KR101905605B1

KR101905605B1 - 코리네형 세균 형질 전환체 및 그것을 사용하는 페놀의 제조 방법

Info

Publication number: KR101905605B1
Application number: KR1020137008697A
Authority: KR
Inventors: 히데아키 유카와; 마사유키 이누이
Original assignee: 그린 케미칼즈 가부시키가이샤
Priority date: 2010-11-10
Filing date: 2011-11-09
Publication date: 2018-10-08
Also published as: CN103228784B; JP5932660B2; JPWO2012063860A1; CN103228784A; US20130266999A1; EP2639306A1; EP2639306B1; KR20130139258A; US9090900B2; WO2012063860A1; EP2639306A4

Abstract

4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제(4-hydroxybenzoate decarboxylase) 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가, 숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰에 도입된, 페놀 생산능를 가지는 형질 전환체. 이 형질 전환체를, 환원 조건 하에서, 4-하이드록시벤조에이트 또는 그의 염을 함유하는 반응액 중 반응시키는 공정과, 반응액 중의 페놀을 회수하는 공정을 포함하는 페놀의 제조 방법.

Description

코리네형 세균 형질 전환체 및 그것을 사용하는 페놀의 제조 방법{CORYNEFORM BACTERIUM TRANSFORMANT AND METHOD FOR PRODUCING PHENOL USING SAME}

본 발명은, 페놀 생산 기술에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 페놀 생산 기능을 부여하기 위해 특정한 유전자 조작이 행해진 코리네박테리움 글루타미쿰의 형질 전환체, 및 이 형질 전환체를 사용한 효율적인 페놀의 제조 기술에 관한 것이다.

지구 온난화, 및 화석 자원 고갈 문제를 배경으로 하여, 재생 가능 자원을 원료로 한 화학 제품의 제조는, 바이오 연료 제조와 더불어, 신산업 바이오 리파이너리(refinery)로서 저탄소 사회 실현의 중요한 방책인 것으로 인식되어 큰 주목을 끌고 있다.

그러나, 재생 가능 자원을 원료로 한 바이오 페놀 생산은, 락트산이나 에탄올의 생산과 비교하여, 원료로 되는 당류로부터 대사 반응까지의 단계수가 대단히 많으므로 생산성이 낮고, 또한 생산물인 페놀에 의해 균의 증식이 저해되거나 페놀에 의한 세포 독성이 있는 등의 이유로 인해, 지금까지 공업적 생산이 불가능한 것으로 여겨지고 있었다.

페놀의 중요한 용도로서, 페놀 수지를 예로 들 수 있다. 페놀 수지는, 페놀과 알데히드류와의 부가 축합 반응에 의해 생성되며, 플라스틱 중에서도 가장 오래된 역사를 가지는 수지이며, 그 우수한 내열성, 내구성 등의 장점이 있으므로, 현재에도 자동차용 금속 대체 재료, 반도체 봉지(封止) 재료, 회로 기판 등 다양한 용도에 사용되고 있다. 또한, 지금까지 페놀 수지는, 원료의 페놀과 알데히드류의 반응성이 극히 높고, 얻어지는 고분자가 복잡한 3차원 메쉬 구조가 되기 때문에, 폴리머의 정밀 구조 설계나 나노 소재(nanomaterial)로 전개하기 곤란하여, 고부가 가치 용도로 이용하기 어려웠다. 그러나, 최근, 고분자의 물성 이론이나 시뮬레이션의 급속한 발전에 의해, 네트워크 구조를 정밀화하여 페놀 수지로부터 고기능성 재료의 제작이 가능해지고 있다. 이와 같은 배경 하에서 일본에서의 페놀 수지 생산량도 해마다 증가하고 있다.

페놀의 현재의 공업적 생산법(큐멘법)은, 석유 유래의 벤젠과 프로필렌을 원료로 하고, 다량의 용제류 및 다량의 열에너지를 필요로 하는, 전형적인 화학 공업의 고에너지 소비형 프로세스이다. 따라서, 지구 환경 보전이나 온실 효과 가스 삭감의 관점에서, 이산화탄소 배출이 적은 에너지 절약형이며, 재생 가능 자원으로부터 제조할 수 있고, 폐기물 배출이 적은 환경 조화형 프로세스의 개발, 즉 바이오 페놀 제조 기술 확립이 급선무가 되고 있다.

지금까지 자연계에 있어서 페놀 생산균에 대해서는 보고되어 있지 않다.

유전자 재조합균에 의한 페놀의 생산 기술에 대하여 설명하면, 비특허 문헌 1은, 클로스트리듐 하이드록시벤조이쿰(Clostridium hydroxybenzoicum)의 세포 현탁액 또는 세포 추출액을 사용하여, 2 mM의 4-하이드록시벤조에이트를 50 시간에 완전하게 페놀로 변환하는 기술에 대하여 개시하고 있다.

또한, 특허 문헌 1은, 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae)의 4-하이드록시벤조에이트 디카르복실라아제 유전자를 도입한 형질 전환균을 사용하여 4-하이드록시벤조에이트로부터 페놀을 제조하는 기술에 대하여 개시하고 있다.

그러나, 비특허 문헌 1 및 특허 문헌 1의 방법은, 실용적으로 충분히 효율적으로 페놀을 제조할 수 없다.

일본 특허출원 공개번호 2006-050914호

International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.52, 2002, 801-807.

본 발명은, 4-하이드록시벤조에이트를 원료로 하여 효율적으로 페놀을 제조할 수 있는 미생물, 및 4-하이드록시벤조에이트를 원료로 하여 효율적으로 페놀을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명자들은 연구를 거듭하여 이하의 지견을 얻었다.

(i) 코리네박테리움 글루타미쿰에 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 유전자를 도입한 형질 전환체는, 효율적으로, 4-하이드록시벤조에이트로부터 페놀을 생산할 수 있다.

(ii) 이 형질 전환체에 있어서, 숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 상에 존재하는 페놀 2-모노옥시게나아제 유전자가 파괴 또는 결손되어 있을 때는, 한층 효율적으로 페놀을 생산할 수 있다.

(iii) 이 형질 전환체는, 환원 조건 하의 반응액 중 실질적으로 증식하지 않는 상태에서 반응시키는 경우, 페놀 생산 효율이 특히 높다.

본 발명은 전술한 지견에 따라 완성된 것이며, 이하의 형질 전환체 및 페놀의 제조 방법을 제공한다.

항 1.

4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제(4-hydroxybenzoate decarboxylase) 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가, 숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에 도입된, 페놀 생산능를 가지는 형질 전환체.

항 2.

4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus), 바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니(Bacillus subtilis subsp. spizizenii), 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 엔테로박터 호마에체이(Enterobacter hormaechei), 엔테로박터 사카자키(Enterobacter sakazakii), 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 에쉐리키아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 또는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 유래의 유전자인 항 1에 기재된 형질 전환체.

항 3.

4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 하기 (a) 또는 (b)의 DNA인 항 1에 기재된 형질 전환체

(a) 서열 번호 16, 서열 번호 23, 서열 번호 26, 서열 번호 29, 서열 번호 32, 서열 번호 35, 서열 번호 38, 서열 번호 41, 서열 번호 44, 서열 번호 47, 서열 번호 50, 또는 서열 번호 53의 염기 서열로 이루어지는 DNA,

(b) (a) 중 어느 하나의 염기 서열과 상보적인(complementary) 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.

항 4.

숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰이, 그 염색체 상에 존재하는 페놀 2-모노옥시게나아제(phenol 2-monooxygenase) 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 파괴되거나, 또는 결손된 것인, 항 1∼3 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체.

항 5.

숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰이, 그 염색체 상에 존재하는 4-하이드록시벤조에이트 하이드록실라아제(4-hydroxybenzoate hydroxylase) 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 파괴되거나, 또는 결손된 것인, 항 1∼4 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체.

항 6.

숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰이, 코리네박테리움 글루미쿰 R(FERM P-18976), ATCC13032, 또는 ATCC13869인 항 1∼3 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체.

항 7.

숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰이, 코리네박테리움 글루미쿰 R(FERM P-18976), ATCC13032, 또는 ATCC13869의 염색체 상에 존재하는 페놀 2-모노옥시게나아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 파괴되거나, 또는 결손된 것인, 항 1∼3 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체.

항 8.

숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰이, 코리네박테리움 글루미쿰 R(FERM P-18976), ATCC13032, 또는 ATCC13869의 염색체 상에 존재하는 4-하이드록시벤조에이트 하이드록실라아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 파괴되거나, 또는 결손된 것인, 항 1∼3 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체.

항 9.

코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21(수탁 번호：NITE BP-996), PHE21-2, PHE21-3, PHE21-4, PHE21-5, PHE21-6, PHE21-7, PHE21-8, PHE21-9, PHE21-10, PHE21-11, PHE21-12, PHE22-1, PHE22-2, PHE22-3, PHE22-4, PHE22-5, PHE22-6, PHE22-7, PHE22-8, PHE22-9, PHE22-10, PHE22-11, PHE22-12, PHE23-1, PHE23-2, PHE23-3, PHE23-4, PHE23-5, PHE23-6, PHE23-7, PHE23-8, PHE23-9, PHE23-10, PHE23-11, 또는 PHE23-12의 형질 전환체.

항 10.

항 1∼9 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체를, 환원 조건 하에서, 4-하이드록시벤조에이트 또는 그의 염을 함유하는 반응액 중 반응시키는 공정과, 반응액 중의 페놀을 회수하는 공정을 포함하는 페놀의 제조 방법.

항 11.

반응 공정에 있어서, 형질 전환체가 실질적으로 증식하지 않는 항 10에 기재된 페놀의 제조 방법.

항 12.

환원 조건 하의 반응액의 산화 환원 전위가 -200∼-500 mV(밀리볼트)인 항 10 또는 11에 기재된 페놀의 제조 방법.

본 발명의 형질 전환체를 사용함으로써, 4-하이드록시벤조에이트로부터 페놀을 고효율로 제조할 수 있다.

일반적으로 미생물은 페놀과 같은 용제의 세포 독성에 의해 생육이 저해되므로, 미생물을 사용하여 페놀을 제조하는 것은 곤란했지만, 본 발명 방법에 의하면, 미생물을 사용하여, 실용적으로 충분히 양호한 효율로 페놀을 제조할 수 있다.

도 1은 실시예에서 사용한 플라스미드의 구성을 나타낸 도면이다.
도 2는 각종 미생물의 호기 조건 하에 있어서의 증식에 미치는 페놀의 영향을 나타낸 도면이다.

이하에서, 본 발명을 상세하게 설명한다.

(I) 페놀 생산능를 가지는 형질 전환체

본 발명의 페놀 생산능를 가지는 형질 전환체는, 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가, 숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰에 도입된 형질 전환체이다.

숙주

숙주로서 사용되는 코리네박테리움 글루타미쿰은, 버지즈·매뉴얼·디터미네이티브·박테리올로지[Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 8, 599(1974)]에 정의되어 있는 일군의 미생물이다.

구체적으로는, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) R(FERM P-18976), ATCC13032, ATCC13869, ATCC13058, ATCC13059, ATCC13060, ATCC13232, ATCC13286, ATCC13287, ATCC13655, ATCC13745, ATCC13746, ATCC13761, ATCC14020, ATCC31831, MJ-233(FERM BP-1497) 또는 MJ-233 AB-41(FERM BP-1498) 등의 균주를 예로 들 수 있다. 그 중에서도, R(FERM P-18976)주, ATCC13032주, 및 ATCC13869주가 바람직하고, R(FERM P-18976)주가 보다 바람직하다.

그리고, 분자 생물학적 분류에 의해, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum), 코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium) 등의 코리네형 세균도 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로 균명이 통일되어 있으므로[Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297 T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41:255-260.(1991), 코마가타 가즈오 외, 코리네포름 세균의 분류, 발효와 공업, 45:944-963 (1987)], 본 발명에 포함된다.

또한, 코리네박테리움 글루타미쿰은, 야생주 외에, 그 변이주나 인위적인 유전자 재조합체라도 된다. 예를 들면, 락테이트(락트산) 데히드로게나아제(lactate dehydrogenase：LDH), 포스포에놀피르베이트 카르복실라아제(phosphoenolpyrvate carboxylase), 말레이트 데히드로게나아제(malate dehydrogenase) 등의 유전자의 파괴주가 있다. 이와 같은 유전자 파괴주를 숙주로서 사용함으로써, 페놀의 생산성을 향상시키거나, 부산물의 생성을 억제할 수 있다.

그 중에서도, 락테이트 데히드로게나아제 유전자의 파괴주가 바람직하다. 이 유전자 파괴주는, 락트산 데히드로게나아제 유전자가 파괴되어 있는 것에 의해, 피루브산으로부터 락트산으로의 대사 경로가 차단되어 있다. 그 중에서도, 코리네박테리움 글루타미쿰 R(FERM P-18976)의 락테이트 데히드로게나아제 유전자의 파괴주가 특히 바람직하다.

이와 같은 유전자 파괴주는, 유전자 공학적 방법에 의해 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, WO2005/010182 A1에, 락트산 데히드로게나아제 파괴주, 및 그 제조 방법에 대하여 기재되어 있다.

4- 하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 효소 유전자( bsdBCD 또는 dca )

4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제는, 4-하이드록시벤조에이트의 탈탄산(脫炭酸)에 의한 페놀의 생성 반응을 촉매하는 효소이다.

4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자의 유래는 특별히 한정되지 않지만, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 리케니모미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus), 바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니(Bacillus subtilis subsp. spizizenii)와 같은 바실러스속세균 유래의 유전자；시트로박터 코세리(Citrobacter koseri)와 같은 시트로박터속 세균 유래의 유전자；엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 엔테로박터 호마에체이(Enterobacter hormaechei), 엔테로박터 사카자키(Enterobacter sakazakii)와 같은 엔테로박터속 세균 유래의 유전자；에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 에쉐리키아 퍼구소니(Escherichia fergusonii)와 같은 에쉐리키아속 세균 유래의 유전자；파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)와 같은 파에니바실러스속 세균 유래의 유전자；판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)와 같은 판토에아속 세균 유래의 유전자 등을 예로 들 수 있다. 그 중에서도, 바실러스속 세균, 특히 바실러스 서브틸리스 유래의 유전자, 엔테로박터속 세균, 특히 엔테로박터 클로아케 유래의 유전자, 에쉐리키아속 세균, 특히 에쉐리키아 콜라이 유래의 유전자가 바람직하다.

그리고, 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자는, 유래에 따라 상이한 각종 약칭이 사용되고 있다. 예를 들면, 바실러스 서브틸리스 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 유전자는 bsdBCD로 약칭되어 있다. 본 명세서에서는, 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 유전자를, 유래를 불문하고 「dca」라고 약칭하는 경우가 있다.

바실러스 서브틸리스 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 효소 유전자로서는, 서열 번호 16의 염기 서열로 이루어지는 DNA를, 바실러스 아트로파에우스 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 효소 유전자로서는, 서열 번호 23의 염기 서열로 이루어지는 DNA를, 바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 효소 유전자로서는, 서열 번호 26의 염기 서열로 이루어지는 DNA를, 시트로박터 코세리 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 효소 유전자로서는, 서열 번호 29의 염기 서열로 이루어지는 DNA를, 엔테로박터 아에로게네스 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 효소 유전자로서는, 서열 번호 32의 염기 서열로 이루어지는 DNA를, 엔테로박터 클로아케 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 효소 유전자로서는, 서열 번호 35의 염기 서열로 이루어지는 DNA를, 엔테로박터 호마에체이 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 효소 유전자로서는, 서열 번호 38의 염기 서열로 이루어지는 DNA를, 엔테로박터 사카자키 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 효소 유전자로서는, 서열 번호 41의 염기 서열로 이루어지는 DNA를, 에쉐리키아 콜라이 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 효소 유전자로서는, 서열 번호 44의 염기 서열로 이루어지는 DNA를, 에쉐리키아 퍼구소니 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 효소 유전자로서는, 서열 번호 47의 염기 서열로 이루어지는 DNA를, 파에니바실러스 폴리믹사 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 효소 유전자로서는, 서열 번호 50의 염기 서열로 이루어지는 DNA를, 판토에아 아나나티스 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 효소 유전자로서는, 서열 번호 53의 염기 서열로 이루어지는 DNA를 예로 들 수 있다.

또한, 본 발명에서는, 서열 번호 16, 서열 번호 23, 서열 번호 26, 서열 번호 29, 서열 번호 32, 서열 번호 35, 서열 번호 38, 서열 번호 41, 서열 번호 44, 서열 번호 47, 서열 번호 50, 또는 서열 번호 53의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 또한 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA도 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서 「엄격한 조건」은, 일반적인 조건, 예를 들면, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, 1989, Vol2, p11.45에 기재된 조건을 지칭한다. 구체적으로는, 완전 하이브리드의 융해 온도(Tm)보다 5∼10 ℃ 낮은 온도에서 혼성화가 일어나는 경우를 지칭한다.

4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성은, 「Genomics, 86, 342-351, 2005 “Materials and Methods”」에 기재된 방법으로 측정할 수 있다. 간단하게 설명하면, 시험 용액에 피험 효소를 첨가하고, 100 mM MES, pH 6.0, 1 mM DTT, 5 mM 4-하이드록시벤조에이트와 효소를 포함하는 반응액을 조제하고, 270 nm에 있어서의 흡광도의 기울기(처음 속도)를 측정한다. 4-하이드록시벤조에이트를 첨가하지 않는 계에 대해서도 마찬가지로 반응을 행하여, 백그라운드값으로 한다. 양 측정값의 차이를 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성으로 한다.

또한, 본 발명에서는, 서열 번호 16, 서열 번호 23, 서열 번호 26, 서열 번호 29, 서열 번호 32, 서열 번호 35, 서열 번호 38, 서열 번호 41, 서열 번호 44, 서열 번호 47, 서열 번호 50, 또는 서열 번호 53의 염기 서열과 동일성이 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상인 염기 서열로 이루어지고, 또한 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA도 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 염기 서열의 동일성은, GENETYX ver.8(GENETYX 가부시키가이샤 제네틱스 제조)에 의해 산출한 값이다.

서열 번호 16, 서열 번호 23, 서열 번호 26, 서열 번호 29, 서열 번호 32, 서열 번호 35, 서열 번호 38, 서열 번호 41, 서열 번호 44, 서열 번호 47, 서열 번호 50, 또는 서열 번호 53의 염기 서열로 이루어지는 DNA의 유사체는, 예를 들면, 이들 염기 서열에 기초하여, 통상적인 방법에 따라 설계한 프라이머 또는 프로브를 사용한 PCR 또는 혼성화에 의해, 타 생물종의 DNA 라이브러리로부터 선택할 수 있고, 이로써, 높은 확률로 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 얻을 수 있다.

형질 전환을 위한 벡터의 구축

PCR로 증폭한4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 효소를 코딩하는 DNA는, 각각, 숙주에서 증폭할 수 있는 적절한 벡터로 클로닝하면 된다.

플라스미드 벡터로서는, 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 자율 증식(autonomous replication) 기능을 담당하는 유전자를 포함하는 것이면 된다. 그 구체예로서는, 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum) 2256 유래의 pAM330{[일본 특허출원 공개번호 소58-67699], [Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48: 2901-2903(1984)] 및 [Yamaguchi, R. et al., Determination of the complete nucleotide sequence of the Brevibacterium lactofermentum plasmid pAM330 and the analysis of its genetic information. Nucleic Acids Symp. Ser. 16: 265-267(1985)]}, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13058 유래의 pHM1519[Miwa, K. et al., Cryptic plasmids in glutamic acid-producing bacteria. Agric. Biol. Chem. 48:2901-2903(1984)] 및 pCRY30[Kurusu, Y. et al., Identification of plasmid partition function in coryneform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57: 759-764 (1991)], 코리네박테리움 글루타미쿰 T250 유래의 pCG4[일본 특허출원 공개번호 소 57-183799], [Katsumata, R. et al., Protoplast transformation of glutamate-producing bacteria with plasmid DNA. J. Bacteriol.,159:306-311 (1984)], pAG1, pAG3, pAG14, pAG50[일본 특허출원 공개번호 소62-166890], pEK0, pEC5, pEKEx1[Eikmanns, B.J. et al., A family of Corynebacterium glutamicum/Escherichia coli shuttle vectors for cloning, controlled gene expression, and promoter probing. Gene, 102:93-98 (1991)] 등을 들 수 있다.

바람직한 프로모터로서는, 코리네박테리움 글루타미쿰 R 유래의 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나아제 A 유전자(gapA)의 프로모터 PgapA, 말레이트 데히드로게나아제 유전자(mdh)의 프로모터 Pmdh, 락테이트 데히드로게나아제 A 유전자(ldhA)의 프로모터 PldhA 등을 예로 들 수 있고, 그 중에서도, PgapA가 바람직하다.

바람직한 터미네이터로서는, 대장균 rRNA 오페론의 rrnB T1T2 터미네이터, 대장균의 trpA 터미네이터, 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum)의 trp 터미네이터 등을 예로 들 수 있고, 그 중에서도, rrnB T1T2 터미네이터가 바람직하다.

형질 전환

형질 전환 방법은, 공지의 방법을 제한없이 사용할 수 있다. 이와 같은 공지의 방법으로서, 예를 들면, 염화 칼슘/염화 루비듐법, 인산 칼슘법, DEAE-덱스트란 개재 트랜스펙션, 전기 천공법 등이 있다. 그 중에서도, 코리네박테리움 글루타미쿰에는, 전기 펄스법이 매우 적합하고, 전기 펄스법은, 공지의 방법{[Kurusu, Y. et al., Electroporation-transformation system for Coryneform bacteria by auxotrophic complementation. Agric. Biol. Chem. 54:443-447(1990)] 및 [Vertes A.A. et al., Presence of mrr- and mcr-like restriction systems in Coryneform bacteria. Res. Microbiol. 144:181-185 (1993)]}에 의해 행할 수 있다.

형질 전환체는, 미생물의 배양에 통상 사용되는 배지를 사용하여 배양하면 된다. 이 배지로서는, 통상, 탄소원, 질소원, 무기염류 및 그 외의 영양 물질 등을 함유하는 천연 배지 또는 합성 배지 등을 사용할 수 있다.

탄소원으로서는, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 만노오스, 말토오스, 만니톨, 크실로오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 전분, 당밀, 소르비톨, 글리세린 등의 당질 또는 당 알코올；아세트산, 시트르산, 락트산, 푸마르산, 말레산 또는 글루콘산 등의 유기산；에탄올, 프로판올 등의 알코올 등을 예로 들 수 있다. 또한, 원하는 바에 따라 노말 파라핀 등의 탄화수소 등도 사용할 수 있다. 탄소원은, 1종을 단독으로 사용할 수도 있고, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다. 배지 중의 이들 탄소원의 농도는, 통상, 약 0.1∼10(w/v%)로 하면 된다.

질소원으로서는, 염화 암모늄, 황산 암모늄, 질산 암모늄, 아세트산 암모늄 등의 무기 또는 유기 암모늄 화합물, 요소, 암모니아수, 질산 나트륨, 질산 칼륨 등을 예로 들 수 있다. 또한, 콘스팁리커(corn steep liquor), 고기 엑기스, 펩톤, NZ-아민, 단백질 가수분해물, 아미노산 등의 질소 함유 유기 화합물 등도 사용할 수 있다. 질소원은, 1종을 단독으로 사용해도 되고, 또 2종 이상을 혼합하여 사용해도 된다. 배지 중의 질소원 농도는, 사용하는 질소 화합물에 따라 상이하지만, 통상, 약 0.1∼10(w/v%)로 하면 된다.

무기염류로서는, 예를 들면, 인산 제1 칼륨, 인산 제2 칼륨, 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 질산 제1 철, 황산 망간, 황산 아연, 황산 코발트, 또는 탄산 칼슘 등이 있다. 이들 무기염은, 1종을 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 혼합하여 사용해도 된다. 배지 중의 무기염류 농도는, 사용하는 무기염에 따라 상이하지만, 통상, 약 0.01∼1(w/v%)로 하면 된다.

영양 물질로서는, 예를 들면, 고기 엑기스, 펩톤, 폴리 펩톤, 효모 엑기스, 건조 효모, 콘스팁리커, 탈지분유, 탈지 대두 염산 가수분해물, 또는 동식물 또는 미생물균체의 엑기스나 이들의 분해물 등이 있다. 영양 물질의 배지 농도는, 사용하는 영양 물질에 따라 상이하지만, 통상, 약 0.1∼10(w/v%)로 하면 된다. 또한, 필요에 따라 비타민류를 첨가할 수도 있다. 비타민류로서는, 예를 들면, 비오틴, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산 등이 있다.

배지의 pH는 약 5∼8이 바람직하다.

바람직한 미생물 배양 배지로서는, A 배지[Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)], BT 배지[Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103(2004)] 등을 예로 들 수 있다.

배양 온도는 약 15∼45 ℃로 하면 되고, 배양 시간은 약 1∼7 일간으로 하면 된다.

숙주 염색체 유전자의 파괴 또는 결실

숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰은, 그 염색체 상에 존재하는 페놀 2-모노옥시게나아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자(poxF)가, 파괴되거나, 또는 결실되어 있는 것이 바람직하고, 이로써, 한층 양호한 효율로 페놀을 제조할 수 있다.

또한, 숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰은, 그 염색체 상에 존재하는 4-하이드록시벤조에이트 하이드록실라아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자(pobA)가 파괴되거나, 또는 결실되어 있는 것이 바람직하고, 이로써, 한층 양호한 효율로 페놀을 제조할 수 있다.

poxF 및 pobA의 양쪽이 파괴되거나, 또는 결실되어 있는 것이 특히 바람직하다. 유전자의 부분 서열을 결실시켜, 정상적으로 기능하는 효소 단백질을 생산하지 않도록 변형한 결실형 유전자를 제조하고, 상기 유전자를 포함하는 DNA로 세균을 형질 전환하여, 결실형 유전자와 염색체 상의 유전자 사이에 상동 재조합이 일어나게 함으로써, 염색체 상의 유전자를 결실형 또는 파괴형의 유전자로 치환할 수 있다. 결실형 또는 파괴형의 유전자에 의해 코딩되는 효소 단백질은, 생성되더라도, 야생형 효소 단백질과는 상이한 입체 구조를 가지고, 기능이 저하되거나 또는 소실되어 있다. 이와 같은 상동 재조합을 이용한 유전자 치환에 의한 유전자 결실 또는 파괴는 이미 확립되어 있고, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드, 접합 전달 가능한 플라스미드를 사용하는 방법, 숙주 내에서 복제 기점을 가지지 않는 자살 벡터(suicide vector)를 이용하는 방법 등이 있다(미국 특허 제6303383호, 일본 특허출원 공개번호 평05-007491호).

구체적으로는, 실시예 1의 항목에 기재된 방법에 의해, poxF가 파괴되거나 또는 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰을 얻을 수 있다. 또한, 동일한 방법으로 pobA가 파괴되거나 또는 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰을 얻을 수 있다.

( II ) 페놀의 제조 방법

전술한 본 발명의 형질 전환체를, 4-하이드록시벤조에이트를 함유하는 반응액 중 반응시키는 공정과, 반응액 중의 페놀을 회수하는 공정을 포함하는 방법에 의해 페놀을 제조할 수 있다.

미생물의 증식

반응에 앞서, 형질 전환체를 호기 조건 하에서, 온도 약 25∼38 ℃에서, 약 12∼48 시간 배양하여 증식시키는 것이 바람직하다.

배양용 배지

반응에 앞서, 형질 전환체의 호기적 배양에 사용하는 배지는, 탄소원, 질소원, 무기염류 및 그 외의 영양 물질 등을 함유하는 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다.

탄소원으로서, 당류(글루코오스, 프룩토오스, 만노오스, 크실로오스, 아라비노오스, 갈락토오스와 같은 단당；수크로오스, 말토오스, 락토오스, 셀로비오스, 크실로비오스, 트레할로오스와 같은 이당；전분과 같은 다당；당밀 등), 만니톨, 소르비톨, 크실리톨, 글리세린과 같은 당 알코올；아세트산, 시트르산, 락트산, 푸마르산, 말레산, 글루콘산과 같은 유기산；에탄올, 프로판올과 같은 알코올；노말 파라핀과 같은 탄화수소 등도 사용할 수 있다.

탄소원은, 1종을 단독으로 사용할 수도 있고, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.

질소원으로서는, 염화 암모늄, 황산 암모늄, 질산 암모늄, 아세트산 암모늄과 같은 무기 또는 유기 암모늄 화합물, 요소, 암모니아수, 질산 나트륨, 질산 칼륨 등을 사용할 수 있다. 또한, 콘스팁리커, 고기 엑기스, 펩톤, NZ-아민, 단백질 가수분해물, 아미노산 등의 질소 함유 유기 화합물 등도 사용할 수 있다. 질소원은, 1종을 단독으로 사용할 수도 있고, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다. 질소원의 배지 중의 농도는, 사용하는 질소 화합물에 따라 상이하지만, 통상, 약 0.1∼10(w/v%)로 하면 된다.

무기염류로서는, 인산 제1 칼륨, 인산 제2 칼륨, 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 질산 제1 철, 황산 망간, 황산 아연, 황산 코발트, 탄산칼슘 등을 예로 들 수 있다. 무기염은, 1종을 단독으로 사용할 수도 있고, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다. 무기염류의 배지 중의 농도는, 사용하는 무기염에 따라 상이하지만, 통상, 약 0.01∼1(w/v%)로 하면 된다.

영양 물질로서는, 고기 엑기스, 펩톤, 폴리 펩톤, 효모 엑기스, 건조 효모, 콘스팁리커, 탈지분유, 탈지 대두 염산 가수분해물, 동식물 또는 미생물 균체의 엑기스나 이들의 분해물 등을 예로 들 수 있다. 영양 물질의 배지 중의 농도는, 사용하는 영양 물질에 따라 상이하지만, 통상 약 0.1∼10(w/v%)로 하면 된다.

또한, 필요에 따라 비타민류를 첨가할 수도 있다. 비타민류로서는, 비오틴, 티아민(비타민 B1), 피리독신(비타민 B6), 판토텐산, 이노시톨, 니코틴산 등을 예로 들 수 있다.

배지의 pH는 약 6∼8이 바람직하다.

바람직한 코리네박테리움 글루타미쿰용 배지의 구체예로서는, A 배지[Inui, M. et al., Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinate productions under oxygen deprivation conditions. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7: 182-196(2004)], BT 배지[Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103(2004)] 등을 예로 들 수 있다. 이들 배지에 있어서, 당류 농도를 상기 범위로 하여 이용하면 된다.

반응액

반응액은, 페놀 전구체(페놀 원료)를 함유하는 물, 완충액, 무기염 배지 등을 사용할 수 있다.

전구체로서는 4-하이드록시벤조에이트를 사용한다. 4-하이드록시벤조에이트로서는, 나트륨염, 칼륨염과 같은 염；탄소수 1∼4의 알코올과의 에스테르 등을 예로 들 수 있다. 그 중에서도, 염이 바람직하고, 나트륨염이 보다 바람직하다. 전구체는, 1종을 단독으로 사용할 수도 있고, 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.

반응액 중의 4-하이드록시벤조에이트의 농도는, 약 0.5∼20(w/v%)가 바람직하고, 약 1∼10(w/v%)가 보다 바람직하고, 약 2∼5(w/v%)가 더욱 바람직하다. 4-하이드록시벤조에이트는, 방향족 화합물이므로 세포 생존 저해 작용을 가지지만, 4-하이드록시벤조에이트 농도가 전술한 범위에 있으면, 양호한 효율로, 페놀을 제조할 수 있다.

완충액으로서는, 인산 버퍼, 트리스 버퍼, 탄산 버퍼 등을 예로 들 수 있다. 완충액의 농도는, 약 10∼150 mM이 바람직하다.

무기염 배지로서는, 인산 제1 칼륨, 인산 제2 칼륨, 황산 마그네슘, 염화 나트륨, 질산 제1 철, 황산 망간, 황산 아연, 황산 코발트, 탄산칼슘 등의 무기염의 1종 또는 2종 이상을 포함하는 배지를 예로 들 수 있다. 그 중에서도, 황산 마그네슘을 포함하는 배지가 바람직하다. 무기염 배지로서 구체적으로는, BT 배지[Omumasaba, C.A. et al., Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite, ATP-dependent regulation. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103(2004)] 등을 예로 들 수 있다. 무기염류의 배지 중의 농도는, 사용하는 무기염에 따라 상이하지만, 통상, 약 0.01∼1(w/v%)로 하면 된다.

반응액의 pH는 약 6∼8이 바람직하다. 반응 중에는, 암모니아수 용액, 수산화 나트륨 수용액 등을 사용하여, pH 컨트롤러(예를 들면, 에이블가부시키가이샤 제조, 모델형：DT-1023)에 의해, 반응액의 pH를 중성 부근, 특히 약 7로 컨트롤하면서 반응시키는 것이 바람직하다.

반응 조건

반응 온도, 즉 반응 중의 형질 전환체의 생존 온도는, 약 20∼50 ℃가 바람직하고, 약 25∼47 ℃가 보다 바람직하다. 전술한 온도 범위에서, 양호한 효율로 페놀을 제조할 수 있다.

또한, 반응 시간은, 약 1∼7 일간이 바람직하고, 약 1∼3 일간이 보다 바람직하다.

배양은, 배치식(batch type), 유가식(fed-batch type), 연속식(continuous type)의 어느 방식으로 행해도 된다. 그 중에서도, 배치식이 바람직하다.

＜환원 조건＞

반응은, 호기적 조건에서 행해도 되고, 환원 조건에서 행해도 되지만, 환원 조건에서 행하는 것이 바람직하다. 환원 조건에서는, 코리네박테리움 글루타미쿰은 실질적으로 증식하지 않고, 한층 효율적으로 페놀을 생산시킬 수 있다.

환원 조건은, 반응액의 산화 환원 전위로 규정된다. 반응액의 산화 환원 전위는, 약 -200 mV∼-500 mV가 바람직하고, 약 -250 mV∼-500 mV가 보다 바람직하다.

반응액의 환원 상태는 레사주린(resazurin) 지시약(환원 상태이면, 청색으로부터 무색으로 탈색함)으로 간편하게 추정할 수 있으며, 산화 환원 전위차계(예를 들면, BROADLEYJAMES사 제조, ORP Electrodes)를 사용하여 정확하게 측정할 수 있다.

환원 조건에 있는 반응액의 조정 방법은, 공지의 방법을 제한없이 사용할 수 있다. 예를 들면, 반응액 조제용 액체 매체로서, 증류수 등을 대신하여 반응액용 수용액을 사용해도 되고, 반응액용 수용액의 조정 방법은, 예를 들면, 황산 환원 미생물 등의 절대 혐기성 미생물용의 배양액 조정 방법[Pfennig, N. et al.,(1981)：The dissimilatory sulfate-reducing bacteria, In The Prokaryotes, A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria Ed. By Starr, M. P. et al., p.926-940, Berlin, Springer Verlag.]이나 「농예화학 실험서 제3권, 교토 대학 농학부 농예화학 교실편, 1990년 제26쇄, 산업 도서 가부시키가이샤 출판」등이 참고하여, 원하는 환원 조건 하의 수용액을 얻을 수 있다.

구체적으로는, 증류수 등을 가열 처리나 감압 처리하여 용해 가스를 제거함으로써, 환원 조건의 반응액용 수용액을 얻을 수 있다. 이 경우에, 약 10 mmHg 이하, 바람직하게는 약 5 mmHg 이하, 보다 바람직하게는 약 3 mmHg 이하의 감압 하에서, 약 1∼60 분 정도, 바람직하게는 약 5∼40 분 정도, 증류수 등을 처리함으로써, 용해 가스, 특히 용해 산소를 제거하여 환원 조건 하의 반응액용 수용액을 제조할 수 있다.

또한, 적절한 환원제(예를 들면, 티오글리콜산, 아스코르브산, 시스테인 염산염, 머캅토아세트산, 티올아세트산, 글루타티온, 황화 소다 등)를 첨가하여 환원 조건의 반응액용 수용액을 조정할 수도 있다. 이들 방법을 적절하게 조합하는 것도 유효한 환원 조건의 반응액용 수용액의 조정 방법이다.

반응 중에도 반응액을 환원 조건으로 유지하는 것이 바람직하다. 반응 도중에 환원 조건을 유지하기 위하여, 반응계 외부로부터의 산소의 혼입을 가능한 한 방지하는 것이 바람직하고, 구체적으로는, 반응계를 질소 가스 등의 불활성 가스나 탄산 가스 등으로 봉입(封入)하는 방법을 예로 들 수 있다. 산소 혼입을 보다 효과적으로 방지하는 방법으로서는, 반응 도중에 본 발명의 호기성 세균의 균체 내의 대사 기능을 효율적으로 기능시키기 위하여, 반응계의 pH 유지 조정액의 첨가나 각종 영양소 용해액을 적절하게 첨가할 필요도 있지만, 이와 같은 경우에는 첨가 용액으로부터 산소를 사전에 제거하여 두는 것이 유효하다.

페놀의 회수

상기한 바와 같이 하여 배양함으로써, 반응액 중에 페놀이 생산된다. 반응액을 회수함으로써 페놀을 회수할 수 있지만, 또한 공지의 방법으로 페놀을 반응액으로부터 분리할 수도 있다. 이와 같은 공지의 방법으로서, 증류법, 막투과법, 유기용매 추출법 등을 예로 들 수 있다.

[실시예]

이하에서, 본 발명을 실시예에 의해 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 페놀 생산 유전자의 클로닝과 발현

(1) 미생물로부터의 염색체 DNA 의 추출

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) R(FERM P-18976)로부터의 염색체 DNA 추출은, A 배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄.7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄.7H₂O + 0.042%(w/v) MnSO₄.2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g을 증류수 1L에 용해시킴]에, 탄소원으로서 최종 농도 4%가 되도록 50%(w/v) 글루코오스 용액을 첨가하고, 백금이(platinum loop)를 사용하여 식균한 후, 지수 증식기까지 33℃에서 진탕 배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아마샴사 제조)를 사용하여, 취급 설명서에 따라, 집균한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) NBRC 14144로부터의 염색체 DNA 추출은, NBRC Medium No.802 배지[polypeptone 10g, yeast extract 2g, MgSO₄·7H₂O 1g을 증류수 1L에 용해시킴]에, 백금이를 사용하여 식균한 후, 지수 증식기까지 37℃에서 진탕 배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아마샴사 제조)를 사용하여, 취급 설명서에 따라, 집균한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus) JCM 9070으로부터의 염색체 DNA 추출은, JCM Medium No.22 배지[peptone 10g, beef extract 10g, NaCl 5g을 증류수 1L에 용해시킴]에, 백금이를 사용하여 식균한 후, 지수 증식기까지 30℃에서 진탕 배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아마샴사 제조)를 사용하여, 취급 설명서에 따라, 집균한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니(Bacillus subtilis subsp. spizizenii) NBRC 101239로부터의 염색체 DNA 추출은, NBRC Medium No.802 배지[polypeptone 10g, yeast extract 2g, MgSO₄·7H₂O 1g을 증류수 1L에 용해시킴]에, 백금이를 사용하여 식균한 후, 지수 증식기까지 37℃에서 진탕 배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아마샴사 제조)를 사용하여, 취급 설명서에 따라, 집균한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

시트로박터 코세리(Citrobacter koseri) ATCC BAA-895의 염색체 DNA(Catalog No. BAA-895 D-5)는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 입수했다.

엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) NBRC 13534로부터의 염색체 DNA 추출은, NBRC Medium No.802 배지[polypeptone 10g, yeast extract 2g, MgSO₄·7H₂O 1g을 증류수 1L에 용해시킴]에, 백금이를 사용하여 식균한 후, 지수 증식기까지 37℃에서 진탕 배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아마샴사 제조)를 사용하여, 취급 설명서에 따라, 집균한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) NBRC 13535로부터의 염색체 DNA 추출은, NBRC Medium No.802 배지[polypeptone 10g, yeast extract 2g, MgSO₄·7H₂O 1g을 증류수 1L에 용해시킴]에, 백금이를 사용하여 식균한 후, 지수 증식기까지 37℃에서 진탕 배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아마샴사 제조)를 사용하여, 취급 설명서에 따라, 집균한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

엔테로박터 호마에체이(Enterobacter hormaechei) ATCC 49162로부터의 염색체 DNA 추출은, Tryptic Soy Broth 배지[Tryptic Soy Broth(Becton, Dickinson and Company 제조, Catalog No. 211825) 30g을 증류수 1L에 용해시킴]에, 백금이를 사용하여 식균한 후, 지수 증식기까지 30℃에서 진탕 배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아마샴사 제조)를 사용하여, 취급 설명서에 따라, 집균한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

엔테로박터 사카자키(Enterobacter sakazakii) ATCC BAA-894로부터의 염색체 DNA(Catalog No. BAA-894D-5)는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 입수했다.

에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) W NBRC 13500으로부터의 염색체 DNA 추출은, NBRC Medium No.802 배지[polypeptone 10g, yeast extract 2g, MgSO₄·7H₂O 1g을 증류수 1L에 용해시킴]에, 백금이를 사용하여 식균한 후, 지수 증식기까지 30℃에서 진탕 배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아마샴사 제조)를 사용하여, 취급 설명서에 따라, 집균한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

에쉐리키아 퍼구소니(Escherichia fergusonii) NBRC 102419로부터의 염색체 DNA 추출은, NBRC Medium No.802 배지[polypeptone 10g, yeast extract 2g, MgSO₄·7H₂O 1g을 증류수 1L에 용해시킴]에, 백금이를 사용하여 식균한 후, 지수 증식기까지 30℃에서 진탕 배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아마샴사 제조)를 사용하여, 취급 설명서에 따라, 집균한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa) NBRC 15309로부터의 염색체 DNA 추출은, NBRC Medium No.802 배지[polypeptone 10g, yeast extract 2g, MgSO₄·7H₂O 1g을 증류수 1L에 용해시킴]에, 백금이를 사용하여 식균한 후, 지수 증식기까지 30℃에서 진탕 배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아마샴사 제조)를 사용하여, 취급 설명서에 따라, 집균한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) LMG 20103으로부터의 염색체 DNA 추출은, BCCM/LMG BacteriCulture Medium No.1 배지[beef extract 1g, yeast extract 2g, peptone 5g, NaCl 5g을 증류수 1L에 용해시킴]에, 백금이를 사용하여 식균한 후, 지수 증식기까지 30℃에서 진탕 배양하고, 균체를 집균한 후, DNA 게놈 추출 키트(상품명：GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit, 아마샴사 제조)를 사용하여, 취급 설명서에 따라, 집균한 균체로부터 염색체 DNA를 회수했다.

(2) 클로닝 벡터의 구축

클로닝 벡터 pCRB22 의 구축

코리네박테리움 카제이 JCM12072 유래의 플라스미드 pCASE1의 DNA 복제 기점(이후, pCASE1-ori라고 함) 서열, 및 클로닝 벡터 pHSG298(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조)을 각각 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, pCASE1-ori 서열, 클로닝 벡터 pHSG298을 각각 클론화할 수 있도록, 서열 번호 1(pCASE1-ori 서열), 서열 번호 2(클로닝 벡터-pHSG298)를 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를 합성하여, 사용하였다.

pCASE1-ori 서열 증폭용 프라이머

(a-1)；5'-AT AGATCT AGAACGTCCGTAGGAGC-3' (서열 번호 3)

(b-1)；5'-AT AGATCT GACTTGGTTACGATGGAC-3' (서열 번호 4)

그리고, 프라이머 (a-1) 및 (b-1)에는, BglII 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

클로닝 벡터 pHSG298 증폭용 프라이머

(a-2)；5'-AT AGATCT AGGTTTCCCGACTGGAAAG-3' (서열 번호 5)

(b-2)；5'-AT AGATCT CGTGCCAGCTGCATTAATGA-3' (서열 번호 6)

그리고, 프라이머 (a-2) 및 (b-2)에는, BglII 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

주형(鑄型) DNA는, Japan. Collection of Microorganisms(JCM)로부터 입수한 코리네박테리움 카제이 JCM12072로부터 추출한 전체 DNA 및 클로닝 벡터 pHSG298(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조)을 사용하였다.

실제 PCR은, 서멀 사이클러(thermal cycler) GeneAmp PCR System 9700(어플라이드·바이오시스템즈사 제조)을 사용하고, 반응 시약으로서 TaKaRa LA Taq(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조)를 사용하여 하기의 조건에서 행하였다.

이상을 혼합하여, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) pCASE1-ori 서열을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-1)과 (b-1)을 조합하여 행하였고, 클로닝 벡터 pHSG298을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-2)와 (b-2)를 조합하여 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

상기에서 생성된 반응액 10㎕를 0.8% 아가로스겔에 의해 전기 영동을 행하여, pCASE1-ori 서열의 경우 약 1.4-kb의 DNA 단편을, 클로닝 벡터 pHSG298의 경우, 약 2.7-kb의 DNA 단편을 검출할 수 있었다.

상기 PCR에 의해 증폭된 코리네박테리움 카제이주 유래의 플라스미드 pCASE1-ori 서열을 포함하는 약 1.4-kb의 DNA 단편 10㎕ 및 클로닝 벡터 pHSG298을 포함하는 약 2.7-kb의 DNA 단편 10㎕를 각각 제한 효소 BglII로 절단하고, 70℃에서 10분 처리시킴으로써 제한 효소를 실활시킨 후, 양 측을 혼합하고, 여기에 T4 DNA 리가아제 10×완충액 1㎕, T4 DNA 리가아제(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수로 10㎕로 만들고, 15℃에서 3시간 반응시켜, 결합시켰다. 이것을 라이게이션 A액으로 하였다.

얻어진 라이게이션 A액을, 염화 칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)]에 의해 에쉐리키아 콜라이 JM109를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소 BglII로 각각 절단하여, 삽입 단편을 확인하였다. 그 결과, 클로닝 벡터 pHSG298 약 2.7-kb의 DNA 단편뿐만 아니라, pCASE-ori 서열의 약 1.4-kb의 DNA 단편이 확인되었다.

pCASE1-ori 서열을 포함하는 클로닝 벡터를 pCRB22로 명명했다.

클로닝 벡터 pCRB207 의 구축

코리네박테리움 글루타미쿰 R 유래의 글리세르알데히드 3인산 데히드로게나아제(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 gapA 유전자의 프로모터 서열(이후, PgapA라고 함)을 포함하는 DNA 단편, 및 클로닝 벡터 pKK223-3(파마시아사 제조) 유래 rrnBT1T2 양방향 터미네이터 서열(이후, 터미네이터 서열이라고 함)을 포함하는 DNA 단편을 이하의 방법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, PgapA 서열 및 터미네이터 서열을 각각 클론화할 수 있도록, 서열 번호 7(PgapA 서열), 서열 번호 8(터미네이터 서열)을 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를 합성하여, 사용하였다.

PgapA 서열 증폭용 프라이머

(a-3)；5'-CTCT GTCGAC CCGAAGATCTGAAGATTCCTG-3' (서열 번호 9)

(b-3)；5'-CTCT GTCGAC GGATCC CCATGG TGTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3'

(서열 번호 10)

그리고, 프라이머 (a-3)에는, SalI 제한 효소 부위가, 프라이머 (b-3)에는, SalI, BamHI 및 NcoI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

터미네이터 서열 증폭용 프라이머

(a-4)；5'-CTCT GCATGC CCATGG CTGTTTTGGCGGATGAGAGA-3'

(서열 번호 11)

(b-4)；5'-CTCT GCATGC TCATGA AAGAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGG-3

(서열 번호 12)

그리고, 프라이머 (a-4)에는, SphI 및 NcoI 제한 효소 부위가, 프라이머 (b-4)에는, SphI 및 BspHI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

주형 DNA는, 코리네박테리움 글루타미쿰 R(FERM P-18976)로부터 추출한 염색체 DNA 및 pKK223-3 플라스미드(파마시아사 제조)를 사용하였다.

실제 PCR는, 서멀 사이클러 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드·바이오시스템즈사 제조)을 사용하고, 반응 시약으로서 TaKaRa LA Taq(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조)를 사용하여 하기 조건에서 행하였다.

이상을 혼합하여, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) PgapA 서열을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-7)과 (b-7)을 조합하여 행하였고, 터미네이터 서열을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-8)과 (b-8)을 조합하여 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

전술한 바와 같이 생성된 반응액 10㎕를 0.8% 아가로스겔에 의해 전기 영동을 행하여, PgapA 서열의 경우 약 0.6-kb의 단편을 검출할 수 있었고, 터미네이터 서열의 경우, 약 0.4-kb의 DNA 단편을 검출할 수 있었다.

전술한 PCR에 의해 증폭된 코리네박테리움 글루타미쿰 R 유래 PgapA 서열을 포함하는 약 0.6-kb의 DNA 단편 10㎕와 클로닝 벡터 pCRB22 약 4.1-kb를 각각 제한 효소 SalI로 절단하고, 70℃에서 10분 처리시킴으로써 제한 효소를 실활시킨 후, 양 측을 혼합하고, 여기에 T4 DNA 리가아제 10×완충액 1㎕, T4 DNA 리가아제(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수로 10㎕로 만들고, 15℃에서 3시간 반응시켜, 결합시켰다. 이것을 라이게이션 B액으로 하였다.

얻어진 라이게이션 B액을, 염화 칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)]에 의해 에쉐리키아 콜라이 JM109를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소 SalI로 각각 절단하여, 삽입 단편을 확인하였다. 그 결과, 클로닝 벡터 pCRB22 약 4.1-kb의 DNA 단편뿐만 아니라, PgapA 서열의 약 0.6-kb의 DNA 단편이 확인되었다.

PgapA 서열을 포함하는 클로닝 벡터를 pCRB206으로 명명했다.

상기 PCR에 의해 증폭된 pKK223-3 플라스미드 유래 터미네이터 서열을 포함하는 약 0.4-kb의 DNA 단편 10㎕를 제한 효소 NcoI 및 BspHI로 절단하고, 전술한 클로닝 벡터 pCRB206 2㎕를 제한 효소 NcoI로 절단하고, 70℃에서 10분 처리시킴으로써 제한 효소를 실활시킨 후, 양 측을 혼합하고, 여기에 T4 DNA 리가아제 10×완충액 1㎕, T4 DNA 리가아제(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수로 10㎕로 만들고, 15℃에서 3시간 반응시켜, 결합시켰다. 이것을 라이게이션 C액으로 하였다.

얻어진 라이게이션 C액을, 염화 칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)]에 의해 에쉐리키아 콜라이 JM109를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소로 절단하여, 삽입 단편을 확인하였다. 그 결과, 클로닝 벡터 pCRB206 약 4.7-kb의 DNA 단편뿐만 아니라, 터미네이터 서열의 약 0.4-kb의 DNA 단편이 확인되었다.

rrnBT1T2 터미네이터 서열을 포함하는 클로닝 벡터를 pCRB207로 명명했다.

클로닝 벡터 pCRB209 의 구축

코리네박테리움 글루타미쿰 R 유래의 gapA(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase A) 유전자의 프로모터(이후, PgapA라고 함) 서열을 포함하는 DNA 단편을 이하의 방법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, pCRB207 서열을 클론화할 수 있도록, 서열 번호 13(pCRB207)을 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를 합성하여, 사용하였다.

pCRB207 서열 증폭용 프라이머

(a-5)；5'-CTCT CATATG CTGTTTTGGCGGATGAGAG-3' (서열 번호 14)

(b-5)；5'-CTCT CATATG GTGTCTCCTCTAAAGATTGTAGG-3' (서열 번호 15)

그리고, 프라이머 (a-5) 및 (b-5)에는 NdeI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

주형 DNA는, gapA 프로모터 및 rrnBT1T2 터미네이터 서열을 함유하는 클로닝 벡터 pCRB207를 사용하였다.

실제 PCR은, 서멀 사이클러 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드·바이오시스템즈사 제조)을 사용하고, 반응 시약으로서 TaKaRa LA Taq(타카라주조 가부시키가이샤 제조)를 사용하여 하기의 조건에서 행하였다.

이상을 혼합하여, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) pCRB207 서열을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-5)와 (b-5)를 조합하여 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

전술한 바와 같이 생성된 반응액 10㎕를 0.8% 아가로스겔에 의해 전기 영동을 행하여, 클로닝 벡터 pCRB207 서열을 포함하는 약 5.1-kb의 DNA 단편을 검출하였다.

상기 PCR에 의해 증폭된 pCRB207 유래 유전자를 포함하는 약 5.1-kb의 DNA 단편 10㎕를 제한 효소 NdeI로 절단하고, 70℃에서 10분 처리시킴으로써 제한 효소를 실활시킨 후, 여기에 T4 DNA 리가아제 10×완충액 1㎕, T4 DNA 리가아제(타카라주조 가부시키가이샤 제조) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수로 10㎕로 만들고, 15℃에서 3시간 반응시켜, 결합시켰다. 이것을 라이게이션 D액으로 하였다.

얻어진 라이게이션 D액을, 염화 칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)]에 의해 에쉐리키아 콜라이 JM109를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

이 배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소 NdeI로 절단하고, 제한 효소 사이트의 삽입을 확인하였다.

PgapA 서열 및 rrnBT1T2 터미네이터 서열을 포함하는 클로닝 벡터를 pCRB209로 명명했다.

(3) 페놀 생산 유전자의 클로닝

바실러스 서브틸리스 유래의 페놀 생산 유전자의 클로닝

바실러스 서브틸리스 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 유전자를 코딩하는 bsdBCD 유전자를 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, bsdBCD 유전자를 클론화할 수 있도록, 서열 번호 16(바실러스 서브틸리스 bsdBCD 유전자)을 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를, 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제조한「394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)」를 사용하여 합성하여, 사용하였다.

bsdBCD 유전자 증폭용 프라이머

(a-6)；5'-CTCT CATATG AAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG-3' (서열 번호 17)

(b-6)；5'-CTCT CATATG GATCAAGCCTTTCGTTCCG-3' (서열 번호 18)

그리고, 프라이머 (a-6) 및 (b-6)에는, NdeI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

바실러스 아트로파에우스 유래의 페놀 생산 유전자의 클로닝

바실러스 아트로파에우스 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 유전자를 코딩하는 dca 유전자를 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, dca 유전자를 클론화할 수 있도록, 서열 번호 23(바실러스 아트로파에우스 dca 유전자)을 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를, 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제조한 「394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)」를 사용하여 합성하여, 사용하였다.

dca 유전자 증폭용 프라이머

(a-9)；5'-CTCT CATATG AAACTCGTTGTCGGGATG-3' (서열 번호 24)

(b-9)；5'-CTCT CATATG TCAGGCCTTTCTTTCC-3' (서열 번호 25)

그리고, 프라이머 (a-9) 및 (b-9)에는, NdeI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니 유래의 페놀 생산 유전자의 클로닝

바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 유전자를 코딩하는 dca 유전자를 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, dca 유전자를 클론화할 수 있도록, 서열 번호 26(바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니 dca 유전자)을 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를, 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제조한 「394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)」를 사용하여 합성하여, 사용하였다.

dca 유전자 증폭용 프라이머

(a-10)；5'-CTCT CATATG AAAGCAGAATTCAAGCGTAAAG-3' (서열 번호 27)

(b-10)；5'-CTCT CATATG TCAAGCCTTTCGTTCCGG-3' (서열 번호 28)

그리고, 프라이머 (a-10) 및 (b-10)에는, NdeI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

시트로박터 코세리 유래의 페놀 생산 유전자의 클로닝

시트로박터 코세리 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 유전자를 코딩하는 dca 유전자를 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, dca 유전자를 클론화할 수 있도록, 서열 번호 29(시트로박터 코세리 dca 유전자)를 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를, 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제조한 「394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)」를 사용하여 합성하여, 사용하였다.

dca 유전자 증폭용 프라이머

(a-11)；5'-CTCT CATATG AGACTGATTGTGGGGATG-3' (서열 번호 30)

(b-11)；5'-CTCT CATATG TTAACGCTTATCTTCCGCCAG-3' (서열 번호 31)

그리고, 프라이머 (a-11) 및 (b-11)에는, NdeI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

엔테로박터 아에로게네스 유래의 페놀 생산 유전자의 클로닝

엔테로박터 아에로게네스 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 유전자를 코딩하는 dca 유전자를 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, dca 유전자를 클론화할 수 있도록, 서열 번호 32(엔테로박터 아에로게네스 dca 유전자)를 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를, 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제조한 「394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)」를 사용하여 합성하여, 사용하였다.

dca 유전자 증폭용 프라이머

(a-12)；5'-CTCT CATATG AAACTGATTATTGGGATGACCG-3' (서열 번호 33)

(b-12)；5'-CTCT CATATG TTAACGCTTATCTGCCGCC-3' (서열 번호 34)

그리고, 프라이머 (a-12) 및 (b-12)에는, NdeI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

엔테로박터 클로아케 유래의 페놀 생산 유전자의 클로닝

엔테로박터 클로아케 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 유전자를 코딩하는 dca 유전자를 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, dca 유전자를 클론화할 수 있도록, 서열 번호 35(엔테로박터 클로아케 dca 유전자)를 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를, 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제조한 「394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)」를 사용하여 합성하여, 사용하였다.

dca 유전자 증폭용 프라이머

(a-13)；5'-CTCT CATATG AGATTGATCGTGGGAATGAC-3' (서열 번호 36)

(b-13)；5'-CTCT CATATG TTACAGCAATGGCGGAATGG-3' (서열 번호 37)

그리고, 프라이머 (a-13) 및 (b-13)에는, NdeI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

엔테로박터 호마에체이 유래의 페놀 생산 유전자의 클로닝

엔테로박터 호마에체이 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 유전자를 코딩하는 dca 유전자를 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, dca 유전자를 클론화할 수 있도록, 서열 번호 38(엔테로박터 호마에체이 dca 유전자)을 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를, 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제조한 「394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)」를 사용하여 합성하여, 사용하였다.

dca 유전자 증폭용 프라이머

(a-14)；5'-CTCT CATATG AGATTGATTGTGGGAATGAC-3' (서열 번호 39)

(b-14)；5'-CTCT CATATG GAGTCTGGTTTAGTTCTCTGC-3' (서열 번호 40)

그리고, 프라이머 (a-14) 및 (b-14)에는, NdeI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

엔테로박터 사카자키 유래의 페놀 생산 유전자의 클로닝

엔테로박터 사카자키 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 유전자를 코딩하는 dca 유전자를 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, dca 유전자를 클론화할 수 있도록, 서열 번호 41(엔테로박터 사카자키 dca 유전자)을 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를, 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제조한 「394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)」를 사용하여 합성하여, 사용하였다.

dca 유전자 증폭용 프라이머

(a-15)；5'-CTCT CATATG AGGCTAATTGTCGGAATGAC-3' (서열 번호 42)

(b-15)；5'-CTCT CATATG TTAACGCTTACCATCCGCC-3' (서열 번호 43)

그리고, 프라이머 (a-15) 및 (b-15)에는, NdeI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

에쉐리키아 콜라이 유래의 페놀 생산 유전자의 클로닝

에쉐리키아 콜라이 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 유전자를 코딩하는 dca 유전자를 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, dca 유전자를 클론화할 수 있도록, 서열 번호 44(에쉐리키아 콜라이 dca 유전자)를 기초로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를, 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제조한 「394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)」를 사용하여 합성하여, 사용하였다.

dca 유전자 증폭용 프라이머

(a-16)；5'-CTCT CATATG AAACTGATCGTCGGGATG-3' (서열 번호 45)

(b-16)；5'-CTCT CATATG TTAGCGCTTACCTTCCGC-3' (서열 번호 46)

그리고, 프라이머 (a-16) 및 (b-16)에는, NdeI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

에쉐리키아 퍼구소니 유래의 페놀 생산 유전자의 클로닝

에쉐리키아 퍼구소니 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 유전자를 코딩하는 dca 유전자를 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, dca 유전자를 클론화할 수 있도록, 서열 번호 47(에쉐리키아 퍼구소니 dca 유전자)을 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를, 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제조한 「394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)」를 사용하여 합성하여, 사용하였다.

dca 유전자 증폭용 프라이머

(a-17)；5'-CTCT CATATG AGACTGATCGTCGGGAT-3' (서열 번호 48)

(b-17)；5'-CTCT CATATG TTAGCGCTTATCTGCCGC-3' (서열 번호 49)

그리고, 프라이머 (a-17) 및 (b-17)에는, NdeI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

파에니바실러스 폴리믹사 유래의 페놀 생산 유전자의 클로닝

파에니바실러스 폴리믹사 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 유전자를 코딩하는 dca 유전자를 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, dca 유전자를 클론화할 수 있도록, 서열 번호 50(파에니바실러스 폴리믹사 dca 유전자)을 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를, 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제조한 「394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)」를 사용하여 합성하여, 사용하였다.

dca 유전자 증폭용 프라이머

(a-18)；5'-CTCT CATATG AAGAAAATCATTGTAGGAATATCGG-3' (서열 번호 51)

(b-18)；5'-CTCT CATATG CTATATCCGCTCTGGAATAGG-3' (서열 번호 52)

그리고, 프라이머 (a-18) 및 (b-18)에는, NdeI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

판토에아 아나나티스 유래의 페놀 생산 유전자의 클로닝

판토에아 아나나티스 유래의 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 유전자를 코딩하는 dca 유전자를 포함하는 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, dca 유전자를 클론화할 수 있도록, 서열 번호 53(판토에아 아나나티스 dca 유전자)을 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를, 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제조한 「394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)」를 사용하여 합성하여, 사용하였다.

dca 유전자 증폭용 프라이머

(a-19)；5'-CTCT CATATG AGTAGATTACTGTTAATTTCATTCGTAC-3

(서열 번호 54)

(b-19)；5'-CTCT CATATG TTACTTAGCTAACAGAGGAGGG-3'

(서열 번호 55)

그리고, 프라이머 (a-19) 및 (b-19)에는, NdeI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

주형 DNA는, 바실러스 서브틸리스는, NITE(National Institute of Technology and Evaluation) Biological Resource Center(NBRC)로부터 입수한 바실러스 서브틸리스 NBRC 14144로부터 추출한 염색체 DNA를 사용하였다.

바실러스 아트로파에우스는, Japan Collection of Microorganisms(JCM)로부터 입수한 바실러스 아트로파에우스 JCM 9070으로부터 추출한 염색체 DNA를 사용하였다.

바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니는, NITE(National Institute of Technology and Evaluation) Biological Resource Center(NBRC)로부터 입수한 바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니 NBRC 101239로부터 추출한 염색체 DNA를 사용하였다.

시트로박터 코세리는, American Type Culture Collection(ATCC)로부터 입수한 시트로박터 코세리 염색체 DNA(catalog No. BAA-895 D-5)를 사용하였다.

엔테로박터 아에로게네스는, NITE(National Institute of Technology and Evaluation) Biological Resource Center(NBRC)로부터 입수한 엔테로박터 아에로게네스 NBRC 13534로부터 추출한 염색체 DNA를 사용하였다.

엔테로박터 클로아케는, NITE(National Institute of Technology and Evaluation) Biological Resource Center(NBRC)로부터 입수한 엔테로박터 클로아케 NBRC 13535로부터 추출한 염색체 DNA를 사용하였다.

엔테로박터 호마에체이는, American Type Culture Collection(ATCC)로부터 입수한 엔테로박터 호마에체이 ATCC 49162로부터 추출한 염색체 DNA를 사용하였다.

엔테로박터 사카자키는, American Type Culture Collection(ATCC)로부터 입수한 엔테로박터 사카자키 염색체 DNA(catalog No. BAA-894 D-5)를 사용하였다.

에쉐리키아 콜라이 W는, NITE(National Institute of Technology and Evaluation) Biological Resource Center(NBRC)로부터 입수한 에쉐리키아 콜라이 NBRC 13500으로부터 추출한 염색체 DNA를 사용하였다.

에쉐리키아 퍼구소니는, NITE(National Institute of Technology and Evaluation) Biological Resource Center(NBRC)로부터 입수한 에쉐리키아 퍼구소니 NBRC 102419로부터 추출한 염색체 DNA를 사용하였다.

파에니바실러스 폴리믹사는, NITE(National Institute of Technology and Evaluation) Biological Resource Center(NBRC)로부터 입수한 파에니바실러스 폴리믹사 NBRC 15309로부터 추출한 염색체 DNA를 사용하였다.

판토에아 아나나티스는, BCCM/LMG(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/Laboratory for Microbiology, University of Gent)로부터 입수한 판토에아 아나나티스 LMG 20103으로부터 추출한 염색체 DNA를 사용하였다.

실제 PCR은, 서멀 사이클러 GeneAmp PCR System 9700(어플라이드·바이오시스템즈사 제조)을 사용하고, 반응 시약으로서 TaKaRa LA Taq(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조)를 사용하여 하기의 조건에서 행하였다.

이상을 혼합하여, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) 바실러스 서브틸리스 bsdBCD 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-6)과 (b-6)을 조합하여, 바실러스 아트로파에우스 dca 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-9)와 (b-9)를 조합하여, 바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니 dca 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-10)과 (b-10)을 조합하여, 시트로박터 코세리 dca 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-11)과 (b-11)을 조합하여, 엔테로박터 아에로게네스 dca 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-12)와 (b-12)를 조합하여, 엔테로박터 클로아케 dca 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-13)과 (b-13)을 조합하여, 엔테로박터 호마에체이 dca 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-14)와 (b-14)를 조합하여, 엔테로박터 사카자키 dca 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-15)와 (b-15)를 조합하여, 에쉐리키아 콜라이 W dca 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-16)과 (b-16)을 조합하여, 에쉐리키아 퍼구소니 dca 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-17)과 (b-17)을 조합하여, 파에니바실러스 폴리믹사 dca 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-18)과 (b-18)을 조합하여, 판토에아 아나나티스 dca 유전자를 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-19)와 (b-19)를 조합하여 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

전술한 바와 같이 생성된 반응액 10㎕를 0.8% 아가로스겔에 의해 전기 영동을 행하여, 바실러스 서브틸리스 bsdBCD 유전자의 경우 약 2.3-kb의 단편을, 바실러스 아트로파에우스 bsdBCD 유전자의 경우 약 2.3-kb의 단편을, 바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니 dca 유전자의 경우 약 2.3-kb의 단편을, 시트로박터 코세리 dca 유전자의 경우 약 2.3-kb의 단편을, 엔테로박터 아에로게네스 dca 유전자의 경우 약 2.3-kb의 단편을, 엔테로박터 클로아케 dca 유전자의 경우 약 2.3-kb의 단편을, 엔테로박터 호마에체이 dca 유전자의 경우 약 2.4-kb의 단편을, 엔테로박터 사카자키 dca 유전자의 경우 약 2.3-kb의 단편을, 에쉐리키아 콜라이 W dca 유전자의 경우 약 2.3-kb의 단편을, 에쉐리키아 퍼구소니 dca 유전자의 경우 약 2.3-kb의 단편을, 파에니바실러스 폴리믹사 dca 유전자의 경우 약 2.3-kb의 단편을, 판토에아 아나나티스 dca 유전자의 경우 약 2.3-kb의 DNA 단편을 검출할 수 있었다.

(4) 페놀 생산 유전자 발현 플라스미드의 구축

페놀 생산 유전자의 pCRB209 로의 클로닝

상기 항 (3)에 나타낸 PCR에 의해 증폭된 바실러스 서브틸리스주 유래 bsdBCD 유전자를 포함하는 약 2.3-kb의 DNA 단편, 바실러스 아트로파에우스주 유래 dca 유전자를 포함하는 약 2.3-kb의 DNA 단편, 바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니주 유래 dca 유전자를 포함하는 약 2.3-kb의 DNA 단편, 시트로박터 코세리주 유래 dca 유전자를 포함하는 약 2.3-kb의 DNA 단편, 엔테로박터 아에로게네스주 유래 dca 유전자를 포함하는 약 2.3-kb의 DNA 단편, 엔테로박터 클로아케주 유래 dca 유전자를 포함하는 약 2.3-kb의 DNA 단편, 엔테로박터 호마에체이주 유래 dca 유전자를 포함하는 약 2.4-kb의 DNA 단편, 엔테로박터 사카자키주 유래 dca 유전자를 포함하는 약 2.3-kb의 DNA 단편, 에쉐리키아 콜라이 W주 유래 dca 유전자를 포함하는 약 2.3-kb의 DNA 단편, 에쉐리키아 퍼구소니주 유래 dca 유전자를 포함하는 약 2.3-kb의 DNA 단편, 파에니바실러스 폴리믹사주 유래 dca 유전자를 포함하는 약 2.3-kb의 DNA 단편, 및 판토에아 아나나티스주 유래 dca 유전자를 포함하는 약 2.3-kb의 DNA 단편의 각각 10㎕ 및 PgapA 프로모터를 함유하는 클로닝 벡터 pCRB209 2㎕를 각각 제한 효소 NdeI로 절단하고, 70℃에서 10분 처리시킴으로써 제한 효소를 실활시킨 후, 양 측을 혼합하고, 여기에 T4 DNA 리가아제 10×완충액 1㎕, T4 DNA 리가아제(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수로 10㎕로 만들고, 15℃에서 3시간 반응시켜, 결합시켰다. 이것을, 각각 라이게이션 E액, G액, H액, I액, J액, K액, L액, M액, N액, O액, P액 및 Q액으로 하였다.

얻어진 12종류의 라이게이션 E액, G액, H액, I액, J액, K액, L액, M액, N액, O액, P액 및 Q액 각각을, 염화 칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)]에 의해 에쉐리키아 콜라이 JM109를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

각각 배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소로 각각 절단하여, 삽입 단편을 확인하였다. 그 결과, 플라스미드 pCRB209 약 5.1-kb의 DNA 단편뿐만 아니라, 바실러스 서브틸리스주 유래 bsdBCD 유전자(라이게이션 E액)의 경우, 길이 약 2.3-kb의 삽입 단편이, 바실러스 아트로파에우스주 유래 dca 유전자(라이게이션 G액)의 경우, 길이 약 2.3-kb의 삽입 단편이, 바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니주 유래 dca 유전자(라이게이션 H액)의 경우, 길이 약 2.3-kb의 삽입 단편이, 시트로박터 코세리주 유래 dca 유전자(라이게이션 I액)의 경우, 길이 약 2.3-kb의 삽입 단편이, 엔테로박터 아에로게네스주 유래 dca 유전자(라이게이션 J액)의 경우, 길이 약 2.3-kb의 삽입 단편이, 엔테로박터 클로아케주 유래 dca 유전자(라이게이션 K액)의 경우, 길이 약 2.3-kb의 삽입 단편이, 엔테로박터 호마에체이주 유래 dca 유전자(라이게이션 L액)의 경우, 길이 약 2.4-kb의 삽입 단편이, 엔테로박터 사카자키주 유래 dca 유전자(라이게이션 M액)의 경우, 길이 약 2.3-kb의 삽입 단편이, 에쉐리키아 콜라이 W주 유래 dca 유전자(라이게이션 N액)의 경우, 길이 약 2.3-kb의 삽입 단편이, 에쉐리키아 퍼구소니주 유래 dca 유전자(라이게이션 O액)의 경우, 길이 약 2.3-kb의 삽입 단편이, 파에니바실러스 폴리믹사주 유래 dca 유전자(라이게이션 P액)의 경우, 길이 약 2.3-kb의 삽입 단편이, 판토에아 아나나티스주 유래 dca 유전자(라이게이션 Q액)의 경우, 길이 약 2.3-kb의 삽입 단편이 확인되었다.

바실러스 서브틸리스주 유래 bsdBCD 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRB209-bsdBCD/BS(도 1), 바실러스 아트로파에우스주 유래 dca 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRB209-dca/BAE, 바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니주 유래 dca 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRB209-dca/BSS, 시트로박터 코세리주 유래 dca 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRB209-dca/CKO, 엔테로박터 아에로게네스주 유래 dca 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRB209-dca/EAE, 엔테로박터 클로아케주 유래 dca 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRB209-dca/ECL, 엔테로박터 호마에체이주 유래 dca 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRB209-dca/EHO, 엔테로박터 사카자키주 유래 dca 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRB209-dca/ESA, 에쉐리키아 콜라이 W주 유래 dca 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRB209-dca/ECK, 에쉐리키아 퍼구소니주 유래 dca 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRB209-dca/EFE, 파에니바실러스 폴리믹사주 유래 dca 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRB209-dca/PPY, 판토에아 아나나티스주 유래 dca 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRB209-dca/PAM으로 명명했다.

(5) 코리네박테리움 글루타미쿰의 염색체 유전자 파괴용 플라스미드의 구축

코리네박테리움 글루타미쿰주 poxF 유전자 파괴용 플라스미드의 구축

코리네박테리움 글루타미쿰주의 염색체 상 poxF 유전자의 마커리스(markerless) 파괴용 플라스미드를 구축하기 위해 필요한 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

PCR을 행할 때, 코리네박테리움 글루타미쿰 R의 서열을 바탕으로, 각각 하기 한쌍의 프라이머를, 어플라이드·바이오시스템즈(Applied Biosystems)사에서 제조한 「394 DNA/RNA 합성기(synthesizer)」를 사용하여 합성하여, 사용하였다.

poxF-1 영역 증폭용 프라이머

(a-7)；5'-CTCT TCTAGA TACGTCCTAAACACCCGAC-3' (서열 번호 19)

(b-7)；5'-GACCAACCATTGCTGACTTGCGTATCCATAGTCAGGCTTC-3'

(서열 번호 20)

그리고, 프라이머 (a-7)에는, XbaI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

poxF-2 영역 증폭용 프라이머

(a-8)；5'-CAAGTCAGCAATGGTTGGTC-3' (서열 번호 21)

(b-8)；5'-CTCT TCTAGA TGATCAGTACCAAGGGTGAG-3' (서열 번호 22)

그리고, 프라이머 (b-8)에는, XbaI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

주형 DNA는, 코리네박테리움 글루타미쿰 R로부터 추출한 염색체 DNA를 사용하였다.

이상을 혼합하고, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) poxF-1 영역을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-7)과 (b-7)을 조합하여, poxF-2 영역을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-8)과 (b-8)을 조합하여 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

전술한 바와 같이 생성된 반응액 10㎕를 0.8% 아가로스겔에 의해 전기 영동을 행하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 poxF-1 영역의 경우 약 0.8-kb의 DNA 단편을, poxF-2 영역의 경우 약 0.8-kb의 DNA 단편을 검출할 수 있었다.

다음으로, 상기 PCR에 의해 증폭된 poxF-1 영역 단편과 poxF-2 영역 단편을 1㎕씩 혼합하고, PCR에 의해 2종의 단편의 결합 반응을 행하였다.

이상을 혼합하고, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) poxF-1 영역 단편과 poxF-2 영역 단편으로 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

또한, 얻어진 poxF-1 및 poxF-2의 결합 단편을 주형으로 하고, PCR에 의해 poxF 결실 단편의 증폭을 행하였다.

이상을 혼합하고, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) poxF 결실 단편을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-7)과 (b-8)을 조합하여 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

전술한 바와 같이 생성된 반응액 10㎕를 0.8% 아가로스겔에 의해 전기 영동을 행하여, poxF 결실 단편 약 1.6-kb를 검출할 수 있었다.

상기 PCR에 의해 증폭된 코리네박테리움 글루타미쿰 R 유래 poxF 결실 서열 약 1.7-kb의 DNA 단편 10㎕와 약 4.4-kb의 마커리스 염색체 유전자 도입용 플라스미드 pCRA725[J. Mol.Microbiol. Biotechnol., Vol. 8, 243-254(2004), (일본 특허출원 공개번호2006-124440)] 2㎕를 각각 제한 효소 XbaI로 절단하고, 70℃에서 10분 처리시킴으로써 제한 효소를 실활시킨 후, 양 측을 혼합하고, 여기에 T4 DNA 리가아제 10×완충액 1㎕, T4 DNA 리가아제(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수로 10㎕로 만들고, 15℃에서 3시간 반응시켜, 결합시켰다. 이것을 라이게이션 F액으로 하였다.

얻어진 라이게이션 F액을, 염화 칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159(1970)]에 의해 에쉐리키아 콜라이 JM109를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소 XbaI로 각각 절단하여, 삽입 단편을 확인하였다. 그 결과, 플라스미드 pCRA725 약 4.4-kb의 DNA 단편뿐만 아니라, 코리네박테리움 글루타미쿰주 유래 pheA 결실 유전자(라이게이션 F액)의 경우, 길이 약 1.7-kb의 삽입 단편이 확인되었다.

코리네박테리움 글루타미쿰주 유래 poxF 결실 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRA725-poxF/CG로 명명했다.

코리네박테리움 글루타미쿰주 pobA 유전자 파괴용 플라스미드의 구축

코리네박테리움 글루타미쿰주의 염색체 상 pobA 유전자의 마커리스 파괴용 플라스미드를 구축하기 위해 필요한 DNA 단편을 이하의 PCR법에 의해 증폭했다.

pobA-1 영역 증폭용 프라이머

(a-20)；5'-CTCT TCTAGA GAAACGATCAAGTGCACCAG-3' (서열 번호 56)

(b-20)；5'-GACACGAGCGTTTATACCTCTAATTGCCACTGGTACGTGG-3'

(서열 번호 57)

그리고, 프라이머 (a-20)에는, XbaI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

pobA-2 영역 증폭용 프라이머

(a-21)；5'-GAGGTATAAACGCTCGTGTC-3' (서열 번호 58)

(b-21)；5'-CTCT GAGCTC GAGAACACGAACCATACGAG-3 (서열 번호 59)

그리고, 프라이머 (b-21)에는, SacI 제한 효소 부위가 부가되어 있다.

이상을 혼합하고, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) pobA-1 영역을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-20)과 (b-20)을 조합하여, pobA-2 영역을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-21)과 (b-21)을 조합하여 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

전술한 바와 같이 생성된 반응액 10㎕를 0.8% 아가로스겔에 의해 전기 영동을 행하여, 코리네박테리움 글루타미쿰코리 pobA-1 영역의 경우 약 1.0-kb의 단편을, pobA-2 영역의 경우 약 1.0-kb의 DNA 단편을 검출할 수 있었다.

다음으로, 상기 PCR에 의해 증폭된 pobA-1 영역 단편과 pobA-2 영역 단편을 1㎕씩 혼합하고, PCR에 의해 2종의 단편의 결합 반응을 행하였다.

이상을 혼합하고, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) pobA-1 영역 단편과 pobA-2 영역 단편으로 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

또한, 얻어진 pobA-1 및 pobA-2의 결합 단편을 주형으로 하고, PCR에 의해 pobA 결실 단편의 증폭을 행하였다.

이상을 혼합하고, 이 50㎕의 반응액을 PCR에 제공하였다.

*) pobA 결실 단편을 증폭하는 경우에는 프라이머 (a-20)과 (b-21)을 조합하여 행하였다.

이상을 1 사이클로 하여, 30 사이클 행하였다.

전술한 바와 같이 생성된 반응액 10㎕를 0.8% 아가로스겔에 의해 전기 영동을 행하여, pobA 결실 단편 약 2.0을 검출할 수 있었다.

상기 PCR에 의해 증폭된 코리네박테리움 글루타미쿰 R 유래 pobA 결실 서열 약 2.0 DNA 단편 10㎕와 약 4.4-kb의 마커리스 염색체 유전자 도입용 플라스미드 pCRA725[J. Mol. Microbiol. Biotechnol. Vol. 8, 243-254(2004), (일본 특허출원 공개번호 2006-124440)] 2㎕를 각각 제한 효소 XbaI 및 SacI로 절단하고, 70℃에서 10분 처리시킴으로써 제한 효소를 실활시킨 후, 양 측을 혼합하고, 여기에 T4 DNA 리가아제 10×완충액 1㎕, T4 DNA 리가아제(다카라 바이오 가부시키가이샤 제조) 1 unit의 각 성분을 첨가하고, 멸균 증류수로 10㎕로 만들고, 15℃에서 3시간 반응시켜, 결합시켰다. 이것을 라이게이션 R액으로 하였다.

얻어진 라이게이션 R액을, 염화 칼슘법[Journal of Molecular Biology, 53, 159 (1970)]에 의해 에쉐리키아 콜라이 JM109를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소 XbaI 및 SacI로 각각 절단하여, 삽입 단편을 확인하였다. 그 결과, 플라스미드 pCRA725 약 4.4-kb의 DNA 단편뿐만 아니라, 코리네박테리움 글루타미쿰주 유래 pobA 결실 유전자(라이게이션 N액)의 경우, 길이 약 2.0-kb의 삽입 단편이 확인되었다.

코리네박테리움 글루타미쿰주 유래 pobA 결실 유전자를 포함하는 플라스미드를 pCRA725-pobA/CG로 명명했다.

(6) 부산물 경로 유전자 파괴주의 구축

코리네박테리움 글루타미쿰주 poxF 유전자 파괴주의 구축

마커리스 염색체 유전자 도입용 벡터 pCRA725는, 코리네박테리움 글루타미쿰 R 내에서 복제 불가능한 플라스미드이다. pCRA725-poxF/CG를 사용하여, 전기 펄스법[Agric. Biol. Chem., Vol. 54,443-447(1990) 및 Res. Microbiol., Vol. 144,181-185(1993)]에 의해, 코리네박테리움 글루타미쿰 R을 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천 배지[A 액체 배지, 및 1.5% 한천]에 도포했다. 상기 배지에서 얻어진 단일 교차주를, 10%(W/V) 수크로오스 함유 BT 한천 배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄.7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄.7H₂O + 0.042%(w/v) MnSO₄.2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml를 증류수 1L에 용해, 및 1.5%의 한천]에 도포했다.

플라스미드 pCRA725-poxF/CG가 염색체 상의 상동 영역과의 단일 교차주인 경우, pCRA725-poxF/CG 상의 카나마이신 내성 유전자의 발현에 의한 카나마이신 내성과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 sacR-sacB 유전자의 발현에 의한 수크로오스 함유 배지에서의 치사성을 나타내는데 비해, 이중 교차주의 경우, pCRA725-poxF/CG 상의 카나마이신 내성 유전자의 탈락에 의한 카나마이신 감수성과 sacR-sacB 유전자의 탈락에 의한 수크로오스 함유 배지에서의 생육성을 나타낸다. 따라서, 마커리스 염색체 유전자 파괴주는, 카나마이신 감수성 및 수크로오스 함유 배지 생육성을 나타낸다.

이에, 카나마이신 감수성 및 수크로오스 함유 배지 생육성을 나타낸 주를 선택하였다. 이 코리네박테리움 글루타미쿰 R주 poxF 유전자 마커리스 파괴주를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ΔpoxF로 명명했다.

코리네박테리움 글루타미쿰주 poxF , pobA 유전자 파괴주의 구축

마커리스 염색체 유전자 도입용 벡터 pCRA725는, 코리네박테리움 글루타미쿰 R 내에서 복제 불가능한 플라스미드이다. pCRA725-pobA/CG를 사용하여, 전기 펄스법[Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447(1990) 및 Res. Microbiol., Vol. 144, 181-185(1993)]에 의해, 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpoxF를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천 배지[A 액체 배지, 및 1.5% 한천]에 도포했다. 상기 배지에서 얻어진 단일 교차주를, 10%(W/V) 수크로오스 함유 BT 한천 배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄.7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄.7H₂O + 0.042%(w/v) MnSO₄.2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml를 증류수 1L에 용해, 및 1.5% 한천]에 도포했다.

플라스미드 pCRA725-pobA/CG가 염색체 상의 상동 영역과의 단일 교차주인 경우, pCRA725-pobA/CG 상의 카나마이신 내성 유전자의 발현에 의한 카나마이신 내성과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 sacR-sacB 유전자의 발현에 의한 수크로오스 함유 배지에서의 치사성을 나타내는데 비해, 이중 교차주의 경우, pCRA725-pobA/CG 상의 카나마이신 내성 유전자의 탈락에 의한 카나마이신 감수성과 sacR-sacB 유전자의 탈락에 의한 수크로오스 함유 배지에서의 생육성을 나타낸다. 따라서, 마커리스 염색체 유전자 파괴주는, 카나마이신 감수성 및 수크로오스 함유 배지 생육성을 나타낸다.

그래서, 카나마이신 감수성 및 수크로오스 함유 배지 생육성을 나타낸 주를 선택하였다. 이 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpoxF주에 pobA 유전자의 마커리스 파괴를 거듭한 주를, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) ΔpoxFΔpobA로 명명했다.

(7) 페놀 생산 유전자 도입주의 구축

코리네박테리움 글루타미쿰 Δ poxF 주로의 페놀 생산 유전자 도입

전술한 플라스미드 12 종류(pCRB209-bsdBCD/BS, pCRB209-dca/BAE, pCRB209-dca/BSS, pCRB209-dca/CKO, pCRB209-dca/EAE, pCRB209-dca/ECL, pCRB209-dca/EHO, pCRB209-dca/ESA, pCRB209-dca/ECK, pCRB209-dca/EFE, pCRB209-dca/PPY 및 pCRB209-dca/PAM)를 각각 사용하여, 전기 펄스법[Agric. Biol. Chem., Vol. 54,443-447(1990) 및 Res. Microbiol., Vol. 144,181-185(1993)]에 의해, 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpoxF주를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천 배지에 도포했다.

이 배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소로 절단하여, 삽입 단편을 확인하였다. 그 결과, 전술한 바와 같이 제조된 플라스미드 pCRB209-bsdBCD/BS, pCRB209-dca/BAE, pCRB209-dca/BSS, pCRB209-dca/CKO, pCRB209-dca/EAE, pCRB209-dca/ECL, pCRB209-dca/EHO, pCRB209-dca/ESA, pCRB209-dca/ECK, pCRB209-dca/EFE, pCRB209-dca/PPY 및 pCRB209-dca/PAM의 도입이 확인되었다.

pCRB209-bsdBCD/BS의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21, pCRB209-dca/BAE의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21-2, pCRB209-dca/BSS의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21-3, pCRB209-dca/CKO의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21-4, pCRB209-dca/EAE의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21-5, pCRB209-dca/ECL의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21-6, pCRB209-dca/EHO의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21-7, pCRB209-dca/ESA의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21-8, pCRB209-dca/ECK의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21-9, pCRB209-dca/EFE의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21-10, pCRB209-dca/PPY의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21-11, pCRB209-dca/PAM의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21-12로 명명했다. 그리고, 본 주의 유전자 재조합의 개요를, 표 1에 정리하여 나타내었다.

코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) PHE21은, 일본국 지바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8(우편 번호 292-0818)의 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 생물 기탁 센터에 기탁했다(수탁일：2010년 10월 21일, 수탁 번호：NITE BP-996).

[표 1] 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpoxF로의 페놀 생산 유전자의 도입

코리네박테리움 글루타미쿰 Δ poxF Δ pobA 주로의 페놀 생산 유전자 도입

전술한 플라스미드 12 종류(pCRB209-bsdBCD/BS, pCRB209-dca/BAE, pCRB209-dca/BSS, pCRB209-dca/CKO, pCRB209-dca/EAE, pCRB209-dca/ECL, pCRB209-dca/EHO, pCRB209-dca/ESA, pCRB209-dca/ECK, pCRB209-dca/EFE, pCRB209-dca/PPY 및 pCRB209-dca/PAM)를 각각 사용하여, 전기 펄스법[Agric. Biol. Chem., Vol. 54, 443-447(1990) 및 Res. Microbiol. Vol. 144, 181-185(1993)]에 의해, 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpoxFΔpobA주를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천 배지에 도포했다.

이 배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소로 절단하여, 삽입 단편을 확인하였다. 그 결과, 전술한 바와 같이 제조한 플라스미드 pCRB209-bsdBCD/BS, pCRB209-dca/BAE, pCRB209-dca/BSS, pCRB209-dca/CKO, pCRB209-dca/EAE, pCRB209-dca/ECL, pCRB209-dca/EHO, pCRB209-dca/ESA, pCRB209-dca/ECK, pCRB209-dca/EFE, pCRB209-dca/PPY 및 pCRB209-dca/PAM의 도입이 확인되었다.

pCRB209-bsdBCD/BS의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE22-1, pCRB209-dca/BAE의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE22-2, pCRB209-dca/BSS의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE22-3, pCRB209-dca/CKO의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE22-4, pCRB209-dca/EAE의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE22-5, pCRB209-dca/ECL의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE22-6, pCRB209-dca/EHO의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE22-7, pCRB209-dca/ESA의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE22-8, pCRB209-dca/ECK의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE22-9, pCRB209-dca/EFE의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE22-10, pCRB209-dca/PPY의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE22-11, pCRB209-dca/PAM의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE22-12로 명명했다. 그리고, 본 주의 유전자 재조합의 개요를, 표 2에 정리하여 나타내었다.

[표 2] 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpoxFΔpobA주로의 페놀 생산 유전자의 도입

코리네박테리움 글루타미쿰 R주로의 페놀 생산 유전자 도입

전술한 플라스미드 12 종류(pCRB209-bsdBCD/BS, pCRB209-dca/BAE, pCRB209-dca/BSS, pCRB209-dca/CKO, pCRB209-dca/EAE, pCRB209-dca/ECL, pCRB209-dca/EHO, pCRB209-dca/ESA, pCRB209-dca/ECK, pCRB209-dca/EFE, pCRB209-dca/PPY 및 pCRB209-dca/PAM)를 각각 사용하여, 전기 펄스법[Agric. Biol. Chem., Vol. 54,443-447(1990) 및 Res. Microbiol., Vol. 144,181-185(1993)]에 의해, 코리네박테리움 글루타미쿰 R주를 형질 전환하고, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천 배지에 도포했다.

이 배지 상의 생육주를 통상적인 방법에 의해 액체 배양하고, 배양액으로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 상기 플라스미드를 제한 효소로 절단하여, 삽입 단편을 확인하였다. 그 결과, 전술한 바와 같이 제조된 플라스미드 pCRB209-bsdBCD/BS, pCRB209-dca/BAE, pCRB209-dca/BSS, pCRB209-dca/CKO, pCRB209-dca/EAE, pCRB209-dca/ECL, pCRB209-dca/EHO, pCRB209-dca/ESA, pCRB209-dca/ECK, pCRB209-dca/EFE, pCRB209-dca/PPY 및 pCRB209-dca/PAM의 도입이 인정되었다.

pCRB209-bsdBCD/BS의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE23-1, pCRB209-dca/BAE의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE23-2, pCRB209-dca/BSS의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE23-3, pCRB209-dca/CKO의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE23-4, pCRB209-dca/EAE의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE23-5, pCRB209-dca/ECL의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE23-6, pCRB209-dca/EHO의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE23-7, pCRB209-dca/ESA의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE23-8, pCRB209-dca/ECK의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE23-9, pCRB209-dca/EFE의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE23-10, pCRB209-dca/PPY의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE23-11, pCRB209-dca/PAM의 도입이 확인된 주를 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE23-12로 명명했다. 그리고, 본 주의 유전자 재조합의 개요를, 표 3에 정리하여 나타내었다.

[표 3] 코리네박테리움 글루타미쿰 R주로의 페놀 생산 유전자의 도입

실시예 2 페놀 생산 유전자를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 부산물 경로 파괴주 및 R주( 야생주 )의 페놀 생성 실험

실시예 1에 있어서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpoxF/페놀 생산 유전자 도입주(표 1 참조)를, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천 배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄.7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄.7H₂O + 0.042%(w/v) MnSO₄.2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g, 한천 15g을 증류수 1L에 현탁시킴]에 도포하고, 28℃에서, 20시간 암소(暗所)에 정치(靜置)했다.

상기 플레이트에서 생육한 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpoxF/페놀 생산 유전자 도입주를, 카나마이신 50μg/ml를 함유한 A 액체 배지 10 ml가 들어간 시험관에 일백금이 식균하고, 28℃에서 15시간, 호기적으로 진탕 배양을 행하였다.

상기 조건에서 생육한 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpoxF/페놀 생산 유전자 도입주를, 카나마이신 50μg/ml를 함유한 A 액체 배지 500 ml가 들어간 용량 2L의 삼각 플라스크에 식균하고, 28℃에서 15시간, 호기적으로 진탕 배양을 행하였다.

이와 같이 하여 배양 증식된 각각의 균체는, 원심분리(4℃, 5,000×g, 15분 )에 의해 균체를 회수했다. 얻어진 균체를, 최종 균체 농도 10%가 되도록 BT(-요소) 액체 배지[0.7% 황산 암모늄, 0.05% 인산 이수소칼륨, 0.05% 인산 수소 2칼륨, 0.05% 황산 마그네슘·7수화물, 0.0006% 황산 철·7수화물, 0.00042% 황산 망간 수화물, 0.00002% 비오틴, 0.00002% 티아민 염산염]에 50 ml 현탁시켰다. 이 균체 현탁액을 용량 100 ml의 유리병(medium bottle)에 넣어 환원 조건 하(산화 환원 전위；-450 mV), 기질로서 소듐 4-하이드록시벤조에이트를 250 mM이 되도록 첨가하고, 33℃로 유지한 수욕 중에서 교반하면서 반응시켰다. 이 때, 반응액의 pH가 7.0을 하회하지 않도록 2.5N의 암모니아수를 사용하여 pH 컨트롤러(에이블가부시키가이샤 제조, 모델형：DT-1023)로 컨트롤하면서 반응시켰다.

샘플링한 반응액을 원심분리(4℃, 15,000×g, 10분)하고, 얻어진 상청액을 사용하여 페놀의 정량(定量)을 행하였다.

그 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21주는, 환원 조건 하의 반응에 있어서, 1시간 후에 65 mM(6 g/L), 4시간 후에 180 mM(17 g/L)의 페놀을 생성하였다(표 4). 동일 조건 하에서의 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21-2∼PHE21-12주의 결과도 표 4에 함께 나타내었다.

[표 4] 페놀 생산 유전자를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpoxF주에 있어서의 페놀 생산 시험

*) 표 내에 기재된 약어는 하기와 같다

＜유전자 기원 약어＞

BS；바실러스 서브틸리스

BAE；바실러스 아트로파에우스

BSS；바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니

CKO；시트로박터 코세리

EAE；엔테로박터 아에로게네스

ECL；엔테로박터 클로아케

EHO；엔테로박터 호마에체이

ESA；엔테로박터 사카자키

ECK；에쉐리키아 콜라이 W

EFE；에쉐리키아 퍼구소니

PPY；파에니바실러스 폴리믹사

PAM；판토에아 아나나티스

다음으로, 실시예 1에 있어서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpoxFΔpobA/페놀 생산 유전자 도입주(표 2 참조)를, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천 배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄.7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄.7H₂O + 0.042%(w/v) MnSO₄.2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g, 한천 15g을 증류수 1L에 현탁시킴]에 도포하고, 28℃에서, 20시간 암소에 정치했다.

상기 플레이트에서 생육한 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpoxFΔpobA/페놀 생산 유전자 도입주를, 카나마이신 50μg/ml를 함유한 A 액체 배지 10ml가 들어간 시험관에 일백금이 식균하고, 28℃에서 15시간, 호기적으로 진탕 배양을 행하였다.

상기 조건에서 생육한 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpoxFΔpobA/페놀 생산 유전자 도입주를, 카나마이신 50μg/ml를 함유한 A 액체 배지 500ml가 들어간 용량 2L의 삼각 플라스크에 식균하고, 28℃에서 15시간, 호기적으로 진탕 배양을 행하였다.

이와 같이 하여 배양 증식된 각각의 균체는, 원심분리(4℃, 5,000×g, 15분 )에 의해 균체를 회수했다. 얻어진 균체를, 종균체 농도 10%가 되도록 BT(-요소) 액체 배지[0.7% 황산 암모늄, 0.05% 인산 이수소칼륨, 0.05% 인산 수소 2칼륨, 0.05% 황산 마그네슘·7수화물, 0.0006% 황산 철·7수화물, 0.00042% 황산 망간 수화물, 0.00002% 비오틴, 0.00002% 티아민 염산염]에 50ml 현탁시켰다. 이 균체 현탁액을 용량 100 ml의 유리병에 넣어 환원 조건 하(산화 환원 전위；-450 mV), 기질로서 소듐 4-하이드록시벤조에이트를 250 mM가 되도록 첨가하고, 33℃로 유지한 수욕중에서 교반하면서 반응시켰다. 이 때, 반응액의 pH가 7.0을 하회하지 않도록 2.5 N의 암모니아수를 사용하여 pH 컨트롤러(에이블가부시키가이샤 제조, 모델형：DT-1023)로 컨트롤하면서 반응시켰다.

샘플링한 반응액을 원심분리(4℃, 15,000×g, 10분)하고, 얻어진 상청액을 사용하여 페놀의 정량을 행하였다.

그 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE22-1∼PHE22-12주는, 환원 조건 하의 반응에 있어서, 1시간 후에 표 5에 나타낸 바와 같이 페놀을 생성하였다.

이 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, poxA 유전자를 파괴함으로써 페놀 생산성의 향상이 관찰되었다.

[표 5] 페놀 생산 유전자를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 ΔpoxFΔpobA주에 있어서의 페놀 생산 시험

*) 표 내에 기재된 약어는 하기와 같다

＜유전자 기원 약어＞

BS；바실러스 서브틸리스

BAE；바실러스 아트로파에우스

BSS；바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니

CKO；시트로박터 코세리

EAE；엔테로박터 아에로게네스

ECL；엔테로박터 클로아케

EHO；엔테로박터 호마에체이

ESA；엔테로박터 사카자키

ECK；에쉐리키아 콜라이 W

EFE；에쉐리키아 퍼구소니

PPY；파에니바실러스 폴리믹사

PAM；판토에아 아나나티스

또한, 비교예로서, 실시예 1에 있어서 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 R주/페놀 생산 유전자 도입주(표 3 참조)를, 카나마이신 50μg/ml를 포함하는 A 한천 배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄.7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄.7H₂O + 0.042%(w/v) MnSO₄.2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g, 한천 15g을 증류수 1L에 현탁시킴]에 도포하고, 28℃에서, 20시간 암소에 정치했다.

상기 플레이트에서 생육한 코리네박테리움 글루타미쿰 R주/페놀 생산 유전자 도입주를, 카나마이신 50μg/ml를 함유한 A 액체 배지 10 ml가 들어간 시험관에 일백금이 식균하고, 28℃에서 15시간, 호기적으로 진탕 배양을 행하였다.

상기 조건에서 생육한 코리네박테리움 글루타미쿰 R주/페놀 생산 유전자 도입주를, 카나마이신 50μg/ml를 함유한 A 액체 배지 500 ml가 들어간 용량 2L의 삼각 플라스크에 식균하고, 28℃에서 15시간, 호기적으로 진탕 배양을 행하였다.

그 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 PHE23-1∼PHE23-12주는, 환원 조건 하의 반응에 있어서, 1시간 후에 표 6에 나타낸 바와 같이 페놀을 생성하였다.

이 결과로부터, 코리네박테리움 글루타미쿰 R주(야생주)보다, ΔpoxF주(표 4), 또한 ΔpoxFΔpobA주(표 5)에 페놀 생산 유전자를 도입주하는 것이, 페놀 생산성이 높으므로, poxF 유전자의 파괴 및 pobA 유전자의 파괴에 의해 페놀 생산성에 플러스 효과가 있는 것이 밝혀졌다.

[표 6] 페놀 생산 유전자를 도입한 코리네박테리움 글루타미쿰 R주에 있어서의 페놀 생산 시험

*) 표 내에 기재된 약어는 하기와 같다

＜유전자 기원 약어＞

BS；바실러스 서브틸리스

BAE；바실러스 아트로파에우스

BSS；바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니

CKO；시트로박터 코세리

EAE；엔테로박터 아에로게네스

ECL；엔테로박터 클로아케

EHO；엔테로박터 호마에체이

ESA；엔테로박터 사카자키

ECK；에쉐리키아 콜라이 W

EFE；에쉐리키아 퍼구소니

PPY；파에니바실러스 폴리믹사

PAM；판토에아 아나나티스

실시예 3 페놀 생산용 숙주로서의 적성 시험

페놀에 의한 호기 증식에 대한 영향

코리네박테리움 글루타미쿰, 에쉐리키아 콜라이 및 슈도모나스 푸티다에 대하여, 호기 배양에 있어서의 페놀의 생육 저해 시험을 행하였다. 그리고, 본 시험에서 사용한 슈도모나스 푸티다 S12는, 용매 내성균으로서 보고되어 있고, 지금까지 유일하게 페놀 생산의 숙주로서 이용된 기술이 개시되어 있다.

코리네박테리움 글루타미쿰 R을 A 한천 배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄.7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄.7H₂O + 0.042%(w/v) MnSO₄.2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g, 한천 15g을 증류수 1L에 현탁시킴]에 도포하고, 33℃에서, 15시간 암소에 정치했다.

상기 플레이트에서 생육한 코리네박테리움 글루타미쿰 R을, A 액체 배지[(NH₂)₂CO 2g, (NH₄)₂SO₄ 7g, KH₂PO₄ 0.5g, K₂HPO₄ 0.5g, MgSO₄.7H₂O 0.5g, 0.06%(w/v) Fe₂SO₄.7H₂O + 0.042%(w/v) MnSO₄.2H₂O 1ml, 0.02%(w/v) biotin solution 1ml, 0.01%(w/v) thiamin solution 2ml, yeast extract 2g, vitamin assay casamino acid 7g, glucose 40g을 증류수 1L에 용해시킴] 10 ml가 들어간 시험관에 일백금이 식균하고, 33℃에서 13시간, 호기적으로 진탕 배양을 행하였다.

상기 조건에서 생육한 코리네박테리움 글루타미쿰 R을, A 액체 배지 100 ml에 초기균체 농도 OD₆₁₀=0.05가 되도록 식균하고, 동시에 페놀이 종농도 0, 0.16, 0.2, 0.24, 0.32 mM로 되도록 첨가하고, 33℃에서호기적으로 진탕 배양을 행하였다. 균체의 생육은 OD₆₁₀의 흡광도를 측정함으로써 행하였다.

에쉐리키아 콜라이 JM109를 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포하고, 37℃에서, 15시간 암소에 정치했다. 상기 플레이트에서 생육한 에쉐리키아 콜라이 JM109를, LB 액체 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스 및 0.5% 염화 나트륨] 10 ml가 들어간 시험관에 일백금이 식균하고, 37℃에서 13시간, 호기적으로 진탕 배양을 행하였다.

상기 조건에서 생육한 에쉐리키아 콜라이 JM109를 LB 액체 배지 100 ml에 초기균체 농도 OD₆₁₀=0.05가 되도록 식균하고, 동시에 페놀 농도가 종농도 0, 0.16, 0.20 mM로 되도록 첨가하고, 37℃에서 호기적으로 진탕 배양을 행하였다. 균체의 생육은 OD₆₁₀의 흡광도를 측정함으로써 행하였다.

슈도모나스 푸티다 F1 및 S12를 LB 한천 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨, 및 1.5% 한천]에 도포하고, 30℃에서, 15시간 암소에 정치했다.

상기 플레이트에서 생육한 슈도모나스 푸티다 F1 및 S12를, LB(+글루코오스) 액체 배지[1% 폴리 펩톤, 0.5% 효모 엑기스, 0.5% 염화 나트륨 및 0.4% 글루코오스] 10 ml가 들어간 시험관에 일백금이 식균하고, 30℃에서 13시간, 호기적으로 진탕 배양을 행하였다.

상기 조건에서 생육한 슈도모나스 푸티다 F1 및 S12주를 LB(+글루코오스) 액체 배지 100 ml에 초기 균체 농도 OD₆₁₀=0.05가 되도록 식균하고, 동시에 페놀 농도가 종농도 0, 0.10, 0.20 mM로 되도록 첨가하고, 30℃에서 호기적으로 진탕 배양을 행하였다. 균체의 생육은 OD₆₁₀의 흡광도를 측정함으로써 행하였다. 배지 중으로의 페놀 첨가에 의한 호기 증식에 대한 영향을 해석한 결과를 도 2에 나타내었다.

에쉐리키아 콜라이는, 0.16% 페놀 존재 하에서 현저하게 증식이 저해되었고, 0.20% 페놀에서는 완전하게 증식이 저해되었다.

슈도모나스 푸티다 F1 및 용제 내성균으로서 보고된 슈도모나스 푸티다 S12는, 대략 동일한 경향을 나타내며, 0.10% 페놀 존재 하에서 현저하게 증식이 저해되었고, 0.20% 페놀에서는 완전하게 증식이 저해되었다.

이에 비해, 코리네박테리움 글루타미쿰은, 에쉐리키아 콜라이가 현저하게 증식이 저해된 0.16%의 페놀 존재 하에 있어서도 증식에 대한 영향은 거의 없으며, 에쉐리키아 콜라이나 슈도모나스 푸티다에서는 완전하게 증식이 저해된 0.20%의 페놀 존재 하에 있어서도 양호한 생육을 나타낸다. 또한, 0.24%의 페놀 존재 하에 있어서 증식이 가능했다.

이와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰은 에쉐리키아 콜라이 및 슈도모나스 푸티다에 비해, 페놀에 대하여 높은 내성을 가지고, 페놀 생산의 숙주로서 높은 적성을 가지는 것으로 나타났다.

[산업상 이용가능성]

본 발명의 방법에 의하면, 미생물을 사용하여 실용적인 효율로 4-하이드록시벤조에이트로부터 페놀을 제조할 수 있다.

행정 법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터

NITEBP-996

20101021

SEQUENCE LISTING <110> Green Phenol Technology Research Association <120> Transformant of coryneform group of bacteria and method of producing phenol using thereof <130> C01F3969 <150> JP2010-252264 <151> 2010-11-10 <160> 59 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1195 <212> DNA <213> Corynebacterium casei <400> 1 atgaaaaccg accgtgcacg ctcgtgtgag aaagtcagct acatgagacc aactacccgc 60 cctgagggac gctttgagca gctgtggctg ccgctgtggc cattggcaag cgatgacctc 120 cgtgagggca tttaccgcac ctcacggaag aacgcgctgg ataagcgcta cgtcgaagcc 180 aatcccgacg cgctctctaa cctcctggtc gttgacatcg accaggagga cgcgcttttg 240 cgctctttgt gggacaggga ggactggaga cctaacgcgg tggttgaaaa ccccttaaac 300 gggcacgcac acgctgtctg ggcgctcgcg gagccattta cccgcaccga atacgccaaa 360 cgcaagcctt tggcctatgc cgcggctgtc accgaaggcc tacggcgctc tgtcgatggc 420 gatagcggat actccgggct gatcaccaaa aaccccgagc acactgcatg ggatagtcac 480 tggatcaccg ataagctgta tacgctcgat gagctgcgct tttggctcga agaaaccggc 540 tttatgccgc ctgcgtcctg gaggaaaacg cggcggttct cgccagttgg tctaggtcgt 600 aattgcgcac tctttgaaag cgcacgtacg tgggcatatc gggaggtcag aaagcatttt 660 ggagacgctg acggcctagg ccgcgcaatc caaaccaccg cgcaagcact taaccaagag 720 ctgtttgatg aaccactacc tgtggccgaa gttgactgta ttgccaggtc aatccataaa 780 tggatcatca ccaagtcacg catgtggaca gacggcgccg ccgtctacga cgccacattc 840 accgcaatgc aatccgcacg cgggaagaaa ggctggcaac gaagcgctga ggtgcgtcgt 900 gaggctggac atactctttg gaggaacatt ggctaaggtt tatgcacgtt atccacgcaa 960 cggaaaaaca gcccgcgagc tggcagaacg tgccggtatg tcggtgagaa cagctcaacg 1020 atggacttcc gaaccgcgtg aagtgttcat taaacgtgcc aacgagaagc gtgctcgcgt 1080 ccaggagctg cgcgccaaag gtctgtccat gcgcgctatc gcggcagaga ttggttgctc 1140 ggtgggcacg gttcaccgct acgtcaaaga agttgaagag aagaaaaccg cgtaa 1195 <210> 2 <211> 2675 <212> DNA <213>?Unkown <220> <223> pHSG298 <400> 2 gaggtctgcc tcgtgaagaa ggtgttgctg actcatacca ggcctgaatc gccccatcat 60 ccagccagaa agtgagggag ccacggttga tgagagcttt gttgtaggtg gaccagttgg 120 tgattttgaa cttttgcttt gccacggaac ggtctgcgtt gtcgggaaga tgcgtgatct 180 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cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg 1080 gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct 1140 aatcagaatt ggttaattgg ttgtaacact ggcagagcat tacgctgact tgacgggacg 1200 gcggctttgt tgaataaatc gcattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 1260 tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 1320 ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgcc 1380 aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatccccgg gtaccgagct cgaattcgta 1440 atcatgtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 1500 cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta 1560 attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 1620 tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg gcgaactttt gctgagttga 1680 aggatcagat cacgcatctt cccgacaacg cagaccgttc cgtggcaaag caaaagttca 1740 aaatcagtaa ccgtcagtgc cgataagttc aaagttaaac ctggtgttga taccaacatt 1800 gaaacgctga tcgaaaacgc gctgaaaaac gctgctgaat gtgcgagctt cttccgcttc 1860 ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 1920 aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 1980 aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 2040 gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 2100 gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 2160 tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 2220 ttctcaatgc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 2280 ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 2340 tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 2400 tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 2460 ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 2520 aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 2580 ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 2640 tacggggtct gacgctcagt ggaacgatcc gtcga 2675 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 atagatctag aacgtccgta ggagc 25 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR primer <400> 4 atagatctga cttggttacg atggac 26 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 atagatctag gtttcccgac tggaaag 27 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 atagatctcg tgccagctgc attaatga 28 <210> 7 <211> 551 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 7 ccgaagatct gaagattcct gatacaaatt ctgttgtgac ggaagatttg ttggaagaaa 60 tctagtcgct cgtctcataa aaacgaccga gcctattggg attaccattg aagccagtgt 120 gagttgcatc acactggctt caaatctgag actttacttt gtggattcac gggggtgtag 180 tgcaattcat aattagcccc attcggggga gcagatcgcg gcgcgaacga tttcaggttc 240 gttccctgca aaaactattt agcgcaagtg ttggaaatgc ccccgtctgg ggtcaatgtc 300 tatttttgaa tgtgtttgta tgattttgaa tccgctgcaa aatctttgtt tccccgctaa 360 agttggggac aggttgacac ggagttgact cgacgaatta tccaatgtga gtaggtttgg 420 tgcgtgagtt ggaaaatttc gccatactcg cccttgggtt ctgtcagctc aagaattctt 480 gagtgaccga tgctctgatt gacctaactg cttgacacat tgcatttcct acaatcttta 540 gaggagacac a 551 <210> 8 <211> 425 <212> DNA <213> Unkown <220> <223> rrnBT1T2 terminator <400> 8 ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag attaaatcag aacgcagaag 60 cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat 120 gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag 180 agtagggaac tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc 240 gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag gacaaatccg ccgggagcgg 300 atttgaacgt tgcgaagcaa cggcccggag ggtggcgggc aggacgcccg ccataaactg 360 ccaggcatca aattaagcag aaggccatcc tgacggatgg cctttttgcg tttctacaaa 420 ctctt 425 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 ctctgtcgac ccgaagatct gaagattcct g 31 <210> 10 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 ctctgtcgac ggatccccat ggtgtgtctc ctctaaagat tgtagg 46 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 ctctgcatgc ccatggctgt tttggcggat gagaga 36 <210> 12 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 ctctgcatgc tcatgaaaga gtttgtagaa acgcaaaaag g 41 <210> 13 <211> 5118 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 13 agatctaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag 60 ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga 120 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgaattcgag 180 ctcggtaccc ggggatcctc tagagtcgac ccgaagatct gaagattcct gatacaaatt 240 ctgttgtgac ggaagatttg ttggaagaaa tctagtcgct cgtctcataa aaacgaccga 300 gcctattggg attaccattg aagccagtgt gagttgcatc acactggctt caaatctgag 360 actttacttt gtggattcac gggggtgtag tgcaattcat aattagcccc attcggggga 420 gcagatcgcg gcgcgaacga tttcaggttc gttccctgca aaaactattt agcgcaagtg 480 ttggaaatgc ccccgtctgg ggtcaatgtc tatttttgaa tgtgtttgta tgattttgaa 540 tccgctgcaa aatctttgtt tccccgctaa agttggggac aggttgacac ggagttgact 600 cgacgaatta tccaatgtga gtaggtttgg tgcgtgagtt ggaaaatttc gccatactcg 660 cccttgggtt ctgtcagctc aagaattctt gagtgaccga tgctctgatt gacctaactg 720 cttgacacat tgcatttcct acaatcttta gaggagacac accatggctg ttttggcgga 780 tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa 840 cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa 900 gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc 960 caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg 1020 tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc 1080 gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat 1140 taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc tttcatgggg 1200 atccgtcgac ctgcaggcat gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 1260 gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 1320 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 1380 gcgaatgcga tttattcaac aaagccgccg tcccgtcaag tcagcgtaat gctctgccag 1440 tgttacaacc aattaaccaa ttctgattag aaaaactcat cgagcatcaa atgaaactgc 1500 aatttattca tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa 1560 ggagaaaact caccgaggca gttccatagg atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt 1620 ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca 1680 agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag cttatgcatt 1740 tctttccaga cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc actcgcatca 1800 accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac gaaatacgcg atcgctgtta 1860 aaaggacaat tacaaacagg aatcgaatgc aaccggcgca ggaacactgc cagcgcatca 1920 acaatatttt cacctgaatc aggatattct tctaatacct ggaatgctgt tttcccgggg 1980 atcgcagtgg tgagtaacca tgcatcatca ggagtacgga taaaatgctt gatggtcgga 2040 agaggcataa attccgtcag ccagtttagt ctgaccatct catctgtaac atcattggca 2100 acgctacctt tgccatgttt cagaaacaac tctggcgcat cgggcttccc atacaatcga 2160 tagattgtcg cacctgattg cccgacatta tcgcgagccc atttataccc atataaatca 2220 gcatccatgt tggaatttaa tcgcggcttc gagcaagacg tttcccgttg aatatggctc 2280 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gccgcagccc gcgcagccaa caacctcggt gataaaagcc 720 cggctctttt atttaacaat atttacggct acaacaatgc acaaatcgcg atgaatgtca 780 tcggttcttg gccgaaccac gcgatgatgc ttggcttgcc gaaagataca ccggttaaag 840 agcagttttt tgaatttgcg aagcgatatg aacagtttcc gatgccggtc aaacgcgaag 900 aaactgcgcc atttcatgaa aatgaaatca cagaggacat caacctattc gatatattgc 960 ctcttttcag aattaaccag ggtgacggcg gctattattt agataaagcg tgtgtcattt 1020 cccgtgatct ggatgaccct gacaacttcg gcaagcagaa cgtcggaatt taccgcatgc 1080 aggtaaaagg gaaagaccgc ctcggcattc agccagttcc gcagcatgac atcgcgattc 1140 atcttcgcca agcagaagaa cgcggcatca atcttccggt caccatcgcg cttggctgtg 1200 agcctgtcat tacgaccgcg gcgtcaactc cgctcctata tgaccaatcg gaatatgaaa 1260 tggcgggagc gatccagggc gaaccgtata gaatcgtcaa atcaaagctg tctgaccttg 1320 atattccttg gggcgcagaa gtcgtgcttg aaggagaaat cattgccgga gaacgggaat 1380 atgaaggacc gttcggcgaa tttaccggcc attattcagg cggacgcagc atgccgatta 1440 tcaaaatcaa acgcgtatct catagaaatc atccggtatt tgaacattta tatctcggca 1500 tgccttggac agagtgcgat tacatgatcg 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DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 25 ctctcatatg tcaggccttt ctttcc 26 <210> 26 <211> 2283 <212> DNA <213> Bacillus subtilis subsp.spizizenii <400> 26 atgaaagcag aattcaagcg taaaggaggg ggcaaagtga aactcgttgt cggaatgaca 60 ggggcaacag gggctatttt cggggtcagg ctgctggagt ggctgaaggc ggccgaagta 120 gaaacccatc tcgtcgtgtc tccttgggct aacgtcacga tcaaacacga aacaggctat 180 accttaaaag aagtagaaca acttgccaca tacacgtatt cgcataagga ccaggcggca 240 gccatttcaa gcgggtcgtt tgataccgat ggcatgattg ttgcgccatg cagcatgaaa 300 tctctcgcaa gcattcgcac cgggatggcg gataatctgc tgacgcgtgc ggcggatgtc 360 atgctcaagg agagaaaaaa actcgtcctc ttaacgagag agacgccttt gaaccagatt 420 catctcgaaa atatgctagc gcttacgaaa atgggtacca tcattcttcc tccgatgccg 480 gcattttata atcagccgag cagcttagag gaaatggttg accatattgt attcagaacg 540 ttggaccaat tcggcattcg ccttcctgaa gcgaaacgct ggaatgggat tgaaaaacaa 600 aaaggaggag cttgatcatg gcttatcaag atttcagaga atttctcgct gcccttgaaa 660 aagaaggaca gctgctaaca gtgaatgaag aggtaaagcc ggagccggat ataggggctg 720 cagcacgcgc agccagcaat cttggcgata aaagccccgc gctcttattt aataacattt 780 atggctatca caacgcgcaa attgcgatga atgtgatcgg ctcctggccg aaccatgcaa 840 tgatgctggg catgccgaaa gacacgccgg tgaaagaaca gttttttgaa tttgcgaaac 900 gttatgacca gtttccgatg ccagtcaaac gtgaggaatc agcgccgttt catgaaaatg 960 aaatcacaga agatatcaat ttgttcgata tactgcctct tttcagaatt aaccaaggag 1020 acggcggtta ctatctagac aaagcatgtg tcatttcccg cgatcttgaa gatcctgaga 1080 atttcggcaa acaaaacgtc gggatttaca gaatgcaggt caaaggaaaa gaccgccttg 1140 gcattcagcc tgtgccgcag cacgatattg cgatccatct gcgtcaagct gaagaacgcg 1200 gcatcaatct tccggtcacc attgcgctcg gctgtgagcc ggtcataaca acggcggcat 1260 cgactccgct tctttatgat caatcagaat acgaaatggc aggcgcaatt caaggtgaac 1320 catatcgcat cgtgaaatct aagctgtctg atcttgatgt tccatggggc gctgaagtag 1380 tgcttgaagg tgaaatcatt gccggagagc gtgaatatga aggcccgttc ggtgagttca 1440 caggccatta ttccggcgga cgcagcatgc cgattattaa aattaaacga gtgtatcata 1500 gaaacaatcc gatttttgaa catttatact taggcatgcc ttggacagaa tgcgattaca 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<211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 28 ctctcatatg tcaagccttt cgttccgg 28 <210> 29 <211> 2268 <212> DNA <213> Citrobacter koseri <400> 29 atgagactga ttgtggggat gaccggcgca acgggggcgc cgctaggcat tgcgctgcta 60 caggcgctgc ggcaaatgcc gacagtagaa acacacctgg taatgtctaa gtgggccaaa 120 acgaccattg agctggaaac gccttacagt gcgcgagatg ttgccggact ggctgattac 180 tgccataacc cggcggatca ggcggcgacg atctcttccg gctcatttcg caccgacggc 240 atgatcatta tgccttgcag tatgaaaacg ctggcgggga ttcgcgcagg atatgccgag 300 gggttagttg gccgtgccgc cgatgtggtg ctgaaagaag ggcgcaaact ggtgctggtg 360 ccgcgtgaaa tgccgctcag cacgatccat ctggaaaaca tgctcgccct ttcccgcatg 420 ggggtcgcga tggtgccgcc catgcctgct ttctacaacc atccgcaaac tattgatgat 480 attacgcagc atattgtggc gcgtgtgctg gatcagtttg gtctggagca tccgcgtgcc 540 cggcgctggc aggggttgca gcaggcgcag aatttttcac aggagaatga ataatggcat 600 ttgatgactt acgcagcttt ttgcaggcgc tcgacgagca ggggcaactg ctgaaaatca 660 gtgaagaagt gaatgcagag ccggatctgg ctgctgcggc taacgcaacc 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1560 tgccgctgta tcagcagttg aaagcggaat tcccggaagt gcaggcggtt aacgccatgt 1620 atacccacgg tctgctggcg attatctcga ccaaaaaacg ctacggcgga tttgcccgcg 1680 cgatcggcct gcgggcaatg accacgccgc acggtctggg ctatgtgaag atggtgatta 1740 tggttgatga ggatgtcgat ccgttcaacc tgccgcaggt gatgtgggcg ctgtcgtcga 1800 aggtcaaccc ggcaggcgat ctggtgcagc tgccgaacat gtcggtgctg gaactggacc 1860 caggctcaag cccggcgggg atcactgaca aactgatcat cgacgccaca acgccggttg 1920 cgccggataa tcgcggccac tacagccagc cggtatgtga tttaccggaa accaaagcct 1980 gggctgaaaa gctgactgcc atgctggcca accgtaaata aggagtagca gatgatttgt 2040 ccacgttgtg ctgatgaaca tattgaattg atggcgacct ctccggtcaa agggatctgg 2100 acggtgtatc agtgccagca ttgtctgtac acctggcgtg ataccgagcc gctacgccgt 2160 accagccgtg aacattatcc gcaagcgttt cgcatgacgc agaaagatat tgatcaagcg 2220 ccgatggtgc cgggcattcc accgctgctg gcggaagata agcgttaa 2268 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> PCR primer <400> 30 ctctcatatg agactgattg tggggatg 28 <210> 31 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 31 ctctcatatg ttaacgctta tcttccgcca g 31 <210> 32 <211> 2268 <212> DNA <213> Enterobacter aerogenes <400> 32 atgaaactga ttattgggat gaccggggcg accggcgcgc cgttaggcgt cgcgctgtta 60 caggcgctga atgaaatgcc ggatgtggaa acgcatctgg tcatgtcgaa atgggcaaaa 120 accaccattg agctggaaac gccctatagc gctcgtgatg tcgccgcgct ggcggacttc 180 tgccatagcc ctgcggatca ggccgcgacc atctcatcag gatcgtttcg taccgacggc 240 atgattgtta tcccctgcag catgaaaacg ctggcgggta ttcgcgctgg ctatgcggaa 300 gggttagtcg gccgcgcggc ggacgtggtg ctgaaagagg ggcgcaagct ggttctggtg 360 ccgcgtgaaa tgccgctgag caccattcat ctggagaaca tgctggcgct gtcgcgcatg 420 ggcgtggcga tggtgccgcc catgcctgcc tattacaacc acccggaaac ggtagaggat 480 atcaccaacc atatcgtgac ccgggtgctg gatcagtttg gtctcgaata tcacaaagcg 540 cgccgctgga acggcctgcg cgcggtcgag aatttatcac aggagaatta atcatggctt 600 ttgatgattt acgcagcttt ttgcaggcgc ttgatgagca ggggcaactg ctaaaaatta 660 gcgaagaggt gaatgccgag ccggatctcg ccgctgccgc taacgccaca gggcgcatcg 720 gtgacggcgc gccagcgttg tggtttgata 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gcaggcggtc aatgccatgt 1620 acacccatgg tctgctggcg attatctcca ccaaaaaacg ctacggcggt tttgcccgcg 1680 cggtgggatt acgggcaatg actaccccgc acggcctcgg ttacgtgaaa atggtgatca 1740 tggtcgatga agatgtcgat ccgttcaacc tgccgcaggt gatgtgggcg ctctcctcga 1800 aggtcaaccc ggcgggcgac ctggtacagt tgccgaacat gtcggtgctg gagcttgacc 1860 ctggttccag tccggcgggg atcaccgaca aactgattat cgacgccacc accccggttg 1920 cgcctgacct tcgcggtcac tacagccagc cggttcagga tttaccggaa accaaagcct 1980 gggctgaaaa actgaccgcc atgttggcca accgtaaata aggagaagaa gatgatttgt 2040 ccacgttgcg ctgatgagca gattgaagtg atggcgacgt cgccggtaaa aggggtgtgg 2100 atcgtttacc agtgccagca ctgcctctat acctggcgta ataccgaacc gctgcgtcgt 2160 accagccgcg aacattatcc ggaagcgttc cgcatgacgc agaaagatat tgatgaggcg 2220 ccgcaggtgc cgcatattcc accgctgttg gcggcagata agcgttaa 2268 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 33 ctctcatatg aaactgatta ttgggatgac cg 32 <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 34 ctctcatatg ttaacgctta tctgccgcc 29 <210> 35 <211> 2252 <212> DNA <213> Enterobacter cloacae <400> 35 atgagattga tcgtgggaat gacgggagca acaggtgctc cgctgggtgt ggctttactg 60 caggcgttac gtgacatgcc agaggttgaa acccatctgg tgatgtcgaa atgggcgaaa 120 accaccattg agctggaaac gccttatacc gcgcaggatg tcgccgccct ggcagatgtc 180 gttcacagtc ctgccgatca ggctgccacc atctcctccg gctcgtttcg taccgacggc 240 atgatcgtca ttccctgcag catgaaaacg ctggcgggta tccgcgcggg ctatgccgaa 300 gggctggtgg gccgtgcggc agacgtggtg ctgaaagagg ggcgcaagct ggtgctggtc 360 ccgcgtgaaa cgccgctcag caccattcat ctggagaaca tgctcgcgct ttcccgcatg 420 ggggtggcga tggtgccgcc catgcctgcg tattacaacc acccgcaaac cgccgatgat 480 atcacccagc atatcgtgac ccgcgtactc gaccagtttg gtctggagca caaaaaggcg 540 cgtcgctgga acggcctgca ggcggcgaaa catttttcac aggagaataa cgatggcatt 600 tgatgatttg agaagcttcc tgcaggcgct agatgagcaa gggcaactgc tgaaaattga 660 agaagaggtc aatgcggagc cggatctggc ggcggccgct aacgcgacgg gacgtatcgg 720 tgatggtgcg cctgcgctgt ggttcgataa cattcgcggg tttaccgatg ccagggtggt 780 gatgaacacc atcggctcct ggcagaacca cgccatttcg atggggctgc cggcgaatac 840 cccggtcaaa aagcagatcg atgagtttat tcgccgctgg gataaattcc cggtcgcacc 900 ggagcgccgg gccaaccccg catgggcgca gaatacggtg gacggtgagg agattaacct 960 gttcgacatc ctgccgctgt ttcgcctgaa cgacggggac ggcggttttt atctcgacaa 1020 agcgtgcgtt gtctcgcgcg atccgctcga cccggaccat ttcggcaagc agaacgtcgg 1080 tatttaccgc atggaagtga agggcaaacg taagctcggc ctgcagccgg tgccgatgca 1140 tgatatcgcc ctgcatctgc ataaagccga agagcgtggt gaagacctgc cgattgcgat 1200 tacgttgggc aacgatccga tcatcaccct gatgggcgca acgccgctga aatacgatca 1260 gtccgagtat gaaatggccg gggcgctgcg tgaaagcccg tacccgattg cgaccgcgcc 1320 gttgaccggc ttcgatgtgc cgtgggggtc tgaagtgatc ctggaagggg tgattgaagg 1380 ccgtaaacgt gaaattgaag ggccgttcgg tgagtttacc gggcactatt cgggcggacg 1440 caatatgacg gtggtccgta ttgataaagt ctcgtaccgc accaaaccga ttttcgaatc 1500 cctctatctc gggatgccct ggaccgagat cgactacctg atggggccag ccacctgtgt 1560 gccgctttac cagcaactga aagcggagtt ccctgaagtg caggcggtga 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ggcggaatgg 30 <210> 38 <211> 2358 <212> DNA <213> Enterobacter hormaechei <400> 38 atgagattga ttgtgggaat gacgggcgcg acgggtgcgc cattaggcgt ggcgttgttg 60 caggcgctgc gggaaatgcc ggaggtggaa acgcacctgg tgatgacgaa gtgggcaaaa 120 accacgattg agctggaaac gcccttcact gcgcatgacg ttgctgcact ggcggatgtc 180 gtccacagtc cggccgatca ggctgccacc atctcctccg gctcgtttcg caccgacggc 240 atgatcgtca tcccgtgcag catgaaaacg ctggcgggga tccgcgcggg ctacgccgaa 300 gggctggtag ggcgtgcggc agacgtggtg ctgaaagagg gacgcaagct ggtgctggtt 360 ccccgcgaga cgccgctcag caccattcat cttgagaaca tgcttgccct ttcccgcatg 420 ggcgtggcga tggtgccgcc tatgcctgcg tactacaacc acccgcaaac cgccgatgac 480 attacccagc atatcgtgac ccgcgttctc gaccagtttg gtctggagca taaaaaagcc 540 cgacgctggg aaggtttgca ggcagcgaaa catttttcac aggagaataa agatggcatt 600 tgatgatttg agaagcttct tgcaggcgct cgatgagcaa gggcagctgc tgaaaattga 660 ggaagaggta aacgcggagc cggatttagc ggcggccgcc aacgctaccg ggcgcattgg 720 cgatggcgcg cctgcgctgt ggttcgataa tattcgcggc ttcaccgatg cccgagtggt 780 gatgaacacc atcggctcgt ggcaaaacca cgccatttcg atggggctgc cagcgaatac 840 ttcggtgaaa aaacagatcg acgagtttat tcgtcgctgg gacaaattcc ccgtcacgcc 900 agagcgtcgt gccaatcctg cctgggcgca gaacacggtg gacggagaag atatcaacct 960 gttcgacatt ttgccgctgt tccgcctgaa cgacggtgac gggggctttt atctcgataa 1020 agcgtgcgtt gtctcccgcg atccgctcga ccccgaccac ttcggcaagc agaacgtcgg 1080 catttaccgt atggaagtga agggcaagcg taagctcggc ctgcaaccgg tgccgatgca 1140 tgatattgcg ctgcatctgc ataaggcaga agagcgtggc gaagacctgc ccattgccat 1200 tacgctgggt aacgatccga tcatcaccct gatgggcgcc acgccgctga aatacgatca 1260 atccgagtat gagatggctg gcgcgctacg cgaaagcccg tatccgattg cgacggctcc 1320 gctgaccggt tttgatgtgc cgtgggggtc ggaagtgatc ctggaagggg tgattgaagg 1380 ccggaaacgt gaaattgaag gaccattcgg tgagtttacc ggacactact ctggcgggcg 1440 caacatgacc gttgtgcgca ttgataaagt ctcttaccgc accaaaccca ttttcgaatc 1500 tctctacctg gggatgcctt ggaccgagat tgattatctg atgggacccg ccacctgcgt 1560 gccgctctat cagcaactga aggcggaatt cccggaagtg caggcggtaa acgccatgta 1620 cacccacggt ctgctggcaa ttatctccac taaaaagcgt tacggcggtt ttgcccgtgc 1680 ggtcgggcta cgcgccatga ccacaccgca cggtctgggt tacgtgaaga tggtgattat 1740 ggtggatgaa gatgtcgatc cgtttaacct gccgcaggtc atgtgggcgc tttcatcgaa 1800 ggttaatccg gcgggcgatc tggtgcagct tccgaatatg tctgtgctgg aacttgaccc 1860 tggctccagc ccggcgggga tcaccgacaa gctgatcatt gatgccacca cccctgttgc 1920 cccggacaac cgtggtcact acagccagcc ggtacaggac ctccctgaaa ccaaagcctg 1980 ggccgaaaaa ctgaccgcga tgctggcagc acgtcaataa ggaggaaaaa atgatttgtc 2040 cacgttgtgc cgatgaacat attgaagtaa tggcaacatc accggtgaaa ggtgtctgga 2100 cggtatatca gtgccagcac tgtctgtata cctggcgcga taccgaaccg ctacgccgta 2160 ccagccgcga gcattacccg gaagccttcc gcatgacgca gaaggatatt gatgaggcgc 2220 cgcaggtgcc aacaatcccg ccgctgctgt aaaaaaagcc cggtggcggc tgcgcttacc 2280 gggcctacgg gttttgtagg ccgggtaagg cgaagccgcc acccggcaaa aaagaccgca 2340 gagaactaaa ccagactc 2358 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 39 ctctcatatg agattgattg tgggaatgac 30 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ggagccggat atcgcggcgg ccgccaacgc 720 gaccggacgc atcggcgaag gcgcgcccgc gctctggttt gacaatatcc gcggctttac 780 tgacgcgcgg gtggcgatga acaccattgg ttcatggccg aaccacgcga tctcgctcgg 840 tctgccgcct gccacaccgg taaagcagca gatagaagaa tttattcgcc gctgggatac 900 cttcccggtc gcgccggaac gccgcgataa tccgccatgg gcggaaaaca gcgtcgacgg 960 cgacgacatt aacctgttcg acattctgcc gctgtttcgc ttaaacgacg gcgacggcgg 1020 gttctacctt gataaagcgt gtgtggtctc gcgcgatccg ctcgatcccg aacacttcgg 1080 caagcagaat gtcggcatct accggatgga agtgaaaggc aagcgcaagc tcgggctgca 1140 accggtgccg atgcatgaca tcgcgctgca tctgcataag gccgaagagc gtggcgagga 1200 tttgccggtt gcgattacgc ttggcaacga tccgatcatc acgctgatgg gcgccacgcc 1260 gctgaaatac gatcagtcgg aatatgaaat ggcgggcgcg ctgcgcgaaa gcccgtaccc 1320 gatagccacc gcgccgctga ccggtttcga cgtgccgtgg gggtcggaag tgatccttga 1380 aggggtgatt gaaggacgca agcgcgagat agaagggccg ttcggcgagt ttaccgggca 1440 ctactccggc gggcgtaaca tgaccgtggt gcgtatcgat aaagtctctt atcgcaccaa 1500 accgattttc gaatcgctct atctcggcat gccgtggacc 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gatggggcca gccacctgcg 1560 tgccgctgta tcagcagctg aaagccgagt tccctgaagt gcaggcggta aacgccatgt 1620 acacccatgg cctgctggcg attatctcca ccaaaaaacg ctacggcggc tttgcccgcg 1680 cggtgggcct gcgcgcaatg accacgccgc atggtctggg ctacgtgaag atggtgatta 1740 tggtcgatga agacgttgac ccgttcaacc tgccgcaggt gatgtgggcg ctctcctcga 1800 aagtgaaccc ggcaggggat ttggtgcagt tgccgaatat gtccgtgctg gaactcgatc 1860 caggctcaag ccctgcgggg atcaccgaca agctgattat cgacgccact acgcctgtcg 1920 ccccggacaa ccgtggtcac tacagccaac cggtggtgga tttaccggaa accaaagcct 1980 gggctgaaaa actgaccgct atgctggctg cacgtaaata aggagaagaa gatgatttgt 2040 ccacgttgtg ccgatgaaca gattgaagtg atggcgaaat cgccggtgaa agatgtctgg 2100 acggtatatc agtgccagca ttgcctttat acctggcgcg ataccgaacc gctgcgccgt 2160 accagccgcg aacattatcc cgaagcgttc cgcatgacgc agaaagatat tgatgacgcg 2220 ccaatggtgc cgagcatccc gccgctgctg gtggaaggta agcgctaa 2268 <210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 45 ctctcatatg aaactgatcg tcgggatg 28 <210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 46 ctctcatatg ttagcgctta ccttccgc 28 <210> 47 <211> 2268 <212> DNA <213> Escherichia fergusonii <400> 47 atgagactga tcgtcgggat gacaggggcc accggagcgc ctcttggtgt ggcattactg 60 caagcgctgc gggagatgcc gaatgtcgag actcatctgg tgatgtcgaa gtgggcgaaa 120 accaccattg aactggaaac gccttacaac gcccgcgatg ttgctgccct cgcagacttc 180 tgccataacc cggcggatca ggccgcaacc atctcctcag gttcctttcg taccgacggt 240 atgatcgtta ttccgtgcag tatgaaaacg ctcgccggta tccgcgctgg ttacgccgat 300 ggcctggtag ggcgcgcggc ggacgtcgtg ctcaaagaag gccgcaaact ggtgctggtg 360 ccgcgtgaaa tgccgcttag caccatccat ctcgaaaata tgctcgcact ttcgcgcatg 420 ggcgtggcga tggtgccgcc gatgcctgcc ttttataacc atcccgaaac ggtagatgac 480 attgtccacc acgtggtagc ccgcgtgctg gatcaatttg gcctcgaaca tcctcacgcc 540 aggcgctggc aaggattgcc gcaggcccgg aatttttccc aggagaatga ataatggcat 600 ttgatgattt acgcagcttt ttacaggcgc ttgatgacta cggtcagtta ctgaaaatca 660 gtgaagaagt gaacgccgag ccggatctgg cagccgctgc caacgccacc gggcgtatcg 720 gcgacggtgc accggcgctg tggtttgaca atattcgcgg ctttaccgat gcccgcgtgg 780 caatgaacac catcggctcc tggcagaacc acgcgatttc cctcggcctg ccgccaaaca 840 ccccggttaa aaaacagatt gatgagttta tccgccgctg ggataacttt cccattgccc 900 cggagcgccg tgcgaatccg gtctgggcgc agaacaccgt cgatggcgac gagattaatt 960 tgttcgatat tctgccgctg tttcgtttaa acgatggcga tggcggtttc tatctcgaca 1020 aagcgtgcgt ggtttcccgc gatccgctcg acccggataa tttcggcaag cagaatgtcg 1080 gcatctaccg catggaagtg aagggcaagc gtaagctcgg cctgcaaccg gtgccgatgc 1140 acgatatcgc cctgcatctg cataaagcag aagagcgcgg tgaagatctg ccgattgcga 1200 tcacgctcgg taacgatccg atcatcaccc tgatgggggc caccccgctg aaatacgatc 1260 aatcagagta cgaaatggct ggcgcactac gcgaaagccc gtacccgatc gccaccgccc 1320 cgctgaccgg ttttgatgtg ccgtggggct cagaagtgat cctcgaaggc gttatcgaaa 1380 gccgtaaacg cgagattgaa gggccgttcg gtgaatttac cggccactac tccggcgggc 1440 gcaacatgac cgtagtgcgc atcgataaag tctcttaccg caccaaaccg atttttgaat 1500 cgctctatct cggtatgccg tggaccgaaa tcgactacct gatggggcca gccacctgtg 1560 tgccgctgta tcagcaactg aaagccgagt tcccggaagt gcaggcggtg aacgccatgt 1620 acacccacgg cctgctggcg attatctcca ccaaaaaacg ctacggcggc tttgcccgcg 1680 cggtgggcct gcgtgcgatg accacgccgc acggtctggg ctacgtgaag atggtgatta 1740 tggtcgatga agacgttgat ccgttcaacc tgccgcaggt gatgtgggcg ctttcgtcga 1800 aagtgaaccc ggcaggggat ctggtgcagt tgccgaatat gtcagtactg gaactcgacc 1860 ctggctcaag cccggcgggg atcaccgata agctgattat cgacgccact acgcctgtcg 1920 ccccggacaa ccgtggtcac tacagccagc cggtggtgga cttaccggaa accaaagcct 1980 gggctgaaaa actgaccgct atgctggccg cacgtaaata aggagaacaa gatgatttgt 2040 ccacgttgtg ccgatgaaca gattgaagtg atggcgaaat cgccggtgaa agatgtctgg 2100 acggtctacc agtgccagca ttgcctttat acctggcgcg atactgaacc gctacgccgc 2160 accagccgcg aacattaccc gcaagcgttc cgtatgactc aaaaagatat tgatgacgcg 2220 ccaatggtgc cgagcattcc gccgctgctg gcggcagata agcgctaa 2268 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 48 ctctcatatg agactgatcg tcgggat 27 <210> 49 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 49 ctctcatatg ttagcgctta tctgccgc 28 <210> 50 <211> 2304 <212> DNA <213> Paenibacillus polymyxa <400> 50 atgaagaaaa tcattgtagg aatatcggga gcgacagggt caatctttgg tatccgtata 60 ttgcaaaaat tacgggaggc tggagtccaa agccatctgg tgctatcccc gtgggctatt 120 gccaacattc cctatgagac aggctacacg gtgaaggatg tgaaggcaat ggcggatgca 180 gtctactcgt ataaggatca ggccgcacgt atttctagcg gctccttccg ggtagatggt 240 atggtcgtcg ctccttgcag tatgaagact cttgcctcta ttcgtatcgg tatggcggac 300 aacctgctta cccgatcagc ggatgtgata ctgaaggagc gaaagaagct gctgctcatg 360 accagagaaa caccattaag cagtatccat ctggaaaata tgctggagct gtcacgtatg 420 ggcgtgatga tcctgccgcc gatgcctgcc ttttataatc atcctgcaag tatcgaggaa 480 ttagtggatc atattgtttt tcgcgcattg gatcagttcg gtattgtcac aaccgcagcc 540 aaacgctggg atgggatgaa gcagaatgac tccaggctgc accagaattg agaaatcgaa 600 agacgaagga gaatgaatga tggcttataa agactttcgc gattttctac acaccttgga 660 aaaggaggga caattactca cgatcagcga tgaggtaaag ccggagccgg acctcgcagc 720 agctaacaga gcattaaaca atcttggaga taagacgcct gctctctttt tcaacaacat 780 ctatggatat acggatgctc gtattgcaat gaatgtgatg ggctcctggc ccaatcatgc 840 cctcatgatg ggaatgccca aaaatacgcc gctcaaggag cagttttttg aatttgccag 900 acgctatgaa caatttccgg tgcccgtgaa gcgggaagaa gccgctcctt ttcatgaagt 960 cgaaattacg gagaatatta atttgtttga tattttgccg ttgtttcgtt tgaatcaggg 1020 ggacggaggg ttttatttgg ataaagcaat tctaatttca cgcgatctgg atgacccgga 1080 cacctacggt aagcaaaatg tcggcttata ccggatgcag gtgaaaggca agaaccgttt 1140 gggcatccag cctgtaccac agcatgatat tgcgatccat atccgtcagg ctgaggagcg 1200 tggcgaaaat ctgaaggtgg ctattgccct cggatgtgag cctgtgatta caacggctgc 1260 ttctacgcca ctgctgtacg atcaatccga atatgagatg gcgggcgcca ttcagggcga 1320 gccttatcgt gtggtcaaag cgaaggatgc agatctggat ctgccttggg gagccgaggt 1380 cattttggaa ggcgaagtgt tagcaggtga acgtgagtat gaaggtccat tcggtgaatt 1440 cacaggtcac tattccggcg gtcgcgcgat gccagtcatt cagattaatc gtgtatatca 1500 ccgcaaacag cctatctttg agcatctgta catcgggatg ccttggacgg aaacggatta 1560 tatgatcggt gtgaatacaa gtgtaccgtt gtttcagcag cttaaggatg cttttcctaa 1620 tgaaatcgta gctgttaatg ccatgtatac gcatgggctg gtcgctatta tttccacgaa 1680 aacccggtat ggcggctttg cgaaggctgt gggaatgcgt gcgttaacga ctccgcatgg 1740 attggggtat tgcaagctgg tgattgtggt ggacgaggag gtcgatccgt tcaatctgcc 1800 gcaagtcatg tgggctttat ccaccaagct tcatccaaag catgatgctg tcattgttcc 1860 tggcttgtct attttaccgc ttgaccccgg ctctgatccg gcaggtatga cgcacaaaat 1920 gatactggat gcgacgacac ctgtagcacc ggatattaga ggccattact cgcagccgct 1980 cgattccccg ctgggtgtag cggaatggga gaaaaagttg agccaaatgc ttcgctaaat 2040 atttttaaaa acaaagaaaa tttaaaggag tgctgacaga tgcatatttg tccccgttgt 2100 gagtccaatc gttcagaagt cgtttcccat tcgccggtta aaggtgcctg ggaggttttg 2160 ttgtgccctg tatgcctgtt cacatggcga acctcagaac cggatagcat tactgatcca 2220 gcaaagtata aatcggcgtt caaggtaaac ccccaagata ttccggatgc tgctcatgtt 2280 cctcctattc cagagcggat atag 2304 <210> 51 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 51 ctctcatatg aagaaaatca ttgtaggaat atcgg 35 <210> 52 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 52 ctctcatatg ctatatccgc tctggaatag g 31 <210> 53 <211> 2318 <212> DNA <213> Pantoea ananatis <400> 53 atgagtagat tactgttaat ttcattcgta cacgaacgtt atttgcaagg aagtcagatg 60 agaattgtaa tcggtatgac gggagcaaca ggtgcccctt taggggtggc tctgctcagc 120 attttgcagg aaatcaaaga ggttgaaact catctgattt tgagcaagtg ggctaaaacc 180 acaattgaac tcgaaacgcc tttttcatcg cgtgaggtga tgagcatggc tgatgttgtg 240 tatggcccgt ccgaccaggc cgctactctc tcgtcaggtt cttttcacac cgatgggatg 300 gtcattattc cttgcagtat gaaaacctta gcgggaattc gcatgggata cgcggaaggc 360 cttattggac gggctgctga tgtcgtcatt aaagaaggca gaaaacttgt gctggtcccc 420 agagagacgc ctctcagcac cattcacctg gaaaatatgc tagccctttc ccgtcttggc 480 gtatccatgg ttccgcccat gcccgctttt tataaccacc ccgcagtaat tgatgatgtg 540 atcgatcatg tcgtttctcg tgttctcgac cagtttggga ttgcctcgcc aaaggcaaat 600 cgctggaaag gcctgaacaa ttctaagaaa tccctgagta tggagagtaa ataatggctt 660 ttgatgacct acgtagcttc cttaaggctc tggacgagca ggggcagctt cttgagattg 720 atgaagaggt tttacccgaa cctgatattg ccgcggccgc taatgctaca ggccgaattg 780 gtgaaggtgc accggcaatc tcattcaaaa aaataaaggg gttcaatcat gctcatgttg 840 tgatgaacac tattggttcc tggcaaaacc atgcaatttc actgggcctc ccaatgaata 900 ccccagtgaa acagcagata gatgaattca ttcgtcgctg ggacactttt cctgtggcac 960 cagagcggcg cgacaatgcg ccctggtcag aaaataccgt tgattgtgaa gagatcaatc 1020 tcttcgacat ccttcccctg ttccgcctga acgacggcga cggcggtttc tatcttgata 1080 aggcctgcgt agtatcacgt gacccgcttg atccagaaca tttcggtaag caaaacgtcg 1140 gcatttaccg gatggaggtg aaaggtaaac gtaaactcgg gctccagccc gtgccgatgc 1200 atgacattgc acttcatctc cataaggccg aagaacgcgg cgacgatctg ccagtggcta 1260 ttacgctggg caatgacccc attattacat tgatgggcgc cacgccgctg aaatacgacc 1320 agtcagaata tgagatggca ggtgcgctgc gtgaaagccc gtaccccatc gcctccgcgc 1380 ctctgaccgg ctttgatgtg ccgtggggat cggaagtcat tcttgaaggc gtgatagaag 1440 ggcgcaaacg tgagattgaa ggaccgtttg gcgaattcac cggccattat tccggcggtc 1500 gcaatatgac cgttgtgcgg attgataagg tctcctaccg cactaagcca atattcgagt 1560 cattgtatct gggaatgccc tggaccgaaa ttgattatct gatgggcccg gcaacctgtg 1620 tccctttgta tcaacagctg aaagcggatt tccctgaggt gcaggctgta aatgcaatgt 1680 atacacacgg attactggcc attatttcta caaagaaacg ttatggtgga tttgcccgtg 1740 ctgtaggcgt acgggcgatg acaaccccgc atggtctggg ctacgtcaag atggtgatca 1800 tggtcgatga ggatgtcgat ccctttaacc tgcctcaggt gatgtgggcg ctgtcttcaa 1860 aggtcaatcc gcaaggcgat ctcgttcaac tgccaaacat gtccgtactg gaactggacc 1920 cgggttccag ccctgcggga atcacggata aacttgtgat cgatgcgacg actcccgtgg 1980 caccggatac ccgcggccac tacagtcagc cggtaaaaga cctgccagaa acttcaatct 2040 gggttgagaa gttaacgtcc ctgttatcaa atcgcggtta aggagaaagt atgatttgtc 2100 cacgttgtgc tgatgaacac attgaaatca tggcaacatc cccagttgag gggatatgga 2160 cggtgcatca gtgtcagcat tgcctgtaca catggcgcaa tacagagcca gcccgaagaa 2220 cggagcggga acattatcct gaagccttcc ggatgactca acgtgatatt gataatgcgc 2280 cggaagtccc gtctgtccct cctctgttag ctaagtaa 2318 <210> 54 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 54 ctctcatatg agtagattac tgttaatttc attcgtac 38 <210> 55 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 55 ctctcatatg ttacttagct aacagaggag gg 32 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 56 ctcttctaga gaaacgatca agtgcaccag 30 <210> 57 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 57 gacacgagcg tttatacctc taattgccac tggtacgtgg 40 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 58 gaggtataaa cgctcgtgtc 20 <210> 59 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 59 ctctgagctc gagaacacga accatacgag 30

Claims

4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제(4-hydroxybenzoate decarboxylase) 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가, 염색체 상에 존재하는 페놀 2-모노옥시게나아제(phenol 2-monooxygenase) 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 파괴되거나 또는 결손된 숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에 도입된, 페놀 생산능를 가지는 형질 전환체.
제1항에 있어서,
4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아트로파에우스(Bacillus atrophaeus), 바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니(Bacillus subtilis subsp. spizizenii), 시트로박터 코세리(Citrobacter koseri), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 엔테로박터 호마에체이(Enterobacter hormaechei), 엔테로박터 사카자키(Enterobacter sakazakii), 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 에쉐리키아 퍼구소니(Escherichia fergusonii), 파에니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa), 또는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 유래의 유전자인, 형질 전환체.
제1항에 있어서,
4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 하기 (a) 또는 (b)의 DNA인, 형질 전환체:
(a) 서열 번호 16, 서열 번호 23, 서열 번호 26, 서열 번호 29, 서열 번호 32, 서열 번호 35, 서열 번호 38, 서열 번호 41, 서열 번호 44, 서열 번호 47, 서열 번호 50, 또는 서열 번호 53의 염기 서열로 이루어지는 DNA,
(b) 상기 (a) 중 어느 하나의 염기 서열과 상보적인(complementary) 염기 서열로 이루어지는 DNA와 혼성화하고, 또한 4-하이드록시벤조에이트 데카르복실라아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰이, 그 염색체 상에 존재하는 4-하이드록시벤조에이트 하이드록실라아제(4-hydroxybenzoate hydroxylase) 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 파괴되거나, 또는 결손된 것인, 형질 전환체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰이, 코리네박테리움 글루미쿰 R(FERM P-18976), ATCC13032, 또는 ATCC13869인, 형질 전환체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰이, 코리네박테리움 글루미쿰 R(FERM P-18976), ATCC13032, 또는 ATCC13869의 염색체 상에 존재하는 페놀 2-모노옥시게나아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 파괴되거나, 또는 결손된 것인, 형질 전환체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
숙주의 코리네박테리움 글루타미쿰이, 코리네박테리움 글루미쿰 R(FERM P-18976), ATCC13032, 또는 ATCC13869의 염색체 상에 존재하는 4-하이드록시벤조에이트 하이드록실라아제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자가 파괴되거나, 또는 결손된 것인, 형질 전환체.
코리네박테리움 글루타미쿰 PHE21(수탁 번호：NITE BP-996), PHE21-2, PHE21-3, PHE21-4, PHE21-5, PHE21-6, PHE21-7, PHE21-8, PHE21-9, PHE21-10, PHE21-11, PHE21-12, PHE22-1, PHE22-2, PHE22-3, PHE22-4, PHE22-5, PHE22-6, PHE22-7, PHE22-8, PHE22-9, PHE22-10, PHE22-11, 또는 PHE22-12 형질 전환체.
제1항 내지 제3항 및 제8항 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환체를, 환원 조건 하에서, 4-하이드록시벤조에이트 또는 그의 염을 함유하는 반응액 중 반응시키는 반응 공정과, 반응액 중의 페놀을 회수하는 회수 공정을 포함하는 페놀의 제조 방법.
제9항에 있어서,
상기 반응 공정에 있어서, 형질 전환체가 증식하지 않는, 페놀의 제조 방법.
제9항에 있어서,
환원 조건 하의 반응액의 산화 환원 전위가 -200∼-500 mV(밀리볼트)인, 페놀의 제조 방법.
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