CN104651291A - 一株生产苯酚的重组菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株生产苯酚的重组菌株及其应用，本发明提供了重组菌1，为将编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因导入大肠杆菌中得到的重组菌1。上述重组菌1为如下重组菌1-1或重组菌1-2：所述重组菌1-1为将所述编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因及其人工调控元件M1-12整合到大肠杆菌基因组中得到的重组菌1-1；所述重组菌1-2为将所述编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因通过重组载体导入大肠杆菌得到的重组菌1-2。本发明公开的菌株具有一个新的苯酚合成途径，可用于生物发酵法生产苯酚，生物发酵法生产苯酚相对于化学合成法更加绿色环保，具有很高的生产应用价值。

Description

一株生产苯酚的重组菌株及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株生产苯酚的重组菌株及其应用。
背景技术
苯酚(phenol)，又称石炭酸、羟基苯，是一种非常重要的有机化工原料。在石油化工领域，苯酚常用来生产酚醛树脂、己内酰胺、双酚A、己二酸、水杨醛、苦味酸、烷基酚、苯胺、五氯酚等化工产品及中间体；在生物医药领域，苯酚常作为杀菌剂、防腐剂以及生产药物(如阿司匹林)的重要原料等。近些年来，随着生物、医药、化工等行业的飞速发展，国内外对苯酚及其下游产品的需求呈逐年上升的趋势。预计到2015年，我国的苯酚市场需求将达到174.3万吨。而即使在建的苯酚生产项目全部投产，按90％的开工率计算，苯酚的生产能力才151.6万吨。由此可见，我国苯酚产量仍不能满足消费需求，大力发展苯酚项目，仍有广阔的市场前景。
目前，国内外生产苯酚的方法主要是化学合成法，包括异丙苯法、甲苯-苯甲酸法、苯氧化法和苯磺化法等。其中，异丙苯法在苯酚生产中占据主导地位，是目前较为成熟的工艺。据统计，截止2010年，全球近97％的苯酚是由异丙苯法生产的。异丙苯法生产苯酚的工艺是以苯和丙烯为原料，在催化剂的作用下，通过加成反应和烷基化反应，生成异丙苯；然后，异丙苯经氧气氧化成过氧化氢异丙苯(CHP)；CHP在硫酸作为催化剂的条件下，分解生产苯酚和丙酮。异丙苯法生产苯酚固然存在工艺成熟、经济性较好等优点，但是其生产工艺特点决定了苯酚生产过程是在较高的温度、一定的压力下进行，而且生产原料和中间产物大部分为易燃、易爆，有毒、有害的危险化学品，造成严重的环境问题和人身安全问题。随着社会的不断发展，崇尚低碳环保、绿色生产的观念日益增强。低能耗、低污染、安全性高的苯酚生产方式逐渐成为科学家们研究的热点。
绿色、环保法合成苯酚的早期实施案例是一种半生物合成技术。这种技术首先以葡萄糖为原料，通过微生物发酵法生产莽草酸；然后通过超(近)临界水氧化技术将莽草酸转化为苯酚(Gibson et al.,2001)。随后，Wierckx等人克隆了来源于Pantoea agglomerans的酪氨酸裂解酶(TPL)，在Pseudomonas putida S12菌株中构建了完整的苯酚生物合成途径(Wierckx et al.,2005)。由于充足的前体物质酪氨酸的供给是苯酚合成的限制因素，他们过表达了编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶的基因aroF-1来提高酪氨酸的供给。然后通过NTG诱变结合高通量筛选来提高苯酚产量(van den Berg et al.,2008；Wierckx et al.,2009；Wierckx et al.,2008)。最后，使用辛醇作为有毒代谢产物苯酚的萃取剂进行双相发酵，使得苯酚产量进一步提高到0.86g/L。最近，Kim等人克隆了来源于Pasteurella multocida 36950的酪氨酸裂解酶，在大肠杆菌中构建了同样的苯酚生物合成途径。他们采用sRNA技术对苯酚生物合成途径中的基因进行调控，得到一株高产苯酚的菌株。最后，使用三丁酸甘油酯作为萃取溶剂进行双相发酵，进一步使苯酚产量提高到3.79g/L(Kimet al.,2014)。
4-羟基苯甲酸(pHBA)脱羧基可以生成苯酚。催化这个反应的4-羟基苯甲酸脱羧酶存在于一些微生物中，如Cryptanaerobacter phenolicus(Juteau et al.,2005),Enterobactercloacae(Valkova et al.,2001),E.coli C2(Chamkha et al.,2002)和Klebsiellaaerogenes(Grant and Patel,1969)。4-羟基苯甲酸脱羧酶已相继被纯化出来，相关的酶学性质也已被研究的比较透彻(Chow et al.,1999；Liu et al.,2007；Lupa et al.,2005；Lupa et al.,2008；Matsui et al.,2006)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组菌1。
本发明提供的重组菌1，为如下重组菌1-1或重组菌1-2：
所述重组菌1-1为在目的大肠杆菌中表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因及其人工调控元件M1-12得到的重组菌；
所述重组菌1-2为在目的大肠杆菌中表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因得到的重组菌；
所述4-羟基苯甲酸脱羧酶由亚基A、亚基B和亚基C组成；
所述亚基A的氨基酸序列为序列表中序列11；
所述亚基B的氨基酸序列为序列表中序列12；
所述亚基C的氨基酸序列为序列表中序列13；
所述人工调控元件M1-12的核苷酸序列为序列表中序列7。
上述重组菌1-1(Phe002)按照包括如下步骤的方法制备：将所述编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因及其人工调控元件M1-12整合到目的大肠杆菌基因组中，得到重组菌1-1；
Phe002具体为将含有与乳酸脱氢酶基因ldhA上游同源的50bp序列、FRT-Km-FRT片段、编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因(ycl操纵子)及其人工调控元件M1-12和与ldhA基因下游同源的60bp序列的DNA片段(实施例2的(一)一的1制备)导入的大肠杆菌ATCC 8739中，同源重组，得到Phe001；再将质粒pFT-A转入Phe001中，去除Km-FRT序列，得到Phe002。
所述重组菌1-2(8739-ycl)按照包括如下步骤的方法制备：将所述编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因通过重组载体导入目的大肠杆菌，得到重组菌1-2。
上述重组载体具体可为99AM-ECycl。
上述重组菌中，所述4-羟基苯甲酸脱羧酶来源于大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌；
所述编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因的核苷酸序列具体为序列表中序列1(来源于大肠杆菌)或序列2(枯草芽孢杆菌)。
本发明的另一个目的是提供重组菌2。
本发明提供的重组菌2，为如下重组菌2-1或重组菌2-2：
所述重组菌2-1为在将编码DAHP合酶突变体基因及其人工调控元件M1-46替换上述的重组菌1-1基因组中的DAHP合酶基因及其调控元件得到的重组菌1；
所述重组菌2-2为在目的大肠杆菌中表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因和编码DAHP合酶突变体基因得到的重组菌2；
所述人工调控元件M1-12的核苷酸序列为序列表中序列7；
所述人工调控元件M1-46的核苷酸序列为序列表中序列9；
所述编码DAHP合酶突变体基因的核苷酸序列为序列表中序列4。
重组菌2-1(Phe004)为将aroGfbr基因替换重组菌1-1(Phe002菌株)基因组中的aroG基因，且将人工调控元件M1-46替换重组菌1-1(Phe002菌株)基因组中的aroG基因的原始调控元件得到的重组菌，具体如下：
1)将含有与aroG基因上游同源50bp、下游同源的100bp序列、FRT-Km-FRT片段、人工调控元件M1-12和aroGfbr基因的前552bp片段(实施例2的(二)的二)导入的Phe002菌株中，同源重组，得到Phe003；
2)将含有与aroG基因上游同源的50bp序列、catsacB基因簇和与aroG基因ATG下游同源的50bp序列的DNA片段(实施例2的(二)的三的1)转入含有pKD46的Phe003，得到中间菌；再将含有与aroG基因上游同源的50bp序列、人工调控元件M1-46和与aroG基因ATG下游同源的50bp序列的DNA片段(实施例2的(二)的三的1)转入中间菌，得到Phe004。
上述重组菌2-2(8739-ycl-aroGfbr)按照包括如下步骤的方法制备：将表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因的重组载体(99AM-ECycl)和表达编码DAHP合酶突变体基因的重组载体(184M-aroGfbr)导入所述目的大肠杆菌中得到的重组菌2-2。
本发明的第三个目的是提供重组菌3。
本发明提供的重组菌3，为在上述重组菌2-1中表达编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因及其人工调控元件得到的重组菌；
所述编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因的核苷酸序列为序列表中序列5；
所述编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因的人工调控元件为M1-12、M1-46或M1-93。
所述人工调控元件M1-12的核苷酸序列为序列表中序列7；
所述人工调控元件M1-46的核苷酸序列为序列表中序列9；
所述人工调控元件M1-93的核苷酸序列为序列表中序列10。
上述重组菌3为如下重组菌3-1或重组菌3-2：
重组菌3-1(Phe005)按照包括如下步骤的方法制备：将所述编码分支酸-丙酮酸裂解酶(Chorismate pyruvate lyase)基因ubiC及其人工调控元件M1-12整合到上述的重组菌2-1基因组中得到的重组菌3-1；具体为将ubiC基因及其调控元件M1-12整合到Phe004的pflB位点，具体为将含有与pflB基因上游同源的50bp序列、FRT-Km-FRT片段、ubiC基因及其人工调控元件M1-12和与pflB基因下游同源的60bp序列的DNA片段(实施例2的(三)的二)导入的菌株Phe004，同源重组得到的重组菌Phe005。
重组菌3-2(Phe006)按照包括如下步骤的方法制备：将人工调控元件M1-46替换上述重组菌3-1(Phe005)基因组中pflB位点整合的ubiC基因的FRT-Km-FRT序列和人工调控元件M1-12得到的重组菌3-2；具体为先将含有与pflB基因上游同源的50bp序列、catsacB基因簇DNA片段和与ubiC基因ATG下游同源的50bp序列DNA片段(实施例2的(三)的四)导入的Phe005，得到中间菌；再将含有与pflB基因上游同源的50bp序列、人工调控元件M1-46和与ubiC基因ATG下游同源的50bp序列的DNA片段(实施例2的(三)的四)导入中间菌中，得到Phe006；
重组菌3-3(Phe007)按照包括如下步骤的方法制备：将人工调控元件M1-93替换上述重组菌3-1(Phe005)基因组中pflB位点整合的ubiC基因的FRT-Km-FRT序列和人工调控元件M1-12得到的重组菌3-3；具体为先将含有与pflB基因上游同源的50bp序列、catsacB基因簇DNA片段和与ubiC基因ATG下游同源的50bp序列DNA片段(实施例2的(三)的四)导入的Phe005，得到中间菌；再将含有与pflB基因上游同源的50bp序列、人工调控元件M1-93和与ubiC基因ATG下游同源的50bp序列的DNA片段(实施例2的(三)的四)导入中间菌中，得到Phe007。
本发明第四个目的是提供重组菌4。
本发明提供的重组菌4，按照包括如下方法的步骤制备：将人工调控元件M1-93或M1-46替换上述重组菌3-2中的编码4-羟基苯甲酸脱羧酶的基因的调控元件M1-12，得到的重组菌；
所述M1-46的核苷酸序列为序列表中序列9；
所述M1-93的核苷酸序列为序列表中序列10。
上述重组菌4为如下重组菌4-1或重组菌4-2：
重组菌4-1(Phe008)按照包括如下步骤的方法制备：将人工调控元件M1-46替换重组菌3-2(Phe006)中的ycl编码4-羟基苯甲酸脱羧酶的基因(ycl操纵子)的人工调控元件M1-12得到的重组菌；具体为先将含有与ldhA基因上游同源的50bp序列、catsacB基因簇DNA片段和与ycl操纵子ATG下游同源的50bp序列DNA片段(实施例2的(四)的一的1)导入Phe006中，得到中间菌，再将含有与ldhA基因上游同源的50bp序列、人工调控元件M1-46和与ycl操纵子ATG下游同源的50bp序列的DNA片段(实施例2的(四)的一的1)导入中间菌，得到Phe008；
重组菌4-2(Phe009)按照包括如下步骤的方法制备：将人工调控元件M1-93替换重组菌3-2(Phe006)中的编码4-羟基苯甲酸脱羧酶的基因(ycl操纵子)的人工调控元件M1-12得到的重组菌；具体为先将含有与ldhA基因上游同源的50bp序列、catsacB基因簇DNA片段和与ycl操纵子ATG下游同源的50bp序列DNA片段(实施例2的(四)的一的1)导入含有pKD46的Phe006中，得到中间菌，再将含有与ldhA基因上游同源的50bp序列、人工调控元件M1-93和与ycl操纵子ATG下游同源的50bp序列的DNA片段(实施例2的(四)的一的1)导入中间菌，得到Phe009。
上述重组菌4-2，其保藏号为CGMCC No.10390。
将重组菌Phe009鉴定为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，该菌株已于2015年1月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.10390。
上述的重组菌1、上述的重组菌2、上述的重组菌3或上述的重组菌4在生产苯酚中的应用也是本发明保护的范围。
本发明还有一个目的是提供重组菌5。
本发明提供的重组菌5(8739-ycl-ubiC)，其为在目的大肠杆菌中表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因和编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因得到的重组菌5；
所述在目的大肠杆菌中表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因和编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因具体为将表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因的重组载体(99AM-ECycl)和表达编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因的重组载体(184M-ubiC)导入所述目的大肠杆菌中；
所述编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因的核苷酸序列为序列表中序列1；
所述编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因的核苷酸序列为序列表中序列5。
上述目的大肠杆菌为无4-羟基苯甲酸脱羧酶的大肠杆菌，具体为大肠杆菌ATCC 8739。
本发明的实验证明，本发明将编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因导入大肠杆菌中，并同时导入编码DAHP合酶突变体基因和/或分支酸-丙酮酸裂解酶基因，得到苯酚产量高的目的大肠杆菌Phe009及其中间各种菌得到的重组菌的产量均高于大肠杆菌，且将4-羟基苯甲酸脱羧酶基因在大肠杆菌中表达制备苯酚是首次发现，为苯酚制备提供一条新途径，具有绿色、环保等经济效益。
附图说明
图1为引入4-羟基苯甲酸脱羧酶基因后大肠杆菌生产苯酚的代谢途径。
图2为苯酚测定标准曲线。
图3为分别引入来源于E.coli W和Bacillus subtilis的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因后菌株的苯酚产量。
图4为质粒过表达关键基因的菌株的苯酚产量。
图5为遗传稳定型菌株的苯酚产量。
图6为重组大肠杆菌Phe009双相高细胞密度发酵生产苯酚。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
重组菌株M1-12、M1-46和M1-93在文献“Lu J,Tang J,Liu Y,Zhu X,Zhang T,ZhangX(2012)Combinatorial modulation of galP and glk gene expression for improvedalternative glucose utilization.Appl Microbiol Biotechnol 93:2455-2462”中公开过，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得。
pKD46质粒在文献“Datsenko,Wanner.One-step inactivation of chromosomal genesin Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA.2000.97(12)：6640-6645；”中公开过，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得。
pFT-A质粒在文献“Posfai G,Koob MD,Kirkpatrick HA,Blattner FR(1997)Versati leinsertion plasmids for targeted genome manipulations in bacteria:Isolation,deletion,and rescue of the pathogenicity island LEE of the O157:H7genome.JBacteriol 179:4426-4428.”中公开过，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得。
pXZ-CS质粒在文献“Tan Z,Zhu X,Chen J,Li Q,Zhang X(2013)Activatingphosphoenolpyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase incombination for improving succinate production.Appl Environ Microbiol79(16):4838-4844.”中公开过，公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得。
pTrc99A-M质粒在文献“Zhao J,Li Q,Sun T,Zhu X,Xu H,Tang J,Zhang X,Ma Y(2013)Engineering central metabolic modules of Escherichia coli for improvingbeta-carotene production.Metab Eng 17:42-50；公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得。
pACYC184-M质粒在文献“Zhao J,Li Q,Sun T,Zhu X,Xu H,Tang J,Zhang X,Ma Y(2013)Engineering central metabolic modules of Escherichia coli for improvingbeta-carotene production.Metab Eng 17:42-50；公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得。
无盐LB的制备方法如下：
1.50％的蔗糖溶液：称取500g蔗糖，溶于1L超纯水中，115℃，灭菌20min。
2.10％的无盐蔗糖LB培养基：称取5g酵母膏，10g蛋白胨于800mL水中，115℃，灭菌20min。灭菌后加200mL的50％的蔗糖溶液。
3.6％的无盐蔗糖LB培养基：称取5g酵母膏，10g蛋白胨，15g琼脂粉，溶于880ml水中，115℃，灭菌20min。灭菌后加120mL的50％的蔗糖溶液。
图1为引入4-羟基苯甲酸脱羧酶基因后大肠杆菌生产苯酚的代谢途径。
实施例中氯霉素、氨苄霉素、卡那霉素、氯四环素的浓度均分别为34μg/L、50μg/L、50μg/L、25μg/L。
下面实施例中苯酚的测定方法如下：
1、苯酚标准曲线的绘制
准确称取标准品粉末40mg溶解于80mL的超纯水中，定容至100mL，得到0.4g/L的标准品溶液。然后进行倍比稀释：2倍、4倍、8倍至64倍。用0.45μm的滤膜进行过滤处理，滤液用于HPLC检测。分析方法：使用安捷伦高效液相色谱仪HPLC(Agilent-1260)分析。检测条件：DAD检测器，C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为V甲醇：V水＝55:45，流速0.5mL/min，柱温箱控制在30℃，进样量20μL，检测时间20min，检测波长277nm。然后以苯酚浓度为横坐标(g/L)，以苯酚标准品的HPLC峰面积为纵坐标，得到苯酚标准曲线，如图2所示。
2、待测菌株的苯酚产量测定
培养方法：将保藏于-80℃冰箱的待测菌株在LB平板(或含有相应抗生素)上划线活化，挑取单菌落接种到15mm×100mm试管(含4mL M9培养基)中，37℃、250rpm培养24h，按1％的接种量转接到100mL三角瓶(含10mL M9培养基)中，37℃、250rpm培养24h。收集菌液用于测定菌株的苯酚产量。对于培养含有诱导型质粒的菌株，在培养基中添加相应的抗生素，在发酵过程中，生长2h后，即OD600约为0.3时，添加终浓度为1mM的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导。然后再继续培养22h，收集菌液用于测定菌株的苯酚产量。
发酵液处理：取2mL发酵液，12,000rpm离心3-5min，取上清液用无菌水适当稀释后，用0.45μm的滤膜进行过滤处理，滤液用于HPLC检测。检测方法同上述1的标曲获得方法所述。
实施例1、质粒水平过表达4-羟基苯甲酸脱羧酶基因、DAHP合酶突变基因或分支酸-丙酮酸裂解酶基因的重组菌构建
(一)表达4-羟基苯甲酸脱羧酶基因的重组载体
一、克隆来源于E.coli W中的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因
来源于E.coli W，编码4-羟基苯甲酸脱羧酶的基因簇ECyclBCD(也称为ycl操纵子)由3个单体B、C、D(GenBank:AFH12530.1(31-JAN-2014),AFH12529.1(31-JAN-2014)和AFH12528.1(31-JAN-2014))构成。将其克隆到表达载体pTrc99A-M上，得到质粒99AM-ECycl。具体步骤如下：
1、含有ECyclBCD基因的DNA片段的PCR扩增
引物如下：
ECycl-SacI-F：5’-GCATGAGCTCAAGGAGATATACCATGAAACTGATCGTCGGGAT-3’；
ECycl-XmaI-R：5’-GCATCCCGGGTTAACGCTTACCTTCCACCA-3’。
上述引物的下划线部分分别为SacI和XmaI酶切位点，AGGAGATATACCA为人工RBS。
以ECycl-SacI-F/ECycl-XmaI-R为引物，以E.coli W(本实验室保存，ATCC 9637)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。得到大小为2268bp的PCR产物，即为含有ECyclBCD基因的DNA片段，该片段包扩yclB、yclC和yclD基因(序列1)。
2、重组载体99AM-ECycl的构建
将得到的DNA片段用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒(购自生工生物工程<上海>有限公司)进行清洁、回收。然后将回收的片段和质粒载体pTrc99A-M分别用限制性内切酶SacI和XmaI(购自NEB公司)进行双酶切。再将酶切后的质粒和DNA片段用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(购自生工生物工程<上海>有限公司)进行清洁、回收。最后将回收得到的片段和质粒载体用NEB快连酶进行连接，得到重组载体。pTrc99C-F/pTrc99C-R引物验证，选PCR产物为2517bp的重组载体送到北京六合华大基因股份有限公司进行测序，测序引物与验证引物相同，序列如下：
pTrc99C-F：5’-TTGCGCCGACATCATAAC-3’；
pTrc99C-R：5’-CTGCGTTCTGATTTAATCTG-3’。
测序结果表明该重组载体为将含有ECyclBCD基因的DNA片段(序列1)插入到pTrc99A-M的SacI和XmaI酶切位点处，命名为99AM-ECycl。
二、克隆来源于Bacillus subtilis中的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因
按照一中描述的方法，将来源于Bacillus subtilis中的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因BSyclBCD(GenBank:AIY95441.1(04-DEC-2014)，AIY91645.1(04-DEC-2014)，AIY91646.1(04-DEC-2014))克隆到表达载体pTrc99A-M上，得到重组载体99AM-BSycl。
1、含有BSyclBCD基因的DNA片段的PCR扩增
引物如下：
BSycl-SacI-F：5’-GCATGAGCTCAAGGAGATATACCATGAAAGCAGAATTCAAGCG-3’
BSycl-XmaI-R：5’-GCATCCCGGGTTACCGTTTTAAATCTTCCA-3’
上述引物的下划线部分分别为SacI和XmaI酶切位点。
以BSycl-SacI-F/BSycl-XmaI-R为引物，以枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis 168(本实验室保存，ATCC 23857)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。得到大小为2744bp的PCR产物，即为含有BSyclBCD基因的DNA片段，该片段包扩yclB、yclC和yclD基因(序列2)。
2、重组载体99AM-BSycl的构建
将得到的DNA片段用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行清洁、回收。然后将回收的片段和质粒载体pTrc99A-M分别用限制性内切酶SacI和XmaI进行双酶切。再将酶切后的质粒和DNA片段用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行清洁、回收。最后将回收得到的片段和质粒载体用NEB快连酶进行连接，得到重组载体。pTrc99C-F/pTrc99C-R引物验证，选PCR产物为2993bp的重组载体送到北京六合华大基因股份有限公司进行测序。
测序结果表明该重组载体为将含有BSyclBCD基因的DNA片段(序列2)插入到pTrc99A-M的SacI和XmaI酶切位点处，命名为99AM-BSycl。
三、重组大肠杆菌表达99AM-ECycl和99AM-BSycl质粒及苯酚测定
1、重组菌株GD-51-ECycl和GD-51-BSycl的构建
选择一株辅酶Q10生产菌株GD-51(戴冠苹,苗良田,孙涛,等.代谢工程改造大肠杆菌生产辅酶Q10[J].生物工程学报,2015,31(2):206-219.；公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得)作为宿主菌，分别将重组载体99AM-ECycl和99AM-BSycl电转化到菌株GD-51中，得到重组菌株GD-51-ECycl和GD-51-BSycl，具体步骤如下(以GD-51-ECycl为例)：
将50ul大肠杆菌GD-51电转化感受态细胞置于冰上，加入1ul质粒99AM-ECycl(约50ng/ul)，冰上放置2分钟，转移至0.2cm的Bio-Rad电击杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1ml LB培养基转移至电击杯中，吹打5次后转移至试管中，75rpm，30℃孵育2小时。取50ul菌液涂在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃孵育过夜培养后，挑选5个阳性单菌落，将阳性单菌落进行液体培养，提取阳性单菌落的质粒进行SacI和XmaI双酶切，得到3743bp和2283bp的两条带的为阳性质粒，将含有阳性质粒重组菌命名为GD-51-ECycl。
按照同样的方法构建重组菌株GD-51-BSycl。
将表达质粒载体pTrc99A-M电转入GD-51的感受态细胞中，得到菌株GD-51-99AM，作为对照菌株。
2、重组菌株苯酚产量的测定
按照上述苯酚测定方法，以GD-51-99AM作为对照菌株，将菌株GD-51-ECycl和GD-51-BSycl发酵，每株菌做3个平行，然后测定苯酚产量。
结果如图3所示(其中空白柱代表OD600，阴影柱代表苯酚产量，下同)。发酵24h后，每株菌的OD600都在4.0左右，细胞干重约为1.29g/L；菌株GD-51-ECycl的细胞干重略高于菌株GD-51-BSycl。对照菌株GD-51-99AM不产苯酚，GD-51转入99AM-ECycl和99AM-BSycl后均能生产苯酚。就苯酚产量而言，菌株GD-51-ECycl的产量也均要略高于菌株GD-51-BSycl。所以，选择来源于E.coli W中的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因进一步进行研究，即选用重组载体99AM-ECycl进行下面研究。
(二)、表达aroGfbr的重组载体
一、克隆编码DAHP合酶基因
1、克隆aroG基因
将来源于大肠杆菌E.coli ATCC 8739(Gunsalus IC,Hand DB.The use of bacteria inthe chemical determination of total vitamin C.J Biol Chem.1941,141:853-858.公众可从中国科学院天津工业生物技术研究所获得)，编码DAHP合酶的aroG基因克隆到表达载体pACYC184-M上，得到重组质粒184M-aroG。具体步骤如下：
(1)aroG基因的PCR扩增
引物如下：
aroG-PstI-F：5’-GCATCTGCAGAAGGAGATATACCATGAATTATCAGAACGACGATTTAC-3’
aroG-HindIII-R：5’-GCATAAGCTTCATCGGATACGCCACTCTGA-3’
上述引物的下划线部分分别为PstI和HindIII的酶切位点。
以aroG-PstI-F/aroG-HindIII-R为引物，以E.coli ATCC 8739的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。得到大小为1053bp的PCR产物，即为aroG基因(序列3)。
(2)重组载体184M-aroG的构建
将得到的DNA片段用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行清洁、回收。然后将回收的片段和质粒载体pACYC184-M分别用限制性内切酶PstI和HindIII进行双酶切。再将酶切后1053bp PCR产物和酶切后4174bp的质粒载体骨架用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行清洁、回收。最后将回收得到的片段和质粒载体用NEB快连酶进行连接，得到重组载体。pTrc99C-F/pTrc99C-R引物验证并将验证正确的重组载体送去测序，测序引物为：pTrc99C-F/pTrc99C-R。
测序结果表明该重组载体为将DNA片段aroG(序列3)插入到pACYC184-M的PstI和HindIII酶切位点处，命名为184M-aroG。
2、克隆aroGfbr基因
将aroG基因定点突变(aroG基因ATG下游第436位碱基由G突变为A)，来解除DAHP合酶的反馈抑制，得到aroGfbr基因(序列4)。然后将aroGf br基因克隆到表达载体pACYC184-M上，得到重组载体184M-aroGfbr。具体步骤如下：
(1)含pACYC184-M载体和aroGfbr基因的DNA片段的扩增
引物如下：
aroG-1-Δ436：5’-GGGTGATCATATTGAGAAACTCACC-3’
aroG-2：5’-CACAATATCTCGCTGACCTGATGAG-3’
以aroG-1-Δ436/aroG-2为引物，以质粒184M-aroG为模板，进行PCR扩增。得到大小为5284bp的PCR产物，即含有pACYC184-M载体和aroGfbr基因的DNA片段。
(2)重组载体184M-aroGfbr的构建
将PCR得到的含有pACYC184-M载体和aroGfbr基因的DNA片段用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行清洁、回收。然后将回收的片段用DpnI(购自NEB公司)酶处理，消除原始的质粒模板184M-aroG。
将DpnI处理后的DNA片段用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行清洁、回收，在回收得到的片段中加入1μL T4多聚核苷酸激酶Buffer和0.5μL T4多聚核苷酸激酶(购自NEB公司)进行磷酸化处理，来提供连接酶连接的磷酸末端。最后，将磷酸化的片段用T4DNA连接酶进行连接，得到重组载体。将重组载体送去测序，测序引物为：pTrc99C-F/pTrc99C-R。
测序结果表明，该重组载体为将序列表中序列4所示的aroGfbr基因插入pACYC184-M载体的PstI和HindIII酶切位点处，命名为184M-aroGfbr，该重组载体也为将184M-aroG载体中的aroG基因的ATG下游第436位碱基由G突变为A，其他序列保持不变，得到的重组载体。
(三)、表达分支酸-丙酮酸裂解酶ubiC基因的重组载体
将来源于大肠杆菌E.coli ATCC 8739，编码分支酸-丙酮酸裂解酶的ubiC基因克隆到表达载体pACYC184-M上，得到重组质粒184M-ubiC。具体步骤如下：
1、ubiC基因的PCR扩增
引物如下：
ubiC-KpnI-F：5’-GCATGGTACCAAGGAGATATACCATGTCACACCCCGCGTTA-3’
ubiC-PstI-R：5’-GCATCTGCAGTTAGTACAACGGTGACGCCG-3’
上述引物的下划线部分分别为KpnI和PstI酶切位点。
以ubiC-KpnI-F/ubiC-PstI-R为引物，以E.coli ATCC 8739的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。得到大小为498bp的PCR产物，即为ubiC基因(序列5)。
2、重组载体184M-ubiC的构建
将得到的DNA片段用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行清洁、回收。然后将回收的片段和质粒载体pACYC184-M分别用限制性内切酶KpnI和PstI进行双酶切。再将酶切后的质粒和DNA片段用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行清洁、回收。最后将回收得到的片段和质粒载体用NEB快连酶进行连接，得到重组载体。将重组载体送去测序，测序引物为：pTrc99C-F/pTrc99C-R。
测序结果表明该重组载体为将DNA片段ubiC(序列5)插入到pACYC184-M的KpnI和PstI酶切位点处，命名为184M-ubiC。
(四)、重组菌株8739-ycl、8739-ycl-aroGfbr和8739-ycl-ubiC的构建及其苯酚产量的测定
1、重组菌株8739-ycl、8739-ycl-aroGfbr和8739-ycl-ubiC的构建
将质粒99AM-ECycl电转化到大肠杆菌野生型ATCC 8739的感受态细胞中，得到重组菌株8739-ycl；
将质粒99AM-ECycl和质粒184M-aroGfbr电转化到大肠杆菌野生型ATCC 8739的感受态细胞中，得到重组菌株8739-ycl-aroGfbr；
将质粒99AM-ECycl和质粒184M-ubiC电转化到大肠杆菌野生型ATCC 8739的感受态细胞中，得到重组菌株8739-ycl-ubiC。
将表达载体pTrc99A-M和pACYC184-M电转化到野生型大肠杆菌ATCC 8739的感受态细胞中，得到重组菌株8739-99AM-184M，作为对照菌株。
2、重组菌株苯酚产量的测定
按照上述苯酚测定方法，以8739-99AM-184M菌株作为对照，将菌株8739-ycl、8739-ycl-aroGfbr和8739-ycl-ubiC发酵，每株菌做3个平行，然后测定苯酚产量。
结果如图4(其中空白柱代表OD600，阴影柱代表苯酚产量，下同)所示。野生型大肠杆菌ATCC 8739并不能生产苯酚；表达来源于E.coli W中的对羟基苯甲酸脱羧酶之后就可以生产苯酚，转化得到的菌株8739-ycl的苯酚产量为0.30mg/L；质粒过表达了定点突变的DAHP合酶后，得到的重组菌株8739-ycl-aroGfbr的苯酚产量提高了5.83倍，达到2.05mg/L。质粒过表达了UbiC后，得到的重组菌株8739-ycl-ubiC的苯酚产量提高了68.20倍，产量达到了20.76mg/L。
实施例2、基因组水平表达4-羟基苯甲酸脱羧酶基因(ECyclBCD)、DAHP合酶突变基因和/或分支酸-丙酮酸裂解酶基因的重组菌构建
本实施例中的ycl操纵子均为来源于大肠杆菌的4-羟基苯甲酸脱羧酶基因簇(序列1)。
(一)ycl操纵子整合到大肠杆菌ATCC 8739的染色体上得到的重组菌Phe002及其苯酚产量的测定
一、组成型质粒pACYC184M-P12的构建
1、FRT-Km-FRT::M1-12DNA片段的PCR扩增。
引物如下：
FRT-SpeI：5’-GCATACTAGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
AP2-down-PmeI-SacI：5’-GCATGAGCTCAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC-3’
上述引物的下划线的部分分别为SpeI、SacI和PmeI酶切位点。
以FRT-SpeI/AP2-down-PmeI-SacI为引物，以M1-12菌株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。得到大小为1573bp的PCR产物，为含有FRT-Km-FRT(序列6)和人工调控元件M1-12的DNA片段(序列7)。
2、重组载体pACYC184M-P12的构建
将得到的含有FRT-Km-FRT和人工调控元件M1-12的DNA片段用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行清洁、回收。然后将回收的片段和分别用限制性内切酶SpeI和SacI进行双酶切。再将酶切后1573bp PCR产物与酶切后2700bp的质粒载体pACYC184-M骨架用NEB快连酶进行连接，得到重组载体。将重组载体pACYC184M-P12用SpeI和SacI进行进行酶切验证，得约2700bp和1550bp条带。酶切验证结果表明将含有FRT-Km-FRT和人工调控元件M1-12的DNA片段插入到pACYC184-M的SpeI和SacI酶切位点，所得重组质粒命名为pACYC184M-P12。
二、质粒184M-P12-ycl的构建
将质粒载体pACYC184M-P12和质粒99AM-Ecycl分别用限制性内切酶SacI和XmaI进行双酶切，将酶切后得到酶切后的载体(4246bp)和ycl操纵子(2268bp)分别用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行清洁、回收。然后将回收得到的片段和载体用NEB快连酶进行连接。
将连接产物化学转化到感受态细胞Trans1-T1中，并在含有硫酸卡那霉素和氯霉素的LB平板上过夜培养。挑选8个在含有Km+Cm的LB平板上生长的阳性克隆，用引物kan-F/ycl-340-R进行PCR验证。引物如下：
kan-F：5’-CCGTGATATTGCTGAAGAG-3’
ycl-340-R：5’-CTTCTTTGAGCACGACGTC-3’
PCR产物为约850bp的条带为正确重组子，将PCR验证正确的克隆提取质粒，用SacI和XmaI进行进行酶切验证。酶切后电泳得2270np和4300bp条带，表明将来源于大肠杆菌的ycl操纵子(ECyclBCD，序列1)插入到pACYC184M-P12的SacI和XmaI酶切位点处，该重组质粒命名为184M-P12-ycl。
三、一步同源重组法在ldhA位点整合ycl操纵子
1、整合片段的PCR扩增
引物如下：
ldhA-up-FRT：5’-ATTAAATTTGAAATTTTGTAAAATATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
ldhA-down-rrnB：5’-AATAGAGGATGAAAGGTCATTGGGGATTATCTGAATCAGCTCCCCTGGAATGCAGGGGAGAAAAGGCCATCCGTCAGGAT-3’
上述引物的下划线部分分别为与ldhA基因上下游同源的序列。
以ldhA-up-FRT/ldhA-down-rrnB为引物，以质粒184M-P12-ycl为模板，进行PCR扩增。得到大小为3728bp的PCR产物(一步同源重组片段)，为含有与乳酸脱氢酶基因ldhA上游同源的50bp序列、FRT-Km-FRT片段、编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因(ycl操纵子)及其人工调控元件M1-12和与ldhA基因下游同源的60bp序列的DNA片段。将得到的PCR产物用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行清洁、回收。并用DpnI酶处理，再清洁、回收，用于一步法整合。
2、质粒pKD46的电转化
将质粒pKD46电转化到野生型大肠杆菌ATCC 8739的感受态细胞中，取50μL转化的菌液，涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，30℃过夜培养。
3、ycl操纵子的一步法整合
将1中准备的一步同源重组片段(含有与乳酸脱氢酶基因ldhA上游同源的50bp序列、FRT-Km-FRT片段、编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因(ycl操纵子)及其人工调控元件M1-12和与ldhA基因下游同源的60bp序列的DNA片段)电转化到含有pKD46的ATCC 8739的感受态细胞中，取500μL转化的菌液，涂布在含硫酸卡那霉素的LB平板上过夜培养。挑选8个在含有Km的LB平板上生长的阳性克隆，用引物ldhA-up/ycl-340-R进行PCR验证。其中上游引物为：
ldhA-up：5’-GATAACGGAGATCGGGAATG-3’
PCR得到大小为2165bp的条带，说明整合成功。
选2株整合成功的菌株送去测序，测序引物为kan-F/ycl-340-R。将测序正确的菌株命名为Phe001，其将含有与乳酸脱氢酶基因ldhA上游同源的50bp序列、FRT-Km-FRT片段、编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因(ycl操纵子)及其人工调控元件M1-12和与ldhA基因下游同源的60bp序列的DNA片段同源重组到大肠杆菌ATCC 8739中得到的重组菌。
4、Phe001菌株中Km-FRT序列的消除
1)、质粒pFT-A的电转化
将质粒pFT-A电转化到Phe001菌株的感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上，30℃过夜培养。
2)、Km-FRT序列的消除
挑取转入质粒pFT-A的Phe001菌株的单克隆，接种到含有10mL LB液体培养基(终浓度50μg/mL的Amp)的250mL三角瓶中，30℃，200rpm培养至OD≈0.1；加入50μL的氯四环素(chlorotetracyclin，5mg/mL，200×的母液)，继续生长6h；在LB平板上划线，39℃培养过夜。
然后挑取单克隆同时在LB，LB(Amp)，LB(Km)平板中划线培养，选取在LB上生长，在LB(Amp)和LB(Km)中不生长的克隆，进行PCR验证。验证引物为：ldhA-up/ycl-340-R。
PCR得到大小为807bp的条带，说明验证成功。将验证成功的菌株命名为Phe002，其为将来源于大肠杆菌的ycl操纵子(ECyclBCD)和其人工调控元件M1-12整合到大肠杆菌ATCC8739的ldhA位点。
四、重组大肠杆菌Phe002苯酚产量的测定
按照上述苯酚测定方法，以野生型大肠杆菌菌株ATCC 8739作为对照，将菌株Phe002发酵，然后测定苯酚产量。
结果如图5(其中空白柱代表OD600，阴影柱代表苯酚产量，下同)所示。野生型大肠杆菌菌株ATCC 8739不能生产苯酚，Phe002菌株的OD600为6.22，苯酚产量为1.73mg/L。
(二)、表达ycl操纵子和aroGfbr基因得到的重组菌Phe004及其苯酚产量的测定
一、质粒184M-P12-aroGfbr的构建
将质粒184M-aroGfbr和质粒载体pACYC184M-P12分别用限制性内切酶KpnI和HindIII进行双酶切。将切下来的aroGfbr基因片段(1053bp)和质粒载体(4217bp)骨架分别用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行清洁、回收。然后将回收得到的片段和载体用NEB快连酶进行连接，得到重组质粒。挑选阳性克隆用引物kan-F/aroG-552-R进行PCR验证。其中下游引物为：
aroG-552-R：5’-CGTCGGTGCCATTTTTGAAG-3’
将验证正确的克隆用KpnI和HindIII进行进行酶切验证。酶切验证结果表明该重组载体为将aroGfbr基因DNA片段(序列4)插入到pACYC184M-P12的KpnI和HindIII酶切位点处，命名为184M-P12-aroGfbr。
二、一步法整合aroGfbr基因
1、整合片段的PCR扩增
引物如下：
aroG-FRT-up：5’-ACAAACAAAGGAGTTACAGTTAGAAATTGTAGGAGAGATCTCGTTTTTCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
上述引物下划线部分为与aroG基因上游同源的50bp序列。
以aroG-FRT-up/aroG-552-R为引物，以质粒184M-P12-aroGfbr为模板，进行PCR扩增。得到大小为2555bp的PCR产物(一步同源重组片段)，为含有与aroG基因上游同源50bp、下游同源的100bp序列、FRT-Km-FRT片段、人工调控元件M1-12和aroGfbr基因的前552bp片段。将得到的PCR产物用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行清洁、回收。并用DpnI酶处理，再清洁、回收，用于一步法整合。
2、质粒pKD46的电转化
将质粒pKD46电转化到菌株Phe002的感受态细胞中，取50μL转化的菌液，涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，30℃过夜培养。
3、aroGfbr基因的一步法整合
将1中准备的一步同源重组片段电转化到含有pKD46的Phe002菌株的感受态细胞中，取500μL转化的菌液，涂布在硫酸卡那霉素的LB平板上过夜培养。挑选8个在含有Km的LB平板上生长的阳性克隆，用引物aroG-252-F/aroG-552-R进行PCR验证。其中上游引物为：
aroG-256-F：5’-CATTGGTTTAAGATTTCAGCCAGG-3’
PCR得到大小为2249bp的条带，说明整合成功。
选2株整合成功的菌株送去测序，测序引物为kan-F/aroG-552-R，将测序正确的菌株命名为Phe003，为将aroGfbr基因替换Phe002菌株基因组中的aroG基因，且将人工调控元件M1-12替换Phe002菌株基因组中的aroG基因的原始调控元件。
三、两步同源重组法调控aroGfbr基因
1、两步同源重组所需片段I和片段II的PCR扩增
扩增片段I引物如下：
aroG-cat-up：5’-ACAAACAAAGGAGTTACAGTTAGAAATTGTAGGAGAGATCTCGTTTTTCGTGTGACGGAAGATCACTTCGCA-3’
aroG-cat-down：5’-GGAAGTAACTCTTTGATTTCTTTGATGCGTAAATCGTCGTTCTGATAATTCATTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCTTG-3’
上述引物下划线部分分别为与aroG基因上下游同源的序列。
以aroG-cat-up/aroG-cat-down为引物，以质粒pXZ-CS为模板，进行PCR扩增。得到大小为2530bp的PCR产物，为含有与aroG基因上游同源的50bp序列、catsacB基因簇(序列8)和与aroG基因ATG下游同源的50bp序列的DNA片段(片段I)。将得到的PCR产物用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行清洁、回收。并用DpnI酶处理，再清洁、回收，用于第一步同源重组。
扩增片段II引物如下：
aroG-p-up：5’-ACAAACAAAGGAGTTACAGTTAGAAATTGTAGGAGAGATCTCGTTTTTCGTTATCTCTGGCGGTGTTGAC-3’
aroG-RBS-down：5’-GGAAGTAACTCTTTGATTTCTTTGATGCGTAAATCGTCGTTCTGATAATTCATAGCTGTTTCCTGGTT-3’
上述引物下划线部分分别为与aroG基因上下游同源的序列。
以aroG-p-up/aroG-RBS-down为引物，以M1-46菌株的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。得到大小为203bp扩增产物，为含有与aroG基因上游同源的50bp序列、人工调控元件M1-46(序列9)和与aroG基因ATG下游同源的50bp序列的DNA片段(片段II)。将得到的PCR产物用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行清洁、回收，用于第二步同源重组。
2、第一步同源重组
将上述1得到的片段I电转化到含有pKD46的Phe003菌株的感受态细胞中。取500μL转化的菌液，涂布在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养。挑选阳性克隆分别在含有氯霉素氨苄的LB平板和含有卡那霉素的LB平板上筛选。得到在含有卡那霉素的LB平板上不长，在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上长的克隆，使用引物cat-up/aroG-552-R进行PCR验证。其中上游引物为：
cat-up：5’-ATGAAACCGCTGATTGCATCTA-3’
PCR得到大小为993bp的条带，说明重组菌株的aroG基因ATG前已经成功插入catsacB基因，可以用于第二步同源重组，命名为Phe003-aroG-catsacB。
3、第二步同源重组
将上述1得到的片段II电转化到含有pKD46的中间菌株Phe003-aroG-catsacB的感受态细胞中。将转化菌液转入50mL无盐LB+10％蔗糖培养基中，37℃、250rpm震荡培养24h。然后在无盐LB+6％蔗糖平板上划线，41℃过夜培养，去除pKD46质粒。挑去单克隆分别在含有氯霉素的LB平板和不含抗生素的LB平板上筛选，得到在含氯霉素的LB平板上不长的克隆。将不含抗生素抗性的克隆用引物p-up/aroG-552-R进行PCR验证。其中上游引物为：
p-up：5’-TTATCTCTGGCGGTGTTGAC-3’
PCR得到大小为908bp的条带，说明重组菌株的aroG基因ATG前的catsacB基因已成功替换为M1-46人工调控元件。选2株重组成功的菌株送去测序，测序引物为aroG-256-F/aroG-552-R，将测序正确的菌株命名为Phe004，其为将aroGfbr基因替换Phe002菌株基因组中的aroG基因，且将人工调控元件M1-46替换Phe002菌株基因组中的aroG基因的原始调控元件。
四、重组大肠杆菌Phe004苯酚产量的测定
按照上述的苯酚测定方法，以Phe002菌株作为对照，将菌株Phe004发酵，然后测定苯酚产量。
结果如图5所示。Phe004菌株的OD600为4.30，苯酚产量为9.13mg/L，相对于Phe002，苯酚产量提高了4.28倍。
(三)、表达ycl操纵子、aroGfbr基因和ubiC基因得到的重组菌Phe005、Phe006或Phe007及其苯酚产量的测定
一、质粒184M-P12-ubiC的构建
将质粒184M-ubiC和质粒载体pACYC184M-P12分别用限制性内切酶KpnI和HindIII进行双酶切。将切下来的ubiC基因片段(498bp)和质粒载体骨架(4217bp)用NEB快连酶进行连接，得到重组质粒。挑选阳性克隆用引物kan-F/ubiC-365-R进行PCR验证。其中下游引物为：
ubiC-365-R：5’-GATGTGAACAGATAGCGTCC-3’
将验证正确的克隆用KpnI和HindIII进行进行酶切验证。酶切验证结果表明该重组载体为将ubiC基因(序列5)插入到pACYC184M-P12的KpnI和HindIII酶切位点处，命名为184M-P12-ubiC。
二、一步法在pflB位点整合ubiC基因
1、整合片段的PCR扩增
引物如下：
pflB-up-FRT：5’-AAACGACCACCATTAATGGTTGTCGAAGTACGCAGTAAATAAAAAATCCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
pflB-down-rrnB：5’-GGTTAGCACCCGGTCCGAACGGCGCGCCAGCACGACGACCGTCTGGGGTGTTACCCGTTTAGAAACGCAAAAAGGCCATCCGTC-3’
上述引物下划线部分分别为与pflB基因上下游同源的序列。
以pflB-up-FRT/pflB-down-rrnB为引物，以质粒184M-P12-ubiC为模板，进行PCR扩增。得到大小为2232bp的PCR产物(一步同源重组片段)，为含有与pflB基因上游同源的50bp序列、FRT-Km-FRT片段、ubiC基因及其人工调控元件M1-12和与pflB基因下游同源的60bp序列的DNA片段。将得到的PCR产物用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行清洁、回收。并用DpnI酶处理，再清洁、回收，用于一步法整合。
2、质粒pKD46的电转化
将质粒pKD46电转化到菌株Phe004的感受态细胞中，取50μL转化的菌液，涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上，30℃过夜培养。
3、ubiC基因的一步法整合
将1中准备的一步同源重组片段电转化到含有pKD46的Phe004菌株的感受态细胞中，取500μL转化的菌液，涂布在硫酸卡那霉素的LB平板上过夜培养。挑选8个在含有Km的LB平板上生长的阳性克隆，用引物pflB-232-F/ubiC-365-R进行PCR验证。其中上游引物为：
pflB-232-F：5’-ATTGTAATCCGCGACTTCGC-3’
PCR得到大小为2042bp的条带，说明整合成功。
选2株整合成功的菌株送去测序，测序引物为kan-F/ubiC-365-R，将测序正确的菌株命名为Phe005，其为将ubiC基因及其调控元件M1-12整合到Phe004的pflB位点。
三、重组大肠杆菌Phe005苯酚产量的测定
按照上述苯酚测定方法，以Phe004菌株作为对照，将菌株Phe005发酵，然后测定苯酚产量。
结果如图5所示。Phe005菌株的OD600为5.48，苯酚产量为65.92mg/L，相对于Phe004，苯酚产量提高了6.22倍。
四、两步法调控p-ubiC基因
1、两步同源重组所需片段I和片段II的PCR扩增
扩增片段I引物如下：
pflB-cat-up：5’-AAACGACCACCATTAATGGTTGTCGAAGTACGCAGTAAATAAAAAATCCATGTGACGGAAGATCACTTCGCA-3’
ubiC-cat-down：5’-TCTTTACAATAGCGCAGCGCACGCAGTTGCGTTAACGCGGGGTGTGACATTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCT-3’
上述引物下划线部分分别为与pflB基因上游、ubiC基因下游同源的序列。
以pflB-cat-up/ubiC-cat-down为引物，以质粒pXZ-CS为模板，进行PCR扩增。得到大小为2505bp的片段I，为含有与pflB基因上游同源的50bp序列、catsacB基因簇DNA片段和与ubiC基因ATG下游同源的50bp序列DNA片段。将得到的PCR产物用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行清洁、回收。并用DpnI酶处理，再清洁、回收，用于第一步同源重组。
扩增片段II引物如下：
pflB-p-up：5’-AAACGACCACCATTAATGGTTGTCGAAGTACGCAGTAAATAAAAAATCCATTATCTCTGGCGGTGTTGAC-3’
ubiC-RBS-down：5’-TCTTTAAAATAGCGCAGCGCACGCAGTTGCGTTAACGCGGGGTGTGACATAGCTGTTTCCTGGTT-3’
上述引物下划线部分分别为与pflB基因上游、ubiC基因下游同源的序列。
以pflB-p-up/ubiC-RBS-down为引物，分别以菌株M1-46和M1-93的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。分别得到大小均为215bp的两种片段II，
一种片段II为含有与pflB基因上游同源的50bp序列、人工调控元件M1-46和与ubiC基因ATG下游同源的50bp序列DNA片段；
另一种片段II为含有与pflB基因上游同源的50bp序列、人工调控元件M1-93(序列10)和与ubiC基因ATG下游同源的50bp序列的DNA片段。
将得到的PCR产物用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行清洁、回收，用于第二步同源重组。
2、第一步同源重组
将上述1得到的片段I电转化到含有pKD46的Phe005菌株的感受态细胞中。取500μL转化的菌液，涂布在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养。挑选阳性克隆分别在含有氯霉素氨苄的LB平板和含有卡那霉素的LB平板上筛选。得到在含有卡那霉素的LB平板上不长，在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上长的克隆，使用引物cat-up/ubiC-365-R进行PCR验证。
PCR得到大小为806bp的条带，说明重组菌株的p-ubiC基因ATG前已经成功插入catsacB基因，可以用于第二步同源重组，命名为Phe005-ubiC-catsacB。
3、第二步同源重组
将上述2种片段II分别电转化到含有pKD46的中间菌株Phe005-ubiC-catsacB的感受态细胞中。将转化菌液转入50mL无盐LB+10％蔗糖培养基中，37℃、250rpm震荡培养24h。然后在无盐LB+6％蔗糖平板上划线，41℃过夜培养，去除pKD46质粒。挑去单克隆分别在含有氯霉素的LB平板和不含抗生素的LB平板上筛选，得到在含氯霉素的LB平板上不长的克隆。将不含抗生素抗性的克隆用引物pflB-232-F/ubiC-365-R进行PCR验证。
PCR得到大小为697bp的条带，说明重组菌株的p-ubiC基因ATG前的catsacB基因已成功替换为M1-46或M1-93人工调控元件。分别选2株重组成功的菌株送去测序，测序引物为pflB-232-F/ubiC-365-R。
将测序正确的且转化了M1-46的命名为Phe006，其为将Phe005中的ubiC基因调控元件M1-12替换为M1-46，
将测序正确的且转化了M1-93的命名为Phe007，其为将Phe005中的ubiC基因调控元件M1-12替换为M1-93。
五、重组大肠杆菌Phe006和Phe007苯酚产量的测定
按照上述苯酚测定方法，以Phe005菌株作为对照，将菌株Phe006和Phe007发酵，然后测定苯酚产量。
结果如图5所示。Phe006菌株的OD600为6.57，苯酚产量为184.45mg/L，相对于Phe005，苯酚产量提高了1.80倍。Phe007菌株的OD600为6.70，苯酚产量为134.21mg/L，相对于Phe005，苯酚产量提高了1.03倍。
(四)、调控ycl操纵子得到Phe008和Phe009提高苯酚产量
一、两步法调控ycl操纵子
1、两步同源重组所需片段I和片段II的PCR扩增
扩增片段I引物如下：
ldhA-cat-up：5’-ATTAAATTTGAAATTTTGTAAAATATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCATGTGACGGAAGATCACTTCGCA-3’
ycl-cat-down：5’-ACACCAAGAGGCGCACCGGTAGCCCCTGTCATCCCGACGATCAGTTTCATTTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCT-3’
上述下划线部分分别为与ldhA基因上游、ycl操纵子下游同源的序列。
以ldhA-cat-up/ycl-cat-down为引物，以质粒pXZ-CS为模板，进行PCR扩增。得到大小为2853bp的片段I，为含有与ldhA基因上游同源的50bp序列、catsacB基因簇DNA片段和与ycl操纵子ATG下游同源的50bp序列DNA片段。将得到的PCR产物用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行清洁、回收。并用DpnI酶处理，再清洁、回收，用于第一步同源重组。
扩增片段II引物如下：
ldhA-p-up：5’-ATTAAATTTGAAATTTTGTAAAATATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCATTATCTCTGGCGGTGTTGAC-3’
ycl-RBS-down：5’-ACACCAAGAGGCGCACCGGTAGCCCCTGTCATCCCGACGATCAGTTTCATAGCTGTTTCCTGGTT-3’
上述下划线部分分别为与ldhA基因上游、ycl操纵子下游同源的序列。
以ldhA-p-up/ycl-RBS-down为引物，分别以菌株M1-46和M1-93的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。得到大小均为200bp的2种片段II，
一种片段II为含有与ldhA基因上游同源的50bp序列、人工调控元件M1-46和与ycl操纵子ATG下游同源的50bp序列的DNA片段；
另一种片段II为含有与ldhA基因上游同源的50bp序列、人工调控元件M1-93和与ycl操纵子ATG下游同源的50bp序列的DNA片段。
将得到的PCR产物用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒进行清洁、回收，用于第二步同源重组。
2、第一步同源重组
将上述1得到的片段I电转化到含有pKD46的Phe006菌株的感受态细胞中。取500μL转化的菌液，涂布在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，30℃过夜培养。挑选阳性克隆分别在含有氯霉素氨苄的LB平板和含有卡那霉素的LB平板上筛选。得到在含有卡那霉素的LB平板上不长，在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上长的克隆，使用引物cat-up/ycl-340-R进行PCR验证。
PCR得到大小为781bp的条带，说明重组菌株的ycl操纵子ATG前已经成功插入catsacB基因，可以用于第二步同源重组，命名为Phe006-ycl-catsacB。
3、第二步同源重组
将上述1得到的2种片段II分别电转化到含有pKD46的中间菌株Phe006-ycl-catsacB的感受态细胞中。将转化菌液转入50mL无盐LB+10％蔗糖培养基中，37℃、250rpm震荡培养24h。然后在无盐LB+6％蔗糖平板上划线，41℃过夜培养，去除pKD46质粒。挑去单克隆分别在含有氯霉素的LB平板和不含抗生素的LB平板上筛选，得到在含氯霉素的LB平板上不长的克隆。将不含抗生素抗性的克隆用引物ldhA-up/ycl-340-R进行PCR验证。
PCR得到大小为795bp的条带，说明重组菌株的ycl操纵子ATG前的catsacB基因已成功替换为M1-46或M1-93人工调控元件。
分别选2株重组成功的菌株送去测序，测序引物为ldhA-up/ycl-340-R，将测序正确的、将转化了M1-46的命名为Phe008，其为将Phe006中的ycl操纵子(ECyclBCD)的调控元件M1-12替换为M1-46，
转化了M1-93启动子的命名为Phe009，其为将Phe006中的ycl操纵子(ECyclBCD)的调控元件M1-12替换为M1-93。
重组菌Phe009为将来源于大肠杆菌的ycl操纵子(ECyclBCD)和其人工调控元件M1-93整合到大肠杆菌ATCC 8739基因组的ldhA位点，且将aroGfbr基因及其人工调控元件M1-46替换大肠杆菌ATCC 8739基因组aroG基因及其原始调控元件，且将ubiC基因及其人工调控元件M1-46到大肠杆菌ATCC 8739基因组的pflB位点；得到的重组菌。
将重组菌Phe009鉴定为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，该菌株已于2015年1月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.10390。
二、重组大肠杆菌Phe008和Phe009苯酚产量的测定
按照上述苯酚测定方法，以Phe006菌株作为对照，将菌株Phe008和Phe009发酵，然后测定苯酚产量。
结果如图5所示。Phe008菌株的OD600为6.43，苯酚产量为207.50mg/L，相对于Phe006，苯酚产量提高了12.5％。Phe009菌株的OD600为5.99，苯酚产量为249.85mg/L，相对于Phe006，苯酚产量提高了35.52％。
实施例3、重组大肠杆菌Phe009的双相高细胞密度发酵
将苯酚产量最高的上述实施例2制备的重组大肠杆菌Phe009在7L发酵罐(Labfors 4；Infors Biotechnology Co.Ltd.)中进行高密度发酵。方法如下：
一、种子液的制备
挑取大肠杆菌Phe009单菌落接种到含4mL M9无机盐培养基的试管中，37℃，250rpm过夜培养；然后按照2％的接种量，将试管中的菌液转接到含300mL M9培养基的1L三角瓶中；37℃，250rpm培养24h，得到高密度发酵的种子液。
二、接种及发酵过程控制
在7L发酵罐中装2.5L发酵培养基，300mL种子液，采用合成培养基对其进行高密度发酵。
发酵培养基：由葡萄糖、柠檬酸、KH2PO4·3H2O、(NH4)2HPO4、MgSO4·7H2O、微量元素溶液和水组成；各组分的含量如下：10g/L葡萄糖、1.7g/L柠檬酸、10.5g/L KH2PO4·3H2O、6g/L(NH4)2HPO4、3.44g/L MgSO4·7H2O、10ml/L微量元素溶液,余量为水。
微量元素溶液：由FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·4H2O、Na2B4O7·10H2O、CaC12、(NH4)6Mo7O24和水组成；各组分的含量如下：10g/L FeSO4·7H2O、5.25g/L ZnSO4·7H2O、3.0g/L CuSO4·5H2O、0.5g/L MnSO4·4H2O、0.23g/L Na2B4O7·10H2O、2.0g/L CaC12、0.1g/L(NH4)6Mo7O24，余量为水。
经火焰接种环，将300mL种子液全部接种到含2.5L高密度发酵培养基的7L发酵罐中，初始OD600＝0.4；发酵过程中温度控制在37℃，使用5M氨水将pH控制在7.0；溶氧设定为30％，发酵起始阶段空气流量设定4L/min，搅拌转速设定为300rpm；为了使发酵过程中溶氧一直控制在30％，将溶氧与搅拌转速、通气相偶联，转速保持在300-1200rpm，空气流量保持在4-9L/min；在初始碳源消耗完全(溶氧开始反弹)时开始补料。
补料培养基：由葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、MgSO4·7H2O组成；各组分的含量如下：500g/L葡萄糖、15g/L蛋白胨、30g/L酵母提取物、30g/L MgSO4·7H2O，余量为水。
发酵过程中采用模拟指数流加补料方式进行补料，整个发酵过程控制甘油浓度保持在0.5g/L以下，乙酸的产量维持在0.2g/L以下；发酵过程中平均补料速度是20mL/h；发酵过程中泡沫产生较多时，手动添加消泡剂ANTIFOAM 204来消除泡沫。
发酵过程中当细胞生长首次受到抑制(OD≈20)时，添加500mL三丁酸甘油酯；随着发酵过程的继续，当细胞再次受到抑制(OD≈60)时，继续添加500mL三丁酸甘油酯。发酵过程中定时取样、分别检测细胞量和苯酚产量，方法详见前面所示。
发酵结果如图6所示，发酵的周期是80h，发酵第11h开始补料；发酵第17h细胞生长开始受到抑制，泵入500mL三丁酸甘油酯；发酵第35h，细胞生长再次受到抑制，继续泵入500mL三丁酸甘油酯；发酵48h后细胞进入稳定期，发酵71h时，OD600达到了最大，OD600＝89.8；发酵80h时，水相苯酚产量达到最大，最大产量为1012.1mg/L。发酵结束后，发酵液出现乳化现象，水相和三丁酸甘油酯相成为均一的一相。取混合相，用三丁酸甘油酯稀释、萃取，然后测苯酚产量。测得混合相的苯酚产量为7.6g/L。由于细胞只在水相生长，发酵过程中实际的苯酚产量按公式：苯酚产量＝C混合相(V水相+V有机相)/V水相计算。发酵初始体积为2.8L(2.5L培养基+0.3L种子)，补料1.2L，加入1L三丁酸甘油酯，所以本次发酵的实际苯酚产量为7.6×(2.8+1.2+1)/(2.8+1.2)＝9.5g/L。转化率为0.061g/g(苯酚/葡萄糖)。

Claims (10)

1.重组菌为如下重组菌1-1或重组菌1-2：
所述重组菌1-1为在目的大肠杆菌中表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因及其人工调控元件M1-12得到的重组菌；
所述重组菌1-2为在目的大肠杆菌中表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因得到的重组菌；
所述4-羟基苯甲酸脱羧酶由亚基A、亚基B和亚基C组成；
所述亚基A的氨基酸序列为序列表中序列11；
所述亚基B的氨基酸序列为序列表中序列12；
所述亚基C的氨基酸序列为序列表中序列13；
所述人工调控元件M1-12的核苷酸序列为序列表中序列7。
2.根据权利要求1所述的重组菌1，其特征在于：
所述重组菌1-1按照包括如下步骤的方法制备：将所述编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因及其人工调控元件M1-12整合到所述目的大肠杆菌基因组中，得到重组菌1-1；
所述重组菌1-2按照包括如下步骤的方法制备：将所述编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因通过重组载体导入所述目的大肠杆菌，得到重组菌1-2。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌1，其特征在于：
所述4-羟基苯甲酸脱羧酶来源于大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌；
所述编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因的核苷酸序列为序列表中序列1或序列2。
4.重组菌2，为如下重组菌2-1或重组菌2-2：
所述重组菌2-1为将编码DAHP合酶突变体基因及其人工调控元件M1-46替换权利要求1-3中任一所述的重组菌1-1基因组中的DAHP合酶基因及其调控元件得到的重组菌；
所述重组菌2-2为在目的大肠杆菌中表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因和编码DAHP合酶突变体基因得到的重组菌；
所述人工调控元件M1-12的核苷酸序列为序列表中序列7；
所述人工调控元件M1-46的核苷酸序列为序列表中序列9；
所述编码DAHP合酶突变体基因的核苷酸序列为序列表中序列4。
5.根据权利要求4所述的重组菌2，其特征在于：
所述重组菌2-2按照包括如下步骤的方法制备：将表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因的重组载体和表达编码DAHP合酶突变体基因的重组载体导入所述目的大肠杆菌中，得到重组菌2-2。
6.重组菌3，为在权利要求4或5中的所述重组菌2-1中表达编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因及其人工调控元件得到的重组菌；
所述编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因的核苷酸序列为序列表中序列5；
所述编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因的人工调控元件为M1-12、M1-46或M1-93。
所述人工调控元件M1-12的核苷酸序列为序列表中序列7；
所述人工调控元件M1-46的核苷酸序列为序列表中序列9；
所述人工调控元件M1-93的核苷酸序列为序列表中序列10。
7.根据权利要求6所述的重组菌3，其特征在于：
所述重组菌3为如下重组菌3-1或重组菌3-2：
所述重组菌3-1按照包括如下步骤的方法制备：将所述编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因及其人工调控元件M1-12整合到权利要求4或5中的所述重组菌2-1基因组中，得到重组菌3-1；
所述重组菌3-2按照包括如下步骤的方法制备：所述编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因及其人工调控元件M1-46整合到权利要求4或5中的所述重组菌2-1基因组中，得到重组菌3-2；
所述重组菌3-3按照包括如下步骤的方法制备：所述编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因及其人工调控元件M1-93整合到权利要求4或5中的所述重组菌2-1基因组中，得到重组菌3-3。
8.重组菌4，按照包括如下方法的步骤制备：将人工调控元件M1-93或M1-46替换权利要求6或7所述重组菌3-2中的编码4-羟基苯甲酸脱羧酶的基因的调控元件M1-12，得到的重组菌；
所述人工调控元件M1-46的核苷酸序列为序列表中序列9；
所述人工调控元件M1-93的核苷酸序列为序列表中序列10。
9.根据权利要求8所述的重组菌4，其特征在于：
所述重组菌4为如下重组菌4-1或重组菌4-2：
所述重组菌4-1按照包括如下步骤的方法制备：将所述人工调控元件M1-46替换权利要求6或7所述重组菌3-2中的编码4-羟基苯甲酸脱羧酶的基因的人工调控元件M1-12，得到重组菌4-1；
所述重组菌4-2按照包括如下步骤的方法制备：将人工调控元件M1-93替换权利要求6或7所述重组菌3-2中的编码4-羟基苯甲酸脱羧酶的基因的人工调控元件M1-12，得到重组菌4-2。
10.权利要求9中的重组菌4-2，其保藏号为CGMCC No.10390；
或一种重组菌5，其为在目的大肠杆菌中表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因和编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因得到的重组菌；
所述在目的大肠杆菌中表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因和编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因具体为将表达编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因的重组载体和表达编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因的重组载体导入所述目的大肠杆菌中；
所述编码4-羟基苯甲酸脱羧酶基因的核苷酸序列为序列表中序列1；
所述编码分支酸-丙酮酸裂解酶基因的核苷酸序列为序列表中序列5；
或权利要求1-3中任一所述重组菌1、权利要求4或5所述的重组菌2、权利要求6或7所述的重组菌3或权利要求8或9所述的重组菌4或所述重组菌5在生产苯酚中的应用。
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