KR20170129474A - 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 속 미생물, 그를 이용하여 셀룰로스를 생산하는 방법 및 상기 미생물을 생산하는 방법 - Google Patents

증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 속 미생물, 그를 이용하여 셀룰로스를 생산하는 방법 및 상기 미생물을 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 속 미생물, 그를 이용하여 셀룰로스를 생산하는 방법 및 상기 미생물을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 속 미생물, 그를 이용하여 셀룰로스를 생산하는 방법 및 상기 미생물을 생산하는 방법{Gluconacetobacter genus microorganism having enhanced cellulose productivity, method for producing cellulose using the same, and method for producing the microorganism}
증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 속 미생물, 그를 이용하여 셀룰로스를 생산하는 방법 및 상기 미생물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
미생물 배양을 통해 만들어진 셀룰로스는 글루코오스가 β-1,4 글루칸이라는 일차 구조로 존재하고, 이들이 여러 가닥의 피브릴(fibril)의 망상 구조를 이루고 있다. 상기 셀룰로스를 '바이오 셀룰로스 혹은 미생물 셀룰로스'라고도 한다.
이런 미생물 셀룰로스는 식물 셀룰로스와 달리 리그닌이나 헤미셀룰로스가 전혀 없는 순수한 셀룰로스 상태이며 섬유폭도 식물 셀룰로스 보다 100nm이하 수준으로 습윤성 흡수성 및 고강도 고탄력성 고내열 등의 특성을 가지고 있다. 이런 특성 때문에 미생물 셀룰로스는 화장품, 의료용, 식이섬유, 음향기기 진동판, 기능성 필름 등의 다양한 산업에 응용되어 개발되고 있다.
미생물 셀룰로스 생산 균주로는 Acetobacter, Agrobacteria, Rhizobia, 또는 Sarcina이 보고되고 있으며 그 중에서 특히 우수한 균주는 Komagataeibacter xylinum ('Acetobacter xylinum'이라고도 함)으로 알려져 있다. 호기적 조건에서 정치 배양하면 배양액 표면에 얇은 막 형태로 3차원 망상 조직의 셀룰로스가 형성된다.
ATP-의존성 프로테아제 ATPase (HslUV)는 열충격 단백질 HslV 및 HslU의 복합체로서, 세포 스트레스에 반응하여 많은 박테리아에서 발현된다. HslV 단백질은 프로테아제이며 HslU 단백질은 ATPase이다. 상기 복합체는 HslV 단백질 도데카머와 HslU 단백질 헥사머를 포함하는 것일 수 있다. HslV 단백질은 ATP-결합된 상태의 HslU 단백질과 복합체화된 때에만 필요하지 않거나 손상된 단백질을 분해하는 것으로 여겨진다. 상기 복합체는 진핵 생물의 프로데아좀(proteasome)의 선구자(ancestor)인 것을 여겨진다.
그러나, 상기한 종래 기술에 의하더라도 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 재조합 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물에 대한 요구가 있다.
일 양상은 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 글루콘아세토박터 속 미생물을 제공한다.
다른 양상은 상기 미생물을 이용하여 셀룰로스를 생산하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 미생물을 생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 세포, 단백질, 또는 효소의 활성의 검출가능한증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 주어진 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포, 단백질, 또는 효소 (예, 본래 또는 "야생형 (wild-type)" 세포, 단백질, 또는 효소)와 같은, 동일한 타입의 비교 세포, 단백질, 또는 효소의 수준 보다 더 높은 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포, 단백질, 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. "세포의 활성"이란 세포의 특정 단백질 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 상기 변형된 또는 조작된 세포, 단백질, 또는 효소의 활성은 동일 타입의 조작되지 않은 세포, 단백질, 또는 효소, 예를 들면, 야생형 세포, 단백질, 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 세포 중 특정 단백질 또는 효소의 활성은 모세포, 예를 들면, 조작되지 않은 세포 중의 동일 단백질 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 단백질 또는 효소의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
효소 또는 폴리펩티드의 활성 증가는 발현 증가 또는 비활성 (specific activity)의 증가에 의하여 얻을 수 있다. 상기 발현 증가는 효소 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되거나 카피 수가 증가되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자가 도입되는 미생물는 자체적으로 상기 유전자를 포함하는 것, 또는 포함하고 있지 않은 것일 수 있다. 상기 유전자는 그의 발현을 가능하게 하는 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 폴리 아데닐화 부위, 또는 그 조합과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 외부에서 도입되거나 또는 카피 수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 외부로부터 세포 내로 도입되는 유전자를 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. "이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미할 수 있다.
용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.
상기 유전자의 도입은 형질전환, 형질도입(transfection), 전기천공 (electroporation)과 같은 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. 상기 유전자는 운반체 (vehicle)를 통하여 도입되거나, 그 자체로서 도입될 수 있다. 본 명세서에 있어서, "운반체"란 연결되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 특정한 유전자의 도입을 매개하는 핵산 서열이라는 관점에서, 본 명세서에서 운반체는, 벡터, 핵산 구조체, 및 카세트와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 해석된다. 벡터에는 예를 들면 플라스미드 또는 바이러스 유래 벡터 등이 포함된다. 플라스미드란 추가의 DNA가 연결될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 고리를 포함한다. 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터, 예를 들면, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스, 또는 그 조합이 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 유전자의 조작은 당업계에 공지된 분자생물학적 방법에 의할 수 있다 (Roslyn M. Bill, Recombinant Protein Production in Yeast: Methods and Protocols (2012), R Daniel Gietz et al., Quick and easy yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method: Nature protocols (2007)).
반면, 본 명세서에서 사용된 용어 "불활성화된(inactivated)" 또는 "감소된(decreased)" 활성은 모세포 (예, 유전적으로 조작되지 않은 세포) 중에서 측정된 것보다 더 낮은 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 갖는 세포를 나타낸다. 또한, "불활성화된(inactivated)" 또는 "감소된(decreased)" 활성은 본래의 (original) 또는 야생형 (wild-type) 효소 또는 폴리펩티드보다 더 낮은 활성을 갖는 분리된 효소 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 불활성화된 또는 감소된 활성은 활성이 없는 것 (no activity)을 포함한다. 예를 들면, 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포 또는 효소에 대한 기질에서 생성물로의 효소 전환 활성이 상기 변형을 갖지 않은 세포 또는 효소, 예를 들면, 모세포 또는 "야생형 (wild-type)" 세포 또는 효소의 효소 전환활성에 비하여 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 효소 또는 세포의 감소된 효소 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 불활성화 또는 감소는 변형되지 않은 유전자를 갖는 세포, 예를 들면, 모세포 또는 야생형 세포에 비하여, 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우, 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 유전자 조작이 되지 않은 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다.
용어 "모세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 미생물에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상황에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 상기 모세포는 주어진 단백질 (예를 들면, GDH와 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질)의 불활성화된 또는 감소된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 미생물, 또는 주어진 단백질 (예를 들면, HslU와 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질)의 증가된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 미생물을 생산하는데 출발 물질 (starting material)로 사용된 세포일 수 있다. 더 설명하면, GDH를 코딩하는 유전자가 변형되어 세포 중 GDH 활성이 감소된 미생물에 대하여, 상기 모세포는 변형되지 않은 "야생형" GDH 유전자를 포함하는 미생물일 수 있다. 동일한 비교가 다른 유전적 변형에도 적용된다.
상기 효소의 활성은 상기 효소를 코딩하는 유전자의 결실(deletion) 또는 파괴(disruption)에 의하여 불활성화 또는 감소될 수 있다. 유전자의 상기 "결실 (deletion)" 또는 "파괴 (disruption)"는 상기 유전자의 일부 또는 전체의 돌연변이, 또는 프로모터 또는 터미네이터와 같은 상기 유전자의 조절 서열의 일부 또는 전체의 돌연변이로서, 자연적 유전자 산물에 비하여 상기 유전자가 발현되지 않거나 감소된 수준으로 발현되거나, 또는 활성이 없거나 감소된 활성을 갖는 유전자 산물 (예, 효소)을 발현하도록 하는 것일 수 있다. 상기 돌연변이는 상기 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 치환, 삽입, 결실 또는 전환을 포함할 수 있다. 상기 유전자의 결실 또는 파괴는 상동 재조합, 지향된 돌연변이유발 (directed mutagenesis), 또는 분자 진화 (molecular evolution)와 같은 유전적 조작법에 의해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 동일 유전자, 또는 유전자의 2 이상의 파라로그 (paralogs)를 포함한 경우, 하나 이상의 유전자는 제거 또는 파괴될 수 있다. 예를 들면, 상기 효소의 불활성화 또는 파괴는 상동 재조합에 의하여 야기될 수 있으며, 또는 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 하여 상기 유전자를 결실 또는 파괴되도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에 있어서 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어서 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전적 변형 (genetic modification)"이란 세포의 유전물질의 구성 또는 구조를 인위적으로 변경시키는 것을 포함한다.
일 양상은 ATP-의존성 프로테아제 ATPase (HslUV) 서브유니트 HslU의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic mdification)을 포함하는 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 재조합 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물을 제공한다.
ATP-의존성 프로테아제 ATPase (HslUV)는 열충격 단백질 HslV 및 HslU의 복합체로서, 세포 스트레스에 반응하여 많은 박테리아에서 발현된다. HslV 단백질은 프로테아제이며 HslU 단백질은 ATPase이다. 상기 복합체는 HslV 단백질 도데카머와 HslU 단백질 헥사머를 포함하는 것일 수 있다. HslV 단백질은 ATP-결합된 상태의 HslU 단백질과 복합체화된 때에만 필요하지 않거나 손상된 단백질을 분해하는 것으로 여겨진다. 상기 복합체는 진핵 생물의 프로테아좀(proteasome)의 선구자(ancestor)인 것을 여겨진다.
상기 HslU는 효소코드(EC) 3.4.25.2에 속하는 효소인 것일 수 있다. 상기 HslU는 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속, 에스케리키아 속, 또는 해모필루스 속 유래의 것일 수 있다. 상기 HslU는 예를 들면, K.xylinus, E.coli, 또는 Haemophilus influenzae 유래의 것일 수 있다.
상기 HslU는 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다.
상기 미생물에 있어서, 상기 유전적 변형은 HslU를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 HslU를 코딩하는 유전자가 도입된 것, 예를 들면 벡터와 같은 비히클을 통하여 도입된 것일 수 있다. 상기 HslU를 코딩하는 유전자는 염색체 내 또는 염색체 외에 존재할 수 있다. 도입된 HslU를 코딩하는 유전자는 복수 개, 예를 들면, 2이상, 5이상, 10이상, 10이상, 50이상, 100이상, 또는 1000이상일 수 있다.
상기 미생물은 Gluconacetobacter 속, 예를 들면, G. aggeris , G. asukensis, G. azotocaptans , G. diazotrophicus , G. entanii , G. europaeus , G. hansenii , G. intermedius, G. johannae , G. kakiaceti , G. kombuchae , G. liquefaciens, G. maltaceti , G. medellinensis , G. nataicola , G. oboediens , G. rhaeticus, G. sacchari , G. saccharivorans , G. sucrofermentans , G. swingsii , G. takamatsuzukensis , G. tumulicola , G. tumulisoli , 또는 G. xylinus("K. xylinus"라고도 한다)일 수 있다.
상기 미생물은 HslUV 중 HslU의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic mdification)을 포함하지만 서브유니트 HslV의 활성을 증가시키는 유전적 변형은 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 미생물은 피롤로퀴놀린-퀴논(pyrroloquinoline-quinone:PQQ)-의존성 글루코스 데히드로게나제(glucose dehydrogenase: GDH)의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 미생물은 GDH를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 서열번호 2의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 GDH 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기한 ATP-의존성 프로테아제 ATPase (HslUV) 서브유니트 HslU의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic mdification)을 포함하는 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 재조합 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물을 배지 중에서 배양하여 셀룰로스를 생성하는 단계; 및 상기 배양물로부터 상기 셀룰로스를 회수하는 단계를 포함하는 셀룰로스를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 ATP-의존성 프로테아제 ATPase (HslUV) 서브유니트 HslU의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic mdification)을 포함하는 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 재조합 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물을 배지 중에서 배양하여 셀룰로스를 생성하는 단계를 포함한다. 상기한 재조합 글루콘아세토박터 속 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 미생물 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다.
상기 배양에 선택되는 산물에 따라 특정한 미생물의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 배양의 조건은 선택되는 산물, 예를 들면, 셀룰로스 생산에 적합하게 적절히 조절될 수 있다. 상기 배양은 세포 증식을 위하여 호기성 조건에서 이루어질 수 있다. 상기 배양은 교반 없이 정치 배양 (static culture)하는 것일 수 있다. 상기 배양은 상기 미생물의 농도가 OD600=0.1 이하의 저농도에서 배양하는 것일 있다. 상기 미생물의 농도는 셀룰로스의 분비에 방해가 되지 않는 정도의 간격이 주어지도록 하는 농도일 수 있다.
용어, "배양 조건"은 미생물을 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 미생물가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함할 수 있다. 상기 탄소원은 자화가능한 당으로서, 글루코스, 프럭토스, 만노스, 또는 갈락토스를 포함할 수 있다. 상기 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 상기 질소원은 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 미생물을 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1% 내지 10%의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 미생물가 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.
상기 방법은 상기 배양물로부터 상기 셀룰로스를 회수하는 단계;를 포함한다. 상기 분리는 예를 들면 배지 상단에 형성된 셀룰로스 박막(cellulose pellicle)을 회수하는 것일 수 있다. 상기 셀룰로스 박막는 물리적으로 걷어내거나 배지를 제거함으로써 회수될 수 있다. 상기 분리는 셀룰로스 박막의 모양을 훼손시키지 않고 유지한 채로 회수하는 것일 수 있다.
다른 양상은 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물에 ATP-의존성 프로테아제 ATPase (HslUV) 서브유니트 HslU를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는, 셀룰로스 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법을 제공한다. HslU를 코딩하는 유전자를 도입하는 것을 상기 유전자를 포함하는 비히클을 상기 미생물에 도입하는 것일 수 있다. 상기 방법에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 유전자를 증폭하는 것, 상기 유전자의 조절 서열을 조작하는 것, 또는 상기 유전자 자체의 서열을 조작하는 것을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조작은 뉴클레오티드의 삽입, 치환, 전환 또는 부가인 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 미생물에 피롤로퀴놀린-퀴논(pyrroloquinoline-quinone:PQQ)-의존성 글루코스 데히드로게나제(glucose dehydrogenase: GDH)의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 도입하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 GDH를 코딩하는 유전자를 제거 또는 파괴시키는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 재조합 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물에 의하면, 셀룰로스를 고효율로 생산하는데 사용할 수 있다.
다른 양상에 따른 셀룰로스를 생산하는 방법에 의하면, 셀룰로스를 효율적으로 생산할 수 있다.
다른 양상에 따른 셀룰로스 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법에 의하면, 셀룰로스 생산능이 증가된 미생물을 효율적으로 제조할 수 있다.
도 1은 정치 배양한 경우 K.xylinus와 K.xylinus(HslU) 균주의 셀룰로스 나노섬유(cellulose nanofiber: CNF) 생산량을 나타낸 도면이다.
도 2는 정치 배양한 경우 K.xylinus(△gdh)와 K.xylinus(△gdh-HslU) 균주의 셀룰로스 나노섬유(cellulose nanofiber: CNF) 생산량을 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. HslU 유전자를 포함하는 K. xylinus 의 제작 및 셀룰로스의 생산
본 실시예에서는 K.xylinus (한국 미생물보존센터 KCCM 41431) 및 GDH 유전자가 결실된 K.xylinus에 HslU 유전자를 도입하고 상기 유전자가 도입된 미생물을 배양하여 셀룰로스를 생산함으로써, 상기 유전자의 도입이 셀룰로스 생산능에 미치는 영향을 확인하였다.
(1) GDH 유전자가 결실된 K. xylinus 의 제작
K.xylinus 중의 막 결합된 PQQ-의존성 글루코스 데히드로게나제(GDH) 유전자를 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 불활성화시켰다. 구체적 과정은 다음과 같다.
GDH 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실하기 위하여 GDH 유전자의 5' 말단과 3' 말단의 단편을 K.xylinus의 게놈 서열을 주형으로 하여 각각 GDH-5-F(서열번호 5)와 GHD-5-R(서열번호 6) 프라이머 세트와 GDH-3-F(서열번호 7)와 GHD-3-R(서열번호 8) 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. 또한 Tn5 유래 카나마이신 내성 유전자인 neo 유전자(nptII) 단편을 서열번호 12와 서열번호 13 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. 상기 GDH 유전자의 5' 말단 단편과 3' 말단 단편 및 카나마이신 저항성 유전자 단편 3종을 pGEM-3zf 벡터(#P2271, Promega Corp.)의 SacI과 XbaI 제한효소 위치에 In-fusion HD cloning kit(#PT5162-1, Clontech)를 이용하여 클로닝함으로써 pGz-dGDH를 제작하였다. 얻어진 벡터를 K.xylinus에 전기충격(electroporation) 방법에 의하여 형질도입하였다. 형질도입된 X.xylinus 균주를 100 ㎍/ml의 카나마이신이 첨가된 HS-agar 배지(peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, Na2HPO4 0.27%, Citric acid 0.15%, glucose 2%, 및 박토-아가 1.5%) 배지에 도말하여 30℃에서 배양했다. 카나마이신 내성을 갖는 균주를 선별함으로써 GDH 유전자가 결실되도록 하였다. 그 결과, GDH 유전자가 결실된 것을 확인하고, 이 균주를 K.xylinus(△gdh)로 명명하였다.
(2) HslU 유전자의 도입
K.xylinus 및 K.xylinus(△gdh)에 K.xylinus 유래의 HslU 유전자 (서열번호 3)를 도입하였다. 구체적인 도입 과정은 다음과 같다.
서열번호 9와 서열번호 10의 프라이머를 프라이머로 하고, K.xylinus의 게놈 서열을 주형으로 하여 PCR 함으로써 K.xylinus 유래의 HslU 유전자를 얻었다. 이를 pTSa(서열번호 11)의 SalI과 PstI 제한 효소 부위에 도입하여 Tac promoter 하에서 발현되도록 하였다. 이렇게 얻어진 균주를 각각 K.xylinus(pTSa-HslU) 및 K.xylinus(△gdh, pTSa-HslU)라 명명하였다.
(3) 셀룰로스 생산량의 확인
지정된 X.xylinus 균주를 HS 배지(peptone 0.5%, yeast extract 0.5%, Na2HPO4 0.27%, Citric acid 0.15%, 및 glucose 2%) 50ml을 함유한 250ml 플라스크(flask)에 접종하고 30℃에서 교반없이 정치 배양으로 또는 230rpm으로 교반하면서 4일 동안 배양하고, 그 산물을 측정하였다.
그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다. 도 1은 정치 배양한 경우 K.xylinus와 K.xylinus(HslU) 균주의 셀룰로스 나노섬유(cellulose nanofiber: CNF) 생산량을 나타낸 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, hslU 유전자가 K. xylinus에 도입되었을 때, CNF 생산량은 2.8g/L에서 5.2g/L로 85% 향상되었으며, 생산된 셀룰로스의 DPw 값과 DPv 값을 측정했을 때, DPw는 7410에서 7885로 6% 향상되었고, DPv 는 4727에서 5619로 약 19% 향상되었다. 또한, 교반 배양한 경우, hslU 유전자가 K. xylinus에 도입되었을 때, CNF 생산량은 3.8g/L 배지에서 6.4g/L 배지로 68% 향상되었으며, 생산된 셀룰로스의 DPw 값과 DPv 값을 측정했을 때, DPw는 7410에서 7885로 6% 향상되었고, DPv는 4727에서 5619로 약 19% 향상되었다. 이는 도입된 hslU가 셀룰로스 생산량 및 셀룰로스 나노섬유의 특징에 영향을 주었음을 나타낸다. 표 1은 정치 및 교반 배양한 경우 K.xylinus와 K.xylinus(HslU) 균주에 의하여 생산된 셀룰로스 나노섬유의 물성을 나타낸다.
배양 균주 평균 DPw 표준편차(±) DPv
교반
 K.xylinus 7410 288 4727
K.xylinus(HslU) 7885 21 5619
정치
 K.xylinus 7044 19 4029
K.xylinus(HslU) 7195 87 4290
여기서 CNF의 중합도(degree of polymerization: DP)는 점도 측정에 의하여 결정된 중합도(Degree of polymerization determined by viscosity measurement: DPv)와 평균중량 중합도(weight average degree of polymerization: DPw)로 측정하였다.
DPw는 동결건조된 CNF 샘플 5 mg을 피리딘(pyridine) 10 mL과 페닐 이소시아네이트(phenyl isocyanate) 1mL을 첨가하여 100℃에서 48시간 동안 유도체화하였다. 유도체화된 CNF를 메탄올 2 mL에 첨가한 후 70% 메탄올 100 mL을 추가하여 고형화하였으며, 이후 물로 2차례 세척(washing) 하였다. 이렇게 준비된 CNF는 진공(vacuum)을 이용하여 수분을 제거한 후 테트라히드로푸란(tetrahydrafuran) 1ml per 1 mg CNF로 50℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 겔 투과 크로마토그래피(gel permeation chromatography: GPC)를 사용하여 CNF의 분자량, 분자량 분포 및 길이 분포를 결정하였다. GPC 시험은 Waters 2414 refractive index detector 및 Styragel HR2, HR4, HMW7 column이 장착된, Waters Alliance e2695 separation module(Milford, MA, USA) 상에서 수행되었다. 용출 용매(eluent)로서 테트라히드로푸란을 유속 0.5 mL/min으로 사용하였다. 테트라히드로푸란 중에 인큐베이션된 CNF는0.15 um syringe filter(PTFE)로 여과한 뒤 주입하였다(주입 부피(injection volume): 20uL). 폴리스티렌 표준(polystyrene standards:PS, #140)을 곡선을 보정하기 위하여 사용하였다.
동결건조된 CNF 15 mg을 0.5M cupriethylenediamine 용액 15 mL에 약 2시간 인큐베이션한 후 visco pump (ACS370)와 viscometer (Ubbelohde) 통해 점성을 확인하였다.
도 2는 정치 배양한 경우 K.xylinus(△gdh)와 K.xylinus(△gdh-HslU) 균주의 셀룰로스 나노섬유(cellulose nanofiber: CNF) 생산량을 나타낸 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, K.xylinus(△gdh)에 hslU가 도입되었을 때 당소모량은 1.52 g/L에서 3.56 g/L로 134% 향상되었으며, 셀룰로스 생산량은 0.66 g/L에서 1.16 g/L로 75% 향상되었다. 또한, 교반 배양한 경우, K.xylinus(△gdh)에 hslU가 도입되었을 때 당소모량은 2.11 g/L에서 4.21 g/L로 98% 향상되었으며, 셀룰로스 생산량은 2.20 g/L에서 3.46 g/L로 57% 향상되었다. 표 2는 정치 및 교반 배양한 경우 K.xylinus(△gdh)와 K.xylinus(△gdh-HslU) 균주에 의하여 생산된 셀룰로스 나노섬유의 물성을 나타낸다.
배양 균주 평균 DPw 표준편차(±) DPv
교반
 K.xylinus(△gdh) 7020 45 4060
K.xylinus(HslU-△gdh) 8008 75 4412
정치
 K.xylinus(△gdh) 6793 119 3967
K.xylinus(△gdh-HslU) 8451 25 3866
상기한 바와 같이 K.xylinus에 HslU 유전자가 도입되거나 및 여기에 선택적으로 △gdh가 도입된 경우, 셀룰로스의 생산능이 현저하게 증가되었을 뿐만 아니라, 생산된 셀룰로스 나노섬유의 물성이 현저하게 향상되었다.
<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Gluconacetobacter genus microorganism having enhanced cellulose productivity, method for producing cellulose using the same, and method for producing the microorganism <130> PN113412KR <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 437 <212> PRT <213> K.xylinus <400> 1 Met Glu Ile Pro Asn His Thr Pro Arg Glu Ile Val Ser Glu Leu Asp 1 5 10 15 Arg Phe Ile Ile Gly Gln Gly Asp Ala Lys Arg Ala Val Ala Ile Ala 20 25 30 Leu Arg Asn Arg Trp Arg Arg Ala Gln Leu Pro Asp Ala Leu Arg Glu 35 40 45 Glu Val Val Pro Lys Asn Ile Leu Met Ile Gly Pro Thr Gly Cys Gly 50 55 60 Lys Thr Glu Ile Ala Arg Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gln Ala Pro Phe 65 70 75 80 Leu Lys Val Glu Ala Thr Lys Phe Thr Glu Val Gly Tyr Val Gly Arg 85 90 95 Asp Val Glu Ser Ile Ile Arg Asp Leu Ile Glu Val Ser Ile Asn Met 100 105 110 Leu Arg Asp Leu Arg Arg Arg Asp Val Glu Ala Asn Ala Gly Asp Ala 115 120 125 Ala Glu Lys Leu Leu Leu Asp Ala Leu Val Gly Glu Gly Ala Ser Ala 130 135 140 Glu Thr Arg Asn Lys Phe Arg Arg Met Leu Arg Ala Gly Glu Leu Glu 145 150 155 160 His Lys Glu Val Glu Ile Ser Ile Ala Glu Gly Gly Asn Pro Ala Gln 165 170 175 Ser Asp Met Pro Asn Met Thr Pro Gly Thr Val Ile Asn Phe Ser Asp 180 185 190 Met Met Lys Gly Phe Met Asn Arg Val Pro Gln Gln Lys Arg Met Thr 195 200 205 Val Ala Ala Ala Arg Ala Ala Leu Ile Arg Gln Glu Ala Asp Arg Met 210 215 220 Leu Asp Thr Glu Ala Leu Thr Arg Glu Ala Val Ala His Ala Gln Asp 225 230 235 240 His Gly Ile Val Phe Leu Asp Glu Ile Asp Lys Val Cys Ala Arg Ala 245 250 255 Ala Glu Gly Gly Ala Arg Gly Gly Asp Val Ser Arg Glu Gly Val Gln 260 265 270 Arg Asp Leu Leu Pro Leu Ile Glu Gly Thr Thr Val Ser Thr Lys Tyr 275 280 285 Gly Pro Val Arg Thr Asp His Ile Leu Phe Ile Ala Ser Gly Ala Phe 290 295 300 His Ile Ala Lys Pro Ser Asp Leu Leu Pro Glu Leu Gln Gly Arg Leu 305 310 315 320 Pro Ile Arg Val Glu Leu Ala Ser Leu Thr Arg Glu Asp Leu Arg Arg 325 330 335 Ile Leu Thr Glu Pro Glu His Ser Leu Leu Lys Gln Tyr Val Ala Leu 340 345 350 Leu Gly Thr Glu Asp Val Lys Leu Ser Phe Ser Asp Gly Ala Ile Asp 355 360 365 Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Asp Ile Asn Glu Arg Val Glu Asn Ile 370 375 380 Gly Ala Arg Arg Leu Ala Thr Val Leu Glu Arg Leu Leu Glu Asp Val 385 390 395 400 Ser Phe Thr Ala Ala Asp Arg Lys Gly Glu Ala Val Leu Ile Glu Ala 405 410 415 Ala Asp Val Gln Ala Arg Val Ala Pro Leu Ala Arg Lys Gly Asp Leu 420 425 430 Ser Arg Phe Ile Leu 435 <210> 2 <211> 796 <212> PRT <213> K.xylinus <400> 2 Met Asn Ser Leu Met Arg Ser Ala Pro Leu Leu Ala Ala Ala Ile Ala 1 5 10 15 Val Cys Ala Leu Thr Gly Leu Tyr Leu Leu Gly Gly Gly Leu Trp Leu 20 25 30 Cys Leu Ile Gly Gly Ser Phe Tyr Tyr Val Val Ala Gly Val Leu Leu 35 40 45 Leu Val Thr Ala Val Leu Leu Ala Arg Arg Gln Ala Met Ala Leu Thr 50 55 60 Val Tyr Ala Val Leu Leu Leu Gly Thr Met Val Trp Ala Val Gln Glu 65 70 75 80 Ala Gly Phe Asp Phe Trp Ala Leu Ala Pro Arg Gly Asp Ile Leu Val 85 90 95 Pro Ile Gly Ile Val Leu Ala Leu Pro Trp Val Thr Arg His Leu Gln 100 105 110 Pro Ala Ser Pro Ala Thr His Leu Pro Leu Phe Gly Ala Ile Gly Ala 115 120 125 Ala Val Val Val Val Gly Ala Ala Leu Thr Gln Asp Pro Gln Asp Ile 130 135 140 Ala Gly Ser Leu Pro Pro Val Ala Gln Asn Ala Pro Glu Pro Gly Asp 145 150 155 160 Ala His Gln Met Pro Asp Glu Asp Trp Gln Ala Tyr Gly Arg Thr Gln 165 170 175 Phe Gly Asp Arg Phe Ser Pro Leu Lys Gln Val Asn Ala Ser Asn Val 180 185 190 Gly Lys Leu Lys Val Ala Trp Thr Phe Arg Thr Gly Asp Leu Arg Gly 195 200 205 Pro Asn Asp Pro Gly Glu Ile Thr Asp Glu Val Thr Pro Ile Lys Ile 210 215 220 Arg Asp Thr Leu Tyr Leu Cys Thr Pro His Gln Ile Leu Phe Ala Leu 225 230 235 240 Asp Ala Lys Thr Gly Gln Gln Arg Trp Lys Phe Asp Pro Lys Leu Ala 245 250 255 Tyr Asn Pro Thr Phe Gln His Leu Thr Cys Arg Gly Val Ser Tyr His 260 265 270 Glu Asp Arg Ala Asp Asp Ala Gln Ala Ala Asp Gly Ala Ala Ala Pro 275 280 285 Ala Glu Cys Ala Arg Arg Ile Phe Leu Pro Thr Asn Asp Gly Gln Leu 290 295 300 Phe Ala Leu Asp Ala Ala Thr Gly Ala Arg Cys Ala Ser Phe Gly Asn 305 310 315 320 Asn Gly Val Val Asn Leu Gln Asp Gly Met Pro Val Lys Thr Leu Gly 325 330 335 Phe Tyr Glu Pro Thr Ser Pro Pro Val Val Thr Asp Thr Thr Val Ile 340 345 350 Val Ser Gly Ala Val Thr Asp Asn Tyr Ser Thr His Glu Pro Ser Gly 355 360 365 Val Thr Arg Gly Phe Asp Val His Thr Gly Ala Leu Lys Trp Ala Phe 370 375 380 Asp Pro Gly Asn Pro Asp Pro Asn Glu Met Pro Ser Glu His His Thr 385 390 395 400 Phe Val Pro Asn Ser Pro Asn Ser Trp Ile Thr Ser Ser Tyr Asp Ala 405 410 415 Lys Leu Asp Leu Ile Tyr Ile Pro Met Gly Val Gln Thr Pro Asp Ile 420 425 430 Trp Gly Gly Asn Arg Gly Ala Asp Ala Glu Arg Tyr Ala Ser Ser Ile 435 440 445 Val Ala Leu Asn Ala Thr Thr Gly Arg Leu Val Trp Ser Tyr Gln Thr 450 455 460 Val His His Asp Leu Trp Asp Met Asp Ile Pro Ala Gln Pro Ser Leu 465 470 475 480 Val Asp Ile Arg Asn Glu Gln Gly Glu Val Ile Pro Thr Leu Tyr Ala 485 490 495 Pro Ala Lys Thr Gly Asn Ile Phe Val Leu Asp Arg Arg Asn Gly Gln 500 505 510 Pro Val Val Pro Ala Pro Glu His Pro Val Pro Gln Gly Ala Ala Pro 515 520 525 Gly Asp His Val Ser Pro Thr Gln Pro Phe Ser Glu Leu Ser Phe Arg 530 535 540 Pro Lys Lys Leu Leu Thr Asp Ala Asp Met Trp Gly Gly Thr Met Tyr 545 550 555 560 Asp Gln Leu Val Cys Arg Ile Met Phe His Arg Leu Arg Tyr Glu Gly 565 570 575 Thr Phe Thr Pro Pro Ser Leu Gln Gly Thr Leu Val Phe Pro Gly Asn 580 585 590 Leu Gly Met Phe Glu Trp Gly Gly Leu Ala Val Asp Pro Val Arg Gln 595 600 605 Ile Ala Ile Ala Asn Pro Ile Ala Ile Pro Phe Val Ser Lys Leu Ile 610 615 620 Pro Arg Gly Pro Asn Asn Pro Ala Thr Pro Asp Lys Ser Leu Pro Ser 625 630 635 640 Gly Ser Glu Ser Gly Val Gln Pro Gln Phe Gly Val Pro Tyr Gly Val 645 650 655 Asp Leu His Pro Phe Leu Ser Pro Phe Gly Leu Pro Cys Lys Gln Pro 660 665 670 Ala Trp Gly Tyr Met Ser Gly Ile Asp Leu Arg Thr Asn Lys Ile Val 675 680 685 Trp Lys His Arg Asn Gly Thr Ile Arg Asp Ser Ala Pro Leu Pro Leu 690 695 700 Pro Ile Lys Met Gly Val Pro Ser Leu Gly Gly Pro Leu Thr Thr Ala 705 710 715 720 Gly Gly Val Ala Phe Leu Thr Ser Thr Leu Asp Tyr Tyr Ile Arg Ala 725 730 735 Tyr Asp Val Thr Asn Gly Gln Val Leu Trp Gln Asp Arg Leu Pro Ala 740 745 750 Gly Gly Gln Ser Thr Pro Met Thr Tyr Ala Val Asp Gly Lys Gln Tyr 755 760 765 Ile Val Thr Ala Asp Gly Gly His Gly Ser Phe Gly Thr Lys Leu Gly 770 775 780 Asp Tyr Ile Val Ala Tyr Ser Leu Pro Asp Gly Asn 785 790 795 <210> 3 <211> 1314 <212> DNA <213> K.xylinus <400> 3 atggaaatac ccaatcatac cccgcgtgag atcgtctccg aactcgaccg tttcatcatc 60 gggcagggtg atgccaagcg ggccgtggcc attgcgctgc gcaaccgctg gcgccgcgcc 120 cagttgcccg atgcgctgcg tgaggaggtg gtgcccaaga acatcctgat gatcgggccc 180 accggctgcg gcaagaccga gatcgcccgc cgcctcgcca agctcgcgca ggcgccgttc 240 ctcaaggtcg aggccaccaa attcaccgaa gtgggttacg tgggccgcga tgtggaaagc 300 atcatccgcg acctgatcga ggtctcgatc aacatgctgc gcgacctgcg gcgcagggat 360 gtcgaggcca atgccgggga cgccgccgag aagctcctgc tcgatgcgct ggtgggcgag 420 ggggcctcgg ccgagacccg caacaagttc cgccgcatgc tgcgcgcggg cgagcttgag 480 cacaaggaag tcgagatatc gattgccgag ggcggcaacc cggcccagtc cgacatgccg 540 aacatgacgc cgggcaccgt catcaacttc tcggacatga tgaagggctt catgaaccgc 600 gtgccgcagc aaaagcgcat gacagtggcc gcggcccgtg ccgccctgat ccggcaggaa 660 gcggaccgga tgctcgatac cgaggccctg acgcgcgagg ccgtggccca cgcgcaggac 720 cacggcatcg tctttctcga cgagatcgac aaggtgtgcg cccgtgccgc cgaagggggc 780 gcgcggggcg gcgatgtctc gcgtgagggc gtgcagcgcg acctgctgcc gctgatcgag 840 ggcaccaccg tctcgaccaa atacggcccg gtgcgcacgg atcatatcct gttcattgca 900 tccggcgcgt tccatattgc caagccatcc gacctgttgc ccgagttgca ggggcggttg 960 cccatccggg tggaactggc ctcgcttacg cgcgaggacc tgcgtcgcat cctgaccgag 1020 ccggagcatt cactgctcaa gcagtatgtt gccctgctgg gcacggagga tgtgaaactg 1080 tcgttcagcg acggggcgat agacgcgctg gcggagcttg cggcggatat taacgagcgg 1140 gttgaaaata tcggcgcgcg gcgtctggcc accgtgcttg agcgccttct ggaggatgtg 1200 tcctttaccg cagccgaccg caagggcgag gctgtgctga tcgaggctgc cgacgtgcag 1260 gccagggtcg cacccctggc ccgcaagggt gatctgagcc gctttatcct gtag 1314 <210> 4 <211> 2391 <212> DNA <213> K.xylinus <400> 4 atgaatagcc tcatgcgctc ggctcccctt ctcgctgcgg ccattgccgt ctgcgccctg 60 acgggtctct acctgctggg aggcgggcta tggctgtgtc tcatcggcgg ctccttttat 120 tatgttgtcg ccggtgtgct gctgctggtc acggccgtgc tgctggcgcg gcggcaggcc 180 atggcgctta cggtctatgc cgtgctcctg ctcggcacga tggtgtgggc cgtgcaggaa 240 gccgggtttg atttctgggc gctcgcaccg cggggcgata ttctggtgcc catcggcatc 300 gtgctcgccc tgccgtgggt cacacgtcac ctgcagcctg ccagccccgc cacccacctg 360 cccctgttcg gcgcaattgg cgccgccgtg gtcgtcgttg gcgcggccct gacgcaggac 420 ccgcaggata tcgcgggcag cctgccccca gtcgcgcaga atgcccccga gccgggcgat 480 gcccaccaga tgcctgatga ggactggcag gcctatggcc gcacccagtt cggtgaccgg 540 ttctccccgc tcaagcaggt caatgccagt aatgtcggca aactgaaggt ggcctggacc 600 ttccgcaccg gcgacctgcg cggccccaat gaccccggtg aaatcaccga tgaggtcacc 660 cccatcaaga tccgtgatac gctctatctg tgcacccccc accagatcct gttcgcgctc 720 gatgcgaaga ccggccagca gcggtggaag tttgacccca agctggccta caaccccacc 780 ttccagcacc tgacctgccg tggcgtgtcc tatcatgagg acagggcgga tgacgcgcag 840 gcagccgatg gtgccgcagc cccggccgag tgcgcgcgcc gcatcttcct gcccaccaat 900 gatggccagc ttttcgcgct cgatgccgca accggcgcgc gctgcgcaag ctttggcaat 960 aatggcgtgg tgaacctgca ggacggcatg ccggtcaaga cgctgggctt ttatgaaccg 1020 acctcccccc cggtcgtgac cgataccacc gtgatcgtgt ccggcgccgt gaccgacaac 1080 tattccacgc atgagccttc gggggttacg cgcggcttcg acgtgcatac cggcgcgctg 1140 aaatgggcgt tcgaccccgg caatcccgat ccgaacgaga tgccgtccga gcaccacacc 1200 ttcgtgccga actcacccaa ttcgtggatc acgtcgtcct atgatgccaa gctggacctg 1260 atctacatcc ccatgggcgt gcagacgccc gatatctggg gcggcaaccg cggcgccgat 1320 gccgagcgct atgcaagctc catcgtggcg ctgaacgcca ccaccggcag gctggtctgg 1380 tcctaccaga ccgtgcacca cgacctgtgg gacatggaca tccccgccca gcccagcctg 1440 gtcgatatcc gcaacgaaca gggcgaggtc atccccaccc tgtatgcccc ggccaagacc 1500 ggcaacatct tcgtgcttga ccggcgcaac ggccagcccg tggtgcccgc ccccgagcac 1560 ccggtgccgc agggcgcagc ccctggcgat cacgtttcgc ccacgcagcc tttctcggag 1620 ctgagcttcc gccccaagaa gctgctgacc gatgccgata tgtggggcgg cacgatgtat 1680 gaccagctgg tctgccgcat catgttccac cgcctgcgct acgaaggcac attcacgccg 1740 ccttcgctgc agggcacgct ggtcttcccc ggcaatctcg gcatgttcga atggggcggc 1800 cttgcggtcg accccgtgcg ccagatcgcg attgccaacc ccatcgccat tccgttcgtc 1860 tccaaactga tcccgcgcgg cccgaacaac ccggcaacgc ctgacaagtc cctgccctcg 1920 ggctcggaga gtggcgtgca gccgcagttt ggcgtgcctt acggcgtgga cctgcatccg 1980 ttcctctcgc cgtttggcct gccgtgcaag cagcccgcct ggggctacat gtcgggcatc 2040 gacctgcgca ccaacaagat cgtgtggaag caccgcaacg gcacgatccg tgacagcgca 2100 ccgctgcccc tgcccatcaa gatgggcgtg cccagccttg gcggcccgct caccacggcg 2160 ggtggcgtgg ccttcctcac ttccacgctc gattactaca tccgcgccta tgacgtgacg 2220 aacggccagg tgctgtggca ggaccgcctg cctgccggtg gccagtccac gcccatgacc 2280 tatgcggtcg atggcaagca gtacatcgtc acggccgatg gcggccacgg gtcgttcggc 2340 accaaactcg gcgactacat cgtcgcctac agcctgcctg acgggaactg a 2391 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdh 5 prime terminal forward primer <400> 5 tagaatactc aagcttggag ctaccagacc gtcca 35 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gdh 5 prime terminal reverse primer <400> 6 tcagaccccg 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gctccggcaa gtagttacag caagtagtat gttcaattag cttttcaatt 300 atgaatatat atatcaatta ttggtcgccc ttggcttgtg gacaatgcgc tacgcgcacc 360 ggctccgccc gtggacaacc gcaagcggtt gcccaccgtc gagcgccagc gcctttgccc 420 acaacccggc ggccggccgc aacagatcgt tttataaatt tttttttttg aaaaagaaaa 480 agcccgaaag gcggcaacct ctcgggcttc tggatttccg atcacctgta agtcggacgc 540 gatgcgtccg gcgtagagga tccggagctt atcgactgca cggtgcacca atgcttctgg 600 cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg tcgtaaatca ctgcataatt 660 cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg 720 ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc atcggctcgt ataatgtgtg 780 gaattgtgag cggataacaa tttcacacag ggacgagcta ttgattgggt accgagctcg 840 aattcgtacc cggggatcct ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg gctgttttgg 900 cggatgagag aagattttca gcctgataca gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat 960 aaaacagaat ttgcctggcg gcagtagcgc ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc 1020 agaagtgaaa cgccgtagcg ccgatggtag tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa 1080 ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct 1140 gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg 1200 ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg caggacgccc gccataaact gccaggcatc 1260 aaattaagca gaaggccatc ctgacggatg gcctttttgc cttccgcttc ctcgctcact 1320 gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 1380 atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 1440 caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 1500 cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 1560 taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 1620 ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 1680 tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 1740 gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 1800 ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 1860 aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 1920 agaacagcat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 1980 agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 2040 cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 2100 gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa aggctgtgca ggtcgtaaat cactgcataa 2160 ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac 2220 ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcggctc gtataatgtg 2280 tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacata gatctcccgg gtaccgagct 2340 ctctagaaag aaggagggac gagctattga tggagaaaaa aatcactgga tataccaccg 2400 ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca gttgctcaat 2460 gtacctataa ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt tttaaagacc gtaaagaaaa 2520 ataagcacaa gttttatccg gcctttattc acattcttgc ccgcctgatg aatgctcatc 2580 cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat atgggatagt gttcaccctt 2640 gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt gaataccacg 2700 acgatttccg gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac ggtgaaaacc 2760 tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc aatccctggg 2820 tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc gcccccgttt 2880 tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg 2940 ttcatcatgc cgtttgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt 3000 actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaat ttttttaagg cagtttttta aggcagttat 3060 tggtgccctt aaacgcctgg ttgctacgcc tgaataagtg ataataagcg gatgaatggc 3120 agaaattc 3128 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Km-F primer <400> 12 tcacgccgcc ttcgcgtgaa gaaggtgttg ctga 34 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Km-R primer <400> 13 aacaccagcg tgcccttcta cggggtctga cgc 33

Claims (20)

  1. ATP-의존성 프로테아제 ATPase (HslUV) 서브유니트 HslU의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic mdification)을 포함하는 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 재조합 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 HslU는 효소코드(EC) 3.4.25.2에 속하는 효소인 것인 미생물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 HslU는 K.xylinus, E.coli, 또는 Haemophilus influenzae 유래의 것인 미생물.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 HslU는 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것인 미생물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 HslU를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 것인 미생물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 것인 미생물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 미생물.
  8. 청구항 1에 있어서, Gluconacetobacter xylinus인 것인 미생물.
  9. 청구항 1에 있어서, 피롤로퀴놀린-퀴논(pyrroloquinoline-quinone:PQQ)-의존성 글루코스 데히드로게나제(glucose dehydrogenase: GDH)의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 포함하는 것인 미생물.
  10. 청구항 1에 있어서, GDH를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것인 미생물.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 유전적 변형은 서열번호 2의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것인 포함하는 미생물.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 GDH 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 미생물.을 갖는 것인 미생물.
  13. ATP-의존성 프로테아제 ATPase (HslUV) 서브유니트 HslU의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic mdification)을 포함하는 증가된 셀룰로스 생산능을 갖는 재조합 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물을 배지 중에서 배양하여 셀룰로스를 생성하는 단계; 및
    상기 배양물로부터 상기 셀룰로스를 회수하는 단계를 포함하는 셀룰로스를 생산하는 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 HslU는 효소코드(EC) 3.4.25.2에 속하는 효소인 것인 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 미생물은 K.xylinus인 것인 방법.
  16. 청구항 13에 있어서, 상기 HslU는 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것인 방법.
  17. 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 것인 방법.
  18. 청구항 13에 있어서, 상기 미생물은 피롤로퀴놀린-퀴논(pyrroloquinoline-quinone:PQQ)-의존성 글루코스 데히드로게나제(glucose dehydrogenase: GDH)의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 포함하는 것인 방법.
  19. 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter) 속 미생물에 ATP-의존성 프로테아제 ATPase (HslUV) 서브유니트 HslU를 코딩하는 유전자를 도입하는 단계를 포함하는, 셀룰로스 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 피롤로퀴놀린-퀴논(pyrroloquinoline-quinone:PQQ)-의존성 글루코스 데히드로게나제(glucose dehydrogenase: GDH)의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 도입하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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