珍圭; 朴轸焕; 梁东植
Original assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Current assignee: Samsung Electronics Co Ltd
Priority date: 2016-10-26
Filing date: 2017-10-13
Publication date: 2018-05-04
Also published as: US20180112197A1; KR20180045617A; EP3315598A1; US10465175B2

Abstract

提供了一种重组微生物，所述微生物包含增加丙酮酸磷酸二激酶活性的基因修饰，一种使用其生产纤维素的方法以及一种生产具有增强的纤维素生产能力的微生物的方法。

Description

包含增加丙酮酸磷酸二激酶活性的基因修饰的重组微生物及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年10月26日在韩国知识产权局提交的韩国专利申请号10-2016-0140178的优先权，其所公开的全部内容通过引用并入本申请。

背景技术

1.发明领域

本申请涉及包含增加丙酮酸磷酸二激酶活性的基因修饰的重组微生物，使用其生产纤维素的方法以及生产具有增强的纤维素生产能力的微生物的方法。

2.相关技术说明

通过培养微生物生产的纤维素存在作为一级结构的由葡萄糖组成的β-1,4葡聚糖以及由β-1,4葡聚糖形成的原纤维束的网状结构。这种纤维素也被称为“微生物纤维素”。

与植物纤维素不同，这种微生物纤维素是完全不含木质素或半纤维素的纯纤维素。与植物纤维素相比，微生物纤维素的宽度为100nm或更窄，并且其具有吸湿性高、吸水能力强、拉伸强度高、弹性高、耐热性高等特点。由于具有这些特征，已将微生物纤维素开发用于诸如化妆品、医疗产品、膳食纤维、音频扬声器隔膜、功能膜等的多个领域。

已报道醋杆菌、农杆菌、根瘤菌(Rhizobia)或八叠球菌(Sarcina)是生产微生物纤维素的菌株。已知其中的木驹形杆菌(Komagataibacter xylinus)(也称为“木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)”)就是一个极好的菌株。在需氧条件下进行静态培养时，在培养基表面上形成具有三维网状结构的纤维素薄膜。

丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)是属于转移酶家族的酶，其催化下述化学反应：

尽管具有如上所述的现有技术，但仍存在对具有增强的纤维素生产能力的重组微生物的需求。

发明概述

本发明的一个方面提供了一种包含增加丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)活性的基因修饰的重组微生物。

本发明的另一个方面提供了一种生产纤维素的方法，所述方法包括在培养基中培养重组微生物；并且从培养物中分离纤维素，所述重组微生物包含增加PPDK活性的基因修饰。

本发明的又一个方面提供了一种生产具有增强的纤维素生产能力的微生物的方法，所述方法包括将增加PPDK活性的基因修饰引入微生物。

附图说明

从以下结合附图对实施方式的描述中，这些和/或其他方面将变得显而易见并且更易于理解，其中：

图1显示了在振荡培养条件下引入PPDK基因的K.xylinus(△gdh)菌株的纤维素纳米纤维(CNF)生产情况和葡萄糖消耗情况；

图2显示了根据焦磷酸盐(PPi)浓度的K.xylinus(△gdh)(对照组)和引入PPDK基因的K.xylinus(△gdh)(实验组)的葡萄糖消耗情况和CNF生产情况；以及

图3显示了根据Mg²⁺浓度的葡萄糖消耗情况和CNF生产情况。

发明详述

如在本申请中所使用，术语“活性增加”或“增加的活性”可以指细胞、蛋白或酶活性可检测的增加。“活性增加”或“增加的活性”还可以指经修饰(例如经基因工程改造)的细胞、蛋白或酶的活性水平高于相同类型的比较细胞、蛋白或酶，如不具有给定基因修饰的细胞、蛋白或酶(例如原始或“野生型”的细胞、蛋白或酶)。“细胞活性”可以指细胞的特定蛋白或酶的活性。例如，经修饰或工程改造的细胞、蛋白或酶的活性与相同类型的未经工程改造的细胞、蛋白或酶(即野生型细胞、蛋白或酶)的活性相比可能增加约5％或更高、约10％或更高、约15％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约50％或更高、约60％或更高、约70％或更高或者约100％或更高。可以采用本领域公知的任何方法对具有增加的蛋白或酶活性的细胞进行鉴定。

可以通过增加其表达或特定活性实现增加酶或多肽的活性。可以通过将编码酶或多肽的多核苷酸引入细胞，通过增加其拷贝数或者通过修饰多肽的调控实现表达增加。在其中引入编码该酶的多核苷酸的微生物可以是内源性地含有或不含该多核苷酸的微生物。编码该酶的多核苷酸可以与能够使其表达的调控序列可操作地连接，例如例如启动子、增强子、多聚腺苷酸化位点或其组合。拷贝数增加的多核苷酸可以是内源性的或外源性的。内源性基因指已经存在于微生物遗传物质中的基因。外源性基因指从外部引入细胞中的基因，并且其相对于引入该基因的宿主细胞可以是同源性或异源性的。术语“异源性”指相对于该物种是“外源性的或非天然的”。

可以通过引入或扩增该基因引起，以及可以通过对细胞进行基因工程改造以使得该细胞具有在非基因工程改造的细胞中不存在的基因实现术语“拷贝数增加”。可以由媒介如载体介导基因的引入。引入可以是瞬时引入，在其中基因未整合至基因组，或者引入使得基因整合至基因组。例如可以通过将载体引入细胞，该载体包含编码目标多肽的多核苷酸，然后在细胞中复制载体或通过将多核苷酸整合至基因组进行引入。

基因的引入可以通过公知的方法进行，如转化、转染或电穿孔。基因可以通过媒介或通过自身引入。如在本申请中使用的，术语“媒介”或“载体”指能够将与其连接的其他核酸递送进入细胞的核酸分子。作为介导特定基因引入的核酸序列，所使用的媒介可以是载体、核酸构建体或表达盒。载体可以包括例如质粒载体、来源于病毒的载体等。载体可以包括例如质粒表达载体、病毒表达载体(如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒)或其组合。

此外，如在本申请中使用的，术语“失活”或“降低的”活性指细胞具有的酶或多肽的活性低于在亲本细胞(即未进行基因工程改造的细胞)中检测到的相同活性。而且，“失活”或“降低的”活性指分离的酶或多肽具有的活性低于原始或野生型酶或多肽的相同活性。例如，经修饰(例如经基因工程改造)的细胞或酶具有的将底物转化为产物的酶促活性与不具有修饰的细胞或酶(即亲本细胞或“野生型”细胞或酶)相比显示出约5％或更高、约10％或更高、约20％或更高、约30％或更高、约40％或更高、约50％或更高、约55％或更高、约60％或更高、约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约95％或更高或者约100％的降低。可以通过本领域公知的任意方法对酶或细胞降低的活性进行确证。失活或降低包括与具有未被修饰基因的细胞(即亲本细胞或野生型细胞)相比酶不具有活性，即使酶被表达但具有降低的活性或者编码酶的基因不表达或以较低水平表达的情形。

可以通过缺失或破坏编码酶的基因将酶的活性失活或降低。基因的“缺失”或“破坏”指将部分或全部基因或者部分或全部基因的调控序列(例如启动子或终止区)突变，这样与天然存在的基因产物相比，基因不表达，以降低的水平表达或者所表达的基因产物(例如酶)不具有活性或具有降低的活性。突变可以包括基因的一个或多个核苷酸的添加、取代、插入、缺失或转化。基因的缺失或破坏可以通过基因操作如同源重组、定向诱变或分子进化实现。当细胞包括多个相同的基因或者基因的两个或多个旁系同源基因时，可以将一个或多个基因除去或破坏。例如，可以通过同源重组引起酶的失活或破坏或者可以通过使用包含部分基因序列的载体转化细胞，培养细胞以使得该序列可以与细胞的内源性基因同源重组以缺失或破坏该基因，然后使用选择标记选择发生了同源重组的细胞进行酶的失活或破坏。

可以使用本领域公知的分子生物学方法进行本公开中使用的基因修饰。

术语“亲本细胞”指原始细胞，例如与经过工程改造的微生物是相同类型的未经过基因工程改造的细胞。对于特定的基因修饰而言，“亲本细胞”可以是缺乏特定的基因修饰，但是所有其他方面是相同的细胞。因此，亲本细胞可以是作为用于生产经基因工程改造的具有增加的给定蛋白(例如与丙酮酸磷酸二激酶蛋白具有约95％或更高的序列同一性的蛋白)活性的微生物的起始原料的细胞。同样的比较也适用于其他基因修饰。

如在本申请中所使用的，术语“基因”指编码特定蛋白的核苷酸片段，并且该片段可以包括或不包括5’-非编码序列和/或3’-非编码序列的调控序列。

如在本申请中所使用的，术语多核苷酸或多肽的“序列同一性”指在进行序列比对后获得的序列的碱基或氨基酸残基之间的同一性程度以使得在某些可比较区域中为最佳匹配。序列同一性是通过对两条序列进行最佳比对对在某些可以比较区域中的两条序列进行比较获得的值，其中在某些可比较区域中的序列的部分与参照序列相比可以增加或缺失。可以通过例如在整个可比较区域中对两条最佳比对序列进行比较，确定相同氨基酸或核酸出现的位置数以获得匹配位置数，使用可比较区域中的匹配位置数除以位置总数(例如范围的尺寸)并将除得的结果乘以100以获得序列同一性百分率计算序列同一性百分率。可以使用公知的序列比较程序例如BLASTN(NCBI)、BLASTP(NCBI)、CLC主要工作台(CLCbio)、MegAlign^TM(DNASTAR Inc)等确定序列同一性百分率。除非另有规定，选择用于操作该程序的参数如下：Ktuple＝2、空位罚分＝4和空位长度罚分＝12。

可以使用不同水平的序列同一性以鉴别具有相同或相似的功能或活性的不同类型的多肽或多核苷酸。例如，序列同一性可以包括约50％或更高、约55％或更高、约60％或更高、约65％或更高、约70％或更高、约75％或更高、约80％或更高、约85％或更高、约90％或更高、约95％或更高、约96％或更高、约97％或更高、约98％或更高、约99％或更高或者100％的序列同一性。

如在本申请中所使用的，术语“基因修饰”指在细胞遗传物质的构成或结构中的人工改变。

在本发明中，除非另有说明，％表示w/w％。

PPDK是属于转移酶家族的酶，其催化下述化学反应：

PPDK可以属于EC 2.7.9.1。PPDK可以是外源性的或内源性的。PPDK可以来自细菌。PPDK可以来自梭菌属、驹形杆菌属、丙酸杆菌属、醋杆菌属，农杆菌属或埃希氏菌属的微生物。PPDK可以来自木驹形杆菌、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、纹膜醋酸杆菌(Acetobacter aceti)或共生梭菌(Clostridium symbiosum)。PPDK可以是与SEQID NO：1至4所示的任意一个氨基酸序列具有约95％或更高的序列同一性的多肽。编码PPDK的基因可以与SEQ ID NO：5至8所示的任意一个核苷酸序列具有约95％或更高的序列同一性。

对于上述微生物而言，基因修饰可以增加编码PPDK的基因的表达。基因修饰可以增加PPDK的拷贝数。基因修饰可以增加编码与SEQ ID NO：1至4所示的任意一个氨基酸序列具有约95％或更高的序列同一性的多肽的基因的拷贝数。该基因可以与SEQ ID NO：5至8所示的任意一个核苷酸序列具有约95％或更高的序列同一性。可以通过例如媒介如载体将基因修饰引入编码PPDK的基因。编码PPDK的基因可以存在于染色体内部或外部。所引入的编码PPDK的基因可以是多个基因，例如2个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、30个或更多个、50个或更多个、100个或更多个或者1000个或更多个。

微生物可以是醋杆菌科的细胞。醋杆菌科的细胞可以是驹形杆菌(也称为“葡糖醋杆菌”)属、醋杆菌属、梭菌属或葡糖杆菌属的细胞。宿主细胞可以是木驹形杆菌(也称为“木葡糖酸醋杆菌”)。微生物可以属于埃希氏菌属或丙酸杆菌属。属于埃希氏菌属的细胞可以是大肠杆菌。属于丙酸杆菌属的细胞可以是费氏丙酸杆菌。属于醋杆菌属和梭菌属的细胞可以分别是纹膜醋酸杆菌和共生梭菌。

微生物还可以包含降低膜结合葡萄糖脱氢酶(GDH)活性的基因修饰。基因修饰可以将编码GDH的基因失活或破坏。基因修饰可以除去或破坏编码与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有约95％或更高的序列同一性的多肽的基因。GDH基因可以具有SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

本发明的另一个方面提供了一种用于生产纤维素的组合物，该组合物包含含有PPDK活性的基因修饰的重组微生物。

对于该组合物而言，重组微生物与如上所述是相同的。

本发明的又一个方面提供了一种生产纤维素的方法，该方法包括在培养基中培养重组微生物；并且从培养物中分离纤维素，所述重组微生物包含增加PPDK活性的基因修饰。

该方法包括在培养基中培养包含增加PPDK活性的基因修饰的重组微生物。对于该方法而言，重组微生物与如上所述是相同的。

可以在含有适宜碳源(例如葡萄糖)的培养基中进行培养。用于培养微生物的培养基可以是适于宿主细胞生长的任意通用培养基，如含有适宜补充剂的最低或复合培养基。适宜的培养基可以是市售的或采用公知的制备方法制备的。

培养基可以是可以满足特定微生物的需求的培养基，其取决于所选择的培养产物。培养基可以是包含选自下组的组分的培养基：碳源、氮源、盐、微量元素及其组合。

可以对培养条件进行适当控制以生产所选择的产物，例如纤维素。可以在有氧条件下进行培养以使得细胞增殖。可以通过静态培养而不是振荡进行培养。微生物的密度可以是提供足够的空间以便不干扰纤维素分泌的密度。

如在本申请中所使用的，术语“培养条件”指用于培养微生物的条件。此类培养条件可以包括例如被微生物所利用的碳源、氮源或氧气条件。可以被微生物利用的碳源可以包括单糖、二糖或多糖。碳源可以包括作为可同化糖的葡萄糖、果糖、甘露糖或半乳糖。氮源可以是有机氮化合物或无机氮化合物。氮源的例示可以为氨基酸、酰胺、胺、硝酸盐或铵盐。用于培养微生物的氧气条件可以是正常氧分压的有氧条件或者在大气中包含约0.1％至约10％氧气的低氧条件，或者是不存在氧气的厌氧条件。可以根据微生物实际使用的碳源或氮源改进代谢途径。通过这种培养，可以在培养物中产生纤维素。

可以在含有1mM至15mM Mg²⁺离子的培养基中进行培养。Mg²⁺离子的浓度可以是1mM至14mM、1mM至12mM、1mM至11mM、2mM至10mM、3mM至15mM、4mM至15mM、5mM至15mM、5mM至10mM、6mM至14mM、7mM至13mM、8mM至12mM、9mM至11mM或9.5mM至10.5mM。可以在含有0.1至5％(v/v)乙醇的培养基中进行培养，例如0.1至3％(v/v)、0.5至2.5％(v/v)、0.5至2％(v/v)、0.5至1.5％(v/v)、0.5至1.0％(v/v)、0.7至3.0％(v/v)、0.7至2.5％(v/v)、0.7至1.0％(v/v)或1.0％至2.0％(v/v)。培养基可以是HS或HSE培养基。还可以在培养基中包括盐形式的Mg² ⁺。盐可以是例如SO₄ ^2-盐。

该方法可以包括从培养物中分离纤维素。分离可以是例如收集在培养基表面上形成的纤维素薄膜。可以通过物理剥离纤维素薄膜或通过除去培养基收集纤维素薄膜。分离可以收集纤维素薄膜同时保持其形状不损坏。而且，可以将纤维素悬浮在培养基中或者其可以具有球团形状。可以通过离心、沉淀或过滤处理进行纤维素的分离。而且，可以根据静态培养或振荡培养对分离进行适宜地控制。

本发明的又一个方面提供了一种生产具有增强的纤维素生产能力的微生物的方法，该方法包括将增加PPDK活性的基因修饰引入微生物。该方法可以是生产微生物的方法，该方法包括将编码PPDK的基因引入微生物。可以通过将包含该基因的媒介引入微生物引入编码PPDK的基因。该方法还可以包括引入降低膜结合葡萄糖脱氢酶活性的基因修饰。该微生物可以属于醋杆菌科。

根据一个方面的重组微生物可以用于生产纤维素。

根据另一个方面的生产纤维素的方法可以用于有效地生产纤维素。

根据又一个方面的生产具有增强的纤维素生产能力的微生物的方法可以用于有效地生产具有增强的纤维素生产能力的微生物。

现在将详细地提及实施方式，其示例在附图中示出，其中相同的附图标记始终表示相同的元件。在这方面，本实施方式可以具有不同的形式，并且不应被解释为限于本申请所示的描述。因此，下面仅通过参考附图对实施方式进行描述来解释这些方面。如在本申请中所使用的，术语“和/或”包括一个或多个相关列出项目的任意和所有组合。

以下，将参照实施例对本发明进行更加详细的描述。然而，所提供的这些实施例仅用于说明目的，本发明不受这些实施例的限制。

实施例1：制备包含丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)基因的K.xylinus和生产纤维素

在这个实施例中，将外源性PPDK基因引入木驹形杆菌(韩国微生物培保藏中心，KCCM 41431)和GDH基因缺失的K.xylinus，并且培养引入了该基因的微生物以生产纤维素，从而考察基因的引入对纤维素生产能力的影响。在此处，术语“外源性”基因还包括内源性存在但是从外部引入的天然基因。PPDK基因来自木驹形杆菌、费氏丙酸杆菌、纹膜醋酸杆菌和共生梭菌。

(1)制备GDH基因缺失的K.xylinus

通过同源重组将K.xylinus中的膜结合吡咯并喹啉-醌(PQQ)依赖性葡萄糖脱氢酶(GDH)基因失活。具体步骤如下：

为了通过同源重组将GDH基因缺失，通过使用K.xylinus基因组序列作为模板以及一组引物GDH-5-F(SEQ ID NO:11)和GHD-5-R(SEQ ID NO:12)和一组引物GDH-3-F(SEQ IDNO:13)和GHD-3-R(SEQ ID NO:14)进行PCR扩增获得GDH基因的5’末端和3’末端片段。进一步地，使用一组引物SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16进行PCR扩增获得来自Tn5的neo基因(nptII)片段，其是具有卡那霉素抗性的基因。使用In-fusion HD克隆试剂盒(#PT5162-1,Clontech)将GDH基因的5’和3’末端片段以及卡那霉素抗性基因片段这三个片段克隆进入pGEM-3zf载体(#P2271,Promega Corp.)的SacI和XbaI限制性位点以制备pGz-dGDH。通过电穿孔将这样获得的这种载体转化进入K.xylinus。将转化的K.xylinus菌株接种在添加了100μg/ml卡那霉素的HS-琼脂培养基(0.5％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.27％Na₂HPO₄、0.15％柠檬酸、2％葡萄糖和1.5％细菌琼脂)上，然后在30℃下培养。选择具有卡那霉素抗性的菌株以缺失GDH基因。其结果是，确证了GDH基因的缺失，并将该菌株命名为K.xylinus(Δgdh)。

(2)引入PPDK基因

将来自木驹形杆菌、费氏丙酸杆菌、纹膜醋酸杆菌和共生梭菌的各PPDK基因(即SEQ ID NOS：5至8所示的核苷酸序列)分别引入K.xylinus和K.xylinus(Δgdh)。具体引入步骤如下：

通过使用一组引物SEQ ID NOS：17和18作为引物以及木驹形杆菌的基因组序列作为模板进行PCR获得来自微生物的PPDK基因。通过使用一组引物SEQ ID NOS：19和20作为引物以及费氏丙酸杆菌的基因组序列作为模板进行PCR获得来自微生物的PPDK基因。通过使用一组引物SEQ ID NOS：21和22作为引物以及纹膜醋酸杆菌的基因组序列作为模板进行PCR获得来自微生物的PPDK基因。将来自共生梭菌PPDK核苷酸序列的密码子优化为木驹形杆菌的密码子，并合成。通过使用一组引物SEQ ID NOS：23和24作为引物以及经密码子优化的共生梭菌PPDK核苷酸序列作为模板进行PCR获得来自微生物的PPDK基因。

使用In-fusion HD克隆试剂盒(#PT5162-1,Clontech)将各基因克隆进入pCSa载体(SEQ ID NO:25)的PstI限制性位点以使得其在Tac启动子条件下表达。通过电穿孔将这样获得的各载体转化进入K.xylinus。将转化的K.xylinus菌株接种在添加了100μg/ml氯霉素的HS-琼脂培养基(0.5％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.27％Na₂HPO₄、0.15％柠檬酸、2％葡萄糖和1.5％细菌琼脂)上，然后在30℃下培养。选择具有氯霉素抗性的菌株以制备过表达PPDK基因的菌株。

(3)葡萄糖消耗情况和纤维素生产情况

将指定的K.xylinus菌株菌株分别接种至含25ml HS培养基(0.5％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.27％Na₂HPO₄、0.15％柠檬酸和2％葡萄糖)或HSE培养基的125-mL烧瓶中，并且在230rpm和30℃下培养5天。HSE培养基与HS培养基相同，除了HSE培养基还包含1(v/v)％乙醇以外。然后，对葡萄糖消耗情况和生产纤维素的情况进行定量。在培养过表达PPDK基因的重组菌株期间，将100μg/ml氯霉素加入培养基中。培养后，对培养物进行过滤以除去细胞，并将培养物注入配有Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad,USA)的高效液相色谱(HPLC)对葡萄糖进行分析，并且在使用0.1N氢氧化钠和水洗涤烧瓶中形成的纤维素固体，在60℃下的烘箱中干燥纤维素固体，随后称重之后测定纤维素的生产情况。

结果见图1。图1显示了在振荡培养条件下引入PPDK基因的K.xylinus(Δgdh)菌株的纤维素纳米纤维(CNF)生产情况和葡萄糖消耗情况。如图1中所示，在HS培养基中，与K.xylinus(Δgdh)(对照组)相比，引入外源性PPDK基因的K.xylinus(Δgdh)(实验组)显示出葡萄糖消耗情况增加约2.9倍，其从3.6g/L增至10.31g/L，以及CNF生产情况增加约3.1倍，其从1.7g/L增至5.2g/L。在HSE培养基中，与对照组相比，实验菌株显示出葡萄糖消耗情况增加约1.3倍和CNF生产情况增加约1.2倍。在图1中，Koma△gdh表示K.xylinus(Δgdh)以及+Cs PPDK表示引入PPDK的K.xylinus(Δgdh)。

表1显示了在HS培养基中振荡培养条件下引入PPDK基因的K.xylinus(Δgdh)菌株的纤维素纳米纤维(CNF)生产情况和葡萄糖消耗情况。在表1中，Koma△gdh表示对照K.xylinus(△gdh)，以及Kx.PPDK、Pf.PPDK、Aa.PPDK和Cs.PPDK表示分别将来自木驹形杆菌、费氏丙酸杆菌、纹膜醋酸杆菌和共生梭菌的PPDK基因引入对照菌株制备的菌株。

[表1]

	葡萄糖消耗情况(g/L)	CNF(g/L)
			KomaΔgdh	2.9	1.4
Kx.PPDK	4.5	2.1
			Pf.PPDK	5.8	3.1
Aa.PPDK	3.6	2.6
			Cs.PPDK	10.31	5.2

(4)焦磷酸盐浓度的影响

在K.xylinus(△gdh)(对照组)和引入PPDK基因的K.xylinus(△gdh)(实验组)(即Cs.PPDK)中检测了根据焦磷酸盐(PPi)浓度的葡萄糖消耗情况和CNF生产情况。

除了将预定浓度的焦磷酸钠加入HS培养基以外，以同第(3)部分中相同的方式进行培养。

其结果是，当将5mM PPi加入对照组时，观察到葡萄糖的消耗和纤维素的合成受到抑制。然而，在实验菌株中，未观察到葡萄糖的消耗被抑制，且观察到甚至在5mM浓度下葡萄糖的消耗得到改善。

图2显示了根据焦磷酸盐(PPi)浓度的K.xylinus(△gdh)(对照组)和引入PPDK基因的K.xylinus(△gdh)(实验组)的葡萄糖消耗情况和CNF生产情况。

(5)Mg²⁺离子浓度的影响

在K.xylinus(△gdh)(对照组)和引入PPDK基因的K.xylinus(△gdh)(实验组)中检测了根据Mg²⁺离子浓度的葡萄糖消耗情况和CNF生产情况。

除了将预定浓度的Mg²⁺离子以MgSO₄形式加入HS培养基以外，以同第(3)部分中相同的方式进行培养。

结果如图3中所示。图3显示了根据Mg²⁺浓度的葡萄糖消耗情况和CNF生产情况。如图3中所示，葡萄糖消耗情况和纤维素生产情况随Mg²⁺离子浓度的增加而增加。表2显示了图3的结果。

[表2]

而且，还检测了由此生产的纤维素的重均分子量(DPw)和体积平均分子量(DPv)。

这里，通过粘度测定(DPv)和重均聚合度(DPw)确定的聚合度，测定CNF的聚合度(DP)。

对于DPw的检测而言，加入10mL吡啶和1mL异氰酸苯酯在100℃下作用48小时将5mg冻干的CNF样品衍生化。将衍生化的CNF加入2mL甲醇中，并进一步加入100mL 70％甲醇以固化衍生化的CNF，随后用水洗涤两次。在真空下从如此制备的CNF中除去水，然后每1mg CNF使用1ml四氢呋喃，随后在50℃下孵育1小时。利用凝胶渗透色谱(GPC)确定CNF的分子量、分子量分布和长度分布。在配有Waters 2414折射率检测器和Styragel HR2、HR4、HMW7柱的Waters Alliance e2695分离模块(Milford,MA,USA)上进行GPC实验。使用四氢呋喃作为洗脱液，流速为0.5mL/min。使用0.15μm的针筒式滤器(PTFE)过滤在四氢呋喃中孵育过的CNF，然后进样(进样体积：20μL)。使用聚苯乙烯(PS,#140)标准品校正曲线。

将15mg冻干的CNF在15mL 0.5M的铜铵乙二胺溶液中孵育约2小时，并通过粘度泵(ACS370)和粘度计(Ubbelohde)检测其粘度。

[表3]

应当理解，应将本申请所述的实施方式认为是仅具有描述性意义并且不是出于限制性目的。通常应将在每个实施方式中对特征或方面的描述认为是可供在其他实施方式中相似的特征或方面使用的。

尽管已经参照附图描述了一个或多个实施方式，但是本领域的普通技术人员应当理解在不脱离由下述权利要求所定义的主旨和范围的前提下，可以对其形式和细节进行各种改变。

<110> 三星电子株式会社

<120> 包含增加丙酮酸磷酸二激酶活性的基因修饰的重组微生物及其用途

<130> PX052944OV

<160> 25

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 891

<212> PRT

<213> 木驹形杆菌

<400> 1

Met Thr Lys Trp Val Tyr Ser Phe Gly Asp Gly Leu Asn Glu Gly Arg

1 5 10 15

Ala Glu Met Arg Asn Leu Leu Gly Gly Lys Gly Ala Asn Leu Ala Glu

20 25 30

Met Ala Ala Asn Gly Leu Pro Val Pro Pro Gly Phe Thr Ile Thr Thr

35 40 45

Glu Val Cys Ser Ala Phe Tyr Glu Asn Gly Arg Lys Tyr Pro Asp Asp

50 55 60

Leu Arg Ala Gln Val Ala Asp Ala Leu Ala Arg Val Glu Lys Ser Met

65 70 75 80

Gly Leu Arg Phe Gly Asp Ala Ala Ala Pro Leu Leu Val Ser Val Arg

85 90 95

Ser Gly Ala Arg Val Phe Met Pro Gly Met Met Asp Thr Val Leu Asn

100 105 110

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<213> 纹膜醋酸杆菌

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<210> 4

<211> 840

<212> PRT

<213> 共生梭菌

<400> 4

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Lys Thr Phe Glu Leu Gly Gly His Thr Phe Ala Glu Gly Asp Tyr Ile

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<210> 5

<211> 2676

<212> DNA

<213> 木驹形杆菌

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ctgcggcagg gtggtttcca tcgggtgctg gcccgcctcg gcgcgcgcgc acgccatggg 1800

ctgcggcgtg cggatgcccg ccaccacatc ctcgccctgc gcgttgatga ggtattcgcc 1860

gtagaagatg ttctcgcccg ttgacggatc acgcgtgaag catacgccgg tggcgcagtc 1920

ctcgcccatg ttgccgaaca ccatggactg cacgttgacc gccgtgcccc atgaggccgg 1980

gatctcgtgc agcctgcggt aggtgttggc gcgcgggttc atccacgagc cgaacaccgc 2040

cccgatcgcg ccccagagct ggtcctgcgg gtcggtgggg aattcggtgc cggcatgggt 2100

gctgatgagg tggcggtaat cggccacaat ggtgcgccac tgctctgccg tgatggcggt 2160

gtcgtcttcc accttgctgg cgcgcttgaa ctgctcgagc acgtcctcga agtgatggtg 2220

gggcacgccc atcaccaccg agccgtacat ctggatgaag cggcggtagc tgtcccatgc 2280

gaagcgggca tcgccggagg agcgggcaag accttccacc gtctcgtcat tgaggccgag 2340

gttgagcacg gtatccatca tgcccggcat gaacacgcgc gcgcccgagc gcaccgagac 2400

cagcagcggg gccgcggcat cgccaaagcg caggcccatg gatttttcaa cccgcgccag 2460

cgcatcggca acctgggcgc gcaggtcatc gggatatttc cggccatttt cataaaaggc 2520

cgaacagact tccgttgtaa tggtgaagcc gggcggcacg ggcaggccat tggccgccat 2580

ttccgccagg ttggcgcctt tgccacccag aaggttgcgc atctccgcgc gcccttcgtt 2640

caggccatct ccgaagctat aaacccattt ggtcat 2676

<210> 6

<211> 2523

<212> DNA

<213> 费氏丙酸杆菌

<400> 6

atggcaaaat gggtttataa gttcgaagaa ggcaatgcat ctatgagaaa ccttcttgga 60

ggcaaaggct gcaaccttgc agagatgacc atcttaggaa tgccgattcc acagggcttt 120

actgtaacaa cagaagcttg tacagagtac tacaacagtg gaaaacagat cacacaggaa 180

attcaggatc agattttcga agctatcaca tggttagagg aactgaacgg caagaagttc 240

ggcgacactg aagatccgtt attagtatct gtacgttccg cggcccgcgc atccatgccg 300

ggtatgatgg ataccatcct gaaccttggt ttaaacgacg ttgcagtaga gggctttgca 360

aagaaaacgg gaaatccaag atttgcatat gattcttaca gaagatttat ccagatgtat 420

tccgacgtag ttatggaagt tccgaagtcc catttcgaga aaatcatcga tgcgatgaaa 480

gaagaaaagg gcgttcactt cgatacagac ctgactgccg atgatttaaa agagctggct 540

gagaagttca aagctgttta caaagaggct atgaacggcg aagagttccc acaggagccg 600

aaggatcagt taatgggcgc tgttaaagca gttttccgtt cctgggacaa ccctcgtgca 660

atcgtatacc gccgtatgaa cgatatccct ggagactggg gtactgcagt taacgttcag 720

accatggtat ttggtaacaa gggcgagacc agcggtacag gcgttgcctt cacacgtaac 780

ccatccacag gtgaaaaagg catctacggt gagtacctga tcaatgcaca gggcgaggac 840

gtagttgcag gtgtccgcac accacagcct atcacccagt tagagaacga tatgcctgac 900

tgctacaagc agttcatgga tctggccatg aagctggaga aacatttccg tgacatgcag 960

gatatggagt tcacaatcga ggaaggtaaa ttatacttct tacagacacg taacggcaag 1020

agaacagctc cggctgctct tcagattgcc tgcgatttag tagacgaagg catgatcaca 1080

gaggaagagg ctgttgtaag aatcgaagca aaatctcttg atcagttact tcacccgacc 1140

ttcaacccgg ctgctttaaa ggccggcgaa gtaatcggtt ccgctcttcc ggcatctcct 1200

ggcgcagcag caggtaaagt atacttcacc gctgatgagg ctaaggctgc ccacgagaag 1260

ggtgagagag ttatccttgt tcgtcttgag acatctccgg aagatatcga aggtatgcat 1320

gcagccgaag gtatcctgac agtgcgcggc ggtatgacaa gccatgcagc cgtagttgca 1380

cgtggtatgg gaacatgctg cgtatccgga tgcggtgaga tcaagatcaa cgaagaagct 1440

aagacattcg aacttggcgg acacacattt gcagagggag attacatctc cttagatggt 1500

tccacaggta agatttacaa gggcgacatc gagactcagg aacgttccgt aagcggaagc 1560

ttcgagcgta tcatggtatg ggctgacaag ttcagaacat taaaggttcg tacaaatgcc 1620

gacacaccgg aagatacact caatgccgtt aaactgggtg cagagggcat cggtctttgc 1680

cgtacagagc atatgttctt cgaggctgac agaatcatga agatcagaaa gatgatcctt 1740

tccgattcag tggaagcaag agaagaggct ctgaacgaat taatcccgtt ccagaagggc 1800

gatttcaagg ctatgtacaa agctctggaa ggcaggccaa tgacggttcg ctacctggat 1860

ccgccgctgc atgagttcgt tcctcataca gaagaggagc aggctgaact ggctaagaac 1920

atgggcctta ctttagcaga agtaaaagca aaagttgacg aattacacga gttcaaccca 1980

atgatgggcc atcgtggctg ccgtcttgca gttacctatc cggaaattgc aaagatgcag 2040

acaagagccg ttatggaagc tgctatcgaa gtgaaggaag agacaggaat cgatattgtt 2100

cctgagatca tgattccgtt agttggcgag aagaaagagc ttaagttcgt taaggacgta 2160

gttgtggaag tagctgagca ggttaagaaa gagaaaggtt ccgatatgca gtaccacatc 2220

ggtaccatga tcgaaattcc tcgtgcagct ctcacagcag atgccatcgc tgaggaagca 2280

gagttcttct ccttcggtac aaacgactta acacagatga cattcggctt ctcccgtgac 2340

gacgccggca agttcctgga ttcctactat aaagcaaaaa tttatgagtc cgatccattc 2400

gcaagacttg accagacagg cgttggccag ttagtagaga tggcagttaa gaaaggccgt 2460

cagacacgtc cgggccttaa gtgcggcatc tgcggcgagc acggcgagat ccttcttccg 2520

tag 2523

<210> 7

<211> 2673

<212> DNA

<213> 纹膜醋酸杆菌

<400> 7

atgacgaaat gggtttacag cttcggtggc ggcctgaacg aaggcagcgc cggaatgcgc 60

aatctgcttg gtggcaaagg cgccaacctg gcggagatgg cttccatcgg actgccagtg 120

cctcccggtt ttaccatcac gaccgaagta tgctcggcat actacgataa cggcaatgcc 180

tacccggctg accttgcaga gcaggtcgcg gcggcccttc atcgcgttga gaaatcggtt 240

ggtctggtct ttggcgacgc cactgcaccg ctgctggttt cggtccgctc gggcgcccgc 300

gtctccatgc caggcatgat ggataccgtt ctcaatctcg gtctgaatga cgagacggtt 360

gaaggtctgg cggcttcctc caaggacgag cggttcgcct gggacagcta tcgccgcttc 420

atccagatgt atggttccgt cgtgatgggc gtgccgcatc accgtttcga ggatctgctg 480

gagcaggcca agcacggtct gggcgttaca gacgacacgg ccatcaaggc ttccgactgg 540

cgcgagatcg tcaaggacta caaggatatc gttcagaaag agaccggcaa gccgttcccg 600

aacgatccgc aggagcagct ctggggcgcc atcagcgccg tgttcggctc ctggatgaac 660

ccgcgcgccc acacctaccg caagctgcat gacattcccg caagctgggg caccgccgtc 720

aacgtgcagg cgatggtctt cggcaacatg ggcgatgact gtgcgaccgg cgtgtgcttc 780

acccgtgatc cgtctaccgg cgaaaacatc ttctacggcg agtatctggt caacgcgcag 840

ggcgaagatg tcgtggcggg tatccgcacg ccgcagccca tgtccgccgc ccgtgcggct 900

gccgatcagt ctccgatgga gaaggtcctg ccggaagcct acaaggaact catgcgtgtg 960

cgtgacatcc ttgaaaagca ctatcgcgac atgcaggaca tcgagttcac ggtgcagagc 1020

aacgtgctct acatgctcca gacccggtcc ggtaagcgta cagcagccgc tgctctcaag 1080

atcgccatcg acatggcgca ggaaggcctg atcacgcagg aagaagccat ccagcgcgtc 1140

ccacccggct cgctcgacca gcttctgcac ccgacgctcg acccgaaagc cgagaagaac 1200

ctgttctccc gtggcctccc ggcctctccg ggtgccgctg ccggtgcaat cgtctttacg 1260

gctgaagaag tcgaagaccg cgccgccaag ggtgaagatg tcattctggt ccgtatcgaa 1320

acctcaccgg aagacgtgca tggcatgcac gcagcccgtg gcgttctgac gacccgtggt 1380

ggcatgacgt ctcacgccgc cgtcgtggcg cgtggtatgg gtcgtgtctg cgtagctggc 1440

gccggcggta tcaccgtcga ctacaaggcg cagaccatga cggtcggcaa tgtcacgctg 1500

aaaggtggcg actggatcac cctcgatggt ggcacgggcg ctgtctatgt cggcaaggtt 1560

gcgaccattc ccccgactct ctcgggtgac ttcagcacac tgatgggctg ggcggatgaa 1620

gtccgtcgcc tgcgcgttcg tgcaaacgcc gagacaccgg aagatgccga gacagcccgt 1680

cgcttcggtg ccgaaggcat cggtctgagc cgcacggagc acatgttctt cggtccggac 1740

cgtatcggtt ttgtccgtca gatgatcatg tccgacgatc cggcgacacg caaaaaggcg 1800

attgacgcgc tgctgccgtt ccagcgtgac gatttctcac agatcttccg catcatgagc 1860

ggcctgcctg tgacaatccg tctgctcgat ccgccgctgc atgagttcct ccctcacggc 1920

gagacggaac ttgaggaagt ggccactgcc ctcggtcagt ccgtggagtc cctgcgcgcc 1980

cgtcgctcgg ctctctcgga agccaacccg atgctcggtc accgtggctg tcgtctcggc 2040

atcacctacc ccgagatcta tgcgatgcag gttcgcgcca tcatcgaggc cgctatcgcc 2100

gtctcgaaag agaccggaca ggccatcgtt cctgaaatca tgatcccgct tgtgggcatg 2160

aagacggaac tcgaggtgac ccgcaaggca gcggaagctg aagtcgctgc agtcttcaag 2220

gaacagggca cgacgcttga ttacctcatc ggcaccatga tcgaactgcc gcgcgcagcg 2280

atcacggcag gccagattgc ggacgtggcg gacttcttct cattcggcac caacgatctg 2340

acccagacca cactcggtct gtctcgtgat gatgccggtt cgttcctgcc ctactacgtc 2400

gatcacggcc ttctgccgaa agacccgttc gtctcgatcg accgtgaagg cgtaggggct 2460

ctggtgcgta tgggtgcgga aaatggtcgc aagaccaagt ccaacctgaa gcttggcgtc 2520

tgcggcgaac atggcggcga tccggactcc atcgcgttct tcgagagcgt tgggctggat 2580

tacgtttcct gttctccgtt ccgcgtgccg gtggcccgtc ttgccgcagc tcaggctgcc 2640

ttggcggcta aaaaggcaaa agcctcatcc tga 2673

<210> 8

<211> 2523

<212> DNA

<213> 共生梭菌

<400> 8

atggccaagt gggtctacaa gttcgaggag gggaacgcca gcatgcggaa cctgctgggc 60

gggaaggggt gtaacctggc cgaaatgacc atcctgggga tgccgatccc ccaggggttt 120

accgtcacca cggaagcctg tacggaatac tacaactcgg ggaagcagat cacgcaggag 180

atccaggacc agatcttcga ggccatcacg tggctggagg agctgaacgg caagaagttc 240

ggcgacaccg aggacccgct gctggtcagc gtccgctccg cggcccgcgc ctccatgccg 300

gggatgatgg ataccattct gaatctgggg ctgaacgatg tggccgtcga aggctttgcc 360

aaaaagacgg gcaacccccg gtttgcctat gacagctacc ggcggtttat ccagatgtac 420

tccgacgtcg tgatggaggt gccgaagtcc cacttcgaga agatcatcga cgcgatgaag 480

gaggagaagg gcgtgcactt cgacacggac ctgaccgccg acgacctgaa ggagctggcg 540

gagaagttca aggcggtgta caaggaggcg atgaacggcg aggagttccc ccaggagccg 600

aaggaccagc tgatgggcgc ggtgaaggcc gtgttccgct cctgggataa cccgcgcgcc 660

attgtctatc gccgcatgaa tgacatcccc ggcgattggg gcaccgccgt gaacgtgcag 720

acgatggtgt ttgggaacaa gggcgaaacc agcgggacgg gcgtggcctt cacgcgcaac 780

ccctccacgg gcgaaaaagg catttatggg gaatacctga tcaacgccca gggcgaagat 840

gtggtggccg gggtccgcac gccccagccc atcacccagc tggaaaatga tatgcccgat 900

tgctacaaac agttcatgga cctggccatg aagctggaga agcacttccg cgacatgcag 960

gacatggagt tcacgatcga ggaagggaag ctgtacttcc tgcagacgcg caacggcaag 1020

cggacggcgc cggcggccct gcagattgcc tgcgatctgg tcgatgaagg catgatcacg 1080

gaggaggaag cggtggtccg gatcgaagcc aaaagcctgg accagctgct gcatccgacc 1140

ttcaacccgg cggcgctgaa agccggcgaa gtcatcgggt ccgcgctgcc ggccagcccc 1200

ggcgccgcgg cggggaaagt ctacttcacc gcggatgaag cgaaagcggc ccatgaaaaa 1260

ggcgaacggg tgatcctggt gcgcctggaa acgagcccgg aagatatcga agggatgcat 1320

gccgccgaag ggatcctgac ggtgcgcggc gggatgacga gccatgccgc cgtcgtggcc 1380

cgcgggatgg gcacgtgctg cgtctccggc tgcggggaaa tcaaaatcaa cgaagaagcg 1440

aaaacgttcg aactgggcgg ccatacgttt gccgaaggcg attatatctc gctggatggg 1500

tcgacgggga aaatttataa aggcgatatc gaaacccagg aacgctcggt cagcggcagc 1560

ttcgaacgca tcatggtctg ggcggataaa ttccggacgc tgaaggtgcg caccaatgcc 1620

gataccccgg aagataccct gaatgccgtg aagctgggcg cggaaggcat cgggctgtgc 1680

cgcaccgaac acatgttctt cgaagcggat cggatcatga agatccggaa gatgatcctg 1740

tcggattcgg tggaagcccg ggaagaagcg ctgaatgaac tgatcccgtt ccagaagggc 1800

gatttcaagg cgatgtataa ggcgctggag ggccgcccca tgacggtgcg ctatctggac 1860

ccgccgctgc atgaattcgt gccccatacc gaagaagagc aggcggaact ggcgaagaat 1920

atgggcctga ccctggccga agtcaaggcc aaggtggacg aactgcacga attcaatccc 1980

atgatgggcc accgcggctg ccgcctggcg gtgacctatc cggaaatcgc gaagatgcag 2040

acccgggccg tgatggaggc ggcgattgag gtgaaggaag agaccggcat cgatatcgtg 2100

cccgagatta tgatcccgct ggtgggcgag aagaaggagc tgaagttcgt gaaggacgtc 2160

gtggtggagg tcgcggagca ggtgaagaag gagaaggggt cggacatgca gtatcatatc 2220

gggaccatga ttgagattcc ccgcgcggcg ctgaccgcgg acgccattgc ggaggaggcg 2280

gagttcttct cgttcgggac caatgacctg acccagatga cctttggctt ttcgcgcgac 2340

gacgccggca agtttctgga ctcgtattat aaggcgaaga tttatgagtc ggaccccttt 2400

gcgcggctgg atcagaccgg cgtgggccag ctggtcgaga tggcggtgaa gaagggccgc 2460

cagacccgcc cgggcctgaa gtgcggcatt tgcggcgagc atggcgagat tctgctgccg 2520

tga 2523

<210> 9

<211> 796

<212> PRT

<213> 木葡糖酸醋杆菌

<400> 9

Met Asn Ser Leu Met Arg Ser Ala Pro Leu Leu Ala Ala Ala Ile Ala

1 5 10 15

Val Cys Ala Leu Thr Gly Leu Tyr Leu Leu Gly Gly Gly Leu Trp Leu

20 25 30

Cys Leu Ile Gly Gly Ser Phe Tyr Tyr Val Val Ala Gly Val Leu Leu

35 40 45

Leu Val Thr Ala Val Leu Leu Ala Arg Arg Gln Ala Met Ala Leu Thr

50 55 60

Val Tyr Ala Val Leu Leu Leu Gly Thr Met Val Trp Ala Val Gln Glu

65 70 75 80

Ala Gly Phe Asp Phe Trp Ala Leu Ala Pro Arg Gly Asp Ile Leu Val

85 90 95

Pro Ile Gly Ile Val Leu Ala Leu Pro Trp Val Thr Arg His Leu Gln

100 105 110

Pro Ala Ser Pro Ala Thr His Leu Pro Leu Phe Gly Ala Ile Gly Ala

115 120 125

Ala Val Val Val Val Gly Ala Ala Leu Thr Gln Asp Pro Gln Asp Ile

130 135 140

Ala Gly Ser Leu Pro Pro Val Ala Gln Asn Ala Pro Glu Pro Gly Asp

145 150 155 160

Ala His Gln Met Pro Asp Glu Asp Trp Gln Ala Tyr Gly Arg Thr Gln

165 170 175

Phe Gly Asp Arg Phe Ser Pro Leu Lys Gln Val Asn Ala Ser Asn Val

180 185 190

Gly Lys Leu Lys Val Ala Trp Thr Phe Arg Thr Gly Asp Leu Arg Gly

195 200 205

Pro Asn Asp Pro Gly Glu Ile Thr Asp Glu Val Thr Pro Ile Lys Ile

210 215 220

Arg Asp Thr Leu Tyr Leu Cys Thr Pro His Gln Ile Leu Phe Ala Leu

225 230 235 240

Asp Ala Lys Thr Gly Gln Gln Arg Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala

245 250 255

Tyr Asn Pro Thr Phe Gln His Leu Thr Cys Arg Gly Val Ser Tyr His

260 265 270

Glu Asp Arg Ala Asp Asp Ala Gln Ala Ala Asp Gly Ala Ala Ala Pro

275 280 285

Ala Glu Cys Ala Arg Arg Ile Phe Leu Pro Thr Asn Asp Gly Gln Leu

290 295 300

Phe Ala Leu Asp Ala Ala Thr Gly Ala Arg Cys Ala Ser Phe Gly Asn

305 310 315 320

Asn Gly Val Val Asn Leu Gln Asp Gly Met Pro Val Lys Thr Leu Gly

325 330 335

Phe Tyr Glu Pro Thr Ser Pro Pro Val Val Thr Asp Thr Thr Val Ile

340 345 350

Val Ser Gly Ala Val Thr Asp Asn Tyr Ser Thr His Glu Pro Ser Gly

355 360 365

Val Thr Arg Gly Phe Asp Val His Thr Gly Ala Leu Lys Trp Ala Phe

370 375 380

Asp Pro Gly Asn Pro Asp Pro Asn Glu Met Pro Ser Glu His His Thr

385 390 395 400

Phe Val Pro Asn Ser Pro Asn Ser Trp Ile Thr Ser Ser Tyr Asp Ala

405 410 415

Lys Leu Asp Leu Ile Tyr Ile Pro Met Gly Val Gln Thr Pro Asp Ile

420 425 430

Trp Gly Gly Asn Arg Gly Ala Asp Ala Glu Arg Tyr Ala Ser Ser Ile

435 440 445

Val Ala Leu Asn Ala Thr Thr Gly Arg Leu Val Trp Ser Tyr Gln Thr

450 455 460

Val His His Asp Leu Trp Asp Met Asp Ile Pro Ala Gln Pro Ser Leu

465 470 475 480

Val Asp Ile Arg Asn Glu Gln Gly Glu Val Ile Pro Thr Leu Tyr Ala

485 490 495

Pro Ala Lys Thr Gly Asn Ile Phe Val Leu Asp Arg Arg Asn Gly Gln

500 505 510

Pro Val Val Pro Ala Pro Glu His Pro Val Pro Gln Gly Ala Ala Pro

515 520 525

Gly Asp His Val Ser Pro Thr Gln Pro Phe Ser Glu Leu Ser Phe Arg

530 535 540

Pro Lys Lys Leu Leu Thr Asp Ala Asp Met Trp Gly Gly Thr Met Tyr

545 550 555 560

Asp Gln Leu Val Cys Arg Ile Met Phe His Arg Leu Arg Tyr Glu Gly

565 570 575

Thr Phe Thr Pro Pro Ser Leu Gln Gly Thr Leu Val Phe Pro Gly Asn

580 585 590

Leu Gly Met Phe Glu Trp Gly Gly Leu Ala Val Asp Pro Val Arg Gln

595 600 605

Ile Ala Ile Ala Asn Pro Ile Ala Ile Pro Phe Val Ser Lys Leu Ile

610 615 620

Pro Arg Gly Pro Asn Asn Pro Ala Thr Pro Asp Lys Ser Leu Pro Ser

625 630 635 640

Gly Ser Glu Ser Gly Val Gln Pro Gln Phe Gly Val Pro Tyr Gly Val

645 650 655

Asp Leu His Pro Phe Leu Ser Pro Phe Gly Leu Pro Cys Lys Gln Pro

660 665 670

Ala Trp Gly Tyr Met Ser Gly Ile Asp Leu Arg Thr Asn Lys Ile Val

675 680 685

Trp Lys His Arg Asn Gly Thr Ile Arg Asp Ser Ala Pro Leu Pro Leu

690 695 700

Pro Ile Lys Met Gly Val Pro Ser Leu Gly Gly Pro Leu Thr Thr Ala

705 710 715 720

Gly Gly Val Ala Phe Leu Thr Ser Thr Leu Asp Tyr Tyr Ile Arg Ala

725 730 735

Tyr Asp Val Thr Asn Gly Gln Val Leu Trp Gln Asp Arg Leu Pro Ala

740 745 750

Gly Gly Gln Ser Thr Pro Met Thr Tyr Ala Val Asp Gly Lys Gln Tyr

755 760 765

Ile Val Thr Ala Asp Gly Gly His Gly Ser Phe Gly Thr Lys Leu Gly

770 775 780

Asp Tyr Ile Val Ala Tyr Ser Leu Pro Asp Gly Asn

785 790 795

<210> 10

<211> 2391

<212> DNA

<213> 木葡糖酸醋杆菌

<400> 10

atgaatagcc tcatgcgctc ggctcccctt ctcgctgcgg ccattgccgt ctgcgccctg 60

acgggtctct acctgctggg aggcgggcta tggctgtgtc tcatcggcgg ctccttttat 120

tatgttgtcg ccggtgtgct gctgctggtc acggccgtgc tgctggcgcg gcggcaggcc 180

atggcgctta cggtctatgc cgtgctcctg ctcggcacga tggtgtgggc cgtgcaggaa 240

gccgggtttg atttctgggc gctcgcaccg cggggcgata ttctggtgcc catcggcatc 300

gtgctcgccc tgccgtgggt cacacgtcac ctgcagcctg ccagccccgc cacccacctg 360

cccctgttcg gcgcaattgg cgccgccgtg gtcgtcgttg gcgcggccct gacgcaggac 420

ccgcaggata tcgcgggcag cctgccccca gtcgcgcaga atgcccccga gccgggcgat 480

gcccaccaga tgcctgatga ggactggcag gcctatggcc gcacccagtt cggtgaccgg 540

ttctccccgc tcaagcaggt caatgccagt aatgtcggca aactgaaggt ggcctggacc 600

ttccgcaccg gcgacctgcg cggccccaat gaccccggtg aaatcaccga tgaggtcacc 660

cccatcaaga tccgtgatac gctctatctg tgcacccccc accagatcct gttcgcgctc 720

gatgcgaaga ccggccagca gcggtggaag tttgacccca agctggccta caaccccacc 780

ttccagcacc tgacctgccg tggcgtgtcc tatcatgagg acagggcgga tgacgcgcag 840

gcagccgatg gtgccgcagc cccggccgag tgcgcgcgcc gcatcttcct gcccaccaat 900

gatggccagc ttttcgcgct cgatgccgca accggcgcgc gctgcgcaag ctttggcaat 960

aatggcgtgg tgaacctgca ggacggcatg ccggtcaaga cgctgggctt ttatgaaccg 1020

acctcccccc cggtcgtgac cgataccacc gtgatcgtgt ccggcgccgt gaccgacaac 1080

tattccacgc atgagccttc gggggttacg cgcggcttcg acgtgcatac cggcgcgctg 1140

aaatgggcgt tcgaccccgg caatcccgat ccgaacgaga tgccgtccga gcaccacacc 1200

ttcgtgccga actcacccaa ttcgtggatc acgtcgtcct atgatgccaa gctggacctg 1260

atctacatcc ccatgggcgt gcagacgccc gatatctggg gcggcaaccg cggcgccgat 1320

gccgagcgct atgcaagctc catcgtggcg ctgaacgcca ccaccggcag gctggtctgg 1380

tcctaccaga ccgtgcacca cgacctgtgg gacatggaca tccccgccca gcccagcctg 1440

gtcgatatcc gcaacgaaca gggcgaggtc atccccaccc tgtatgcccc ggccaagacc 1500

ggcaacatct tcgtgcttga ccggcgcaac ggccagcccg tggtgcccgc ccccgagcac 1560

ccggtgccgc agggcgcagc ccctggcgat cacgtttcgc ccacgcagcc tttctcggag 1620

ctgagcttcc gccccaagaa gctgctgacc gatgccgata tgtggggcgg cacgatgtat 1680

gaccagctgg tctgccgcat catgttccac cgcctgcgct acgaaggcac attcacgccg 1740

ccttcgctgc agggcacgct ggtcttcccc ggcaatctcg gcatgttcga atggggcggc 1800

cttgcggtcg accccgtgcg ccagatcgcg attgccaacc ccatcgccat tccgttcgtc 1860

tccaaactga tcccgcgcgg cccgaacaac ccggcaacgc ctgacaagtc cctgccctcg 1920

ggctcggaga gtggcgtgca gccgcagttt ggcgtgcctt acggcgtgga cctgcatccg 1980

ttcctctcgc cgtttggcct gccgtgcaag cagcccgcct ggggctacat gtcgggcatc 2040

gacctgcgca ccaacaagat cgtgtggaag caccgcaacg gcacgatccg tgacagcgca 2100

ccgctgcccc tgcccatcaa gatgggcgtg cccagccttg gcggcccgct caccacggcg 2160

ggtggcgtgg ccttcctcac ttccacgctc gattactaca tccgcgccta tgacgtgacg 2220

aacggccagg tgctgtggca ggaccgcctg cctgccggtg gccagtccac gcccatgacc 2280

tatgcggtcg atggcaagca gtacatcgtc acggccgatg gcggccacgg gtcgttcggc 2340

accaaactcg gcgactacat cgtcgcctac agcctgcctg acgggaactg a 2391

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

tagaatactc aagcttggag ctaccagacc gtcca 35

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

tcagaccccg tagaacaaac atgccaaggt tgc 33

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

caacaccttc ttcacttgaa tggggtggcc ttg 33

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

tatagggcga attcgggcag gcggtcctgc cacag 35

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

tcacgccgcc ttcgcgtgaa gaaggtgttg ctga 34

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

aacaccagcg tgcccttcta cggggtctga cgc 33

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

cccggggatc ctctaatgac caaatgggtt tatagc 36

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

agcttgcatg cctgctcagg cggggttgcc aacctt 36

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

cccggggatc ctctaatggc aaaatgggtt tataag 36

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

agcttgcatg cctgcctacg gaagaaggat ctcgcc 36

<210> 21

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

cccggggatc ctctaatgac gaaatgggtt tacagc 36

<210> 22

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

agcttgcatg cctgctcagg atgaggcttt tgcctt 36

<210> 23

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

cccggggatc ctctaatggc caagtgggtc tacaag 36

<210> 24

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

agcttgcatg cctgctcacg gcagcagaat ctcgcc 36

<210> 25

<211> 3128

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pCSa 载体

<400> 25

gaattcagcc agcaagacag cgatagaggg tagttatcca cgtgaaaccg ctaatgcccc 60

gcaaagcctt gattcacggg gctttccggc ccgctccaaa aactatccac gtgaaatcgc 120

taatcagggt acgtgaaatc gctaatcgga gtacgtgaaa tcgctaataa ggtcacgtga 180

aatcgctaat caaaaaggca cgtgagaacg ctaatagccc tttcagatca acagcttgca 240

aacacccctc gctccggcaa gtagttacag caagtagtat gttcaattag cttttcaatt 300

atgaatatat atatcaatta ttggtcgccc ttggcttgtg gacaatgcgc tacgcgcacc 360

ggctccgccc gtggacaacc gcaagcggtt gcccaccgtc gagcgccagc gcctttgccc 420

acaacccggc ggccggccgc aacagatcgt tttataaatt tttttttttg aaaaagaaaa 480

agcccgaaag gcggcaacct ctcgggcttc tggatttccg atcacctgta agtcggacgc 540

gatgcgtccg gcgtagagga tccggagctt atcgactgca cggtgcacca atgcttctgg 600

cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg tcgtaaatca ctgcataatt 660

cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg 720

ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg 780

gaattgtgag cggataacaa tttcacacag ggacgagcta ttgattgggt accgagctcg 840

aattcgtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg gctgttttgg 900

cggatgagag aagattttca gcctgataca gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat 960

aaaacagaat ttgcctggcg gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc 1020

agaagtgaaa cgccgtagcg ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa 1080

ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct 1140

gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg 1200

ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccaggcatc 1260

aaattaagca gaaggccatc ctgacggatg gcctttttgc cttccgcttc ctcgctcact 1320

gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 1380

atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 1440

caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 1500

cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 1560

taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 1620

ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 1680

tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 1740

gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 1800

ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 1860

aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 1920

agaacagcat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 1980

agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 2040

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 2100

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa aggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa 2160

ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac 2220

ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg 2280

tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacata gatctcccgg gtaccgagct 2340

ctctagaaag aaggagggac gagctattga tggagaaaaa aatcactgga tataccaccg 2400

ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca gttgctcaat 2460

gtacctataa ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt tttaaagacc gtaaagaaaa 2520

ataagcacaa gttttatccg gcctttattc acattcttgc ccgcctgatg aatgctcatc 2580

cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat atgggatagt gttcaccctt 2640

gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt gaataccacg 2700

acgatttccg gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac ggtgaaaacc 2760

tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc aatccctggg 2820

tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc gcccccgttt 2880

tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg 2940

ttcatcatgc cgtttgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt 3000

actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaat ttttttaagg cagtttttta aggcagttat 3060

tggtgccctt aaacgcctgg ttgctacgcc tgaataagtg ataataagcg gatgaatggc 3120

agaaattc 3128

Claims

1.一种重组微生物，所述重组微生物包含增加丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)活性的基因修饰。

2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述基因修饰增加编码所述PPDK的基因的拷贝数。

3.根据权利要求1所述的重组微生物，所述PPDK是来自梭菌(Clostridium)属、驹形杆菌(Komagataeibacter)属、丙酸杆菌(Propionibacterium)属、醋杆菌(Acetobacter)属，农杆菌(Agrobacterium)属或埃希氏菌(Escherichia)属的PPDK。

4.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述PPDK属于EC 2.7.9.1。

5.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述PPDK是与SEQ ID NO:1至4所示的任一氨基酸序列具有95％或更高的序列同一性的多肽。

6.根据权利要求2所述的重组微生物，其中所述基因与SEQ ID NO:5至8所示的任一核苷酸序列具有95％或更高的序列同一性。

7.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述微生物属于梭菌属、驹形杆菌属、丙酸杆菌属、醋杆菌属，农杆菌属或埃希氏菌属。

8.根据权利要求1所述的重组微生物，所述微生物还包含降低膜结合葡萄糖脱氢酶活性的基因修饰。

9.根据权利要求8所述的重组微生物，其中所述基因修饰灭活或破坏编码所述膜结合葡萄糖脱氢酶的基因。

10.一种生产纤维素的方法，所述方法包括在培养基中培养重组微生物；并且从培养物中分离纤维素，所述重组微生物包含增加PPDK活性的基因修饰。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述基因修饰增加编码所述PPDK的基因的拷贝数。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述PPDK属于EC 2.7.9.1。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述微生物还包含降低膜结合葡萄糖脱氢酶活性的基因修饰。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述培养基含有1至15mM的Mg²⁺离子。

15.根据权利要求10所述的方法，其中所述PPDK是与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有95％或更高的序列同一性的多肽。

16.根据权利要求11所述的方法，其中所述基因与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有95％或更高的序列同一性。

17.根据权利要求10所述的方法，其中所述微生物属于驹形杆菌属、醋杆菌属、葡糖杆菌(Gluconobacter)属、埃希氏菌属或假单胞菌(Pseudomonas)属。

18.一种生产具有增强的纤维素生产能力的微生物的方法，所述方法包括将增加PPDK活性的基因修饰引入所述微生物中。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述微生物属于醋杆菌科。

20.根据权利要求18所述的方法，所述方法还包括引入降低膜结合葡萄糖脱氢酶活性的基因修饰。