CN106916855A - 利用二氧化碳生物转化方法对酚类物质进行修饰的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用CO₂生物转化法对酚类物质进行修饰的方法。它是利用基因工程菌将CO₂结合到酚类物质的芳环上得到羟基苯甲酸及衍生物，并将酚类加羧后生成的羧基还原，生成相应的醛或醇。本发明的方法不仅可以充分减少碳的排放，而且从技术上避免其它碳源的加入引入固体或液体杂质，可以缩短合成步骤，减轻分离负担，因此从经济上更加合算。

Description

利用二氧化碳生物转化方法对酚类物质进行修饰的方法及 应用

技术领域

本发明为合成生物学领域，涉及利用CO₂生物转化法对酚类物质进行修饰的方法。通过将羟基苯甲酸及衍生物脱羧酶基因和羧基还原酶基因构建于同一株菌，利用得到的含有两种功能酶的基因工程菌经一步发酵转化将CO₂加到酚类物质的芳环上得相应羧化产物，并进一步将羧化产物还原得到相应醛或醇。

背景技术

各种酚类及衍生物在香精、食品、药品、化工等领域广泛应用，香精中许多是低分子量的酚类物质，如香兰素、乙基香兰素等。由于安全原因，生物转化法得到的这类物质更为消费者所接受，目前有许多关于生物转化法生产香精（如香草醛）的报道。目前这些方法多是利用酚环上含有的多碳原子碳链进行生物氧化断链在酚环上引入羧基，再通过生物还原手段将酚环上羧基还原为醛基。如：文献已经报道的以阿魏酸，松柏醇，芳香族氨基酸，丁香酚或异丁香酚等天然化合物为底物，通过微生物转化法生成香草醛。但这些方法都是将原料（底物）中酚的长链侧链氧化断链后使酚环上带有羧基，并进一步通过微生物还原手段将羧基还原为醛基。到目前为止，尚没有用一株菌发酵利用CO₂对酚类物质进行加羧后还原制备酚类物质衍生物的报道。

利用CO₂合成有机物及化工和医药中间体或香料，不仅可以充分减少碳的排放，而且从技术上避免引入其它固体或液体原料带来的杂质，可以缩短合成步骤，减轻分离负担，因此从经济上更加合算。但采用生物转化法对酚类物质加羧，需要酶的催化才能完成，根据底物酚类物质的结构不同，可采用不同选择性的羧化酶（因部分反应可逆，有的羧化酶也叫脱羧酶），目前有水杨酸脱羧酶，4-羟基苯甲酸脱羧酶，3,4-二羟基苯甲酸脱羧酶，2,6-二羟基苯甲酸脱羧酶等，以针对不同酚类底物进行催化加羧，可将CO₂加到酚环的不同位置，制得特定位置带羧基的不同羟基苯甲酸衍生物。

但许多产品需要对上述酚羧化产物的羧基进行还原得到相应醇或醛，如香草醛的生产。这可采用微生物发酵或还原酶对羧基进行还原，如采用来自诺卡氏菌的还原酶（CAR）对羧基进行还原从而得到。但到目前为止，尚没有利用同一株工程菌完成在酚环上加羧和将羧基还原为相应醇或醛的报道。

发明内容

本发明公开了一种利用CO₂生物转化法对酚类物质进行修饰的方法，其特征在于：它是采用一株基因工程菌对苯酚及其衍生物进行羧化，同时对羧化产物的羧基进行还原生成相应的醛或醇；

其中R₁, R₂, R₃,R₄ 分别选自H，OH，OCH₃，OC₂H₅基团中的一种；

所述的基因工程菌指的是：羧化酶和羧基还原酶基因；

羧化酶包括：序列1对羟基苯甲酸脱羧酶基因yclBCD，序列2水杨酸脱羧酶基因sdc；

羧基还原酶包括：序列3 诺卡氏菌中的羧基还原酶基因car；序列4 土曲霉中的羧基还原酶基因ATEG03630；磷酸泛酰巯基转移酶基因；其中磷酸泛酰巯基转移酶基因指的是：序列3 枯草芽孢杆菌中的磷酸泛酰巯基转移酶的基因sfp，序列5构巢曲霉中的磷酸泛酰巯基转移酶的基因npgA 。

本发明所述的SEQ ID NO序列1为来自枯草芽孢杆菌168的对酚类物质起羧化作用的酶的基因yclBCD；SEQ ID NO序列2为来自酵母的水杨酸脱羧酶基因sdc；SEQ ID NO序列3来自诺卡氏菌和枯草芽孢杆菌的对羟基苯甲酸及其衍生物还原酶的基因和磷酸泛酰巯基转移酶的基因car-sfp；SEQ ID NO序列4 来自土曲霉的羧基还原酶基因ATEG03630；SEQ IDNO序列5为来自构巢曲霉中的磷酸泛酰巯基转移酶的基因npgA。

本发明进一步公开了利用CO₂生物转化法对酚类物质进行修饰的方法制备的典型化合物：

4-羟基苯甲醛 ；2-羟基苯甲醛 ；

2-羟基苯甲醇；4-羟基苯甲醇；

3-甲氧基-4-羟基苯甲醛；4-羟基-3-甲氧基苄醇；

3,4-二羟基苯甲醛；3,4-二羟基苯甲醇；

3-乙氧基-4-羟基苯甲醛；3-乙氧基-4-羟基苯甲醇；

6-乙氧基-3,4-二羟基-2-甲氧基苯甲醛；6-乙氧基-3,4-二羟基-2-甲氧基苯甲醇。

本发明更进一步公开了基因工程菌的构建方法：

（1）通过PCR技术克隆羧化酶基因对羟基苯甲酸脱羧酶基因yclBCD或水杨酸脱羧酶基因sdc中的一种和还原酶基因car，npgA中的一种的主功能区并与大肠杆菌BL21(DE3)胞内表达质粒pETDuet-1连接构建相应表达质粒；

（2）将（1）中重组表达质粒转至大肠杆菌BL21(DE3)中得到重组基因工程菌。

其中对酚类物质进行修饰的基因工程菌，基因的载体为重组质粒为pETDuet–sdc-car–sfp，pETDuet–yclBCD- car–sfp，pETDuet–yclBCD- ATEG03630–npgA或pETDuet–sdc-ATEG03630–npgA中的一种。

本发明更进一步公开了利用CO₂生物转化法对酚类物质进行修饰方法在制备酚环上加羧和将羧基还原为相应醇或醛方面的应用。

本发明所涉及的生物合成反应通式如下：

其中R₁, R₂, R₃,R₄ 可以分别选自H，OH，OCH₃，OC₂H₅基团。

本发明公开的利用CO₂生物转化法对酚类物质进行修饰的方法与现有技术相比所及有的积极效果在于：

（1）本发明通过生物转化方法利用改造好的工程株菌将CO₂结合到酚的芳环上得到羟基苯甲酸及衍生物，并进一步将生成的羧基还原得到相应醛或醇。相对于化学制备方法，生物转化方法更为消费者接受。

（2）本发明提供的利用CO₂合成有机物及化工和医药中间体或香料，不仅可以充分减少碳的排放，而且从技术上避免引入其它固体或液体碳源带来的杂质，可以缩短合成步骤，减轻分离负担，因此从经济上更加合算。

附图说明

图1为羧化酶基因 yclBCD 的 PCR 扩增琼脂糖凝胶电泳图；

图2为水杨酸脱羧酶基因sdc的 PCR 扩增琼脂糖凝胶电泳图；

图3为羧酸还原酶基因car-sfp的 PCR 扩增琼脂糖凝胶电泳图；

图1，图2，图3中，泳道：M表示marker；1表示PCR扩增目的的片段；

图4为构建的重组表达载体 pETDuet–yclBCD-car–sfp的过程示意图；

图5为重组大肠杆菌BL21(DE3)的表达的酶的 SDS-PAGE 电泳图；

图6为HPLC分析图；其中A为对羟基苯甲酸标品色谱图；B为对羟基苯甲醇标品色谱图；C为苯酚标品色谱图；

图7为含重组质粒的pETDuet-1 的工程菌的发酵液色谱图；

图8A为含重组质粒的pETDuet-yclBCD的工程菌的不含底物苯酚的发酵液色谱图；B为含重组质粒的pETDuet–yclBCD的工程菌的发酵液色谱图；

图9为含重组质粒的pETDuet–yclBCD-car–sfp的工程菌的发酵液色谱图；

图10为HPLC分析图；其中D为香草酸标品色谱图；E为香草醛标品色谱图；

图11为含重组质粒的pETDuet-1 的工程菌的发酵液色谱图；

图12为含重组质粒的pETDuet–yclBCD的工程菌的发酵液色谱图；

图13为含重组质粒的pETDuet–yclBCD-car–sfp的工程菌的发酵液色谱图；

图14为HPLC分析图；其中F为水杨酸标品色谱图；G为水杨醛标品色谱图；

图15为含重组质粒的pETDuet–sdc的工程菌的发酵液色谱图；

图16为含重组质粒的pETDuet–sdc-car–sfp的工程菌的发酵液色谱图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所用原料及试剂均有市售，其中感受态大肠杆菌BL21(DE3)、LB培养来源自制、质粒pETDuet-1来源市售。

本发明涉及的底物转化为产物的反应通式如下：

其中R₁, R₂, R₃,R₄ 可以分别选自H，OH，OCH₃，OC₂H₅基团；

实施例1

来自枯草芽孢杆菌的羧化酶基因yclBCD（基因序列1）,酵母菌的水杨酸脱羧酶基因sdc（基因序列2）和诺卡氏菌中羧酸还原酶基因car（基因序列3）的克隆

（1） 在 GenBank 中查阅羧酸还原酶car和磷酸泛酰巯基转移酶sfp的基因序列, Car来源于诺卡氏菌NRRL5646和sfp来源于枯草芽孢杆菌，序列名称分别为:AY495697.1和WP_015715234.1。通过生物公司合成该羧酸还原酶和磷酸泛酰巯基转移酶基因，命名为car– sfp，car–sfp基因大小为4343bp的片段（基因序列为3）。

（2）查阅yclBCD在 GenBank 中的基因序列为: 2632649, 2632650, 2632651 三段基因，该基因来源于枯草芽孢杆菌168（B. subtilis subsp. subtilis 168），通过 PCR从枯草芽孢杆菌168基因组中获得。 采用 PCR 反应克隆枯草芽孢杆菌168基因组中yclBCD片段，引物和反应条件如下 ：

引物 (F) ： CCCATATG CAGGAGTATGATTGAAATGAAAGC

引物 (R) ： GGGGTACC GATCAAGCCTTTCGTTCC

反应条件为 ：94℃变性 2min ；然后 94℃变性 30s，57℃复性 45s，72℃延伸 1min，30个循环后，72℃保温 10min。 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖电泳结果如图1 所示， yclBCD基因大小为2764bp 的片段（基因序列1）。

（3）查阅sdc在 GenBank 中的基因序列为:DM040453.1，该基因来源于酵母，通过PCR从酵母基因组中获得。 采用 PCR 反应克隆酵母基因组中sdc 片段，引物和反应条件如下 ：

引物 (F) ： CCCATATG ATGCGCGGAAAGGTTTCTCTCG

引物 (R) ： GGGGTACC CTAAGCCTCCGAGTCGTAGAA

反应条件为 ：94℃变性 2min ；然后 94℃变性 30s，57℃复性 45s，72℃延伸 45s，30个循环后，72℃保温 10min。 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖电泳结果如图 2所示， sdc 基因大小为1054bp的片段（见序列2）。

实施例 2

重组表达羧化酶和羧酸还原酶基因的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌的构建

（1）表达载体的构建

将克隆得到的羧化酶基因 yclBCD片段和sdc片段，用限制性内切酶 Kpn I 和 Nde I分别对羧化酶基因 yclBCD片段和sdc片段进行双酶切，100μL 酶切体系如下 ：

PCR羧化酶基因产物 40μL、10×H buffer 10μL、10×BSA 10μL、Kpn I 15μL、Nde I 15μL、 ddH₂O 10μL。 37℃酶切 4h 后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将表达载体pETDuet-1用限制性内切酶 Kpn I 和 Nde I 进行双酶切，100μL 酶切体系如下 ：表达载体pETDuet-1 40μL、10×H buffer 10μL、10×BSA 10μL、Kpn I 15μL、Nde I 15μL、 ddH₂O 10μL。 37℃酶切 4h 后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将经 Kpn I 和 Nde I双酶切的yclBCD片段和sdc片段分别与pETDuet-1 相连接，构建表达载体 pETDuet– yclBCD和pETDuet– sdc，如图 4所示。连接体系如下：表达载体pETDuet-1 与双酶切的目的基因片段 3μL、10×T4 ligase buffer 1μL、 T4 ligase 1μL。16℃连接过夜，转化到大肠杆菌 DH5α，挑取转化子测序验证。 测序验证正确的转化子转接到 LB 液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组表达质粒 pETDuet– yclBCD和pETDuet– sdc，质粒结构图谱见图 4。

将表达载体pETDuet– yclBCD，pETDuet– sdc 和合成基因car –sfp分别用限制性内切酶BamHI 和PstI 进行双酶切，100μL 酶切体系如下 ：表达载体pETDuet– yclBCD 或pETDuet– sdc 40μL、10×H buffer 10μL、BamHI 15μL、PstI 15μL、 ddH₂O 20μL。 37℃酶切 4h 后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将经BamHI 和PstI双酶切的car –sfp片段（图3）分别与pETDuet– yclBCD和pETDuet– sdc 相连接，构建表达载体 pETDuet– yclBCD - car –sfp和pETDuet– sdc- car –sfp，如图 4所示。连接体系如下：表达载体pETDuet– yclBCD 或 pETDuet– sdc与双酶切的目的基因片段 car –sfp 3μL、10×T4 ligase buffer 1μL、 T4 ligase 1μL。 16℃连接过夜，转化到大肠杆菌 DH5α，挑取转化子测序验证。 测序验证正确的转化子转接到LB 液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组表达质粒 pETDuet– yclBCD - car – sfp和pETDuet– sdc- car –sfp，质粒结构图谱见图 4。

（2）转化与筛选

取重组表达质粒pETDuet– yclBCD - car –sfp和pETDuet– sdc- car –sfp各2μL ，通过转化方法导入大肠杆菌BL21(DE3) ，涂布到含AMP的固体LB平板上。 挑取在平板上生长出的几个菌落，然后通过菌落PCR验证是否转入重组质粒，通过PCR后在琼脂糖凝胶电泳时产生目的基因条带的菌落即为大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株。

（3）发酵验证

取过夜培养的重组pETDuet– yclBCD - car –sfp基因工程菌接种到50mL LB培养基中，在37℃，200r/min^-1下培养，当菌液OD600达到0.6-0.8时加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）, 使终浓度为0.1mM，在37℃，200r/min^-1下培养4-4.5h。取培养物100uL于 EP管，5000g×5min离心， 弃上清， 菌体加入40uL上样缓冲液， 100℃水浴3min， 待冷却后10000g×10min离心， 小心吸取上清， 转入另一标记好的EP管，分离胶浓度12%；浓缩胶5%；上样量： 15 uL。将上清液进行 SDS-PAGE 电泳检测。 结果如图 5 所示。

实施例 3

CO₂生物转化法对苯酚进行加羧后还原制备对羟基苯甲醇

（1）将取过夜培养的实施例2得到的重组pETDuet– yclBCD - car –sfp基因工程菌接种到50ml LB培养基中，在37℃，200r/min^-1下培养，当菌液吸光度OD600达到0.6-0.8时加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）,使终浓度为0.1mM，在37℃，200r/min^-1下培养4-4.5h。然后加入15mmol/L的苯酚和100mmol/L的碳酸氢钠。培养12h后离心并过滤获得发酵液。

反应式如下：

（2）发酵产物的HPLC分析

采用安捷伦液相色谱仪进行检测，检测条件为： Kromstar C 18 ( 250 m m×4. 6mm, 5 μm ) 色谱柱 , 流动相甲醇( A ) -0.1%醋酸水溶液 ( B ) , 线性梯度洗脱 0～25 min , 10%A-23% A ,流速 1. 0 mL·min ^-1 , 检测波长 254nm , 柱温35 ℃,进样量20 μL 。其HPLC分析图见图6-9，对羟基苯甲酸和对羟基苯甲醇的保留时间分别为12.23min 和20.10 min。

实施例4

CO₂生物转化方法利用愈创木酚制备香草素（香草醛）

（1）香草素生成过程反应式如下：

（2）将取过夜培养的实施例2得到的重组pETDuet– yclBCD - car –sfp基因工程菌接种到50ml LB培养基中，在37℃，200r/min^-1下培养，当菌液OD600达到0.6-0.8时加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）,使终浓度为0.1mM，在37℃，200r/min^-1下培养4-4.5h。然后加入15mmol/L的愈创木酚和100mmol/L的碳酸氢钠。培养12h后离心获得发酵液进行HPLC分析。

（3）产物HPLC分析

采用安捷伦液相色谱仪进行检测，检测条件为： Kromstar C 18 ( 250 m m×4. 6mm, 5 μm ) 色谱柱 , 流动相甲醇( A ) -0.1%醋酸水溶液 ( B ) , 线性梯度洗脱 0 ～8 min , 23%A -25%A , 8 ～23 m i n , 25%A -70%A , 流速 1. 0 mL·min-1 , 检测波长 254nm , 柱温35 ℃,进样量 20 μL。其HPLC分析图见图10-13，香草酸和香草醛的出峰时间分别为14.6 min 和 16.9 min。

实施例5

CO₂生物转化法利用苯酚制备水杨醛

（1）通过PCR技术克隆羧化酶基因和还原酶基因的主功能区并与大肠杆BL21(DE3)胞内表达重组质粒pETDuet-sdc连接，将重组表达载体pETDuet– sdc - car –sfp转至大肠杆菌BL21(DE3)中得到重组基因工程菌，取过夜培养的重组pETDuet– sdc - car –sfp基因工程菌接种到50ml LB培养基中，在37℃，200r/min^-1下培养，当菌液吸光度OD600达到0.6-0.8时加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）,使终浓度为0.1mM，在37℃，200r/min^-1下培养4-4.5h。然后加入15mmol/L的苯酚和100mmol/L的碳酸氢钠。培养12h后离心并过滤获得发酵液。

反应式如下：

（2）对产物HPLC分析

采用安捷伦液相色谱仪进行检测，检测条件为： Kromstar C 18 ( 250 m m×4. 6mm, 5 μm ) 色谱柱 , 流动相甲醇( A ) -0.1%醋酸水溶液 ( B ) , 线性梯度洗脱 0 ～8 min , 23%A -25%A , 8 ～23 m i n , 25%A -70%A , 流速 1. 0 mL·min-1 , 检测波长 254nm , 柱温35 ℃,进样量 20 μL。其HPLC分析图见图14-16，水杨酸和水杨醛的出峰时间分别为13.5min和24.2min。

本发明所述的基因序列为：

序列1为来自枯草芽孢杆菌168的对酚类物质起羧化作用的酶的基因yclBCD：TTGAACCAAAATGAAAGCAGAATTCAAGCGTAAAGGAGGGGGCAAAGTGAAACTCGTTGTCGGAATGACAGGGGCAACAGGGGCCATTTTCGGGGTCAGGCTGCTGCAGTGGCTGAAGGCCGCCGGAGTGGAAACCCATCTCGTTGTGTCTCCTTGGGCAAACGTCACGATCAAACACGAAACAGGCTATACGTTACAAGAAGTAGAACAACTGGCCACATACACTTACTCACATAAGGATCAGGCGGCAGCCATTTCAAGCGGGTCGTTTGATACCGATGGAATGATTGTTGCGCCGTGCAGCATGAAATCTCTCGCAAGCATTCGCACAGGAATGGCGGATAATCTGCTGACACGTGCGGCGGATGTCATGCTCAAGGAGAGAAAAAAACTCGTCCTCTTAACGAGAGAGACGCCTTTGAACCAAATTCATCTCGAAAATATGCTAGCGCTTACGAAAATGGGCACCATCATTCTTCCTCCGATGCCGGCATTTTATAATCGGCCGAGAAGCTTAGAGGAAATGGTTGACCATATTGTTTTTAGAACGTTGGACCAATTCGGCATTCGGCTTCCTGAAGCGAAGCGCTGGAATGGGATTGAAAAACAAAAAGGAGGAGCTTGATCATGGCTTATCAAGATTTCAGAGAATTTCTCGCTGCCCTTGAAAAAGAAGGACAGCTGCTTACAGTGAATGAAGAGGTAAAGCCGGAACCGGATTTAGGGGCCTCCGCACGGGCAGCCAGCAATCTTGGCGATAAAAGCCCTGCGCTCTTATTTAACAACATTTACGGCTATCATAACGCGCGAATTGCGATGAATGTCATCGGCTCTTGGCCAAACCATGCCATGATGCTGGGCATGCCGAAAGACACACCGGTAAAAGAACAGTTTTTTGAATTCGCAAAGCGTTATGACCAGTTTCCGATGCCGGTCAAACGTGAGGAAACAGCGCCATTTCATGAAAATGAAATCACAGAAGATATCAATTTGTTCGATATACTGCCTCTTTTCAGAATTAACCAGGGTGATGGAGGCTACTATTTAGACAAAGCATGTGTCATTTCCCGTGATCTTGAGGACCCTGACAACTTCGGCAAACAAAATGTCGGCATTTACAGAATGCAAGTCAAAGGAAAAGACCGCCTTGGCATTCAGCCTGTCCCGCAGCACGATATTGCAATCCATCTGCGCCAAGCTGAAGAACGCGGCATCAACCTTCCGGTCACTATTGCGCTCGGCTGTGAGCCGGTCATTACAACGGCGGCATCGACTCCGCTTCTCTATGATCAATCAGAATACGAAATGGCAGGTGCGATTCAAGGCGAACCATATCGCATCGTCAAATCAAAGCTGTCTGATCTTGATGTTCCGTGGGGCGCTGAAGTGGTGCTTGAAGGTGAGATTATTGCCGGAGAGCGCGAATATGAAGGGCCGTTCGGTGAATTCACAGGCCATTATTCCGGCGGACGCAGCATGCCGATTATCAAAATTAAACGCGTCTATCACAGAAACAATCCGATCTTTGAACATTTATACTTAGGCATGCCTTGGACAGAATGCGATTACATGATCGGCATTAACACATGCGTGCCGCTTTATCAGCAGTTAAAAGAAGCGTATCCGAACGAAATTGTGGCAGTGAACGCCATGTACACACACGGTTTAATCGCGATTGTTTCCACAAAAACCCGCTATGGCGGATTTGCGAAAGCGGTCGGCATGCGCGCACTCACAACGCCGCACGGACTCGGCTACTGCAAAATGGTCATAGTCGTTGATGAGGATGTCGATCCATTCAACCTTCCGCAGGTCATGTGGGCGCTTTCGACCAAAATGCATCCGAAACATGATGCGGTCATCATTCCGGACTTATCTGTCCTGCCGCTTGATCCGGGATCCAATCCATCAGGAATCACTCACAAAATGATTCTCGACGCCACTACACCGGTTGCGCCGGAAACAAGAGGCCATTATTCACAGCCGCTTGATTCTCCGCTAACAACGAAAGAATGGGAACAAAAACTAATGGACTTAATGAATAAATAAGGAAAGGATGTTCGAAATGCATACATGTCCTCGATGCGACTCAAAAAAGGGAGAAGTCATGAGCAAATCGCCTGTAGAAGGCGCATGGGAAGTTTATCAGTGCCAAACATGCTTTTTTACATGGAGATCCTGTGAACCGGAAAGCATTACAAATCCCGAAAAATACAATCCAGCGTTTAAAATTGATCCAAAGGAAACAGAAACAGCAATTGAAGTTCCGGCGGTGCCGGAACCGAAAGGCTTGATCCGCGTGAACTGTATGTCAGACCGTCTCTTTGAGCTGCTTGACGGGAGCTGCCTGAATGAGAAGCAGCATGAGGCCTTCGTTCTGCAAACAGTATCAGAGGATGGCTGGCCGCATGCCGCTATGATCAGTGCAGGTGAAATCATCGCGCTGAGCCGAACTGATATCCGAATCGCTCTGTGGAAAAACACAATGACTTCGGCCAACATCCTTCGCACAGGAAAAGCACAGTTCACGGCGTGGTGGAAGGGAGCGGCCTATTATGTAAAGCTTGAATGCGCGCCTTTACCGCCTTTGAAAGATGCCGAATATGAAAGAGACCGTTTTTCCTGCCGCATCGTTTCAGTGAAAGAGGACGTTGCGAAATACGCTGATTTGACTTCAGGTGTCCGTATACAGCTTCACAGCCCTGAAGAGGTGCTGAGCAGATGGAAAAAGACCCTGGAAGATTTAAAACGGTAATATCGATA

序列2为来自酵母的水杨酸脱羧酶基因sdc

ATGCGCGGAAAGGTTTCTCTCGAGGAGGCGTTCGAGCTTCCCAAGTTCGCTGCCCAGACCAAGGAGAAGGCCGAGCTCTACATCGCCCCCAACAACCGCGACCGGTACTTTGAGGAGATTCTCAACCCGTGCGGCAACCGTCTCGAGCTTTCGAACAAGCACGGTATCGGCTACACCATCTACTCTATCTACTCGCCTGGTCCGCAGGGATGGACCGAGCGCGCCGAGTGTGAGGAGTACGCGCGCGAGTGCAACGACTACATCTCGGGCGAGATTGCCAATCACAAGGACCGGATGGGTGCCTTTGCCGCTCTGTCGATGCACGACCCCAAGCAGGCGTCCGAGGAGCTTACCCGCTGCGTTAAAGAGCTCGGTTTCCTCGGCGCGCTCGTCAACGACGTGCAGCACGCCGGACCCGAAGGCGAGACCCACATCTTCTACGACCAGCCCGAGTGGGACATCTTCTGGCAGACTTGCGTCGATCTCGACGTTCCATTCTACCTCCACCCCGAGCCTCCCTTCGGCTCGTACCTCCGCAACCAGTACGAGGGACGCAAGTACCTTATTGGTCCTCCCGTGTCTTTTGCCAACGGCGTCTCGCTCCACGTCCTCGGCATGATCGTCAACGGTGTCTTTGACCGCTTCCCCAAGCTCAAGGTCATCCTCGGCCACCTTGGCGAGCACATTCCCGGAGACTTCTGGCGCATCGAGCACTGGTTCGAGCACTGCTCCCGCCCTCTCGCCAAGTCGCGCGGAGACGTCTTCGCTGAGAAGCCCCTCCTCCACTACTTCCGCAACAACATCTGGCTCACCACCTCGGGCAACTTCTCCACCGAGACTCTCAAGTTCTGCGTCGAGCACGTCGGCGCCGAGCGCATCCTCTTCTCCGTCGACTCGCCTTACGAGCACATCGACGTCGGATGCGGATGGTACGACGACAACGCCAAGGCTATCATGGAGGCCGTTGGCGGTGAGAAGGCCTACAAGGACATTGGCCGTGACAACGCCAAGAAGCTCTTCAAGCTCGGCAAGTTCTACGACTCGGAGGCTTAG

序列3来自诺卡氏菌和枯草芽孢杆菌的对羟基苯甲酸及其衍生物还原酶的基因和磷酸泛酰巯基转移酶的基因car-sfp

AGCCAGGATCCGAATTCGATGGCTGTGGACTCGCCGGATGAACGCCTGCAACGCCGTATCGCCCAACTGTTTGCCGAAGATGAACAAGTGAAAGCTGCCCGCCCGCTGGAAGCAGTTAGCGCGGCCGTCTCTGCACCGGGTATGCGTCTGGCTCAGATCGCAGCTACGGTGATGGCTGGTTATGCGGATCGTCCGGCGGCGGGCCAGCGTGCTTTCGAACTGAATACCGATGACGCAACCGGCCGTACCAGCCTGCGTCTGCTGCCGCGTTTTGAAACCATTACGTACCGCGAACTGTGGCAGCGTGTCGGCGAAGTGGCAGCTGCGTGGCATCACGACCCGGAAAACCCGCTGCGTGCGGGTGATTTTGTGGCCCTGCTGGGCTTCACCAGCATTGATTATGCAACGCTGGATCTGGCTGACATCCATCTGGGTGCGGTTACCGTGCCGCTGCAAGCGAGCGCGGCGGTGTCCCAACTGATTGCAATCCTGACCGAAACGAGTCCGCGCCTGCTGGCGTCCACCCCGGAACATCTGGATGCTGCGGTGGAATGCCTGCTGGCAGGCACCACGCCGGAACGTCTGGTGGTTTTCGATTATCACCCGGAAGATGACGATCAGCGCGCCGCATTTGAAAGTGCGCGTCGCCGTCTGGCAGATGCAGGTTCCCTGGTGATCGTTGAAACCCTGGACGCGGTGCGTGCGCGTGGCCGTGATCTGCCGGCTGCGCCGCTGTTTGTCCCGGATACCGACGATGACCCGCTGGCGCTGCTGATTTATACGTCAGGTTCGACCGGCACGCCGAAAGGTGCCATGTACACCAATCGTCTGGCCGCAACGATGTGGCAGGGCAACTCAATGCTGCAAGGCAACAGCCAACGCGTTGGCATTAACCTGAATTATATGCCGATGAGTCATATTGCGGGTCGTATCTCCCTGTTCGGCGTGCTGGCGCGTGGCGGCACCGCATACTTTGCTGCGAAATCAGACATGAGCACCCTGTTTGAAGATATTGGCCTGGTTCGCCCGACCGAAATCTTTTTCGTTCCGCGTGTCTGTGACATGGTGTTTCAGCGCTATCAAAGCGAACTGGATCGCCGTTCTGTCGCTGGTGCGGATCTGGACACCCTGGACCGCGAAGTGAAAGCGGATCTGCGTCAGAATTACCTGGGCGGTCGCTTCCTGGTTGCAGTCGTGGGCTCGGCTCCGCTGGCCGCAGAAATGAAAACGTTTATGGAAAGCGTGCTGGACCTGCCGCTGCATGATGGTTATGGCAGTACCGAAGCCGGCGCATCCGTTCTGCTGGATAACCAGATCCAACGTCCGCCGGTCCTGGACTATAAACTGGTCGATGTGCCGGAACTGGGTTACTTTCGCACGGATCGTCCGCACCCGCGTGGCGAACTGCTGCTGAAAGCAGAAACCACGATTCCGGGTTATTACAAACGCCCGGAAGTTACGGCGGAAATCTTTGATGAAGACGGCTTCTATAAAACCGGCGATATTGTGGCCGAACTGGAACATGACCGCCTGGTTTACGTGGATCGTCGTAACAATGTTCTGAAACTGTCCCAGGGCGAATTTGTGACCGTTGCGCACCTGGAAGCTGTGTTCGCGAGCAGCCCGCTGATCCGTCAAATTTTTATCTATGGTAGTTCCGAACGCAGTTACCTGCTGGCCGTCATTGTGCCGACCGATGACGCACTGCGTGGCCGCGATACCGCTACGCTGAAAAGCGCTCTGGCGGAATCTATTCAGCGTATCGCCAAAGACGCAAATCTGCAACCGTATGAAATTCCGCGCGATTTTCTGATCGAAACCGAACCGTTCACGATTGCCAATGGCCTGCTGAGCGGTATCGCAAAACTGCTGCGCCCGAACCTGAAAGAACGTTATGGTGCGCAGCTGGAACAAATGTACACCGACCTGGCTACGGGCCAGGCAGATGAACTGCTGGCCCTGCGCCGTGAAGCTGCGGATCTGCCGGTGCTGGAAACCGTTAGCCGTGCCGCAAAAGCGATGCTGGGTGTGGCAAGCGCGGATATGCGTCCGGACGCACATTTTACCGATCTGGGCGGTGACAGCCTGTCTGCACTGAGTTTTTCCAACCTGCTGCACGAAATCTTCGGTGTTGAAGTCCCGGTGGGTGTTGTCGTGTCTCCGGCAAACGAACTGCGTGATCTGGCGAATTATATTGAAGCCGAACGCAACAGTGGCGCAAAACGTCCGACCTTCACGTCAGTGCATGGCGGTGGCTCGGAAATTCGTGCTGCGGATCTGACCCTGGACAAATTTATCGATGCACGCACGCTGGCCGCAGCTGATTCTATTCCGCACGCCCCGGTGCCGGCACAGACCGTTCTGCTGACGGGTGCGAATGGCTATCTGGGTCGTTTCCTGTGCCTGGAATGGCTGGAACGCCTGGATAAAACCGGCGGCACCCTGATTTGTGTTGTCCGTGGTAGCGACGCGGCGGCGGCACGTAAACGTCTGGATTCAGCCTTTGATAGCGGCGATCCGGGCCTGCTGGAACATTATCAGCAACTGGCAGCACGTACCCTGGAAGTGCTGGCAGGCGATATTGGTGACCCGAACCTGGGCCTGGATGACGCGACCTGGCAGCGTCTGGCAGAAACGGTCGATCTGATTGTGCATCCGGCAGCTCTGGTGAATCACGTTCTGCCGTACACCCAGCTGTTTGGCCCGAACGTGGTTGGCACCGCGGAAATTGTGCGCCTGGCTATCACCGCGCGTCGTAAACCAGTGACCTATCTGTCTACGGTTGGCGTCGCAGATCAGGTTGACCCGGCTGAATACCAAGAAGATAGCGATGTGCGTGAAATGTCTGCGGTGCGTGTCGTGCGCGAAAGCTATGCCAACGGTTACGGCAATTCTAAATGGGCTGGTGAAGTGCTGCTGCGCGAAGCGCATGATCTGTGCGGTCTGCCGGTGGCAGTTTTTCGTTCAGATATGATTCTGGCACACTCGCGCTATGCTGGTCAGCTGAATGTCCAAGATGTGTTCACCCGTCTGATTCTGTCACTGGTTGCTACGGGCATCGCGCCGTATTCGTTTTACCGCACCGATGCAGACGGTAACCGTCAGCGCGCCCATTACGATGGTCTGCCGGCAGATTTCACCGCGGCGGCGATTACGGCGCTGGGTATCCAGGCCACCGAAGGCTTTCGCACGTATGATGTGCTGAATCCGTATGATGACGGTATTAGTCTGGACGAATTTGTTGATTGGCTGGTCGAATCCGGCCATCCGATTCAGCGTATCACGGATTATTCAGACTGGTTTCACCGCTTCGAAACCGCCATCCGTGCACTGCCGGAAAAACAGCGTCAAGCCAGCGTGCTGCCGCTGCTGGATGCATACCGTAACCCGTGTCCGGCCGTTCGCGGTGCAATTCTGCCGGCTAAAGAATTTCAGGCTGCGGTCCAAACCGCGAAAATTGGCCCGGAACAGGATATTCCGCACCTGAGTGCCCCGCTGATTGATAAATACGTGTCTGACCTGGAACTGCTGCAACTGCTGGGTAGTGGCTCTGGACTGGTGGGTGCCCTGATGCACGTGATGCAGAAGCGCAGCCGCGCCATCCACTCCTCCGACGAAGGGGAGGACCAGGCTGGCGATGAAGATGAAGATTGAGAGCTCTAATAAAAGGAGATATACCATGAAAATCTATGGCATTTACATGGATCGTCCGCTGAGTCAGGAAGAAAAGAACGCTTTATGACCTTCATCAGCCCGGAAAAACGTGAAAAATGCCGTCGCTTTTATCATAAAGAAGATGCACACCGCACGCTGCTGGGCGATGTGCTGGTTCGTAGCGTGATCTCTCGCCAGTATCAGCTGGATAAATCTGATATTCGTTTCAGTACCCAGGAATACGGTAAACCGTGTATTCCGGATCTGCCGGATGCACATTTTAATATCAGCCACTCTGGCCGCTGGGTTATTGGTGCGTTCGATTCTCAGCCGATTGGTATCGATATTGAAAAAACGAAACCGATCAGTCTGGAAATTGCCAAACGTTTCTTTAGCAAAACCGAATATTCTGATCTGCTGGCAAAAGATAAAGATGAACAGACGGATTACTTTTACCATCTGTGGAGTATGAAAGAATCTTTTATCAAACAGGAAGGCAAAGGTCTGAGCCTGCCGCTGGATAGTTTTAGCGTGCGCCTGCATCAGGATGGCCAGGTTTCTATCGAACTGCCGGATTCTCACAGTCCGTGCTATATTAAAACCTACGAAGTTGATCCGGGCTATAAAATGGCCGTTTGTGCGGCCCACCCGGATTTCCCGGAAGATATTACGATGGTGAGCTACGAAGAACTGCTGTAA

序列4 来自土曲霉的羧基还原酶基因ATEG03630

ATGTCGCCCATCGCCATCGATACAGCGCCTTTCCAGAGGGCCAGGGTCAACTTGCTGCATCCCGAGGACCCGAAAGCAGTCAAAAGTATTGTCCAGCTTCTTCAGTTCAACGCCGAGCACAATCCAGACCATGTGTTTTGTCTCCAGCTTCCTTCGAAACAAGACGACGCCATCGGCAATCCAATAAGGATCACGCATCTGCAATTCTATCGCGCTGTCTCCTACTGCACCCAGCGGCTGCAGGAAGAAATAGACGGTCTTCACGGTCCAAGAGTCAACGAGGACGGAACAGTGACCAAATGCAGCCCCGTGGTACTTTTCATGGAAAGCAACGTCGGACTCCTGATTCACCTCTTGGCCTTGATGAGTCTAGGCGTGCCCGTGGCCGTCCTCTCTGCTCGCCTCAGTCCAACGGCTGTCCAACACCTCATGTCGAGTATCAGGGCACAATCGGTTATTGCATCGCCCCGGCTGAAAGGTACAATTGAGGAGGCAATCGCATCTGATAACAACACCCCGGCAATTGGAGTGAGGATGTATACACAACGACCGTTCGAAGACGATCTCGAGAATAGTCGAACACTGGACCTTCCTGCTACGAACGAGGAAAGCCATTTCATCAGCGAGAATGATCGAAATGTATTGATCCTCCACTCTTCGGGAACAACCGGACTCCCCAAACCGATATATCAACCGCATAGATATCTCCTCAACTACTCCGAGTGCCATGAGCTGGGGCCAGACGACGCGCTCGGAACTGTACTCTCTGCTCTACCGTTATTTCACGTAGGTCCAGGCGCAGGAACAAACGCACGCAAGACACTGACTGATGTAACAGGGATTCGGGTTGGTCGCACCATGTCTCGCCATGACAGTTGGGAAGCCCTTTATGCTGCCTCCCTCCAACACCATACCCACCGGCTCGTTGATCATCGAATTGATCCAGTCTTTTCAGCCCACGGCGCTGATGACGGTTCCCCACATTCTCGAGGAAATCACCACACTACCCCCCGAGCAAAGTATCAGTGCTTTGCAGCCCTTGGAATTTGTTCTTTGTGGTGGAGGGCCACTCAAGATTTCTGTCGCCGAGGCATTGGCCGCCAGCGGTGTCAATCTACTCGCTCATTTTGGCACGACCGAGACCGGCCCTCTAGGCGTCGTTTTTGTTCCGACCCCAGACTACGACTGGCACTACTGGAAGCTTCGTCAAGACATCAACTACCGGCTCGATGAGGTGGACGCCAACTCCGCCGATGGAAATCAGTACAAACTCACTGTTCATCCATTTGGCTGGGACTCAGCTTTCGAGATCCAGGACATCCTCCTCAGTCGCGGTGCAGAGTATAAGCATCATCTTCGCGCCGTGGGACGCAAAGATGATTTGATTGTGCTCGCGAACGGAGAGAAGCTTGTTCCGCGGGTTCTGGAGACTCTCCTTATGCAAGACGAGCGGGTCAAGTCCGCCGTAGCATTCGGAGAAGGCAAGTTCGAAATTGGTGTAATCGTCGAACCTACACACAAAGTTAGCGATGAGGAGGATTTTAAAGCAGCTTTGTGGGCCATCGTCTTGGAAGCTGGAGCGCAGATGGATTCTCATGCGCAGGTATCCAGCCCGTCCAGCATTATACTTGCGACACCCGAAAAGCCTGTTCCCAGGTCCGATAAGGGCTCGATTCTCAGGAGAGAGACATACCGTGTCTATGACGAGGAGATATCAAGGGTCTACGAAGTACTAGACAGAGCTTCTGAAGAGACGACCGCATTGAATCTCCAGTCTGATAGCCTTGAGGAGGACTTGAAGGATCTCATCCAGCGCGAGATAGGCTGGAAGATTTCCCCTTCAGAATGGCTTCAAGATAGCGACCTGTTTGAACTCGGTATGAATTCTCTGCAGGCAATCCGCCTGCATCGACTTCTACTTTCTTCCTTACCTGTGGATTCGAGAGAGCGGGTTGGGGCCGATTTCGTCTATAGAAGTCCATCTGTGTCCAAGCTTGGGGCGTCTCTACGGCATCTGGCTGCAAACGAGAACGGACATAGGAATGACCCCGAGACTGAGATTGATGAGCTGATTTGTCTAAACTCCTTTATTGCCCGACAGGATGCCACAGTTCTCTTGACTGGTAGCACAGGCAATCTCGGGTCGAATCTGTTGGCTCATCTCACCACCTTACCCAGAGTCAAGAAGGTTATCTGCCTCAATCGACGAGGCTCTGACACCTCGACGGCGCATACCGACCTCGTTGAACGACAACTAGCCATCGCCAAAAGCAAAGGAGTTGTGATTGACCCGGAATCAGCTTCGAAAATTGAAGTCATCCCATGCGATCCCAGCGCCGACTTCTTCGGGCTTCCTGCCGAGGTATACACGCACCTAACAGCACAAACAACACACATTCTTCACAATGCGTGGCCAATGGATTTTAAACGCAACGTGGCCTCCTTCCAATCTCAATTTCAATACCTTAACAATCTCCTCCGTGTCGCCCATGACACCCGTCTCTGTCGACCGTCCATCAAGCCACGATTCTTGTTTGTCTCTTCGATCGCGGTTGTGGGACAGTATCCACGTACCCATGGGACCCGGCTCATTCCTGAAGTCCCCTCTGATAAATCCAGCATCATTGAAGACTTTGGATACGGGAAGGCCAAGTATGTATGCGAAGAGATTATGCGCGCCGCAGCAGACAGGTATCCGGAGATGCAGTTGGGAATTGTACGCGTGGGACAGATGTCGGGATCGTCCAGGACGGGTTACTGGAACCCCAAGGAACATTTTCCAACCCTGATCAAGTTTGCAAGCATGGTTGGTCAACTGCCAGCTATTAAACAGGTACGTATTTATTTTTCAATTACTGAGCCGAGAAAAGGTTAACGATATAGACTCTCTCCTGGATCGCTGTTGACAATGCGGCTACTGTGCTGAGCGATATTCTGTTTGCGCCATCGCTAAGCGGCATATATCACCTGGAAAACCCAATCCGCCAGGCATGGCAGGATGTCCTTGATATATTTGCTTCCTCCCTTTATATAAACACGGTGAACGTGCCATTTGACCAGTGGCTGCGCAATGTACAGGCGGCAGTGCAGGAGCTAGGAACCGAGGATGAGCGGATGGAATACGACTTGTTGGCCGAGTTCCTCGAGAAGGACTTCCAGCGGATGGCGACTGGTAAAGTCATCCTGGATACGAGTAGATCGAGAGCCGTATCCGAAACCCTGAGGGAAGTGGGTGAGATATCGGAAGAGGTGGTGTGGAAGTACGTGAGAGAATGGAGGAGAGCCGGAACACTGAGGGCACCACTAGAATGA

序列5为来自构巢曲霉中的磷酸泛酰巯基转移酶的基因npgA

ATGGTGCAAGACACATCAAGCGCAAGCACTTCGCCAATTTTAACAAGATGGTACATCGACACCCGCCCTCTAACCGCCTCAACAGCAGCCCTTCCTCTCCTTGAAACCCTCCAGCCCGCTGATCAAATCTCCGTCCAAAAATACTACCATCTGAAGGATAAACACATGTCTCTCGCCTCTAATCTGCTCAAATACCTCTTCGTCCACCGAAACTGTCGCATCCCCTGGTCTTCAATCGTGATCTCTCGAACCCCAGATCCGCACAGACGACCATGCTATATTCCACCCTCAGGCTCACAGGAAGACAGCTTCAAAGACGGATATACCGGCATCAACGTTGAGTTCAACGTCAGCCACCAAGCCTCAATGGTCGCGATCGCGGGAACAGCTTTTACTCCCAATAGTGGTGGGGACAGCAAACTCAAACCCGAAGTCGGAATTGATATTACGTGCGTAAACGAGCGGCAGGGACGGAACGGGGAAGAGCGGAGCCTGGAATCGCTACGTCAATATATTGATATATTCTCGGAAGTGTTTTCCACTGCAGAGATGGCCAATATAAGGAGGTTAGATGGAGTCTCATCATCCTCACTGTCTGCTGATCGTCTTGTGGACTACGGGTACAGACTCTTCTACACTTACTGGGCGCTCAAAGAGGCGTATATAAAAATGACTGGGGAGGCCCTCTTAGCACCGTGGTTACGGGAACTGGAATTCAGTAATGTCGTCGCCCCGGCCGCTGTTGCGGAGAGTGGGGATTCGGCTGGGGATTTCGGGGAGCCGTATACGGGTGTCAGGACGACTTTATATAAAAATCTCGTTGAGGATGTGAGGATTGAAGTTGCTGCTCTGGGCGGTGATTACCTATTTGCAACGGCTGCGAGGGGTGGTGGGATTGGAGCTAGTTCTAGACCAGGAGGTGGTCCAGACGGAAGTGGCATCCGAAGCCAGGATCCCTGGAGGCCTTTCAAGAAGTTAGATATAGAGCGAGATATCCAGCCCTGTGCGACTGGGGTGTGTAATTGCCTATCCTAA。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 利用二氧化碳生物转化方法对酚类物质进行修饰的方法及应用

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2763

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgaaccaaa atgaaagcag aattcaagcg taaaggaggg ggcaaagtga aactcgttgt 60

cggaatgaca ggggcaacag gggccatttt cggggtcagg ctgctgcagt ggctgaaggc 120

cgccggagtg gaaacccatc tcgttgtgtc tccttgggca aacgtcacga tcaaacacga 180

aacaggctat acgttacaag aagtagaaca actggccaca tacacttact cacataagga 240

tcaggcggca gccatttcaa gcgggtcgtt tgataccgat ggaatgattg ttgcgccgtg 300

cagcatgaaa tctctcgcaa gcattcgcac aggaatggcg gataatctgc tgacacgtgc 360

ggcggatgtc atgctcaagg agagaaaaaa actcgtcctc ttaacgagag agacgccttt 420

gaaccaaatt catctcgaaa atatgctagc gcttacgaaa atgggcacca tcattcttcc 480

tccgatgccg gcattttata atcggccgag aagcttagag gaaatggttg accatattgt 540

ttttagaacg ttggaccaat tcggcattcg gcttcctgaa gcgaagcgct ggaatgggat 600

tgaaaaacaa aaaggaggag cttgatcatg gcttatcaag atttcagaga atttctcgct 660

gcccttgaaa aagaaggaca gctgcttaca gtgaatgaag aggtaaagcc ggaaccggat 720

ttaggggcct ccgcacgggc agccagcaat cttggcgata aaagccctgc gctcttattt 780

aacaacattt acggctatca taacgcgcga attgcgatga atgtcatcgg ctcttggcca 840

aaccatgcca tgatgctggg catgccgaaa gacacaccgg taaaagaaca gttttttgaa 900

ttcgcaaagc gttatgacca gtttccgatg ccggtcaaac gtgaggaaac agcgccattt 960

catgaaaatg aaatcacaga agatatcaat ttgttcgata tactgcctct tttcagaatt 1020

aaccagggtg atggaggcta ctatttagac aaagcatgtg tcatttcccg tgatcttgag 1080

gaccctgaca acttcggcaa acaaaatgtc ggcatttaca gaatgcaagt caaaggaaaa 1140

gaccgccttg gcattcagcc tgtcccgcag cacgatattg caatccatct gcgccaagct 1200

gaagaacgcg gcatcaacct tccggtcact attgcgctcg gctgtgagcc ggtcattaca 1260

acggcggcat cgactccgct tctctatgat caatcagaat acgaaatggc aggtgcgatt 1320

caaggcgaac catatcgcat cgtcaaatca aagctgtctg atcttgatgt tccgtggggc 1380

gctgaagtgg tgcttgaagg tgagattatt gccggagagc gcgaatatga agggccgttc 1440

ggtgaattca caggccatta ttccggcgga cgcagcatgc cgattatcaa aattaaacgc 1500

gtctatcaca gaaacaatcc gatctttgaa catttatact taggcatgcc ttggacagaa 1560

tgcgattaca tgatcggcat taacacatgc gtgccgcttt atcagcagtt aaaagaagcg 1620

tatccgaacg aaattgtggc agtgaacgcc atgtacacac acggtttaat cgcgattgtt 1680

tccacaaaaa cccgctatgg cggatttgcg aaagcggtcg gcatgcgcgc actcacaacg 1740

ccgcacggac tcggctactg caaaatggtc atagtcgttg atgaggatgt cgatccattc 1800

aaccttccgc aggtcatgtg ggcgctttcg accaaaatgc atccgaaaca tgatgcggtc 1860

atcattccgg acttatctgt cctgccgctt gatccgggat ccaatccatc aggaatcact 1920

cacaaaatga ttctcgacgc cactacaccg gttgcgccgg aaacaagagg ccattattca 1980

cagccgcttg attctccgct aacaacgaaa gaatgggaac aaaaactaat ggacttaatg 2040

aataaataag gaaaggatgt tcgaaatgca tacatgtcct cgatgcgact caaaaaaggg 2100

agaagtcatg agcaaatcgc ctgtagaagg cgcatgggaa gtttatcagt gccaaacatg 2160

cttttttaca tggagatcct gtgaaccgga aagcattaca aatcccgaaa aatacaatcc 2220

agcgtttaaa attgatccaa aggaaacaga aacagcaatt gaagttccgg cggtgccgga 2280

accgaaaggc ttgatccgcg tgaactgtat gtcagaccgt ctctttgagc tgcttgacgg 2340

gagctgcctg aatgagaagc agcatgaggc cttcgttctg caaacagtat cagaggatgg 2400

ctggccgcat gccgctatga tcagtgcagg tgaaatcatc gcgctgagcc gaactgatat 2460

ccgaatcgct ctgtggaaaa acacaatgac ttcggccaac atccttcgca caggaaaagc 2520

acagttcacg gcgtggtgga agggagcggc ctattatgta aagcttgaat gcgcgccttt 2580

accgcctttg aaagatgccg aatatgaaag agaccgtttt tcctgccgca tcgtttcagt 2640

gaaagaggac gttgcgaaat acgctgattt gacttcaggt gtccgtatac agcttcacag 2700

ccctgaagag gtgctgagca gatggaaaaa gaccctggaa gatttaaaac ggtaatatcg 2760

ata 2763

<210> 2

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcgcggaa aggtttctct cgaggaggcg ttcgagcttc ccaagttcgc tgcccagacc 60

aaggagaagg ccgagctcta catcgccccc aacaaccgcg accggtactt tgaggagatt 120

ctcaacccgt gcggcaaccg tctcgagctt tcgaacaagc acggtatcgg ctacaccatc 180

tactctatct actcgcctgg tccgcaggga tggaccgagc gcgccgagtg tgaggagtac 240

gcgcgcgagt gcaacgacta catctcgggc gagattgcca atcacaagga ccggatgggt 300

gcctttgccg ctctgtcgat gcacgacccc aagcaggcgt ccgaggagct tacccgctgc 360

gttaaagagc tcggtttcct cggcgcgctc gtcaacgacg tgcagcacgc cggacccgaa 420

ggcgagaccc acatcttcta cgaccagccc gagtgggaca tcttctggca gacttgcgtc 480

gatctcgacg ttccattcta cctccacccc gagcctccct tcggctcgta cctccgcaac 540

cagtacgagg gacgcaagta ccttattggt cctcccgtgt cttttgccaa cggcgtctcg 600

ctccacgtcc tcggcatgat cgtcaacggt gtctttgacc gcttccccaa gctcaaggtc 660

atcctcggcc accttggcga gcacattccc ggagacttct ggcgcatcga gcactggttc 720

gagcactgct cccgccctct cgccaagtcg cgcggagacg tcttcgctga gaagcccctc 780

ctccactact tccgcaacaa catctggctc accacctcgg gcaacttctc caccgagact 840

ctcaagttct gcgtcgagca cgtcggcgcc gagcgcatcc tcttctccgt cgactcgcct 900

tacgagcaca tcgacgtcgg atgcggatgg tacgacgaca acgccaaggc tatcatggag 960

gccgttggcg gtgagaaggc ctacaaggac attggccgtg acaacgccaa gaagctcttc 1020

aagctcggca agttctacga ctcggaggct tag 1053

<210> 3

<211> 4353

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agccaggatc cgaattcgat ggctgtggac tcgccggatg aacgcctgca acgccgtatc 60

gcccaactgt ttgccgaaga tgaacaagtg aaagctgccc gcccgctgga agcagttagc 120

gcggccgtct ctgcaccggg tatgcgtctg gctcagatcg cagctacggt gatggctggt 180

tatgcggatc gtccggcggc gggccagcgt gctttcgaac tgaataccga tgacgcaacc 240

ggccgtacca gcctgcgtct gctgccgcgt tttgaaacca ttacgtaccg cgaactgtgg 300

cagcgtgtcg gcgaagtggc agctgcgtgg catcacgacc cggaaaaccc gctgcgtgcg 360

ggtgattttg tggccctgct gggcttcacc agcattgatt atgcaacgct ggatctggct 420

gacatccatc tgggtgcggt taccgtgccg ctgcaagcga gcgcggcggt gtcccaactg 480

attgcaatcc tgaccgaaac gagtccgcgc ctgctggcgt ccaccccgga acatctggat 540

gctgcggtgg aatgcctgct ggcaggcacc acgccggaac gtctggtggt tttcgattat 600

cacccggaag atgacgatca gcgcgccgca tttgaaagtg cgcgtcgccg tctggcagat 660

gcaggttccc tggtgatcgt tgaaaccctg gacgcggtgc gtgcgcgtgg ccgtgatctg 720

ccggctgcgc cgctgtttgt cccggatacc gacgatgacc cgctggcgct gctgatttat 780

acgtcaggtt cgaccggcac gccgaaaggt gccatgtaca ccaatcgtct ggccgcaacg 840

atgtggcagg gcaactcaat gctgcaaggc aacagccaac gcgttggcat taacctgaat 900

tatatgccga tgagtcatat tgcgggtcgt atctccctgt tcggcgtgct ggcgcgtggc 960

ggcaccgcat actttgctgc gaaatcagac atgagcaccc tgtttgaaga tattggcctg 1020

gttcgcccga ccgaaatctt tttcgttccg cgtgtctgtg acatggtgtt tcagcgctat 1080

caaagcgaac tggatcgccg ttctgtcgct ggtgcggatc tggacaccct ggaccgcgaa 1140

gtgaaagcgg atctgcgtca gaattacctg ggcggtcgct tcctggttgc agtcgtgggc 1200

tcggctccgc tggccgcaga aatgaaaacg tttatggaaa gcgtgctgga cctgccgctg 1260

catgatggtt atggcagtac cgaagccggc gcatccgttc tgctggataa ccagatccaa 1320

cgtccgccgg tcctggacta taaactggtc gatgtgccgg aactgggtta ctttcgcacg 1380

gatcgtccgc acccgcgtgg cgaactgctg ctgaaagcag aaaccacgat tccgggttat 1440

tacaaacgcc cggaagttac ggcggaaatc tttgatgaag acggcttcta taaaaccggc 1500

gatattgtgg ccgaactgga acatgaccgc ctggtttacg tggatcgtcg taacaatgtt 1560

ctgaaactgt cccagggcga atttgtgacc gttgcgcacc tggaagctgt gttcgcgagc 1620

agcccgctga tccgtcaaat ttttatctat ggtagttccg aacgcagtta cctgctggcc 1680

gtcattgtgc cgaccgatga cgcactgcgt ggccgcgata ccgctacgct gaaaagcgct 1740

ctggcggaat ctattcagcg tatcgccaaa gacgcaaatc tgcaaccgta tgaaattccg 1800

cgcgattttc tgatcgaaac cgaaccgttc acgattgcca atggcctgct gagcggtatc 1860

gcaaaactgc tgcgcccgaa cctgaaagaa cgttatggtg cgcagctgga acaaatgtac 1920

accgacctgg ctacgggcca ggcagatgaa ctgctggccc tgcgccgtga agctgcggat 1980

ctgccggtgc tggaaaccgt tagccgtgcc gcaaaagcga tgctgggtgt ggcaagcgcg 2040

gatatgcgtc cggacgcaca ttttaccgat ctgggcggtg acagcctgtc tgcactgagt 2100

ttttccaacc tgctgcacga aatcttcggt gttgaagtcc cggtgggtgt tgtcgtgtct 2160

ccggcaaacg aactgcgtga tctggcgaat tatattgaag ccgaacgcaa cagtggcgca 2220

aaacgtccga ccttcacgtc agtgcatggc ggtggctcgg aaattcgtgc tgcggatctg 2280

accctggaca aatttatcga tgcacgcacg ctggccgcag ctgattctat tccgcacgcc 2340

ccggtgccgg cacagaccgt tctgctgacg ggtgcgaatg gctatctggg tcgtttcctg 2400

tgcctggaat ggctggaacg cctggataaa accggcggca ccctgatttg tgttgtccgt 2460

ggtagcgacg cggcggcggc acgtaaacgt ctggattcag cctttgatag cggcgatccg 2520

ggcctgctgg aacattatca gcaactggca gcacgtaccc tggaagtgct ggcaggcgat 2580

attggtgacc cgaacctggg cctggatgac gcgacctggc agcgtctggc agaaacggtc 2640

gatctgattg tgcatccggc agctctggtg aatcacgttc tgccgtacac ccagctgttt 2700

ggcccgaacg tggttggcac cgcggaaatt gtgcgcctgg ctatcaccgc gcgtcgtaaa 2760

ccagtgacct atctgtctac ggttggcgtc gcagatcagg ttgacccggc tgaataccaa 2820

gaagatagcg atgtgcgtga aatgtctgcg gtgcgtgtcg tgcgcgaaag ctatgccaac 2880

ggttacggca attctaaatg ggctggtgaa gtgctgctgc gcgaagcgca tgatctgtgc 2940

ggtctgccgg tggcagtttt tcgttcagat atgattctgg cacactcgcg ctatgctggt 3000

cagctgaatg tccaagatgt gttcacccgt ctgattctgt cactggttgc tacgggcatc 3060

gcgccgtatt cgttttaccg caccgatgca gacggtaacc gtcagcgcgc ccattacgat 3120

ggtctgccgg cagatttcac cgcggcggcg attacggcgc tgggtatcca ggccaccgaa 3180

ggctttcgca cgtatgatgt gctgaatccg tatgatgacg gtattagtct ggacgaattt 3240

gttgattggc tggtcgaatc cggccatccg attcagcgta tcacggatta ttcagactgg 3300

tttcaccgct tcgaaaccgc catccgtgca ctgccggaaa aacagcgtca agccagcgtg 3360

ctgccgctgc tggatgcata ccgtaacccg tgtccggccg ttcgcggtgc aattctgccg 3420

gctaaagaat ttcaggctgc ggtccaaacc gcgaaaattg gcccggaaca ggatattccg 3480

cacctgagtg ccccgctgat tgataaatac gtgtctgacc tggaactgct gcaactgctg 3540

ggtagtggct ctggactggt gggtgccctg atgcacgtga tgcagaagcg cagccgcgcc 3600

atccactcct ccgacgaagg ggaggaccag gctggcgatg aagatgaaga ttgagagctc 3660

taataaaagg agatatacca tgaaaatcta tggcatttac atggatcgtc cgctgagtca 3720

ggaagaaaag aacgctttat gaccttcatc agcccggaaa aacgtgaaaa atgccgtcgc 3780

ttttatcata aagaagatgc acaccgcacg ctgctgggcg atgtgctggt tcgtagcgtg 3840

atctctcgcc agtatcagct ggataaatct gatattcgtt tcagtaccca ggaatacggt 3900

aaaccgtgta ttccggatct gccggatgca cattttaata tcagccactc tggccgctgg 3960

gttattggtg cgttcgattc tcagccgatt ggtatcgata ttgaaaaaac gaaaccgatc 4020

agtctggaaa ttgccaaacg tttctttagc aaaaccgaat attctgatct gctggcaaaa 4080

gataaagatg aacagacgga ttacttttac catctgtgga gtatgaaaga atcttttatc 4140

aaacaggaag gcaaaggtct gagcctgccg ctggatagtt ttagcgtgcg cctgcatcag 4200

gatggccagg tttctatcga actgccggat tctcacagtc cgtgctatat taaaacctac 4260

gaagttgatc cgggctataa aatggccgtt tgtgcggccc acccggattt cccggaagat 4320

attacgatgg tgagctacga agaactgctg taa 4353

<210> 4

<211> 3312

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgtcgccca tcgccatcga tacagcgcct ttccagaggg ccagggtcaa cttgctgcat 60

cccgaggacc cgaaagcagt caaaagtatt gtccagcttc ttcagttcaa cgccgagcac 120

aatccagacc atgtgttttg tctccagctt ccttcgaaac aagacgacgc catcggcaat 180

ccaataagga tcacgcatct gcaattctat cgcgctgtct cctactgcac ccagcggctg 240

caggaagaaa tagacggtct tcacggtcca agagtcaacg aggacggaac agtgaccaaa 300

tgcagccccg tggtactttt catggaaagc aacgtcggac tcctgattca cctcttggcc 360

ttgatgagtc taggcgtgcc cgtggccgtc ctctctgctc gcctcagtcc aacggctgtc 420

caacacctca tgtcgagtat cagggcacaa tcggttattg catcgccccg gctgaaaggt 480

acaattgagg aggcaatcgc atctgataac aacaccccgg caattggagt gaggatgtat 540

acacaacgac cgttcgaaga cgatctcgag aatagtcgaa cactggacct tcctgctacg 600

aacgaggaaa gccatttcat cagcgagaat gatcgaaatg tattgatcct ccactcttcg 660

ggaacaaccg gactccccaa accgatatat caaccgcata gatatctcct caactactcc 720

gagtgccatg agctggggcc agacgacgcg ctcggaactg tactctctgc tctaccgtta 780

tttcacgtag gtccaggcgc aggaacaaac gcacgcaaga cactgactga tgtaacaggg 840

attcgggttg gtcgcaccat gtctcgccat gacagttggg aagcccttta tgctgcctcc 900

ctccaacacc atacccaccg gctcgttgat catcgaattg atccagtctt ttcagcccac 960

ggcgctgatg acggttcccc acattctcga ggaaatcacc acactacccc ccgagcaaag 1020

tatcagtgct ttgcagccct tggaatttgt tctttgtggt ggagggccac tcaagatttc 1080

tgtcgccgag gcattggccg ccagcggtgt caatctactc gctcattttg gcacgaccga 1140

gaccggccct ctaggcgtcg tttttgttcc gaccccagac tacgactggc actactggaa 1200

gcttcgtcaa gacatcaact accggctcga tgaggtggac gccaactccg ccgatggaaa 1260

tcagtacaaa ctcactgttc atccatttgg ctgggactca gctttcgaga tccaggacat 1320

cctcctcagt cgcggtgcag agtataagca tcatcttcgc gccgtgggac gcaaagatga 1380

tttgattgtg ctcgcgaacg gagagaagct tgttccgcgg gttctggaga ctctccttat 1440

gcaagacgag cgggtcaagt ccgccgtagc attcggagaa ggcaagttcg aaattggtgt 1500

aatcgtcgaa cctacacaca aagttagcga tgaggaggat tttaaagcag ctttgtgggc 1560

catcgtcttg gaagctggag cgcagatgga ttctcatgcg caggtatcca gcccgtccag 1620

cattatactt gcgacacccg aaaagcctgt tcccaggtcc gataagggct cgattctcag 1680

gagagagaca taccgtgtct atgacgagga gatatcaagg gtctacgaag tactagacag 1740

agcttctgaa gagacgaccg cattgaatct ccagtctgat agccttgagg aggacttgaa 1800

ggatctcatc cagcgcgaga taggctggaa gatttcccct tcagaatggc ttcaagatag 1860

cgacctgttt gaactcggta tgaattctct gcaggcaatc cgcctgcatc gacttctact 1920

ttcttcctta cctgtggatt cgagagagcg ggttggggcc gatttcgtct atagaagtcc 1980

atctgtgtcc aagcttgggg cgtctctacg gcatctggct gcaaacgaga acggacatag 2040

gaatgacccc gagactgaga ttgatgagct gatttgtcta aactccttta ttgcccgaca 2100

ggatgccaca gttctcttga ctggtagcac aggcaatctc gggtcgaatc tgttggctca 2160

tctcaccacc ttacccagag tcaagaaggt tatctgcctc aatcgacgag gctctgacac 2220

ctcgacggcg cataccgacc tcgttgaacg acaactagcc atcgccaaaa gcaaaggagt 2280

tgtgattgac ccggaatcag cttcgaaaat tgaagtcatc ccatgcgatc ccagcgccga 2340

cttcttcggg cttcctgccg aggtatacac gcacctaaca gcacaaacaa cacacattct 2400

tcacaatgcg tggccaatgg attttaaacg caacgtggcc tccttccaat ctcaatttca 2460

ataccttaac aatctcctcc gtgtcgccca tgacacccgt ctctgtcgac cgtccatcaa 2520

gccacgattc ttgtttgtct cttcgatcgc ggttgtggga cagtatccac gtacccatgg 2580

gacccggctc attcctgaag tcccctctga taaatccagc atcattgaag actttggata 2640

cgggaaggcc aagtatgtat gcgaagagat tatgcgcgcc gcagcagaca ggtatccgga 2700

gatgcagttg ggaattgtac gcgtgggaca gatgtcggga tcgtccagga cgggttactg 2760

gaaccccaag gaacattttc caaccctgat caagtttgca agcatggttg gtcaactgcc 2820

agctattaaa caggtacgta tttatttttc aattactgag ccgagaaaag gttaacgata 2880

tagactctct cctggatcgc tgttgacaat gcggctactg tgctgagcga tattctgttt 2940

gcgccatcgc taagcggcat atatcacctg gaaaacccaa tccgccaggc atggcaggat 3000

gtccttgata tatttgcttc ctccctttat ataaacacgg tgaacgtgcc atttgaccag 3060

tggctgcgca atgtacaggc ggcagtgcag gagctaggaa ccgaggatga gcggatggaa 3120

tacgacttgt tggccgagtt cctcgagaag gacttccagc ggatggcgac tggtaaagtc 3180

atcctggata cgagtagatc gagagccgta tccgaaaccc tgagggaagt gggtgagata 3240

tcggaagagg tggtgtggaa gtacgtgaga gaatggagga gagccggaac actgagggca 3300

ccactagaat ga 3312

<210> 5

<211> 1035

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggtgcaag acacatcaag cgcaagcact tcgccaattt taacaagatg gtacatcgac 60

acccgccctc taaccgcctc aacagcagcc cttcctctcc ttgaaaccct ccagcccgct 120

gatcaaatct ccgtccaaaa atactaccat ctgaaggata aacacatgtc tctcgcctct 180

aatctgctca aatacctctt cgtccaccga aactgtcgca tcccctggtc ttcaatcgtg 240

atctctcgaa ccccagatcc gcacagacga ccatgctata ttccaccctc aggctcacag 300

gaagacagct tcaaagacgg atataccggc atcaacgttg agttcaacgt cagccaccaa 360

gcctcaatgg tcgcgatcgc gggaacagct tttactccca atagtggtgg ggacagcaaa 420

ctcaaacccg aagtcggaat tgatattacg tgcgtaaacg agcggcaggg acggaacggg 480

gaagagcgga gcctggaatc gctacgtcaa tatattgata tattctcgga agtgttttcc 540

actgcagaga tggccaatat aaggaggtta gatggagtct catcatcctc actgtctgct 600

gatcgtcttg tggactacgg gtacagactc ttctacactt actgggcgct caaagaggcg 660

tatataaaaa tgactgggga ggccctctta gcaccgtggt tacgggaact ggaattcagt 720

aatgtcgtcg ccccggccgc tgttgcggag agtggggatt cggctgggga tttcggggag 780

ccgtatacgg gtgtcaggac gactttatat aaaaatctcg ttgaggatgt gaggattgaa 840

gttgctgctc tgggcggtga ttacctattt gcaacggctg cgaggggtgg tgggattgga 900

gctagttcta gaccaggagg tggtccagac ggaagtggca tccgaagcca ggatccctgg 960

aggcctttca agaagttaga tatagagcga gatatccagc cctgtgcgac tggggtgtgt 1020

aattgcctat cctaa 1035

Claims (6)

1.一种利用CO₂生物转化法对酚类物质进行修饰的方法，其特征在于：它是采用一株基因工程菌对苯酚及其衍生物进行羧化，同时对羧化产物的羧基进行还原生成相应的醛或醇；

其中R₁, R₂, R₃,R₄ 分别选自H，OH，OCH₃，OC₂H₅基团中的一种；

所述的基因工程菌指的是：羧化酶和羧基还原酶基因；

羧化酶包括：序列1对羟基苯甲酸脱羧酶基因yclBCD，序列2水杨酸脱羧酶基因sdc；

羧基还原酶包括：序列3 诺卡氏菌中的羧基还原酶基因car；序列4 土曲霉中的羧基还原酶基因ATEG03630；磷酸泛酰巯基转移酶基因；

其中磷酸泛酰巯基转移酶基因指的是：序列3 枯草芽孢杆菌中的磷酸泛酰巯基转移酶的基因sfp，序列5构巢曲霉中的磷酸泛酰巯基转移酶的基因npgA 。

2.权利要求1所述的修饰方法，其中SEQ ID NO序列1为来自枯草芽孢杆菌168的对酚类物质起羧化作用的酶的基因yclBCD；SEQ ID NO序列2为来自酵母的水杨酸脱羧酶基因sdc；SEQ ID NO序列3来自诺卡氏菌和枯草芽孢杆菌的对羟基苯甲酸及其衍生物还原酶的基因和磷酸泛酰巯基转移酶的基因car-sfp；SEQ ID NO序列4 来自土曲霉的羧基还原酶基因ATEG03630；SEQ ID NO序列5为来自构巢曲霉中的磷酸泛酰巯基转移酶的基因npgA。

3.采用权利要求1所述利用CO₂生物转化法对酚类物质进行修饰的方法制备的典型化合物：

4-羟基苯甲醛 ；

2-羟基苯甲醛 ；

2-羟基苯甲醇；

4-羟基苯甲醇；

3-甲氧基-4-羟基苯甲醛；

4-羟基-3-甲氧基苄醇；

3,4-二羟基苯甲醛；

3,4-二羟基苯甲醇；

3-乙氧基-4-羟基苯甲醛；

3-乙氧基-4-羟基苯甲醇；

6-乙氧基-3,4-二羟基-2-甲氧基苯甲醛；

6-乙氧基-3,4-二羟基-2-甲氧基苯甲醇。

4.权利要求1所述的修饰的方法，其中基因工程菌的构建方法如下

（1）通过PCR技术克隆羧化酶基因对羟基苯甲酸脱羧酶基因yclBCD或水杨酸脱羧酶基因sdc中的一种和还原酶基因car，npgA中的一种的主功能区并与大肠杆菌BL21(DE3)胞内表达质粒pETDuet-1连接构建相应表达质粒；

（2）将（1）中重组表达质粒转至大肠杆菌BL21(DE3)中得到重组基因工程菌。

5.根据权利要求/4所述的修饰的方法，其中对酚类物质进行修饰的基因工程菌，基因的载体为重组质粒为pETDuet–sdc- car–sfp，pETDuet–yclBCD- car–sfp，pETDuet– yclBCD- ATEG03630–npgA或pETDuet–sdc- ATEG03630–npgA中的一种。

6.权利要求1利用CO₂生物转化法对酚类物质进行修饰方法在制备酚环上加羧和将羧基还原为相应醇或醛方面的应用。