CN114591996B - 一种凝结芽孢杆菌h-1的表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents
一种凝结芽孢杆菌h-1的表达载体及其构建方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114591996B CN114591996B CN202210426970.2A CN202210426970A CN114591996B CN 114591996 B CN114591996 B CN 114591996B CN 202210426970 A CN202210426970 A CN 202210426970A CN 114591996 B CN114591996 B CN 114591996B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vector
- replicon
- expression
- bacillus coagulans
- resistance gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000403952 Bacillus coagulans H-1 Species 0.000 title claims abstract description 42
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 238000010276 construction Methods 0.000 title abstract description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 95
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 52
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims abstract description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 32
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims abstract description 27
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims abstract description 27
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims abstract description 27
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 101100184605 Escherichia coli mobA gene Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 101100391699 Pseudomonas viridiflava gacA gene Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 101150055347 repA2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 101150107738 repB gene Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 40
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 19
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 6
- 101150026107 ldh1 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 2
- 241000770536 Bacillus thermophilus Species 0.000 claims description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 abstract description 18
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 abstract description 18
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 abstract description 18
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 abstract description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 abstract description 18
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 description 21
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 description 21
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 14
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 12
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 9
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 8
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 8
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 7
- 101150035026 mobA gene Proteins 0.000 description 7
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 6
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000006457 gys medium Substances 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 229940072172 tetracycline antibiotic Drugs 0.000 description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 4
- 241000252505 Characidae Species 0.000 description 3
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 230000007940 bacterial gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000006860 carbon metabolism Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 2
- 230000001973 epigenetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000012231 antisense RNA technique Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000000861 blow drying Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- -1 conjunctive transfer Chemical compound 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000006477 desulfuration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000023556 desulfurization Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000033607 mismatch repair Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 101150061166 tetR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007671 third-generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/11—Antisense
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种凝结芽孢杆菌H‑1的表达载体及其构建方法与应用，所述表达载体包括来源于载体pNW33N的复制子ori、复制子repB，来源于载体pKVM1的DNA转移起始位点oriT，抗性基因。本发明构建了携带四环素抗性基因的pNWMT质粒、携带卡那霉素抗性基因的pNWMK质粒和敲弱DNA甲基转移酶hsdM846表达的载体pNWMTAS，完成了凝结芽孢杆菌H‑1的基础基因操作工具，验证了反义RNA表达模块在凝结芽孢杆菌H‑1的关键基因的研究上的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种基于接合转移方法转化凝结芽孢杆菌H-1的表达载体及其应用。
背景技术
嗜热凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是芽孢杆菌属的重要成员，是一种革兰氏阳性，兼性厌氧，非致病性，产孢子、产乳酸菌。最佳生长温度为45～60℃，最佳生长pH值6.5～7.0。嗜热凝结芽孢杆菌具有耐热、适合开放式发酵、兼性厌氧、低能耗、高碳代谢速率、高转化率等优势，不仅是重要的益生菌，在工业上也具有重要地位。
异源表达系统是改造微生物，拓展微生物菌株应用范围的有力工具，已经在生物催化中被广泛的应用，例如精细化工生产、生物先修复和生物脱硫。合适的异源表达系统不仅可以使微生物的菌株改造或者构建变得容易，可以赋予基因工程菌优良的特性，使得利用生物催化剂进行大规模生产更经济可行。目前，只有很少的基因操作工具可以在凝结芽孢杆菌中工作，而且转化效率极低，很难进行操作。这限制了嗜热凝结芽孢杆菌的优良特性在工业和健康领域的应用。
研究基因的作用的常用方法是删除基因，但更多情况下，删除基因组靶标是不可行或不理想的。因为，有的基因是必需基因，细胞生存必不可少；有的细菌基因操作系统仍未完善建立，没有手段进行敲除，比如凝结芽孢杆菌。基因敲低可以实现中等或有条件的抑制。反义RNA介导的基因沉默技术目前已广泛用作常规工具。在基因治疗，调控细菌基因表达，质粒复制等领域有广泛应用。可以在不改变基因组的前提下对细菌的关键基因进行调控和研究。真核生物中的小RNA(sRNA)可以特异性敲低各种靶细胞中的基因表达，如siRNA和miRNA。sRNA由靶结合序列和Hfq伴侣蛋白组成，与之相比反义RNA可以单独发挥作用，更为便捷简单。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种基于接合转移方法转化凝结芽孢杆菌H-1的表达载体及开发一种可以在凝结芽孢杆菌H-1中应用的反义RNA工具。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供了一种基于接合转移方法转化凝结芽孢杆菌H-1的表达载体及其应用，优化了凝结芽孢杆菌H-1的接合转移方法和转化子验证方法，筛选出了四环素和卡那霉素两种可用抗生素及其工作浓度，使用反义RNA技术敲弱了甲基转移酶的表达，表现了良好的操作性和较高的转化率，远好于目前的电转化的转化方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的第一个方面是提供一种凝结芽孢杆菌H-1的表达载体，包括来源于载体pNW33N的复制子ori、复制子repB，来源于载体pKVM1的DNA转移起始位点oriT，抗性基因。
优选地，所述抗性基因为四环素抗性基因Tetr，载体命名为pNWMT，所述载体pNWMT的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述抗性基因为卡那霉素抗性基因Kanr，载体命名为pNWMK，所述载体pNWMK的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步，优选地，所述pNWMT载体还包括反义RNA表达模块。
优选地，所述反义RNA表达模块包括启动子Pldh1、限制酶识别位点、反义RNA序列、终止子TB5和终止子rrnB T1。
进一步，优选地，所述反义RNA序列以甲基转移酶hsdM846为目标基因，载体命名为pNWMTAS，所述载体pNWMTAS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
载体pNWMTAS的所述DNA元件，其中复制子ori和复制子repB来自载体pNW33N，四环素抗性基因Tetr来自载体pHY300PLK，DNA转移起始位点oriT来自载体pKVM1。反义RNA表达模块来自人工设计合成，其中启动子Pldh1来自凝结芽孢杆菌H-1，反义RNA序列是目标基因起始密码子前30nt的反义序列，终止子TB5来自枯草芽孢杆菌，终止子rrnB T1来自大肠杆菌
本发明的第二个方面是提供所述的表达载体在凝结芽孢杆菌H-1敲弱基因表达中的应用。
本发明的第三个方面是提供所述表达载体构建方法，包括以下步骤：
S1从载体pNW33N上PCR扩增出复制子ori和复制子repB片段，从载体pKVM1上PCR扩增出DNA转移起始位点oriT片段，从含有抗性基因的载体上PCR扩增出抗性基因片段；
S2将复制子ori和复制子repB片段和DNA转移起始位点oriT片段进行融合PCR；
S3将复制子ori、复制子repB和DNA转移起始位点oriT片段与抗性基因片段使用无缝克隆技术进行连接，即可得到目的载体；
S4将S3获得的目的载体转化到供体菌，再通过结合转移的方法，将目的载体转化到受体菌嗜热凝结芽孢杆菌H-1中。
优选地，所述结合转移的方法中，供体菌与受体菌以总OD600值以10：1的比例混合。
优选地，所述供体菌为大肠杆菌S17-1菌株。
本发明具有如下有益效果为：
1、利用实验室已有的穿梭载体pNW33N，pKVM1，pCas和pHY300PLK中的各元件，使用接合转移方法转化凝结芽孢杆菌H-1，构建了可以在大肠杆菌和凝结芽孢杆菌H-1中自主复制的载体pNWMT和pNWMK。并使用反义RNA表达模块研究了载体的可用性和在反义RNA技术的应用。
2、以pNWM质粒为基础，探索出高效准确的接合转移转化凝结芽孢杆菌H-1的方法和转化子的验证方法。在探索可用抗生素抗性基因的过程中，得到了携带四环素抗性基因的pNWMT质粒和携带卡那霉素抗性基因的的pNWMK质粒，摸索出了可以在凝结芽孢杆菌H-1中正常工作的两种抗生素及其工作浓度。基本完成了凝结芽孢杆菌H-1的基础基因操作工具。并以反义RNA技术敲弱凝结芽孢杆菌H-1DNA甲基转移酶hsdM846表达对其生长的影响为实例，考察了所构建载体在反义RNA技术应用中的优势。首先用本发明的载体pNWMT构建了对照菌株H1C，用载体pNWMTAS构建了敲弱DNA甲基转移酶hsdM846表达的工程菌H1AS846，使用这两株菌与野生H-1在活化两代的情况下测量其在50℃条件下的生长情况，发现H1AS846的生长被严重抑制。这表明本发明所构建的载体的实用性以及反义RNA表达模块在凝结芽孢杆菌H-1中的实用性，在对关键基因的研究上有更大的应用价值。
附图说明
图1是载体pNWMT的构建示意图；
图2是PCR验证载体PNWMT的电泳图(M1：分子标记物；O1：以载体PNWMT为模板，OriRep.f(KpnⅠ)和OriRep.r为引物进行PCR扩增的结果；J1：以载体PNWMT为模板，Mob.f和Mob.r为引物进行PCR扩增的结果；T1：以载体PNWMT为模板，TetR.f和TetR.R(KpnⅠ)为引物进行PCR扩增的结果)；
图3是载体PNWMK的构建示意图；
图4是PCR验证载体PNWMK的电泳图(M2：分子标记物；C2：对照；A2：以载体PNWMK为模板，KanR.f和KanR.r为引物进行PCR扩增的结果)
图5是载体PNWMTAS的构建示意图；
图6是PCR验证载体PNWMTAS的电泳图(M1：分子标记物；C2：对照；A2:以载体PNWMTAS为模板，AsRNA.f和AsRNA.r为引物进行PCR扩增的结果)；
图7是反义RNA敲弱DNA甲基转移酶hsdM846对生长的影响曲线图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
以下实施例中未注明具体方法的实验方法，按照常规方法，具体参见《分子克隆实验手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或者按照试剂和试剂盒制造厂商所建议的条件。
本发明所有用到的DNA元件和微生物菌株均来自已经公开发表文献资料，其序列信息和DNA本身均可以被公众获得，详见表1和表2；其他各种材料均系本发明构建，可以用本发明所述的方法进行再构造；
表1本实施例涉及的菌株列表
表2本实施例涉及的载体列表
表3本实施例涉及的引物列表
注：小写字母表示前后片段同源序列
实施例1通过接合转移转化凝结芽孢杆菌H-1的表达载体pNWMT的构建
质粒pNW33N是一种可以在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达的穿梭质粒，也被用于电转化凝结芽孢杆菌，但是目前电转化的效率极低，很难通过电转化稳定得到改造菌株。本实施例通过提取载体pNW33N的复制子ori和复制子repB，将其与载体pKVM1的DNA转移起始位点oriT，载体pHY300PLK的四环素抗性基因Tetr组合在一起，得到通过接合转移转化凝结芽孢杆菌H-1的表达载体pNWMT。
为此，首先以OriRep.f(KpnⅠ)和OriRep.r为引物从载体pNW33N上PCR扩增出复制子ori和复制子repB片段，以Mob.f和Mob.r为引物从载体载体pKVM1上PCR扩增出DNA转移起始位点oriT片段，以TetR.f和TetR.r为引物从载体pHY300PLK上PCR扩增出四环素抗性基因Tetr片段。然后，用引物OriRep.f(KpnⅠ)和Mob.r为引物将复制子ori和复制子repB片段和DNA转移起始位点oriT片段进行融合PCR。最后将复制子ori、复制子repB和DNA转移起始位点oriT片段与四环素抗性基因Tetr片段使用无缝克隆技术进行连接，即可得到目的载体pNWMT(图1)
在载体构建的过程中以四环素抗性作为四环素抗性基因是否插入的活性指标，构建好的载体使用PCR扩增的方法提供生物分子学证据证明是否正确。图2是用PCR方法对载体pNWMT进行验证的结果，由图可知用引物OriRep.f(KpnⅠ)和OriRep.r可以扩增出2000～2500bp的条带O1，这和克隆的复制子ori和复制子repB片段大小相符。用引物Mob.f和Mob.r可以扩增出1600～2000bp的条带J1，这和克隆的DNA转移起始位点oriT片段大小相符。用引物TetR.f和TetR.r可以扩增2000bp大小的条带T1，这与四环素抗性基因Tetr片段大小相符。说明载体pNWMT的构建是成功的。
进一步验证采用测序的方法，使用DNA测序的方法对对载体pNWMT最终进行验证，验证结果表明所测得的构建载体的序列和预计的完全一致。
实施例2通过接合转移转化凝结芽孢杆菌H-1的表达载体pNWMK的构建
在异源化改造微生物系统的过程中，抗生素抗性基因能起到筛选目标菌株和外缘压力维持质粒等重要作用。对于一个未曾进行基因操作的菌种，多开发可用的抗性基因有重要作用，可以为后续基因操作如CRISPR双质粒系统等的开发铺平道路。本实施例以pNWMT为基本骨架，开发出了第二种可以在嗜热凝结芽孢杆菌H-1中使用的抗性基因卡那霉素抗性基因。本实施例通过提取载体pNWMT的复制子ori和复制子repB，DNA转移起始位点oriT与载体pCas的卡那霉素抗性基因Kanr组合在一起，得到通过接合转移转化凝结芽孢杆菌的表达载体pNWMK(图3)。为此，首先以OriRepMob.f和OriRepMob.r为引物从载体pNWMT上PCR扩增出复制子ori、复制子repB和DNA转移起始位点oriT片段，以KanR.f和KanR.r为引物从载体pCas上PCR扩增出卡那霉素抗性基因Kanr片段。将复制子ori、复制子repB和DNA转移起始位点oriT片段与卡那霉素抗性基因Kanr片段使用无缝克隆技术进行连接，即可得到目的载体pNWMTK(图3)
在载体构建的过程中以卡那霉素抗性作为卡那霉素抗性基因是否插入的活性指标，构建好的载体使用PCR扩增的方法提供生物分子学证据证明是否正确。图4是用PCR方法对载体pNWMK进行验证的结果，由图可知用pNWMT作为模板(对照)时不能用引物KanR.f和KanR.r扩增出条带。用pNWMK作为模板用引物KanR.f和KanR.r可以扩增1000～1200bp大小的条带T1，这与卡那霉素抗性基因Kanr片段大小相符。说明载体pNWMK的构建是成功的。
进一步验证采用测序的方法，使用DNA测序的方法对对载体pNWMK最终进行验证，验证结果表明所测得的构建载体的序列和预计的完全一致。
实施例3培养方法
嗜热凝结芽孢杆菌是一种高效的生产乳酸的菌株，具有耐热、适合开放式发酵、兼性厌氧、低能耗、高碳代谢速率、高转化率等优势。嗜热凝结芽孢杆菌H-1具有更强的产酸能力，其培养基中需含有适量的葡萄糖才能正常生长，而且在普通的LB等无缓冲剂培养基里不能正常生长。经过探索，在GYS培养基中凝结芽孢杆菌H-1可以正常生长。GYS培养基的配方是每升蒸馏水中加入100g葡萄糖，50g轻质碳酸钙，10g酵母粉和5g蛋白胨。适宜的培养温度是50℃。在一些操作中需要降低轻质碳酸钙的干扰，比如接合转移，三代测序样品制备等。GYS培养基中轻质碳酸钙的含量可以适当降低。经测试GYS5培养基可以让凝结芽孢杆菌H-1正常生长到OD600值为2，可以满足接合转移，三代测序样品制备等操作的需求。GYS5培养基的配方是每升蒸馏水中加入100g葡萄糖，5g轻质碳酸钙，10g酵母粉和5g蛋白胨。
实施例4优化的接合转移方法
常见的接合转移方法并不适合嗜热凝结芽孢杆菌，本实施例根据凝结芽孢杆菌的生理性质将接合转移方法进行优化，得到了较高转化率。本实施例将表达载体pNWMT化学转化到大肠杆菌S17-1菌株中做为质粒供体菌，将从单菌落接种到液体培养基并活化两代的凝结芽孢杆菌作为受体菌。将大肠杆菌S17-1以OD600为0.01的初始浓度接种于浓度为25ng/mL四环素的LB培养基培养至对数期初期，即OD600在0.5～1。凝结芽孢杆菌H-1接种于GYS5培养基(初始OD600为0.06)，培养至OD600在0.5～1(约4.5h)。通过离心(2min，5000×g，37℃)收获细胞。大肠杆菌用37℃预热的LB培养基洗涤两遍，凝结芽孢杆菌H-1用37℃预热的LB培养基洗涤一遍。将供体菌与受体菌以总OD600值以10：1的比例混合，离心(2min，5000×g，37℃)沉淀。吸去多余的培养基，使用20μL LB培养基轻柔的重悬菌体，滴在37℃预热的无抗生素的固体LB平板上，吹干后在37℃培养箱中正面放置孵育4h。孵育结束后将菌体从平板上刮下，在1mL无碳酸钙的GYS培养基中重悬，涂布在含2.5μg/mL四环素的固体GYS培养基平板上。50℃条件下避光孵育，两天后即可得到单菌落。
实施例5优化的转化子的验证方法
嗜热凝结芽孢杆菌H-1在接合转移的转化子的验证方法和普通的大肠杆菌或芽孢杆菌不同。因为其只能在含有轻质碳酸钙的培养基中培养且生长速度较慢，导致菌液PCR验证操作麻烦且效率低下。嗜热凝结芽孢杆菌H-1的初代转化子中还有很强的丢失质粒的现象，会有不少的转化子验证正确但接种培养后质粒丢失。
本实施例研究出了一种方便准确的转化子验证方法。挑取需要验证的转化子单菌落，在20μL的LB培养基中混匀。吸取1μL用于PCR验证，如果存在相应的条带，则把该转化子对应的剩余19μL菌液在含抗生素的GYS固体培养基上划线，50℃条件下避光孵育两天。选择生长良好的单菌落进行PCR验证，如果条带正确测序结果正确，那么这就是可以稳定保存工程质粒的目标菌株。
实施例6嗜热凝结芽孢杆菌H-1适合的四环素抗生素工作浓度
嗜热凝结芽孢杆菌H-1进行接合转移后，我们发现其可以正常生长的抗生素浓度与大肠杆菌的并不一致。嗜热凝结芽孢杆菌H-1适合的抗生素工作浓度远小于大肠杆菌所需。
本实施例验证了嗜热凝结芽孢杆菌H-1的适宜四环素抗生素工作浓度。制作一批四环素抗性的GYS固体培养基，其四环素的浓度设置梯度为50，25，12.5，5，2.5和1.25μg/mL。按照实施例4中的方法将质粒pNWMT转入凝结芽孢杆菌H-1中，涂布在梯度浓度四环素的GYS固体培养基中，50℃条件下避光孵育，观察转化子生长情况。继续按照实施例5中的方法筛选出PCR阳性的初代转化子在其对应浓度的四环素GYS固体培养基上划线接种，50℃条件下避光孵育，观察生长情况并挑取单菌落进行PCR验证。
具体结果在表3中，可见5或2.5μg/mL是嗜热凝结芽孢杆菌H-1对应的四环素抗生素正常工作浓度，在该浓度下质粒可以在抗生素压力下稳定存在，而且对细菌的生长影响较小。
表4嗜热凝结芽孢杆菌H-1四环素抗生素工作浓度
实施例7
适合的卡那霉素抗生素浓度
嗜热凝结芽孢杆菌H-1进行接合转移后，我们发现其可以正常生长的抗生素浓度与大肠杆菌的并不一致。嗜热凝结芽孢杆菌H-1适合的抗生素工作浓度远小于大肠杆菌所需。本实施例验证了嗜热凝结芽孢杆菌H-1的适宜卡那霉素抗生素工作浓度。制作一批卡那霉素抗性的GYS固体培养基，其四环素的浓度设置梯度为200，100，50，25，12.5和5μg/mL。按照实施例4中的方法将质粒pNWMK转入凝结芽孢杆菌H-1中，涂布在梯度浓度卡那霉素的GYS固体培养基中，50℃条件下孵育，观察转化子生长情况。继续按照实施例5中的方法筛选出PCR阳性的初代转化子在其对应浓度的卡那霉素GYS固体培养基上划线接种，50℃条件下孵育，观察生长情况并挑取单菌落进行PCR验证。具体结果在表4中，可见25μg/mL是嗜热凝结芽孢杆菌H-1对应的卡那霉素抗生素正常工作浓度，在该浓度下质粒可以在抗生素压力下稳定存在，卡那霉素对细菌生长影响较小，即使在50μg/mL浓度下，初代转化子也仅需两天就能孵育出来。
表5嗜热凝结芽孢杆菌H-1卡那霉素抗生素工作浓度
实施例8通过接合转移转化凝结芽孢杆菌反义RNA表达载体pNWMTAS的构建
反义RNA介导的基因沉默技术目前已广泛用作常规工具。在基因治疗，调控细菌基因表达，质粒复制等领域有广泛应用。可以在不改变基因组的前提下对细菌的关键基因进行调控和研究。因此有必要开发一种可以在凝结芽孢杆菌H-1中应用的反义RNA工具。甲基转移酶是DNA甲基化的关键酶，DNA甲基化是表观遗传的主要机制。凝结芽孢杆菌是DNA甲基化程度较高的菌种。凝结芽孢杆菌H-1表达量最高的DNA甲基转移酶hsdM846，直接敲除DNA甲基化酶的操作难度很大。本实施例以甲基转移酶hsdM846为反义RNA目标基因，反义RNA序列为5‘-TCTTGAAGTTTGGTTCCTCCTTTTTCTTAC-3’。Pldh1启动子是凝结芽孢杆菌H-1中极高表达的L乳酸脱氢酶基因的启动子，是反义RNA表达模块的优良启动子。本实施例用Pldh1启动子来表达asRNA，插入载体pNWMT构建了可以通过接合转移转化凝结芽孢杆菌H-1的反义RNA表达载体pNWMTAS(图5)。为此，首先以OriRepMob.f和OriRepMob.r从载体pNWMT上PCR扩增出复制子ori、复制子repB和DNA转移起始位点oriT片段，以AsRNA.f和AsRNA.r为引物扩增出反义RNA表达模块，以TetRas.f和TetRas.r为引物从载体pHY300PLK上PCR扩增出四环素抗性基因Tetr片段。然后，以AsRNA.f和TetRas.r为引物将反义RNA表达模块和四环素抗性基因Tetr片段进行融合PCR。最后将复制子ori、复制子repB和DNA转移起始位点oriT线性片段与反义RNA表达模块和四环素抗性基因Tetr线性片段使用无缝克隆方法进行连接，即可得到目的载体pNWMTAS(图5)。
构建好的载体使用PCR扩增的方法提供生物分子学证据证明是否正确。图6是用PCR方法对载体pNWMT进行验证的结果，由图可知用pNWMT作为模板(对照)时不能用引物AsRNA.f和AsRNA.r扩增出条带，用pNWMTAS作为模板时可以扩增出800bp大小的条带，这与反义RNA表达模块大小相符。这一结果说明已经成功构建了载体pNWMTAS。
进一步验证采用测序的方法，使用DNA测序的方法对对载体pNWMT最终进行验证，验证结果表明所测得的构建载体的序列和预计的完全一致。
实施例9接合转移方法
本实施例将表达载体pNWMT和pNWMTAS通过接合转移方法转化凝结芽孢杆菌H-1，具体的接合转移方法和实施例4相同。由于pNWMTAS其中的反义RNA元件对凝结芽孢杆菌H-1的生理状态有影响，需要扩大接合转移的细菌量才能得到较多的转化子，合适的凝结芽孢杆菌受体菌的量为10～15mL。使用载体pNWMT接合转移转化凝结芽孢杆菌得到转化子H1C，使用载体pNWMTAS接合转移转化凝结芽孢杆菌得到转化子H1AS846。
实施例10反义RNA敲弱甲基转移酶hsdM846对凝结芽孢杆菌的生长情况的影响
DNA甲基化是表观遗传的主要机制，能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达、DNA错配修复和转座。hsdM846是凝结芽孢杆菌H-1表达量最高的DNA甲基转移酶，它的敲弱可能会对细菌的生长产生较大影响。本实施例以H1AS846菌株为实验菌株，H1C为实验对照菌株，原始的H-1菌株为空白对照菌株。挑取以上菌株的单菌落，接种于30mL GYS培养基中过夜培养。以初始OD600为0.015的条件接种至新的GYS培养基中，作为种子菌株继续培养，在OD600为0.5～1时接种至新的GYS培养基中(初始OD600为0.015)。每1.5～2h取样测量OD600值并绘制生长曲线，以上过程的培养温度均为50℃，H1AS846菌株和H1C菌株的培养过程中的培养基均含有浓度为2.5μg/mL的四环素。结果显示如图5所示。菌株H1C相比于H-1菌株的生长显著放缓。菌株H1AS846的生长速度变得非常慢，其需要约14h才能生长到OD600等于1。这表明反义RNA技术在凝结芽孢杆菌中起到了敲弱甲基转移酶hsdM846表达的效果，载体pNWMTAS可以有效敲弱凝结芽孢杆菌中的基因表达。甲基化酶hsdM846是影响凝结芽孢杆菌H-1生长的关键DNA甲基化酶。因此，除上述证明的优势外，本实施例构建的通过接合转移转化凝结芽孢杆菌H-1的反义RNA表达载体还具有调控基因表达的优势，它可以使得对关键基因的调控及研究成为可能。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种凝结芽孢杆菌H-1的表达载体及其构建方法与应用
<130> 01335-22080PIX
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5694
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
caatcctttt ttaaaagtca atcccgtttg ttgaactact ctttaataaa ataatttttc 60
cgttcccaat tccacattgc aataatagaa aatccatctt catcggcttt ttcgtcatca 120
tctgtatgaa tcaaatcgcc ttcttctgtg tcatcaaggt ttaatttttt atgtatttct 180
tttaacaaac caccatagga gattaacctt ttacggtgta aaccttcctc caaatcagac 240
aaacgtttca aattcttttc ttcatcatcg gtcataaaat ccgtatcctt tacaggatat 300
tttgcagttt cgtcaattgc cgattgtata tccgatttat atttattttt cggtcgaatc 360
atttgaactt ttacatttgg atcatagtct aatttcattg cctttttcca aaattgaatc 420
cattgttttt gattcacgta gttttctgta ttcttaaaat aagttggttc cacacatacc 480
aatacatgca tgtgctgatt ataagaatta tctttattat ttattgtcac ttccgttgca 540
cgcataaaac caacaagatt tttattaatt tttttatatt gcatcattcg gcgaaatcct 600
tgagccatat ctgacaaact cttatttaat tcttcgccat cataaacatt tttaactgtt 660
aatgtgagaa acaaccaacg aactgttggc ttttgtttaa taacttcagc aacaaccttt 720
tgtgactgaa tgccatgttt cattgctctc ctccagttgc acattggaca aagcctggat 780
ttacaaaacc acactcgata caactttctt tcgcctgttt cacgattttg tttatactct 840
aatatttcag cacaatcttt tactctttca gcctttttaa attcaagaat atgcagaagt 900
tcaaagtaat caacattagc gattttcttt tctctccatg gtctcacttt tccacttttt 960
gtcttgtcca ctaaaaccct tgatttttca tctgaataaa tgctactatt aggacacata 1020
atattaaaag aaacccccat ctatttagtt atttgtttgg tcacttataa ctttaacaga 1080
tggggttttt ctgtgcaacc aattttaagg gttttcaata ctttaaaaca catacatacc 1140
aacacttcaa cgcacctttc agcaactaaa ataaaaatga cgttatttct atatgtatca 1200
agaatagaaa gaactcgttt ttcgctacgc tcaaaacgca aaaaaagcac tcattcgagt 1260
gctttttctt atcgctccaa atcatgcgat tttttcctct ttgcttttct ttgctcacga 1320
agttctcgat cacgctgcaa aacatcttga agcgaaaaag tattcttctt ttcttccgat 1380
cgctcatgct gacgcacgaa aagccctcta ggcgcatagg aacaactcct aaatgcatgt 1440
gaggggtttt ctcgtccatg tgaacagtcg catacgcaat attttgtttc ccatactgca 1500
ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc 1560
ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 1620
aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 1680
aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 1740
gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 1800
gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 1860
tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 1920
ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 1980
ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 2040
tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 2100
tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 2160
ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 2220
aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 2280
ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 2340
tacggggtct gacgcgcctt ccccattatg attcttctcg cttccggcgg catcgggatg 2400
cccgcgttgc aggccatgct gtccaggcag gtagatgacg accatcaggg acagcttcaa 2460
ggatcgctcg cggctcttac cagcctaact tcgatcactg gaccgctgat cgtcacggcg 2520
atttatgccg cctcggcgag cacatggaac gggttggcat ggattgtagg cgcccttcct 2580
ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt 2640
tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac 2700
gtagtgggcc ttttgctggc ccaggtcgcc attgatgcgg gccagctcgc ggacgtgctc 2760
atagtccacg acgcccgtga ttttgtagcc ctggccgacg gccagcaggt aggccgacag 2820
gctcatgccg gccgccgccg ccttttcctc aatcgctctt cgttcgtctg gaaggcagta 2880
caccttgata ggtgggctgc ccttcctggt tggcttggtt tcatcagcca tccgcttgcc 2940
ctcatctgtt acgccggcgg tagccggcca gcctcgcaga gcaggattcc cgttgagcac 3000
cgccaggtgc gaataaggga cagtgaagaa ggaacacccg ctcgcgggtg ggcctacttc 3060
acctatcctg cccggctgac gccgttggat acaccaagga aagtctacac gaaccctttg 3120
gcaaaatcct gtatatcgtg cgaaaaagga tggatatacc gaaaaaatcg ctataatgac 3180
cccgaagcag ggttatgcag cggaaaagat ccgtcgacct gcaggcatcg tggtgtcacg 3240
ctcgtcgttt ggtggcgccg ccctatacct tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcggtgc 3300
atggagccgg gccacctcga cctgaatgga agccggcggc acctcgctaa cggattcacc 3360
actccaagaa ttggagccaa tcaattcttg cggagaactg tgaatgcgca aaccaaccct 3420
tggcagaaca tatccatcgc gtccgccatc tccagcagcc gcacgcggcg catctcgggc 3480
agcgttgggt cctggccacg ggtgcgcatg atcgtgctcc tgtcgttgag gacccggcta 3540
ggctggcggg gttgccttac tggttagcag aatgaatcac cgatacgcga gcgaacgtga 3600
agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc tgagcaacaa catgaatggt cttcggtttc 3660
cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct gcaccattat gttccggatc 3720
tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta catctgtatt aacgaagcgc 3780
tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg tcccgccgca tccataccgc cagttgttta 3840
ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt tcatcatcag taacccgtat cgtgagcatc 3900
ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa attccccctt acacggaggc 3960
atcaagtgac cagggggcgg agcctatgga aaaacgcttt gcccaagctt ctagagatct 4020
gcaggtcgac ggatccccgg gaattcctgt tataaaaaaa ggatcaattt tgaactctct 4080
cccaaagttg atcccttaac gatttagaaa tccctttgag aatgtttata tacattcaag 4140
gtaaccagcc aactaatgac aatgattcct gaaaaaagta ataacaaatt actatacaga 4200
taagttgact gatcaacttc cataggtaac aacctttgat caagtaaggg tatggataat 4260
aaaccaccta caattgcaat acctgttccc tctgataaaa agctggtaaa gttaagcaaa 4320
ctcattccag caccagcttc ctgctgtttc aagctacttg aaacaattgt tgatataact 4380
gttttggtga acgaaagccc acctaaaaca aatacgatta taattgtcat gaaccatgat 4440
gttgtttcta aaagaaagga agcagttaaa aagctaacag aaagaaatgt aactccgatg 4500
tttaacacgt ataaaggacc tcttctatca acaagtatcc caccaatgta gccgaaaata 4560
atgacactca ttgttccagg gaaaataatt acacttccga tttcggcagt acttagctgg 4620
tgaacatctt tcatcatata aggaaccata gagacaaacc ctgctactgt tccaaatata 4680
attcccccac aaagaactcc aatcataaaa ggtatatttt tccctaatcc gggatcaaca 4740
aaaggatctg ttactttcct gatatgtttt acaaatatca ggaatgacag cacgctaacg 4800
ataagaaaag aaatgctata tgatgttgta aacaacataa aaaatacaat gcctacagac 4860
attagtataa ttcctttgat atcaaaatga ccttttatcc ttacttcttt ctttaataat 4920
ttcataagaa acggaacagt gataattgtt atcataggaa tgagtagaag ataggaccaa 4980
tgaatataat gggctatcat tccaccaatc gctggaccga ctccttctcc catggctact 5040
atcgatccaa taagaccaaa tgctttaccc ctattttcct ttggaatata gcgcgcaact 5100
acaaccatta cgagtgctgg aaatgcagct gcaccagccc cttgaataaa acgagccata 5160
ataagtaagg aaaagaaaga atggccaaca aacccaatta ccgacccgaa acaatttatt 5220
ataattccaa ataggagtaa ccttttgatg cctaattgat cagatagctt tccatataca 5280
gctgttccaa tggaaaaggt taacataaag gctgtgttca cccagtttgt actcgcaggt 5340
ggtttattaa aatcatttgc aatatcaggt aatgagacgt tcaaaaccat ttcatttaat 5400
acgctaaaaa aagataaaat gcaaagccaa attaaaattt ggttgtgtcg taaattcgat 5460
tgtgaatagg atgtattcac atttcaccct ccaataatga gggcagacgt agtttatagg 5520
gttaatgata cgcttccctc ttttaattga accctgttac attcattatt cattacactt 5580
cataattaat tcctcctaaa cttgattaaa acattttacc acatataaac taagttttaa 5640
attcagtatt tcatcactta tacaacaata tggcccgttt gtcggggtac cccg 5694
<210> 2
<211> 5063
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
caatcctttt ttaaaagtca atcccgtttg ttgaactact ctttaataaa ataatttttc 60
cgttcccaat tccacattgc aataatagaa aatccatctt catcggcttt ttcgtcatca 120
tctgtatgaa tcaaatcgcc ttcttctgtg tcatcaaggt ttaatttttt atgtatttct 180
tttaacaaac caccatagga gattaacctt ttacggtgta aaccttcctc caaatcagac 240
aaacgtttca aattcttttc ttcatcatcg gtcataaaat ccgtatcctt tacaggatat 300
tttgcagttt cgtcaattgc cgattgtata tccgatttat atttattttt cggtcgaatc 360
atttgaactt ttacatttgg atcatagtct aatttcattg cctttttcca aaattgaatc 420
cattgttttt gattcacgta gttttctgta ttcttaaaat aagttggttc cacacatacc 480
aatacatgca tgtgctgatt ataagaatta tctttattat ttattgtcac ttccgttgca 540
cgcataaaac caacaagatt tttattaatt tttttatatt gcatcattcg gcgaaatcct 600
tgagccatat ctgacaaact cttatttaat tcttcgccat cataaacatt tttaactgtt 660
aatgtgagaa acaaccaacg aactgttggc ttttgtttaa taacttcagc aacaaccttt 720
tgtgactgaa tgccatgttt cattgctctc ctccagttgc acattggaca aagcctggat 780
ttacaaaacc acactcgata caactttctt tcgcctgttt cacgattttg tttatactct 840
aatatttcag cacaatcttt tactctttca gcctttttaa attcaagaat atgcagaagt 900
tcaaagtaat caacattagc gattttcttt tctctccatg gtctcacttt tccacttttt 960
gtcttgtcca ctaaaaccct tgatttttca tctgaataaa tgctactatt aggacacata 1020
atattaaaag aaacccccat ctatttagtt atttgtttgg tcacttataa ctttaacaga 1080
tggggttttt ctgtgcaacc aattttaagg gttttcaata ctttaaaaca catacatacc 1140
aacacttcaa cgcacctttc agcaactaaa ataaaaatga cgttatttct atatgtatca 1200
agaatagaaa gaactcgttt ttcgctacgc tcaaaacgca aaaaaagcac tcattcgagt 1260
gctttttctt atcgctccaa atcatgcgat tttttcctct ttgcttttct ttgctcacga 1320
agttctcgat cacgctgcaa aacatcttga agcgaaaaag tattcttctt ttcttccgat 1380
cgctcatgct gacgcacgaa aagccctcta ggcgcatagg aacaactcct aaatgcatgt 1440
gaggggtttt ctcgtccatg tgaacagtcg catacgcaat attttgtttc ccatactgca 1500
ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc 1560
ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 1620
aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 1680
aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 1740
gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 1800
gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 1860
tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 1920
ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 1980
ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 2040
tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 2100
tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 2160
ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 2220
aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 2280
ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 2340
tacggggtct gacgcgcctt ccccattatg attcttctcg cttccggcgg catcgggatg 2400
cccgcgttgc aggccatgct gtccaggcag gtagatgacg accatcaggg acagcttcaa 2460
ggatcgctcg cggctcttac cagcctaact tcgatcactg gaccgctgat cgtcacggcg 2520
atttatgccg cctcggcgag cacatggaac gggttggcat ggattgtagg cgcccttcct 2580
ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt 2640
tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac 2700
gtagtgggcc ttttgctggc ccaggtcgcc attgatgcgg gccagctcgc ggacgtgctc 2760
atagtccacg acgcccgtga ttttgtagcc ctggccgacg gccagcaggt aggccgacag 2820
gctcatgccg gccgccgccg ccttttcctc aatcgctctt cgttcgtctg gaaggcagta 2880
caccttgata ggtgggctgc ccttcctggt tggcttggtt tcatcagcca tccgcttgcc 2940
ctcatctgtt acgccggcgg tagccggcca gcctcgcaga gcaggattcc cgttgagcac 3000
cgccaggtgc gaataaggga cagtgaagaa ggaacacccg ctcgcgggtg ggcctacttc 3060
acctatcctg cccggctgac gccgttggat acaccaagga aagtctacac gaaccctttg 3120
gcaaaatcct gtatatcgtg cgaaaaagga tggatatacc gaaaaaatcg ctataatgac 3180
cccgaagcag ggttatgcag cggaaaagat ccgtcgacct gcaggcatcg tggtgtcacg 3240
ctcgtcgttt ggtggcgccg ccctatacct tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcggtgc 3300
atggagccgg gccacctcga cctgaatgga agccggcggc acctcgctaa cggattcacc 3360
actccaagaa ttggagccaa tcaattcttg cggagaactg tgaatgcgca aaccaaccct 3420
tggcagaaca tatccatcgc gtccgccatc tccagcagcc gcacgcggcg catctcgggc 3480
agcgttgggt cctggccacg ggtgcgcatg atcgtgctcc tgtcgttgag gacccggcta 3540
ggctggcggg gttgccttac tggttagcag aatgaatcac cgatacgcga gcgaacgtga 3600
agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc tgagcaacaa catgaatggt cttcggtttc 3660
cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct gcaccattat gttccggatc 3720
tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta catctgtatt aacgaagcgc 3780
tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg tcccgccgca tccataccgc cagttgttta 3840
ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt tcatcatcag taacccgtat cgtgagcatc 3900
ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa attccccctt acacggaggc 3960
atcaagtgac cttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 4020
aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacg 4080
tttccacaac caattaacca attctgatta gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg 4140
caatttattc atatcaggat tatcaatacc atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga 4200
aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat 4260
tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc 4320
aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga atccggtgag aatggcaaaa gcttatgcat 4380
ttctttccag acttgttcaa caggccagcc attacgctcg tcatcaaaat cactcgcatc 4440
aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga cgaaatacgc gatcgctgtt 4500
aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc aggaacactg ccagcgcatc 4560
aacaatattt tcacctgaat caggatattc ttctaatacc tggaatgctg ttttcccggg 4620
gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg ataaaatgct tgatggtcgg 4680
aagaggcata aattccgtca gccagtttag tctgaccatc tcatctgtaa catcattggc 4740
aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca tcgggcttcc catacaatcg 4800
atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc catttatacc catataaatc 4860
agcatccatg ttggaattta atcgcggcct cgagcaagac gtttcccgtt gaatatggct 4920
cataacaccc cttgtattac tgtttatgta agcagacagt tttattgttc atgatgatat 4980
atttttatct tgtgcaatgt aacatcagag attttgagac acaacgtggc tttccctgca 5040
gggtttgcag tcagagtaga ata 5063
<210> 3
<211> 6201
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
caatcctttt ttaaaagtca atcccgtttg ttgaactact ctttaataaa ataatttttc 60
cgttcccaat tccacattgc aataatagaa aatccatctt catcggcttt ttcgtcatca 120
tctgtatgaa tcaaatcgcc ttcttctgtg tcatcaaggt ttaatttttt atgtatttct 180
tttaacaaac caccatagga gattaacctt ttacggtgta aaccttcctc caaatcagac 240
aaacgtttca aattcttttc ttcatcatcg gtcataaaat ccgtatcctt tacaggatat 300
tttgcagttt cgtcaattgc cgattgtata tccgatttat atttattttt cggtcgaatc 360
atttgaactt ttacatttgg atcatagtct aatttcattg cctttttcca aaattgaatc 420
cattgttttt gattcacgta gttttctgta ttcttaaaat aagttggttc cacacatacc 480
aatacatgca tgtgctgatt ataagaatta tctttattat ttattgtcac ttccgttgca 540
cgcataaaac caacaagatt tttattaatt tttttatatt gcatcattcg gcgaaatcct 600
tgagccatat ctgacaaact cttatttaat tcttcgccat cataaacatt tttaactgtt 660
aatgtgagaa acaaccaacg aactgttggc ttttgtttaa taacttcagc aacaaccttt 720
tgtgactgaa tgccatgttt cattgctctc ctccagttgc acattggaca aagcctggat 780
ttacaaaacc acactcgata caactttctt tcgcctgttt cacgattttg tttatactct 840
aatatttcag cacaatcttt tactctttca gcctttttaa attcaagaat atgcagaagt 900
tcaaagtaat caacattagc gattttcttt tctctccatg gtctcacttt tccacttttt 960
gtcttgtcca ctaaaaccct tgatttttca tctgaataaa tgctactatt aggacacata 1020
atattaaaag aaacccccat ctatttagtt atttgtttgg tcacttataa ctttaacaga 1080
tggggttttt ctgtgcaacc aattttaagg gttttcaata ctttaaaaca catacatacc 1140
aacacttcaa cgcacctttc agcaactaaa ataaaaatga cgttatttct atatgtatca 1200
agaatagaaa gaactcgttt ttcgctacgc tcaaaacgca aaaaaagcac tcattcgagt 1260
gctttttctt atcgctccaa atcatgcgat tttttcctct ttgcttttct ttgctcacga 1320
agttctcgat cacgctgcaa aacatcttga agcgaaaaag tattcttctt ttcttccgat 1380
cgctcatgct gacgcacgaa aagccctcta ggcgcatagg aacaactcct aaatgcatgt 1440
gaggggtttt ctcgtccatg tgaacagtcg catacgcaat attttgtttc ccatactgca 1500
ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc 1560
ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 1620
aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 1680
aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 1740
gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 1800
gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 1860
tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 1920
ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 1980
ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 2040
tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 2100
tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 2160
ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 2220
aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 2280
ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 2340
tacggggtct gacgcgcctt ccccattatg attcttctcg cttccggcgg catcgggatg 2400
cccgcgttgc aggccatgct gtccaggcag gtagatgacg accatcaggg acagcttcaa 2460
ggatcgctcg cggctcttac cagcctaact tcgatcactg gaccgctgat cgtcacggcg 2520
atttatgccg cctcggcgag cacatggaac gggttggcat ggattgtagg cgcccttcct 2580
ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt 2640
tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac 2700
gtagtgggcc ttttgctggc ccaggtcgcc attgatgcgg gccagctcgc ggacgtgctc 2760
atagtccacg acgcccgtga ttttgtagcc ctggccgacg gccagcaggt aggccgacag 2820
gctcatgccg gccgccgccg ccttttcctc aatcgctctt cgttcgtctg gaaggcagta 2880
caccttgata ggtgggctgc ccttcctggt tggcttggtt tcatcagcca tccgcttgcc 2940
ctcatctgtt acgccggcgg tagccggcca gcctcgcaga gcaggattcc cgttgagcac 3000
cgccaggtgc gaataaggga cagtgaagaa ggaacacccg ctcgcgggtg ggcctacttc 3060
acctatcctg cccggctgac gccgttggat acaccaagga aagtctacac gaaccctttg 3120
gcaaaatcct gtatatcgtg cgaaaaagga tggatatacc gaaaaaatcg ctataatgac 3180
cccgaagcag ggttatgcag cggaaaagat ccgtcgacct gcaggcatcg tggtgtcacg 3240
ctcgtcgttt ggtggcgccg ccctatacct tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcggtgc 3300
atggagccgg gccacctcga cctgaatgga agccggcggc acctcgctaa cggattcacc 3360
actccaagaa ttggagccaa tcaattcttg cggagaactg tgaatgcgca aaccaaccct 3420
tggcagaaca tatccatcgc gtccgccatc tccagcagcc gcacgcggcg catctcgggc 3480
agcgttgggt cctggccacg ggtgcgcatg atcgtgctcc tgtcgttgag gacccggcta 3540
ggctggcggg gttgccttac tggttagcag aatgaatcac cgatacgcga gcgaacgtga 3600
agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc tgagcaacaa catgaatggt cttcggtttc 3660
cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag tcagcgccct gcaccattat gttccggatc 3720
tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt ggaacaccta catctgtatt aacgaagcgc 3780
tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg tcccgccgca tccataccgc cagttgttta 3840
ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt tcatcatcag taacccgtat cgtgagcatc 3900
ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc atgaacagaa attccccctt acacggaggc 3960
atcaagtgac ccgcggatcc gcgaaggtga cgcctatttc actttctagc tgtttaatct 4020
gctggctgag cggaggctga gtcatgttca gccgaagagc tgcttttccg aaatgcagtt 4080
cttcggcaac aaccataaaa taacgaagat ggcgcagctc cattaatcac tcattccttt 4140
ctgaatgcga tttcagtcgt tttacatatt aattgtaaga caaagaagta ttggaaaaca 4200
atttccacaa gatgtatatt taataataca ataattttat taaaaattca ttgtaaatga 4260
atgaaaatgg aggagtgagg gcttcccatg gggcggccgc ttctagagtc ttgaagtttg 4320
gttcctcctt tttcttacta ctagtagcgg ccgctgcagg catgccagga caccgttcaa 4380
attgaacggt gtttttcttt gaaaagcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg 4440
cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctccc ggaattccgg agggggcgga 4500
gcctatggaa aaacgctttg cccaagcttc tagagatctg caggtcgacg gatccccggg 4560
aattcctgtt ataaaaaaag gatcaatttt gaactctctc ccaaagttga tcccttaacg 4620
atttagaaat ccctttgaga atgtttatat acattcaagg taaccagcca actaatgaca 4680
atgattcctg aaaaaagtaa taacaaatta ctatacagat aagttgactg atcaacttcc 4740
ataggtaaca acctttgatc aagtaagggt atggataata aaccacctac aattgcaata 4800
cctgttccct ctgataaaaa gctggtaaag ttaagcaaac tcattccagc accagcttcc 4860
tgctgtttca agctacttga aacaattgtt gatataactg ttttggtgaa cgaaagccca 4920
cctaaaacaa atacgattat aattgtcatg aaccatgatg ttgtttctaa aagaaaggaa 4980
gcagttaaaa agctaacaga aagaaatgta actccgatgt ttaacacgta taaaggacct 5040
cttctatcaa caagtatccc accaatgtag ccgaaaataa tgacactcat tgttccaggg 5100
aaaataatta cacttccgat ttcggcagta cttagctggt gaacatcttt catcatataa 5160
ggaaccatag agacaaaccc tgctactgtt ccaaatataa ttcccccaca aagaactcca 5220
atcataaaag gtatattttt ccctaatccg ggatcaacaa aaggatctgt tactttcctg 5280
atatgtttta caaatatcag gaatgacagc acgctaacga taagaaaaga aatgctatat 5340
gatgttgtaa acaacataaa aaatacaatg cctacagaca ttagtataat tcctttgata 5400
tcaaaatgac cttttatcct tacttctttc tttaataatt tcataagaaa cggaacagtg 5460
ataattgtta tcataggaat gagtagaaga taggaccaat gaatataatg ggctatcatt 5520
ccaccaatcg ctggaccgac tccttctccc atggctacta tcgatccaat aagaccaaat 5580
gctttacccc tattttcctt tggaatatag cgcgcaacta caaccattac gagtgctgga 5640
aatgcagctg caccagcccc ttgaataaaa cgagccataa taagtaagga aaagaaagaa 5700
tggccaacaa acccaattac cgacccgaaa caatttatta taattccaaa taggagtaac 5760
cttttgatgc ctaattgatc agatagcttt ccatatacag ctgttccaat ggaaaaggtt 5820
aacataaagg ctgtgttcac ccagtttgta ctcgcaggtg gtttattaaa atcatttgca 5880
atatcaggta atgagacgtt caaaaccatt tcatttaata cgctaaaaaa agataaaatg 5940
caaagccaaa ttaaaatttg gttgtgtcgt aaattcgatt gtgaatagga tgtattcaca 6000
tttcaccctc caataatgag ggcagacgta gtttataggg ttaatgatac gcttccctct 6060
tttaattgaa ccctgttaca ttcattattc attacacttc ataattaatt cctcctaaac 6120
ttgattaaaa cattttacca catataaact aagttttaaa ttcagtattt catcacttat 6180
acaacaatat ggcccgtttg t 6201
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ggcccgtttg tcggggtacc ccgcaatcct tttttaaaag tcaatccc 48
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
cgagaagaat cataatgggg aaggcgcgtc agaccccgta gaaaa 45
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
gatcttttct acggggtctg acgcgccttc cccattatga ttcttct 47
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
ataggctccg ccccctggtc acttgatgcc tccgtg 36
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gaggcatcaa gtgaccaggg ggcggagcct atg 33
<210> 9
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
tttaaaaaag gattgcgggg taccccgaca aacgggccat attgttgt 48
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
caatcctttt ttaaaagtca atccc 25
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
ggtcacttga tgcctccgtg 20
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
ccttacacgg aggcatcaag tgaccttggt catgagatta tcaaaaagga 50
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
gggattgact tttaaaaaag gattgtattc tactctgact gcaaaccctg 50
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
ccttacacgg aggcatcaag tgacctgccc atcagaaatt gcgt 44
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
agggggcgga gcctaccgga attccgggag ag 32
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
ctcccggaat tccggagggg gcggagccta tg 32
<210> 17
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
gggattgact tttaaaaaag gattgacaaa cgggccatat tgttgt 46
Claims (5)
1.一种凝结芽孢杆菌H-1的表达载体，其特征在于，包括来源于载体pNW33N的复制子ori、复制子repB，来源于载体pKVM1的DNA转移起始位点oriT，抗性基因，所述抗性基因为四环素抗性基因Tetr，所述载体还包括反义RNA表达模块，所述反义RNA表达模块包括启动子Pldh1、限制酶识别位点、反义RNA序列、终止子TB5和终止子rrnB T1,其中启动子Pldh1来自凝结芽孢杆菌H-1，反义RNA序列是目标基因起始密码子前30nt的反义序列，终止子TB5来自枯草芽孢杆菌，终止子rrnB T1来自大肠杆菌。
2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述反义RNA序列以甲基转移酶hsdM846为目标基因，载体命名为pNWMTAS，所述载体pNWMTAS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求2所述的表达载体在凝结芽孢杆菌H-1敲弱基因表达中的应用。
4.如权利要求1～3所述的任一项表达载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1从载体pNW33N上PCR扩增出复制子ori和复制子repB片段，从载体pKVM1上PCR扩增出DNA转移起始位点oriT片段，从载体pHY300PLK上PCR扩增出四环素抗性基因Tetr片段，将复制子ori、复制子repB片段和DNA转移起始位点oriT片段进行融合PCR，再将复制子ori、复制子repB和DNA转移起始位点oriT片段与四环素抗性基因Tetr片段使用无缝克隆技术进行连接，得到载体pNWMT；
S2从载体pNWMT上PCR扩增出复制子ori、复制子repB和DNA转移起始位点oriT片段，以AsRNA.f和AsRNA.r为引物扩增出反义RNA表达模块，从载体pHY300PLK上PCR扩增出四环素抗性基因Tetr片段，其中AsRNA.f的序列如SEQ ID NO.14所示，AsRNA.r的序列如SEQ IDNO.15所示；
S3将反义RNA表达模块和四环素抗性基因Tetr片段进行融合PCR；
S4将复制子ori、复制子repB和DNA转移起始位点oriT线性片段与反义RNA表达模块和四环素抗性基因Tetr线性片段使用无缝克隆方法进行连接，即可得到目的载体pNWMTAS；
S5将S4获得的目的载体转化到供体菌，再通过接合转移的方法，将目的载体转化到受体菌嗜热凝结芽孢杆菌H-1中。
5.如权利要求4所述的表达载体构建方法，其特征在于，所述供体菌为大肠杆菌S17-1菌株，所述接合转移的方法中，供体菌与受体菌以总OD600值以10：1的比例混合。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210426970.2A CN114591996B (zh) | 2022-04-21 | 2022-04-21 | 一种凝结芽孢杆菌h-1的表达载体及其构建方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210426970.2A CN114591996B (zh) | 2022-04-21 | 2022-04-21 | 一种凝结芽孢杆菌h-1的表达载体及其构建方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114591996A CN114591996A (zh) | 2022-06-07 |
| CN114591996B true CN114591996B (zh) | 2023-11-24 |
Family
ID=81821312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210426970.2A Active CN114591996B (zh) | 2022-04-21 | 2022-04-21 | 一种凝结芽孢杆菌h-1的表达载体及其构建方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114591996B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009022162A1 (en) * | 2007-08-15 | 2009-02-19 | Cobra Biologics Limited | Bacillus with inactivated or downregulated htra and/or htrb |
| CN101374951A (zh) * | 2006-01-24 | 2009-02-25 | 普拉克生化公司 | 同型乳酸的嗜热芽孢杆菌的遗传修饰 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8497128B2 (en) * | 2006-01-24 | 2013-07-30 | Purac Biochem B.V. | Genetic modification of homolactic thermophilic bacilli |
-
2022
- 2022-04-21 CN CN202210426970.2A patent/CN114591996B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101374951A (zh) * | 2006-01-24 | 2009-02-25 | 普拉克生化公司 | 同型乳酸的嗜热芽孢杆菌的遗传修饰 |
| WO2009022162A1 (en) * | 2007-08-15 | 2009-02-19 | Cobra Biologics Limited | Bacillus with inactivated or downregulated htra and/or htrb |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 凝结芽孢杆菌产高光学纯L-乳酸的机理研究;杨静华等;《科技成果》;第1页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114591996A (zh) | 2022-06-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110551752B (zh) | xCas9n-epBE碱基编辑系统及其在基因组碱基替换中的应用 | |
| KR102056250B1 (ko) | 재조합 세포, 및 이소프렌의 생산 방법 | |
| CN108203714B (zh) | 一种棉花基因的编辑方法 | |
| CN107119063B (zh) | 一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法 | |
| KR101905605B1 (ko) | 코리네형 세균 형질 전환체 및 그것을 사용하는 페놀의 제조 방법 | |
| KR101914464B1 (ko) | 코리네형 세균 형질 전환체 및 그것을 사용하는 페놀의 제조 방법 | |
| CN110760538B (zh) | 一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法 | |
| CN110656122B (zh) | 一种提高去甲四环素产量的方法 | |
| CN109321576A (zh) | 一种无腺体低棉酚棉花种质的创制方法 | |
| KR101608078B1 (ko) | 이산화탄소 유래 숙신산 생산을 위한 균주 및 이를 이용한 이산화탄소 유래 숙신산 생산 방법 | |
| CN114591996B (zh) | 一种凝结芽孢杆菌h-1的表达载体及其构建方法与应用 | |
| CN113699090B (zh) | 一种构建丙酸生产菌的方法 | |
| CN115058439A (zh) | 云锦杜鹃samt基因过表达载体及其构建方法和应用 | |
| CN109485707B (zh) | 蛋白质OsVPE1在调控植物液泡无机磷输出能力中的应用 | |
| CN109232726B (zh) | 蛋白质OsVPE2在调控植物液泡无机磷输出能力中的应用 | |
| CN107815435A (zh) | 具有增强的纤维素生产能力的葡糖醋杆菌 | |
| CN111394385A (zh) | 一种快速鉴定水稻双向启动子的方法 | |
| CN109337925B (zh) | 一种以黄花蒿悬浮细胞系为受体的转AaADS基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法 | |
| CN113122516B (zh) | 一种植物epsps突变体及其在植物中的应用 | |
| CN108841862A (zh) | 一种含有ha蛋白融合标签的植物表达质粒载体及其载体的构建方法 | |
| CN114806996B (zh) | 一株高产戊二胺基因工程菌及构建方法与应用 | |
| CN112662672B (zh) | 一种启动子及其制备方法 | |
| US20020039761A1 (en) | Ketogulonigenium shuttle vectors | |
| CN107988126A (zh) | 包含增加丙酮酸磷酸二激酶活性的基因修饰的重组微生物及其用途 | |
| CN115466319A (zh) | 高粱SbMS1蛋白及其编码基因与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |