CN107312737A - 一种重组大肠杆菌、制备方法及合成3,4‑二羟基丁酸的方法 - Google Patents

一种重组大肠杆菌、制备方法及合成3,4‑二羟基丁酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组大肠杆菌、制备方法及合成3,4‑二羟基丁酸的方法，属于生物合成领域。通过敲除大肠杆菌中的木糖异构酶基因xylA、2‑酮酸醛缩酶基因yjhH、2‑酮酸醛缩酶基因yagE和醇脱氢酶基因，过表达木糖脱氢酶基因和/或2‑酮酸脱羧酶基因，过表达醛脱氢酶基因，得到重组大肠杆菌。以木糖为基础底物，还可以在木糖的基础上添加葡萄糖和/或甘油形成复合底物，通过重组大肠杆菌生物合成3,4‑二羟基丁酸，副产物极少且可通过通路代谢优化阻断副产物的形成。所述制备方法简单，生产周期短，成本较低，且具有后期的继续优化和改造，提示具有很好的工业开发和应用前景。

Description

一种重组大肠杆菌、制备方法及合成3,4-二羟基丁酸的方法
技术领域
本发明涉及一种重组大肠杆菌、制备方法及合成3,4-二羟基丁酸的方法，属于生物合成技术领域。
背景技术
3,4-二羟基丁酸(3,4-dihydroxybutyric acid,3,4-DHBA)，是一种易溶于水、乙醇和乙醚的通用手性化合物，其含有一分子羧基和两分子羟基的分子结构使得它可以经修饰形成许多有用的衍生物，如可用于合成抗生素、α-氨基酸、β-氨基酸和多肽等，或是作为手性合成的基础材料。
3,4-二羟基丁酸可通过简单地皂化反应形成环状的内酯物质3-羟基-γ-丁内酯(3-hydroxy-γ-butyrolactone，3HBL)，3-羟基-γ-丁内酯也是一种非常重要的手性C4化合物，可用来合成各种药物、聚合物和溶剂。例如制备降血脂药物阿托伐他汀、神经介质L-肉毒碱(Larcheveque,1990)、人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus；HIV)蛋白酶抑制剂氨普那韦、饱感剂(2S,4S)-2-羟基-4-羟甲基-4-丁内酯、治疗皮肤病药羟基二十碳四烯酸(12-HETE)和抗癌药aplysistatin(单环金合欢烷类，是一种珊瑚药物)等。将(S)-3-羟基-γ-丁内酯还原可得(S)-3-羟基四氢呋喃，(S)-3-羟基四氢呋喃是治疗艾滋病药物的一种重要中间体；将(S)-3-羟基-γ-丁内酯转化为(S)-5-羟甲基-1,3-唑啉-2-酮，可得最新一代的抗菌药物。此外，由3-羟基-γ-丁内酯经简单的转换而得到的(S)-N-甲基-3-羟基吡咯和(R)-N-甲基-3-甲氮基吡咯也都具有重要的生理活性。由于(S)-3-羟基-γ-丁内酯广泛的用途，其被美国能源部定义为最具价值的化合物之一。但是，现有关于3,4-二羟基丁酸的合成方法报道较少，限制了3,4-二羟基丁酸的大范围推广使用。
现有技术中，有关3,4-二羟基丁酸化学合成的报道主要以对其内酯物质3-羟基-γ-丁内酯的皂化化学合成为主。此外，Hollingsworth等人在美国专利(US 5292939)中称可利用葡萄糖和碱金属氢氧化物作为反应物，在双氧水存在的情况下经70℃加热反应24h也可获得3,4-二羟基丁酸，但该过程产率低，反应时间长，并不存在实际生产的可能性。还有将(R)-3-氯-1,2-丙二醇经氯化和水解直接形成3,4-二羟基丁酸的方法，但是该方法因底物较难获取也不具备实际生产的可行性(美国专利US4994597)。
目前，有关3,4-二羟基丁酸生物合成的研究非常少。有报导关于生物合成3,4-二羟基丁酸的研究有且仅有麻省理工的化学工程系Prather团队，该团队在2013年和2014年分别发表了两篇关于利用代谢系统改造的大肠杆菌以葡萄糖为底物，生物合成3,4-二羟基丁酸的文章，但是，所述利用葡萄糖生物合成3,4-二羟基丁酸的代谢通路的合成能力较低，对底物葡萄糖的转化效率不高，而且该通路会有很多其他代谢物质的生成。
其中，2013年麻省理工的化学工程系Prather团队中的Martin等人在NatureCommunications发表文章，通过利用葡萄糖和一些可提供酰基辅酶A(酰基CoA)的前体物质作为原料，通过从头合成法构建了以3-羟基酸作为平台化合物合成3,4-二羟基丁酸和其他多种平台化合物的方法，利用该方法在生成3,4-二羟基丁酸的同时，还产生了其他代谢产物：3-羟基戊酸(3HV)、3-羟基己酸(3HH)和3-羟基-4-甲基戊酸(3H4MV)，其中3-羟基戊酸作为主要的合成物质，产量可达1.3g/l，成为该方法碳源的主要流向。该文章中，3,4-二羟基丁酸是利用来自埃氏巨球型菌(Megasphaera elsdenii)中具有广泛底物特异性的乙酰辅酶A转移酶(Pct)将一系列短链羧酸类前体物质如丙酸、丁酸、异丁酸或乙醇酸激活以供应酰基辅酶A，之后利用硫解酶基因BktB缩合酰基辅酶A和葡萄糖经代谢产生的乙酰辅酶A，缩合形成3-酮基-辅酶A，之后经还原和硫解两步反应合成的，产量为555±52mg/l(Martin,C.H.et al.A platform pathway for production of 3-hydroxyacids provides abiosynthetic route to 3-hydroxy-g-butyrolactone.Nat.Commun.4:1414doi:10.1038/ncomms2418(2013).)。
2014年，麻省理工的化学工程系Prather团队中的Dhamankar等人继续优化该生物合成方法，通过利用乙酰辅酶A转移酶将辅酶A转移到乙醇酸上，之后经过缩合和立体定向还原可形成4-羟基-3-酮丁基辅酶A，该中间代谢物可经硫解酶基因tesB作用生成3,4-二羟基丁酸，最终合成了0.7g/l的3,4-二羟基丁酸；但是该方法除可合成3,4-二羟基丁酸外，还可合成了其他的代谢产物：(R)-3-羟基丁酸((R)-3HB)、3-羟基-γ-丁内酯(3HBL)、2,3-二羟基丁酸(2,3-DHBA)和乙酸等(Dhamankar H,Tarasova Y,Martin C H,etal.Engineering E.coli for the biosynthesis of 3-hydroxy-γ-butyrolactone(3HBL)and 3,4-dihydroxybutyric(3,4-DHBA)as value-added chemicals from glucoseas a sole carbon source[J].Metabolic engineering,2014,25:72-81.)。
在利用麻省理工的化学工程系Prather团队2013年和2014公开的生物合成方法合成3,4-二羟基丁酸的过程中，有许多不可避免的副产物的形成，这些副产物的形成大量分流了底物葡萄糖的碳源，而且这些副产物是该方法中不可避免的，因为副产物与目标产物3,4-二羟基丁酸合成的关键酶都相同，基于此，想要阻断副产物的形成以提高目标产物的合成不具备现实可行性，而且所述方法也没用进一步的关于提高产量或方法优化的研究。因此，急需研究出一种更好的3,4-二羟基丁酸的生物合成方法以满足实际生产的需要。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的之一是提供一种重组大肠杆菌。
本发明的目的之二是提供一种重组大肠杆菌的制备方法。
本发明的目的之三是提供一种重组大肠杆菌合成3,4-二羟基丁酸的方法。所述方法以木糖为基础底物，还可以在木糖的基础上添加葡萄糖和/或甘油形成复合底物，通过代谢工程改造的重组大肠杆菌生物合成3,4-二羟基丁酸；所述方法中产生的主要竞争副产物D-1,2,4-丁三醇的合成，可通过敲除醇脱氢酶以达到减弱甚至阻断的作用，而其他中间代谢物有可能合成的副产物都可经途径优化以阻断，使得目标产物3,4-二羟基丁酸成为该方法唯一的合成物质。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
一种重组大肠杆菌，所述大肠杆菌由如下方法制得：
敲除大肠杆菌中的木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH、2-酮酸醛缩酶基因yagE和醇脱氢酶基因，过表达木糖脱氢酶基因和/或2-酮酸脱羧酶基因，过表达醛脱氢酶基因，当醛脱氢酶基因为醛脱氢酶基因pduP(L.b)和/或醛脱氢酶基因pduP(K.p)时，还需同时过表达硫解酶基因tesB，得到本发明所述的一种重组大肠杆菌Ⅰ。
所述基因的敲除顺序没有限制，优选采用Red同源重组技术进行基因敲除；过表达的基因顺序也没有限制。
优选大肠杆菌为K12系列；更优选为K12系列中的MG1655。
所述木糖异构酶基因xylA在美国国立生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information,NCBI)中的基因登录号为948141，来源于大肠杆菌，进行敲除作用是阻止大肠杆菌自身对底物木糖和代谢中间物质的利用和分解。
所述2-酮酸醛缩酶基因yjhH在NCBI中的基因登录号为948825，来源于大肠杆菌，进行敲除作用是阻止大肠杆菌自身对底物木糖和代谢中间物质的利用和分解。
所述2-酮酸醛缩酶基因yagE在NCBI中的基因登录号为944925，来源于大肠杆菌，进行敲除作用是阻止大肠杆菌自身对底物木糖和代谢中间物质的利用和分解。
优选醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因yqhD、醇脱氢酶基因adhP、醇脱氢酶基因adhE和醇脱氢酶基因fucO中的一种以上；
其中，醇脱氢酶基因yqhD在NCBI中的基因登录号为947493，来源于大肠杆菌，进行敲除作用是阻止中间物3,4-二羟基丁醛转化为副产物D-1,2,4-丁三醇；
醇脱氢酶基因adhP在NCBI中的基因登录号为946036，来源于大肠杆菌，进行敲除作用是阻止中间物3,4-二羟基丁醛转化为副产物D-1,2,4-丁三醇；
醇脱氢酶基因adhE在NCBI中的基因登录号为945837，来源于大肠杆菌，进行敲除作用是阻止中间物3,4-二羟基丁醛转化为副产物D-1,2,4-丁三醇；
醇脱氢酶基因fucO在NCBI中的基因登录号为947273，来源于大肠杆菌，进行敲除作用是阻止中间物3,4-二羟基丁醛转化为副产物D-1,2,4-丁三醇。
优选木糖脱氢酶基因为木糖脱氢酶基因xylB，在NCBI中的基因登录号为941308，来源于新月柄杆菌，作用为催化D-木糖转变成D-木糖酸；优选过表达载体为pTrc99a。
优选2-酮酸脱羧酶基因为2-酮酸脱羧酶基因mdlC，在NCBI中的基因登录号为AY143338.1，来源于恶臭假单胞菌，作用为催化2-酮酸3-脱氧D-戊酮糖酸转化成3,4-二羟基丁醛；优选过表达载体为pTrc99a。
优选醛脱氢酶基因为醛脱氢酶基因feaB、醛脱氢酶基因aldB、醛脱氢酶基因puuC、醛脱氢酶基因ydcW、醛脱氢酶基因pduP(L.b)和醛脱氢酶基因pduP(K.p)中的一种以上；优选过表达载体为pDHC29；
其中，醛脱氢酶基因feaB在NCBI中的基因登录号为945933，来源于大肠杆菌，主要作用是将3,4-二羟基丁醛转化为3,4-二羟基丁酸；
醛脱氢酶基因aldB在NCBI中的基因登录号为948104，来源于大肠杆菌，主要作用是将3,4-二羟基丁醛转化为3,4-二羟基丁酸；
醛脱氢酶基因puuC在NCBI中的基因登录号为947003，来源于大肠杆菌，主要作用是将3,4-二羟基丁醛转化为3,4-二羟基丁酸；
醛脱氢酶基ydcW在NCBI中的基因登录号为7158620，来源于大肠杆菌，主要作用是将3,4-二羟基丁醛转化为3,4-二羟基丁酸；
醛脱氢酶基因pduP(L.b)在NCBI中的基因登录号为4413431，来源于短乳杆菌，主要作用是将3,4-二羟基丁醛转化为3,4-二羟基丁酸；
醛脱氢酶基因pduP(K.p)在NCBI中的基因登录号为FO203501.1，来源于克雷伯氏菌，主要作用是将3,4-二羟基丁醛转化为3,4-二羟基丁酸。
硫解酶基因tesB在NCBI中的基因登录号为945074，来源于大肠杆菌，主要作用是将3,4-二羟基丁酰辅酶A转化为3,4-二羟基丁酸。
更优选在重组大肠杆菌Ⅰ中进行过表达木糖酸脱水酶基因、敲除2-酮酸还原酶基因、敲除丙酮醛合酶基因、敲除葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG和过表达烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶基因中至少一种处理，所述处理的顺序没有限制，得到本发明所述的一种重组大肠杆菌Ⅱ。
优选采用Red同源重组技术进行基因敲除。
优选木糖酸脱水酶基因为木糖酸脱水酶基因xylD和/或木糖酸脱水酶基因HVO_RS00180；优选过表达载体为pTrc99a；
木糖酸脱水酶基因xylD在NCBI中的基因登录号为7329902，来源于新月柄杆菌，具有高效的催化木糖酸转变为2-酮-3-脱氧-D-戊酮糖酸的活性；
木糖酸脱水酶基因HVO_RS00180，在NCBI中的基因登录号为8919180，来源于沃氏嗜盐富饶菌，相应的酶具有高效的催化木糖酸转变为2-酮-3-脱氧-D-戊酮糖酸的活性。
优选2-酮酸还原酶基因为2-酮酸还原酶基因yiaE，在NCBI中的基因登录号为3798160，来源于大肠杆菌，主要作用为将中间代谢物催化形成副产物以分流碳源。
优选丙酮醛合酶基因为丙酮醛合酶基因mgsA，在NCBI中的基因登录号为945574，来源于大肠杆菌，其催化产生的丙酮醛会增大葡萄糖对木糖利用的抑制作用，因此是葡萄糖和木糖共利用中的阻遏因素，进行敲除作用为提高木糖和葡萄糖共利用。
葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG在NCBI中的基因登录号为945651，来源于大肠杆菌，可转移性向细胞内转运葡萄糖，进行敲除作用为在一定程度促进葡萄糖和木糖同时利用。
优选NADH氧化酶基因为NADH氧化酶基因noxE，在NCBI中的基因登录号为1114002，来源于乳酸乳球菌，主要作用为将NADH氧化为NAD+，从而提高大肠杆菌体内NAD+的水平；优选过表达载体为pDHC29。
一种本发明所述重组大肠杆菌的制备方法，所述制备方法如下：
步骤一、制备木糖异构酶基因xylA敲除的重组大肠杆菌菌株A1
1.基因敲除所用的打靶片段DNA的制备
采用从耶鲁大学菌种保藏中心(CGSC)购买的木糖异构酶基因xylA缺陷型大肠杆菌菌株JW3537-1，提取其基因组为模板，采用聚合酶链式反应(PCR)分别扩增含有同源臂的基因片段，凝胶电泳分离，即获得打靶片段DNA；优选PCR反应扩增体系如表1所示，PCR反应条件如表2所示。
表1 PCR反应扩增体系
ddH2O 33μL
dNTP混和液 8μL
上游引物 2μL
下游引物 2μL
PCR扩增缓冲液 50μL
DNA聚合酶PrimerSTAR 1μL
扩增用DNA模板 4μL
合计 100μL
表2 PCR反应条件
上游引物为xylA-S：5’-AGGCTATTCGGCTATGACTG-3’，为核苷酸序列表中数字标识符<210>所表示的序列标识符1所述的核苷酸序列，即核苷酸序列表中SEQ ID No.1(以下简称SEQ ID No.1，其余引物序列依次顺序命名)，下游引物为xylA-AN：5’-TACGCCCGAGGTGCCAAGAT-3’(SEQ ID No.2)。
2.感受态细胞制备
将转入pKD46质粒的待敲除基因的大肠杆菌制成感受态细胞。
3.目的基因的敲除
将打靶片段DNA转入感受态细胞中，加入SOC培养基培养，然后在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上培养，待长出单菌落之后利用聚合酶采用PCR进行验证，所述验证一般采用测定DNA序列的方法进行，比如用所述的引物xylA-S，xylA-AN，以基因组DNA为模板，扩增出新的DNA片段，将DNA片段送到测序公司测定序列后，与目标的序列进行比对，符合预期的即为敲除成功。筛选得到基因敲除的重组大肠杆菌菌株A1。
4.卡那霉素抗性基因的去除
接种重组大肠杆菌菌株A1于含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，再转接至新鲜LB培养基培养，然后制成感受态细胞，转入pCP20质粒，在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上培养，挑取单菌落，在LB液体培养基培养后，在LB固体培养基培养；分别挑取LB固体培养基中长出的单菌落，转移至LB固体培养基、含卡那霉素的LB固体培养基和含氨苄青霉素的LB固体培养基中培养，若含卡那霉素的LB固体培养基和含氨苄青霉素的LB固体培养基都无菌生长，而LB固体培养基有菌生长，则该菌已成功去除卡那霉素抗性基因。
步骤二、制备木糖异构酶基因xylA和2-酮酸醛缩酶基因yjhH双敲除的重组大肠杆菌菌株A2
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸醛缩酶基因yjhH缺陷型大肠杆菌菌株JW5775-2，上游引物为yjhH-S：5’-AACTATGCAATCTCACTTTCTGGC-3’(SEQ ID No.3)，下游引物为yjhH-AN：5’-CATCTCTGCGGTTAATGGGAGTTCG-3’(SEQ ID No.4)，在重组大肠杆菌菌株A1的基础上敲除2-酮酸醛缩酶基因yjhH，制得木糖异构酶基因xylA和2-酮酸醛缩酶基因yjhH双敲除的重组大肠杆菌菌株A2；去除重组大肠杆菌菌株A2的卡那霉素抗性基因。
其余方法同步骤一。
步骤三、制备木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE三敲除的重组大肠杆菌菌株A3
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸醛缩酶基因yagE缺陷型大肠杆菌菌株JW0261-2，上游引物为yagE-S：5’-AGTATGATCGTTAAATAAACGAACG-3’(SEQ ID No.5)，下游引物为yagE-AN：5’-TTTCTCAATGGTCATCGTTATCGTC-3’(SEQ ID No.6)，在重组大肠杆菌菌株A2的基础上进一步敲除2-酮酸醛缩酶基因yagE，制备得到木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE三敲除的重组大肠杆菌菌株A3；去除重组大肠杆菌菌株A3的卡那霉素抗性基因。
其余方法同步骤一。
步骤四、制备木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH、2-酮酸醛缩酶基因yagE和醇脱氢酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株B系列
所述醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因yqhD、醇脱氢酶基因adhP、醇脱氢酶基因adhE和醇脱氢酶基因fucO中的一种以上，采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的醇脱氢酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及其对应引物如表3所示，在重组大肠杆菌菌株A3的基础上进一步敲除所述醇脱氢酶基因，制备得到大肠杆菌菌株B系列，缩写为B-X，X代表该系列中具体一种大肠杆菌菌株，取值为正整数，如X为1时，就是B系列中的B-1，下文涉及X处含义相同。
表3 构建醇脱氢酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及对应引物
其余方法步骤同步骤一。
步骤五、构建过表达木糖脱氢酶基因和/或2-酮酸脱羧酶基因的重组载体质粒及含有所述重组载体质粒的重组大肠杆菌菌株C-X
1.过表达一个基因
(1)将载体质粒pTrc99a采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个木糖脱氢酶基因或一个2-酮酸脱羧酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增木糖脱氢酶基因或2-酮酸脱羧酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTRM-Y-X，其中，Y表示质粒中含有的基因个数，取值为正整数，如Y为1时，表示质粒中含有1个基因，下文涉及Y处含义相同，本步骤重组载体质粒为pTRM-1-X；
(3)将重组载体质粒pTRM-1-X转化入重组大肠杆菌菌株B-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTRM-1-X的重组大肠杆菌菌株C-X。
2.共同过表达两个基因
(1)将步骤五1(1)构建的重组载体质粒pTRM-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒pTRM-1-X中没有的另一个木糖脱氢酶基因或另一个2-酮酸脱羧酶基因，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTRM-2-X；
(3)将重组载体质粒pTRM-2-X转化入重组大肠杆菌菌株B-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTRM-2-X的重组大肠杆菌菌株C-X；
共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤五2类似。
其中，当过表达的基因为2-酮酸脱羧酶基因mdlC时：
限制性内切酶为Nco I和BamH I；以恶臭假单胞菌12633(美国典型微生物菌种保藏中心，ATCC)的基因组为模板，采用PCR扩增2-酮酸脱羧酶基因mdlC的基因片段，上游引物为mdlC-S：5’-GGACGCCTTCGGTACACGGCA-3’(SEQ ID No.15)，mdlC-S序列中斜体为限制性内切酶Nco I的酶切位点，下游引物为mdlC-AN：5’-ACGTCATCACTTCACCGGGCTTACG-3’(SEQ ID No.16)，mdlC-AN序列中斜体为限制性内切酶BamH I的酶切位点；
当过表达的基因为木糖脱氢酶基因xylB时：
限制性内切酶为BamH I和Hind III；以新月柄杆菌CB15(ATCC)基因组为模板，采用PCR方法扩增木糖脱氢酶基因xylB的基因片段，使用添加了核糖体结合位点(RBS)的上游引物为xylB-S：5’-CATGCTTAATTTTGTTTAACTTTAAGtaaggaggATATATTATGTCCTCAGCCATCTATCC-3’(SEQ ID No.17)，xylB-S序列中斜体为限制性内切酶BamH I的酶切位点，小写字母为RBS；下游引物为xylB-AN：5’-TGACTCCCTGCAGGAATTCTAGATCTTAGGTCAACGCCAGCCG-3’(SEQ ID No.18)，xylB-AN序列中斜体为限制性内切酶Hind III的酶切位点。
步骤六、构建过表达醛脱氢酶基因的重组载体质粒及含有所述重组载体质粒的重组大肠杆菌菌株D-X
1.过表达一个基因
(1)将载体质粒pDHC29采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个醛脱氢酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增醛脱氢酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒PDH-Y-X，即PDH-1-X；
(3)将重组载体质粒PDH-1-X转化入重组大肠杆菌菌株C-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒PDH-1-X的重组大肠杆菌菌株D-X。
2.共同过表达两个基因
(1)将步骤六1(1)构建的重组载体质粒PDH-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒PDH-1-X中没有的另一个醛脱氢酶基因或硫解酶基因tesB，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒PDH-2-X；
(3)将重组载体质粒PDH-2-X转化入重组大肠杆菌菌株C-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒PDH-2-X的重组大肠杆菌菌株D-X。
共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤六2类似。
所述重组大肠杆菌菌株D-X为本发明所述的一种重组大肠杆菌Ⅰ。
更优选在重组大肠杆菌Ⅰ中进行过表达木糖酸脱水酶基因、敲除2-酮酸还原酶基因、敲除丙酮醛合酶基因、敲除葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG和过表达烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化酶基因中至少一种的处理，得到本发明所述的一种重组大肠杆菌Ⅱ；
其中，敲除基因的处理为：在去除卡那霉素抗性基因的重组大肠杆菌菌株B-X的基础上继续进行目的基因的敲除，优选采用Red同源重组技术进行基因敲除；
过表达的处理为：根据需要过表达的目的基因所采用的载体质粒，在重组载体质粒pTRM-Y-X或重组载体质粒PDH-Y-X基础上进一步将需要过表达的目的基因片段连接上去得到新的重组载体质粒，转化进入重组大肠杆菌菌株B-X的感受态细胞中，得到过表达目的基因片段的重组大肠杆菌菌株。
具体可采用如下制备方法：
步骤七、构建过表达木糖酸脱水酶基因的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株
1.过表达一个基因
(1)将重组载体质粒pTRM-Y-X采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个木糖酸脱水酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增木糖酸脱水酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTRMD-Y-X，即pTRMD-1-X；
(3)将重组载体质粒pTRMD-1-X转化进入重组大肠杆菌菌株B-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTRMD-1-X的重组大肠杆菌菌株E-X。
2.共同过表达两个基因
(1)将步骤七1(1)构建的重组载体质粒pTRMD-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒pTRMD-1-X中没有的另一个木糖酸脱水酶基因，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTRMD-2-X；
(3)将重组载体质粒pTRMD-2-X转化入大肠杆菌菌株B-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pTRMD-2-X的重组大肠杆菌菌株E-X。
共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤七2类似。
步骤八、敲除重组大肠杆菌菌株中2-酮酸还原酶基因
1.在去除卡那霉素抗性基因的重组大肠杆菌菌株B-X中敲除2-酮酸还原酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株F-X；去除大肠杆菌菌株F-X的卡那霉素抗性基因。
当2-酮酸还原酶基因为2-酮酸还原酶基因yiaE时，采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸还原酶基因yiaE缺陷型大肠杆菌菌株JW5656，上游引物为yiaE-S：5’-GCGCGACAAAATGCGCGGCACTGGT-3’(SEQ ID No.19)，下游引物为yiaE-AN：5’-CTGTCTACAACCGGGCGCAGA-3’(SEQ ID No.20)；其余方法同步骤一。
2.将步骤七制得的重组载体质粒pTRMD-Y-X转化进入重组大肠杆菌菌株F-X，得到含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株F-X。
3.将步骤六制得的重组载体质粒pDH-Y-X转化进入含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株F-X，得到重组大肠杆菌菌株G-X。
步骤九、敲除重组大肠杆菌菌株中丙酮醛合酶基因
1.在重组大肠杆菌菌株F-X中敲除丙酮醛合酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株H-X；
当丙酮醛合酶基因为丙酮醛合酶基因mgsA时，采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的丙酮醛合酶基因mgsA缺陷型大肠杆菌菌株JW5129-1，上游引物为mgsA-S：5’-TAATGGACCGCATCAGTTA-3’(SEQ ID No.21)，下游引物为mgsA-AN：5’-GTGATTTAGACACGAC-3’(SEQ ID No.22)；其余方法同步骤一。
2.将步骤七制得的重组载体质粒pTRMD-Y-X转化进入重组大肠杆菌菌株H-X，得到含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株H-X。
3.将步骤六制得的重组载体质粒pDH-Y-X转化进入含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株H-X，得到重组大肠杆菌菌株I-X。
步骤十、敲除重组大肠杆菌菌株中的葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG
1.在重组大肠杆菌菌株F-X中敲除葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG，制备得到重组大肠杆菌菌株J-X；
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG缺陷型大肠杆菌菌株JW1087-2，上游引物为ptsG-S：5’-CTCGTAATTAATGGCTAAAACGA-3’(SEQID No.23)，下游引物为ptsG-AN：5’-CGCAACGCGCTATATTGCAGAG-3’(SEQ ID No.24)；其余方法同步骤一。
2.将步骤七制得的重组载体质粒pTRMD-Y-X转化进入重组大肠杆菌菌株J-X，得到含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株J-X。
3.将步骤六制得的重组载体质粒pDH-Y-X转化进入含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株J-X，得到重组大肠杆菌菌株K-X。
步骤十一、构建过量表达NADH氧化酶基因的重组大肠杆菌
1.将步骤七制得的重组载体质粒pTRMD-Y-X分别转化进入重组大肠杆菌菌株H-X和重组大肠杆菌菌株J-X，得到含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株H-X和含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株J-X。
2.过表达一个基因
(1)将载体质粒pDH-Y-X采用限制性内切酶处理成线性化载体，用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个NADH氧化酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增NADH氧化酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pDHN-Y-X，即pDHN-1-X；
(3)将重组载体质粒pDHN-1-X分别转化进入含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株H-X的感受态细胞和含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株J-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pDHN-1-X的重组大肠杆菌菌株L-X。
3.共同过表达两个基因
(1)将步骤十一1构建的重组载体质粒pDHN-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒pDHN-1-X中没有的另一个NADH氧化酶基因，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pDHN-2-X；
(3)将重组载体质粒pDHN-2-X分别转化进入含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株H-X的感受态细胞和含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株J-X的感受态细胞，筛选，测序验证，得到含有重组载体质粒pDHN-2-X的重组大肠杆菌菌株L-X。
共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤十一3类似。
所述重组大肠杆菌菌株E-X、重组大肠杆菌菌株G-X、重组大肠杆菌菌株I-X、重组大肠杆菌菌株K-X和重组大肠杆菌菌株L-X为本发明所述的一种重组大肠杆菌Ⅱ。
所述制备方法中，主要涉及以下方法：
方法1：重组大肠杆菌的基因敲除方法
使微生物基因不能表达或表达出不具有正常功能蛋白的方法有多种，如传统的物理或化学诱变、基因敲除法、转座子插入失活、RNA干扰法、CRASPA/CAS9等，这些方法均可用于本发明申请中，实现目标基因的敲除。
其中，优选采用Red同源重组技术进行基因敲除，技术原理如下：
Red同源重组技术是在λ噬菌体Red重组酶(Exo、Beta、Gam三种蛋白)的作用下，线性标记片段与染色体的特定靶序列进行同源重组从而使靶基因被标记基因置换，以达到基因敲除的目的。通常线性标记片段两端与靶基因的两端为同源序列，同源臂序列的加长有利于同源重组的进行，本发明申请设计的同源臂均为30bp以上。
Red同源重组技术进行基因敲除可参考文献(Datsenko KA,Wanner BL.One-stepinactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCRproducts.Proc Natl Acad Sci U S A.2000,97(12):6640-6645.)的操作步骤。
方法2：基因扩增方法
采用聚合酶链式反应(PCR)方法进行基因扩增。
方法3：重组质粒构建方法
重组质粒的构建主要是为了让基因在微生物菌株细胞中进行表达。可以通过现有技术中的全基因合成方法、与现有载体连接方法等构建。
方法4：Gibson DNA连接方法。
是一种将不同的DNA(基因、质粒)片段相连接的方法。主要用于构建重组质粒在大肠杆菌中表达本发明中不同的基因。
一种本发明所述重组大肠杆菌生物合成3,4-二羟基丁酸的方法，所述方法步骤如下：
(1)接种环蘸取本发明所述重组大肠杆菌的菌液于LB固体培养基上重复划线过夜培养，得到活化的所述重组大肠杆菌的单菌落；
(2)挑取单菌落接种于种子培养基，即普通LB培养基中，于30℃～40℃培养，摇床转速100r/min～250r/min，过夜培养；
(3)发酵培养基采用LB液体培养基，根据重组大肠杆菌中重组载体质粒的抗性，加入相应抗生素，加入CaCO3以调节发酵过程中的pH>5；将步骤(2)培养好的菌液转接于发酵培养基，在30℃～35℃，100r/min～250r/min条件下进行发酵，转接6h后加入终浓度为5g/L～50g/L的底物以及终浓度为0.1mmol/L～10mmol/L IPTG诱导，发酵48h～72h发酵结束；所述底物为D-木糖，或D-木糖和葡萄糖。
有益效果
1.本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌可以木糖和葡萄糖作为双底物经酶催化反应生物合成3,4-DHBA，首次提供了一条以木糖为基础底物，还可以在木糖的基础上添加葡萄糖和/或甘油形成复合底物生物合成3,4-DHBA的新通路，突破了从无到有的难关，实现了质的跨越；
2.本发明提供了一种重组大肠杆菌的制备方法，所述制备方法简单，生产周期短，成本较低，且具有后期的继续优化和改造，提示具有很好的工业开发和应用前景；
3.本发明提供了一种重组大肠杆菌合成3,4-二羟基丁酸的方法，所述合成方法中副产物极少，且可通过通路代谢优化阻断副产物的形成。
具体实施方式
以下实施例中，
使用的主要工具酶及试剂盒如表4所示。
表4 主要试剂
主要试剂 来源
PCR扩增试剂盒PrimerSTAR HS TaKaRa
限制性内切酶 Fermentas
质粒提取试剂盒 Omega
DNA胶回收试剂盒 Omega
主要使用培养基、试剂及配制方法：
SOB培养基(200ml)：蛋白胨4g，酵母粉1g，氯化钠0.1g，0.25mol/l氯化钾2ml，加水至总体积为199ml。灭菌后加入2mol/l氯化镁1ml，即得SOB培养基。
SOC培养基(800μl):792μl SOB培养基+8μl 500g/L的葡萄糖溶液。
LB液体培养基(100ml):蛋白胨1g，酵母粉0.5g，氯化钠1g，调pH为7.5，加水至总体积为100ml，即得LB液体培养基。
LB固体培养基(100ml):蛋白胨1g，酵母粉0.5g，氯化钠1g，琼脂粉1.5g，加水至总体积为100ml，凝固后即得LB固体培养基。
发酵培养基(100ml):蛋白胨1.5g，酵母粉0.75g，氯化钠1.5g，加水至总体积为100ml，即得发酵培养基。
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranos,IPTG)、氨苄青霉素钠(Ampicillin)、硫酸卡那霉素(Kanamycin)和氯霉素(ChlorampHenicol)购自sigma公司。
酵母提取物和胰蛋白胨为Oxoid公司产品；其中，常用抗生素浓度为氨苄青霉素100μg/mL；卡那霉素50μ/mL；氯霉素25μ/mL。
主要生物材料：
质粒pDHC29(空)见文献Phillips GJ,Park SK,Huber D.High copy numberplasmids compatible with commonly used cloning vectors.Biotechniques.2000；28:400–406；
pTrc99a(空)在NCBI中的登录号为U13872.1、含有RED重组酶的pKD46和含有翻转酶重组酶(FLP)的pCP20购自于耶鲁大学菌种保藏中心；
本发明所用大肠杆菌K12系列的MG1655(CGSC 6300)菌株购自于耶鲁大学菌种保藏中心；短乳杆菌(ATCC 367)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；克雷伯氏菌(CICC1.10612)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，恶臭假单胞菌12633、新月柄杆菌CB15购自美国典型微生物菌种保藏中心，乳酸乳球菌(CICC 1.2829)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
一种重组大肠杆菌，所述大肠杆菌由如下方法制得：
步骤一、采用Red同源重组技术制备木糖异构酶基因xylA敲除的重组大肠杆菌菌株A1
1.基因敲除所用的打靶片段DNA的制备
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的木糖异构酶基因xylA缺陷型大肠杆菌菌株JW3537-1，将购买的菌株进行活化后挑取单菌落于LB液体培养基中过夜培养，取2mL培养好的菌液于离心管中，高速离心得到菌体后，用1/3菌液体积的无菌水重悬；提取大肠杆菌菌株JW3537-1的基因组为模板，采用PCR分别扩增含有同源臂的基因片段，使用Takara公司的PrimeSTAR Max DNA聚合酶分别扩增含有同源臂的基因片段，凝胶电泳分离，即获得打靶片段DNA；PCR反应扩增体系如表1所示，PCR反应条件如表5所示。
表5 PCR反应条件
上游引物为xylA-S：5’-AGGCTATTCGGCTATGACTG-3’(SEQ ID No.1)，下游引物为xylA-AN：5’-TACGCCCGAGGTGCC AAGAT-3’(SEQ ID No.2)。
2.感受态细胞制备
(1)取500μL转入pKD46质粒的待敲除基因的大肠杆菌菌液，转接于50mL新鲜SOB培养基中，于30℃摇瓶培养至菌液的OD600＝0.2；
(2)向步骤(1)培养的菌液中加入阿拉伯糖诱导Red重组酶的表达，阿拉伯糖的终浓度为10mmol/L，转到37℃继续培养至菌液的OD600＝0.5；
(3)取1.5mL步骤(2)培养的菌液于离心管中，冰浴15min，于4℃，4000×g离心5min，弃上清，用-20℃预冷，用1mL体积分数为10％的甘油重悬离心管中菌体，再在4000×g离心5min，弃上清，重复离心、弃上清和甘油重悬离聚菌体，然后采用体积分数为10％的甘油清洗菌体3次，最后用200μL体积分数为10％的甘油重悬菌体制成感受态细胞。
3.目的基因的敲除
(1)取预冷至-20℃，步骤1中制备得到的打靶片段DNA 6μL，与步骤2制备的感受态细胞充分混匀，转移到间隙为2mm的电击杯中，在1860V 5ms进行电穿孔，将打靶片段DNA转化进入感受态细胞中；
(2)将转入打靶片段DNA的感受态细胞加入800μL的SOC培养基，放置于离心管中，并将离心管置于37℃，190r/min条件下震荡培养2h；最后于5000r/min，1min离心，弃上清液，取剩余菌液200μL，涂于含有卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃过夜培养，待长出单菌落之后，利用聚合酶采用PCR进行验证结果正确，筛选得到基因敲除的重组大肠杆菌菌株A1。
4.构建多基因敲除菌株时，卡那霉素抗性基因的消除
若要该构建多基因敲除菌株，则必须将上一次敲除基因得到的菌株的相应抗生素的抗性去除，因为最后需用所述抗性做为筛选标记来筛选成功敲除菌株。pCP20质粒可用来进行菌株的卡那霉素抗性基因消除，pCP20质粒同pKD46质粒一样含有温度敏感型的复制起点，在高温下会丢失。除了氨苄青霉素抗性，pCP20质粒还具有氯霉素抗性。pCP20是敲除实验的常用菌株，这是因为其上含有一个翻转酶重组酶(FLP)基因，FLP重组酶可以与FRT位点结合，在FLP重组酶的作用下，FRT位点自身发生同源重组，从而消除一个FRT位点及抗性基因，在同源区内只残留34bp FRT位点。具体步骤如下：
(1)接种重组大肠杆菌菌株A1于含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜；
(2)将体积分数为1％的步骤(1)培养的菌液转接至新鲜LB液体培养基中，37℃培养至菌液的OD600≈0.6，制备感受态细胞，并转入pCP20质粒；均匀涂布转入pCP20质粒的菌液于含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，30℃培养过夜；
(3)挑取在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上生长的单菌落，在LB液体培养基培养后，划线于LB固体培养基中，42℃培养过夜；
(4)分别挑取步骤(3)LB固体培养基中长出的单菌落，转移至LB固体培养基、含卡那霉素的LB固体培养基和含氨苄青霉素的LB固体培养基中，在37℃培养，若含卡那霉素的LB固体培养基和含氨苄青霉素的LB固体培养基都无菌，而LB固体培养基有菌生长，则该菌已成功去除卡那霉素抗性基因。
步骤二、采用Red同源重组技术制备木糖异构酶基因xylA和2-酮酸醛缩酶基因yjhH双敲除的重组大肠杆菌菌株A2
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸醛缩酶基因yjhH缺陷型大肠杆菌菌株JW5775-2，上游引物为yjhH-S：5’-AACTATGCAATCTCACTTTCTGGC-3’(SEQ ID No.3)，下游引物yjhH-AN为：5’-CATCTCTGCGGTTAATGGGAGTTCG-3’(SEQ ID No.4)，在重组大肠杆菌菌株A1的基础上采用Red同源重组技术敲除2-酮酸醛缩酶基因yjhH，制备得到木糖异构酶基因xylA和2-酮酸醛缩酶基因yjhH双敲除的重组大肠杆菌菌株A2；去除重组大肠杆菌菌株A2的卡那霉素抗性基因。
其余方法同步骤一。
步骤三、采用Red同源重组技术制备木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE三敲除的重组大肠杆菌菌株A3
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸醛缩酶基因yagE缺陷型大肠杆菌菌株JW0261-2；上游引物为yagE-S为：5’-AGTATGATCGTTAAATAAACGAACG-3’(SEQ ID No.5)，下游引物为yagE-AN：5’-TTTCTCAATGGTCATCGTTATCGTC-3’(SEQ ID No.6)。在重组大肠杆菌菌株A2的基础上进一步采用Red同源重组技术敲除2-酮酸醛缩酶基因yagE，制备得到木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE三敲除的重组大肠杆菌菌株A3；去除重组大肠杆菌菌株A3的卡那霉素抗性基因。
其余方法同步骤一。
步骤四、采用Red同源重组技术制备木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH、2-酮酸醛缩酶基因yagE和醇脱氢酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株B-1
所述醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因yqhD、醇脱氢酶基因adhP、醇脱氢酶基因adhE和醇脱氢酶基因fucO，采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的醇脱氢酶基因缺陷型大肠杆菌菌株及其对应引物，如表3所示，在重组大肠杆菌菌株A3的基础上进一步敲除所述醇脱氢酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株B-1。
其余方法步骤同步骤一。
重组大肠杆菌菌株B-1的感受态细胞的制备方法如下：
(1)挑取重组大肠杆菌菌株B-1，在LB固体培养基上划线活化，37℃，恒温培养14h；
(2)挑取LB固体培养基上长出的单菌落，转入50mL LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养12h；
(3)吸取步骤(2)培养的菌液500μL，转接至50mL LB液体培养基中，加入1mL浓度为1mol/L的MgSO4，MgSO4终浓度为20mmol/L，在37℃，200rpm，振荡培养2h至OD590＝0.4；
(4)将步骤(3)培养得到的菌液分装至2个30mL离心管中，4℃，5000rpm离心5min，弃上清液；
(5)向每个离心管中加入10mL，-20℃预冷的转化缓冲液(TFB)I，重悬菌体，冰浴5min；
(6)将步骤(5)中冰浴后的离心管在4℃，5000rpm离心5min，弃上清液，每个离心管加入1mL，-20℃预冷的转化缓冲液(TFB)II，重悬菌体，冰浴1h；
(7)将步骤(6)重悬冰浴后的菌液分装至20个1.5mL离心管中，每管100μL，在-40℃保存备用；
所述TFB I的组成为：浓度为30mmol/的KaOAC，浓度为100mmol/L的RbCl，浓度为10mmol/L的CaCl2，浓度为50mmol/L的MnCl2，体积分数为10％的甘油，用乙酸调节至pH值为5.8。
缓冲液TFB II的组成为：浓度为10mM的NaMOPS，浓度为75mM的CaC12，浓度为10mM的RbC1，体积分数为10％的甘油，用3mol/L的盐酸或氢氧化钠调节pH值为7.0。
实施例中涉及的重组大肠杆菌菌株感受态细胞制备方法与重组大肠杆菌菌株B-1的感受态细胞制备方法相同。
步骤五、构建过表达木糖脱氢酶基因xylB和2-酮酸脱羧酶基因mdlC的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株C-1
(1)将载体质粒pTrc99a采用限制性内切酶Nco I和BamH I处理成线性化载体质粒pTrc99a，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
以恶臭假单胞菌12633基因组为模板，采用PCR方法扩增2-酮酸脱羧酶基因mdlC的基因片段，上游引物为mdlC-S：5’-GGACGCCTTCGGTACACGGCA-3’(SEQ ID No.15)，mdlC-S序列中的斜体为限制性内切酶Nco I的作用位点，下游引物为mdlC-AN：5’-ACGTCATCACTTCACCGGGCTTACG-3’(SEQ ID No.16)，mdlC-AN序列中的斜体为限制性内切酶BamH I的作用位点，其余与步骤一1中的PCR扩增体系和反应条件相同；将PCR扩增所得的mdlC基因片段采用限制性内切酶Nco I和BamH I处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化。
(2)采用Gibson连接方法将PCR扩增得到的2-酮酸脱羧酶基因mdlC基因片段与线性化载体质粒pTrc99a进行连接，并筛选获得连接正确的重组载体质粒pTRM-1-1，采用NEB公司产Gibson DNA克隆组装试剂盒完成，具体操作如下：
将2μL的PCR扩增得到的2-酮酸脱羧酶基因mdlC基因片段25ng、2μL的线性化载体质粒pTrc99a约100ng，1μL连接缓冲液，1μL T4DNA连接酶，与4μL水混合均匀，37℃孵育2h，转化入重组大肠杆菌菌株B-1感受态细胞，PCR扩增得到的2-酮酸脱羧酶基因mdlC基因片段插入线性化载体质粒pTrc99a的Nco I和BamH I位点，筛选，测序验证结果正确，获得正确连接的重组载体质粒pTRM-1-1。
(3)将重组载体质粒pTRM-1-1采用限制性内切酶BamH I和Hind III处理成线性化载体质粒pTRM-1-1，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
以新月柄杆菌CB15基因组为模板，采用PCR扩增木糖脱氢酶基因xylB的基因片段，使用添加了核糖体结合位点(RBS)的上游引物为xylB-S：5’-CATGCTTAATTTTGTTTAACTTTAAGtaaggaggATATATTATGTCCTCAGCCATCTATCC-3’(SEQ ID No.17)，xylB-S序列中的斜体为限制性内切酶BamH I的作用位点，小写字母为RBS；下游引物为xylB-AN：5’-TGACTCCCTGCAGGAATTCTAGATCTTAGGTCAACGCCAGCCG-3’(SEQ IDNo.18)，xylB-AN序列中的斜体为限制性内切酶Hind III的作用位点，其余与步骤一1中的PCR扩增体系和反应条件相同；将PCR扩增所得的xylB的基因片段采用限制性内切酶BamH I和Hind IIII处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化。
(4)采用Gibson连接方法将PCR扩增得到的木糖脱氢酶基因xylB的基因片段与步骤(3)制得的线性化载体质粒pTRM-1-1进行连接，并筛选获得连接正确的重组载体质粒pTRM-2-1，具体采用试剂盒及操作方法同步骤五(2)。
(5)将重组载体质粒pTRM-2-1转化进入步骤四制得的重组大肠杆菌菌株B-1中，得到含有重组载体质粒pTRM-2-1的重组大肠杆菌菌株C-1。
步骤六、构建过表达醛脱氢酶基因的重组载体质粒及含有所述重组载体质粒的重组大肠杆菌菌株D-1～D-7
1.过表达一个基因
(1)将载体质粒pDHC29采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒pDHC29，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个醛脱氢酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增醛脱氢酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化。
(2)采用Gibson连接方法将PCR扩增得到的基因片段与线性化载体质粒pDHC29进行连接，并筛选获得连接正确的重组载体质粒PDH-1-X，具体采用试剂盒及操作方法同步骤五(2)。
(3)将重组载体质粒PDH-1-X转化进入重组大肠杆菌菌株C-1的感受态细胞，筛选，测序验证结果正确，得到含有重组载体质粒PDH-1-X的重组大肠杆菌菌株D-X。
所述醛脱氢酶基因为醛脱氢酶基因feaB、醛脱氢酶基因aldB、醛脱氢酶基因puuC、醛脱氢酶基因ydcW、醛脱氢酶基因pduP(L.b)或醛脱氢酶基因pduP(K.p)，分别依次顺序对应重组载体质粒PDH-1-1～PDH-1-6；
其中，醛脱氢酶基因feaB、、醛脱氢酶基因aldB、醛脱氢酶基因puuC、醛脱氢酶基因ydcW均以大肠杆基因组为模板，用PCR扩增基因片段；
醛脱氢酶基因pduP(L.b)以短乳杆菌基因组为模板，用PCR扩增基因片段；
醛脱氢酶基因pduP(K.p)以克雷伯氏菌基因组为模板，用PCR扩增基因片段。
将重组载体质粒PDH-1-1～PDH-1-4分别转化进入大肠杆菌菌株C-1的感受态细胞，筛选，测序验证结果正确，得到含有重组载体质粒PDH-1-1～PDH-1-4的重组大肠杆菌菌株D-1～D-4。
2.共同过表达两个基因
2-1.共同过表达醛脱氢酶基因pduP(L.b)和硫解酶基因tesB
(1)将重组载体质粒PDH-1-5采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒PDH-1-5，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将硫解酶基因tesB以大肠杆菌基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson连接方法将PCR扩增得到的基因片段与线性化载体质粒PDH-1-5进行连接，并筛选获得连接正确的重组载体质粒PDH-2-5，具体采用试剂盒及操作方法同步骤五(2)。
(3)将重组载体质粒PDH-2-5转化入重组大肠杆菌菌株C-1的感受态细胞，筛选，测序验证结果正确，得到含有重组载体质粒PDH-2-5的重组大肠杆菌菌株D-5。
2-2.共同过表达醛脱氢酶基因pduP(K.p)和硫解酶基因tesB
(1)将重组载体质粒PDH-1-6采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒PDH-1-6，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将硫解酶基因tesB以大肠杆菌基因组基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson连接方法将PCR扩增得到的基因片段与线性化载体质粒PDH-1-6进行连接，并筛选获得连接正确的重组载体质粒PDH-2-6，具体采用试剂盒及操作方法同步骤五(2)。
(3)将重组载体质粒PDH-2-6转化入大肠杆菌菌株C-1的感受态细胞，筛选，测序验证结果正确，得到含有重组载体质粒PDH-2-6的重组大肠杆菌菌株D-6。
2-3.共同过表达醛脱氢酶基因feaB和醛脱氢酶基因ydcW
(1)将重组载体质粒PDH-1-1采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒PDH-1-1，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将醛脱氢酶基因ydcW以大肠杆菌基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson连接方法将PCR扩增得到的基因片段与线性化载体质粒PDH-1-1进行连接，并筛选获得连接正确的重组载体质粒PDH-2-7，具体采用试剂盒及操作方法同步骤五(2)。
(3)将重组载体质粒PDH-2-7转化入大肠杆菌菌株C-1的感受态细胞，筛选，测序验证结果正确，得到含有重组载体质粒PDH-2-7的重组大肠杆菌菌株D-7。
其中，醛脱氢酶基因feaB、醛脱氢酶基因aldB、醛脱氢酶基因puuC、醛脱氢酶基因ydcW、醛脱氢酶基因pduP(L.b)、醛脱氢酶基因pduP(K.p)以及硫解酶基因tesB所采用PCR中DNA模板、使用引物、限制性内切酶及其对应的重组载体质粒见表6～8。
表6 PCR扩增醛脱氢酶、硫解酶基因对应的DNA模板
基因 DNA模板
feaB 大肠杆菌基因组
aldB 大肠杆菌基因组
puuC 大肠杆菌基因组
ydcW 大肠杆菌基因组
pduP(L.b) 短乳杆菌基因组
pduP(K.p) 克雷伯氏菌基因组
tesB 大肠杆菌基因组
表7构建表达醛脱氢酶、硫解酶质粒时所用的限制性内切酶、引物及所形成的重组载体质粒
表8 PCR扩增醛脱氢酶基因、硫解酶基因引物的序列
步骤七、构建过表达木糖酸脱水酶基因xylD的重组质粒pTRMD-2-1
(1)将重组载体质粒pTRM-2-1采用限制性内切酶NcoI和BamHI处理成线性化载体质粒pTRM-2-1，用琼脂糖凝胶电泳纯化；以新月柄杆菌CB15DNA为模板，采用PCR扩增木糖酸脱水酶基因xylD的基因片段，上游引物为xylD-S：5’-GCGTTGACCTAAGATCTAGATCTAGAGtcacacaggaaagATGAGTTCTCTAACCGCACGCC-3’(SEQ ID No.39)，xylD-S中的小写字母代表RBS，下游引物为xylD-AN：5’-CTCATCCGCCAAAACAGCCAAGCTTGCGGCCGCAGAATTCCCTCCGGATCGCTCCGAA-3’(SEQ ID No.40)，用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson连接方法将PCR扩增得到的木糖酸脱水酶基因xylD片段与线性化载体质粒pTRM-2-1进行连接，并筛选获得连接正确的重组载体质粒pTRMD-1-1，具体采用试剂盒及操作方法同步骤五(2)。
步骤八、敲除重组大肠杆菌菌株中的2-酮酸还原酶基因yiaE
在去除卡那霉素抗性基因的重组大肠杆菌菌株B-1中采用Red同源重组技术敲除2-酮酸还原酶基因yiaE，制备得到重组大肠杆菌菌株F-1；去除重组大肠杆菌菌株F-1的卡那霉素抗性基因。
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸还原酶基因yiaE缺陷型大肠杆菌菌株JW5656，上游引物为yiaE-S：5’-GCGCGACAAAATGCGCGGCACTGGT-3’(SEQ ID No.19)，下游引物为yiaE-AN：5’-CTGTCTACA ACCGGGCGCAGA-3’(SEQ ID No.20)；其余方法同步骤一。
步骤九、敲除重组大肠杆菌菌株中的丙酮醛合酶基因mgsA
1.在去除卡那霉素抗性基因的重组大肠杆菌菌株F-1中采用Red同源重组技术敲除丙酮醛合酶基因mgsA，制备得到重组大肠杆菌菌株H-1，去除重组大肠杆菌菌株H-1的卡那霉素抗性基因。
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的丙酮醛合酶基因mgsA缺陷型大肠杆菌菌株JW5129-1，上游引物为mgsA-S：5’-TAATGGACCGCATCAGTTA-3’(SEQ ID No.21)，下游引物为mgsA-AN：5’-GTGATTTAGACACGAC-3’(SEQ ID No.22)；其余方法同步骤一。
2.将步骤七制得的重组载体质粒pTRMD-1-1转化进入重组大肠杆菌菌株H-1，得到含有重组载体质粒pTRMD-1-1的重组大肠杆菌菌株H-1。
3.(1)将步骤六制得的重组载体质粒pDH-1-1转化进入含有重组载体质粒pTRMD-1-1的重组大肠杆菌菌株H-1，得到重组大肠杆菌菌株I-1；
(2)将步骤六制得的重组载体质粒pDH-1-4转化进入含有重组载体质粒pTRMD-1-1的重组大肠杆菌菌株H-1，得到重组大肠杆菌菌株I-2。
步骤十、构建过量表达NADH氧化酶基因NoxE的重组大肠杆菌
1.(1)将重组载体质粒pDH-1-1采用限制性内切酶Ecor I和Hind III处理成线性化重组载体质粒pDH-1-1，用琼脂糖凝胶电泳纯化；以乳酸乳球菌基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增NADH氧化酶基因NoxE的基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶Ecor I和Hind III处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)采用Gibson连接方法将PCR扩增得到的NADH氧化酶基因NoxE的基因片段，与线性化载体质粒pDH-1-1进行连接，并筛选获得连接正确的重组载体质粒pDHN-1-1，具体采用试剂盒及操作方法同步骤五(2)。
(3)将重组载体质粒pDHN-1-1转化进入含有重组载体质粒pTRMD-1-1的重组大肠杆菌菌株H-1的感受态细胞，筛选测序验证结果正确，得到重组大肠杆菌菌株L-1。
2.将载体质粒pDH-1-1更换为pDH-1-4，获得连接正确的重组载体质粒pDHN-1-2，得到重组大肠杆菌菌株L-2，其余方法同步骤九1。
3.将载体质粒pDH-1-1更换为pDH-1-7，获得连接正确的重组载体质粒pDHN-1-3，得到重组大肠杆菌菌株L-3，其余方法同步骤九1。
使用NADH氧化酶基因NoxE的引物如表9。其余与步骤一1中的PCR扩增体系和反应条件相同。
表9 NADH氧化酶基因NoxE的引物及序列
表9中NADH氧化酶基因NoxE的引物序列中的小写字母表示RBS
制备得到的主要重组质粒载体如表10所示：
表10主要重组质粒载体
pTRM-2-1 pTrc99a harboring mdlC and xylB,AmpR
pTRMD-1-1 pTrc99a harboring mdlC,xylB and xylD,AmpR
pDH-1-1 pDHC29 harboring feaB CmR
pDH-1-2 pDHC29 harboring aldB CmR
pDH-1-3 pDHC29 harboring puuC CmR
pDH-1-4 pDHC29 harboring ydcW CmR
pDH-2-5 pDHC29 harboring pduP(L.)and tesB CmR
pDH-2-6 pDHC29 harboring pdup(K.p)and tesB CmR
pDH-2-7 pDHC29 harboring feaB)and ydcW CmR
pDHN-1-1 pDHC29 harboring feaB and noxE CmR
pDHN-1-2 pDHC29 harboring ydcW and noxE CmR
pDHN-1-3 pDHC29 harboring feaB,ydcW and noxE CmR
其中，Harboring表示携带相应的基因，AmpR表示质粒中携带氨苄青霉素抗性基因，CmR表示质粒中携带氯霉素抗性基因。
制备得到的优选重组大肠杆菌菌株编号及其主要基因型如表11所示。
表11优选重组大肠杆菌菌株编号及其主要基因型
其中，MG1655表示大肠杆菌MG1655，△表示后面基因被敲除，KanR表示卡那霉素抗性基因。
实施例2
一种实施例1制备得到的重组大肠杆菌生物合成3,4-二羟基丁酸的方法，所述方法步骤如下：
(1)接种环蘸取实施例1制备得到的重组大肠杆菌的菌液于LB固体培养基上，重复划线过夜培养三次，以得到充分活化的所述重组大肠杆菌的单菌落；实施例1制备得到的重组大肠杆菌为表11中优选的重组大肠杆菌菌株，即D1～D6、I1、I2以及L1～L3；
(2)挑取单菌落接种于50mL LB液体培养基中，于37℃，转速为190的摇床中培养18h至细胞OD600nm达到5～6，用于接种发酵培养基的种子；
(3)发酵培养基采用1.5倍浓度的液体LB培养基，加入氨苄青霉素或卡那霉素，10g/L CaCO3以调节发酵过程中的pH>5；将步骤(2)培养好的种子以10％体积的接种量转接于50mL发酵培养基，用规格为250mL三角瓶于33℃，转速190r/min条件下进行发酵，所有发酵均设置三个平行实验。接种6h后加入终浓度为20g/L D-木糖，终浓度为5g/L葡萄糖以及终浓度为0.8mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(PTGI)诱导，记为发酵0时，每12h取样一次，直到48h发酵结束。
发酵检测方法如下：
1.配制衍生化反应试剂：
(1)2-硝基苯肼(2-NPH)水溶剂：购买于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；配制方法：取2-NPH 62mg溶于5mL乙醇，超声溶解后加1mol/L HCl 2mL和3mL三蒸水，形成0.04mol/L的2-NPH水溶剂。
(2)1-乙基-3-(3-二甲)-碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶液：购买于阿拉丁；配制方法为：取0.24g EDC溶于5mL甲醇，配置成0.25mol/L的EDC·HCl溶液。
(3)吡啶溶液：购买于北京化学试剂公司；配制方法：取0.3mL吡啶用乙醇定容至10mL，配置成质量分数为3％的吡啶溶液。
以上所有试剂需置于4℃冰箱保存，且最多存放一周时间。
(4)3,4-DHBA标准品：由于现在市场上没有3,4-DHBA的标准品，本专利申请利用其酯化形式3-羟基-γ-丁内酯在pH>10的溶液中37℃反应3h获得的3,4-DHBA进行标准曲线制备，以便于产物的定量分析。
2.进行3,4-二羟基丁酸样品的衍生化反应
将200μL 2-硝基苯肼溶液、200μL EDC·HCl溶液、200μL吡啶溶液和800μL检测样品上清液充分混匀后，60℃反应30min，取反应后溶液用孔径为0.22μm的有机系无菌滤膜过滤。
3.采用岛津LC-15C型HPLC进行样品的分析
色谱柱为TSKgel ODS-100V(4.6mm I.D.×25cm，5μm)，流动相为20mM磷酸二氢钾(pH 4.5)与乙腈(HPLC级)体积比为3:1，流速1mL/min，检测器为紫外检测器SPD-15C，柱温箱40℃，进样量20μL，通过紫外检测器测定400nm处吸收峰，LC solution 15C工作站；每组发酵三个平行，最终数据取平均值。
检测结果如表12所示：
表12发酵检测结果
菌株编号 发酵后发酵液中3,4-DHBA合成量(g/L)
D-1 0.12
D-2 0.085
D-3 0.075
D-4 0.10
D-5 0.08
D-6 0.08
I-1 0.28
I-2 0.24
L-1 0.33
L-2 0.27
L-3 0.38
核苷酸序列表
<110> 北京理工大学
<120> 一种重组大肠杆菌、制备方法及合成3, 4-二羟基丁酸的方法
<160> 46
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 木糖异构酶基因xylA上游引物xylA-S
<400> 1
aggctattcg gctatgactg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 木糖异构酶基因xylA下游引物xylA-AN
<400> 2
tacgcccgag gtgccaagat 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-酮酸醛缩酶基因yjhH上游引物yjhH-S
<400> 3
aactatgcaa tctcactttc tggc 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-酮酸醛缩酶基因yjhH下游引物yjhH-AN
<400> 4
catctctgcg gttaatggga gttcg 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-酮酸醛缩酶基因yagE上游引物yagE-S
<400> 5
agtatgatcg ttaaataaac gaacg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-酮酸醛缩酶基因yagE下游引物yagE-AN
<400> 6
tttctcaatg gtcatcgtta tcgtc 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醇脱氢酶基因yqhD上游引物yqhD-S
<400> 7
cgccaatgtc catcaacagt tcc 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序
<220>
<223> 醇脱氢酶基因yqhD下游引物yqhD-AN
<400> 8
caattcgatc atgcctttcc atgc 24
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醇脱氢酶基因adhP上游引物adhP-S
<400> 9
gcccgtttaa tccagtggta tgg 23
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醇脱氢酶基因adhP下游引物adhP-AN
<400> 10
gtagcgcatc aggcaatgtt gc 22
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醇脱氢酶基因adhE上游引物adhE-S
<400> 11
gtctgaatca cggttagctc cgaag 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醇脱氢酶基因adhE下游引物adhE-AN
<400> 12
gtgccagtca tccttcaggt aacg 24
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醇脱氢酶基因fucO上游引物fucO-S
<400> 13
ggcaacggta aacatgagga agg 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醇脱氢酶基因fucO下游引物fucO-AN
<400> 14
caacgaagcc gatgacttag ccg 23
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-酮酸脱羧酶基因mdlC上游引物mdlC-S
<400> 15
ggacgcccat ggcttcggta cacggca 27
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-酮酸脱羧酶基因mdlC下游引物mdlC-AN
<400> 16
acgtcaggat cctcacttca ccgggcttac g 31
<210> 17
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> RBS
<222> （33）…（40）
<223> 木糖脱氢酶基因xylB上游引物xylB-S
<400> 17
catgctggat cctaattttg tttaacttta agtaaggagg atatattatg tcctcagcca 60
tctatcc 67
<210> 18
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 木糖脱氢酶基因xylB下游引物xylB-AN
<400> 18
tgactcaagc ttcctgcagg aattctagat cttaggtcaa cgccagccg 49
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-酮酸还原酶基因yiaE上游引物yiaE-S
<400> 19
gcgcgacaaa atgcgcggca ctggt 25
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2-酮酸还原酶基因yiaE下游引物yiaE-AN
<400> 20
ctgtctaca accgggcgca ga 22
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 丙酮醛合酶基因mgsA上游引物mgsA-S
<400> 21
taatggaccg catcagtta 19
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 丙酮醛合酶基因mgsA下游引物mgsA-AN
<400> 22
gtgatttaga cacgac 16
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG上游引物ptsG-S
<400> 23
ctcgtaatta atggctaaaa cga 23
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG下游引物ptsG-AN
<400> 24
cgcaacgcgc tatattgcag ag 22
<210> 25
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醛脱氢酶基因feaB上游引物feaB-S
<400> 25
gtggcggccg ctctagaact agtgatgaca gagccgcatg tagc 44
<210> 26
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醛脱氢酶基因feaB下游引物feaB-AN
<400> 26
gcttgatatc gaattcctgc attaataccg tacacacacc gactt 45
<210> 27
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醛脱氢酶基因aldB上游引物aldB-S
<400> 27
gtggcggccg ctctagaact agtgacgatc atgaccaata atccccct 48
<210> 28
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醛脱氢酶基因aldB下游引物aldB-AN
<400> 28
gcttgatatc gaattcctgc atcagaacag ccccaacggt tta 43
<210> 29
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醛脱氢酶基因puuC上游引物puuC-S
<400> 29
gtggcggccg ctctagaact agtgatgaat tttcatcatc tggcttactg 50
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醛脱氢酶基因puuC下游引物puuC-AN
<400> 30
gcttgatatc gaattcctgc atcaggcctc caggcttatc c 41
<210> 31
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醛脱氢酶基因ydcW上游引物ydcW-S
<400> 31
gtggcggccg ctctagaact agtggctatg caacataagt tactgattaa cgg 53
<210> 32
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醛脱氢酶基因ydcW下游引物ydcW-AN
<400> 32
gcttgatatc gaattcctgc attaatgttt aaccatgacg tggcgg 46
<210> 33
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醛脱氢酶基因pduP(L.b)上游引物pduP(L.b)-S
<400> 33
gtggcggccg ctctagaact agtgatgaac acagaaaaca ttgaacaagc c 51
<210> 34
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醛脱氢酶基因pduP(L.b)下游引物pduP(L.b)-AN
<400> 34
gcttgatatc gaattcctgc actaagcctc ccaagtccgt aatgag 46
<210> 35
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醛脱氢酶基因pduP(K.p)上游引物pduP(K.p)-S
<400> 35
gtggcggccg ctctagaact agtgatgaat acagcagaac tggaaaccct t 51
<210> 36
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 醛脱氢酶基因pduP(K.p)下游引物pduP(K.p)-AN
<400> 36
gcttgatatc gaattcctgc attagcgaat ggaaaaaccg ttgg 44
<210> 37
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 硫解酶基因tesB上游引物tesB-S
<400> 37
ggaattcgat atcaagctta ttaaggagga tgagtcaggc gctaaaaaat ttactgac 58
<210> 38
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 硫解酶基因tesB下游引物tesB-AN
<400> 38
accgggcccc ccctcgaggt taattgtgat tacgcatcac ccct 44
<210> 39
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> RBS
<222> （28）…（40）
<223> 木糖酸脱水酶基因xylD上游引物xylD-S
<400> 39
gcgttgacct aagatctaga tctagagtca cacaggaaag atgagttctc taaccgcacg 60
cc 62
<210> 40
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 木糖酸脱水酶基因xylD下游引物xylD-AN
<400> 40
ctcatccgcc aaaacagcca agcttgcggc cgcagaattc cctccggatc gctccgaa 58
<210> 41
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> RBS
<222> （22）…（29）
<223> NADH氧化酶基因NoxE上游引物NoxE-S
<400> 41
ttggggctgt tctgatgcag gtaaggagga tgaaaatcgt agttatcggt acgaac 56
<210> 42
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NADH氧化酶基因NoxE下游引物NoxE-AN
<400> 42
cctcgaggtc gacggtatcg atattatttt gcatttaaag ctgcaacag 49
<210> 43
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> RBS
<222> （25）…（32）
<223> NADH氧化酶基因NoxE上游引物NoxE-S
<400> 43
gtcatggtta aacattaatg caggtaagga ggatgaaaat cgtagttatc ggtacgaac 59
<210> 44
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NADH氧化酶基因NoxE下游引物NoxE-AN
<400> 44
cctcgaggtc gacggtatcg atattatttt gcatttaaag ctgcaacag 49
<210> 45
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> RBS
<222> （20）…（32）
<223> NADH氧化酶基因NoxE上游引物NoxE-S
<400> 45
aacattaata tcgataccgt cacacaggaa agatgaaaat cgtagttatc ggtacgaac 59
<210> 46
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NADH氧化酶基因NoxE下游引物NoxE-AN
<400> 46
ctatagggcg aattgggtac ttattttgca tttaaagctg caacag 46

Claims (10)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于：通过敲除大肠杆菌中的木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH、2-酮酸醛缩酶基因yagE和醇脱氢酶基因，过表达木糖脱氢酶基因和/或2-酮酸脱羧酶基因，过表达醛脱氢酶基因，当醛脱氢酶基因为醛脱氢酶基因pduP(L.b)和/或醛脱氢酶基因pduP(K.p)时，还需同时过表达硫解酶基因tesB，得到所述的一种重组大肠杆菌Ⅰ。
2.一种如权利要求1所述的一种重组大肠杆菌，其特征在于：在重组大肠杆菌Ⅰ中进行过表达木糖酸脱水酶基因、敲除2-酮酸还原酶基因、敲除丙酮醛合酶基因、敲除葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG和过表达NADH氧化酶基因中至少一种处理，得到所述的一种重组大肠杆菌Ⅱ。
3.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌为K12系列大肠杆菌。
4.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌，其特征在于：醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因yqhD、醇脱氢酶基因adhP、醇脱氢酶基因adhE和醇脱氢酶基因fucO中的一种以上；
木糖脱氢酶基因为木糖脱氢酶基因xylB；2-酮酸脱羧酶基因为2-酮酸脱羧酶基因mdlC；
醛脱氢酶基因为醛脱氢酶基因feaB、醛脱氢酶基因aldB、醛脱氢酶基因puuC、醛脱氢酶基因ydcW、醛脱氢酶基因pduP(L.b)和醛脱氢酶基因pduP(K.p)中的一种以上，过表达载体为pDHC29。
5.根据权利要求1所述的一种重组大肠杆菌，其特征在于：大肠杆菌为K12系列大肠杆菌中的MG1655；
醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因yqhD、醇脱氢酶基因adhP、醇脱氢酶基因adhE和醇脱氢酶基因fucO中的一种以上；
木糖脱氢酶基因为木糖脱氢酶基因xylB；2-酮酸脱羧酶基因为2-酮酸脱羧酶基因mdlC；
醛脱氢酶基因为醛脱氢酶基因feaB、醛脱氢酶基因aldB、醛脱氢酶基因puuC、醛脱氢酶基因ydcW、醛脱氢酶基因pduP(L.b)和醛脱氢酶基因pduP(K.p)中的一种以上，过表达载体为pDHC29。
6.根据权利要求2所述的一种重组大肠杆菌，其特征在于：木糖酸脱水酶基因为木糖酸脱水酶基因xylD和/或木糖酸脱水酶基因HVO_RS00180，过表达载体为pTrc99a；
2-酮酸还原酶基因为2-酮酸还原酶基因yiaE；
丙酮醛合酶基因为丙酮醛合酶基因mgsA；
NADH氧化酶基因为NADH氧化酶基因noxE，过表达载体为pDHC29；
采用Red同源重组技术进行基因敲除。
7.根据权利要求1～6任一项所述的一种重组大肠杆菌，其特征在于：
步骤一、制备木糖异构酶基因xylA敲除的重组大肠杆菌菌株A1
1.基因敲除所用的打靶片段DNA的制备
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的木糖异构酶基因xylA缺陷型大肠杆菌菌株JW3537-1，提取其基因组为模板，采用PCR分别扩增含有同源臂的基因片段，凝胶电泳分离，获得打靶片段DNA；上游引物xylA-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.1，下游引物xylA-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.2；
2.感受态细胞制备
将转入pKD46质粒的待敲除基因的大肠杆菌制成感受态细胞；
3.目的基因的敲除
将打靶片段DNA转入感受态细胞中，加入SOC培养基培养，然后在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上培养，待长出单菌落之后利用聚合酶采用PCR进行验证，验证结果正确即为敲除成功，筛选得到基因敲除的重组大肠杆菌菌株A1；
4.卡那霉素抗性基因的去除
接种重组大肠杆菌菌株A1于含有卡那霉素的LB液体培养基中培养，再转接至新鲜LB培养基培养，然后制成感受态细胞，转入pCP20质粒，在含有氨苄青霉素的LB培养基平板上培养，挑取单菌落，在LB液体培养基培养后，在LB固体培养基培养；分别挑取LB固体培养基中长出的单菌落，转移至LB固体培养基、含卡那霉素的LB固体培养基和含氨苄青霉素的LB固体培养基中培养，若含卡那霉素的LB固体培养基和含氨苄青霉素的LB固体培养基都无菌生长，而LB固体培养基有菌生长，则该菌已成功去除卡那霉素抗性基因；
步骤二、制备木糖异构酶基因xylA和2-酮酸醛缩酶基因yjhH双敲除的重组大肠杆菌菌株A2
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸醛缩酶基因yjhH缺陷型大肠杆菌菌株JW5775-2，上游引物yjhH-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.3，下游引物yjhH-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.4，在重组大肠杆菌菌株A1的基础上敲除2-酮酸醛缩酶基因yjhH，制得木糖异构酶基因xylA和2-酮酸醛缩酶基因yjhH双敲除的重组大肠杆菌菌株A2；去除重组大肠杆菌菌株A2的卡那霉素抗性基因；
其余方法同步骤一；
步骤三、制备木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE三敲除的重组大肠杆菌菌株A3
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸醛缩酶基因yagE缺陷型大肠杆菌菌株JW0261-2，上游引物yagE-的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.5，下游引物yagE-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.6，在重组大肠杆菌菌株A2的基础上进一步敲除2-酮酸醛缩酶基因yagE，制备得到木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH和2-酮酸醛缩酶基因yagE三敲除的重组大肠杆菌菌株A3；去除重组大肠杆菌菌株A3的卡那霉素抗性基因；
其余方法同步骤一；
步骤四、制备木糖异构酶基因xylA、2-酮酸醛缩酶基因yjhH、2-酮酸醛缩酶基因yagE和醇脱氢酶基因敲除的重组大肠杆菌菌株B-X
所述醇脱氢酶基因为醇脱氢酶基因yqhD、醇脱氢酶基因adhP、醇脱氢酶基因adhE和醇脱氢酶基因fucO中的一种以上，采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的醇脱氢酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及其对应引物如表3所示，在重组大肠杆菌菌株A3的基础上进一步敲除所述醇脱氢酶基因，制备得到大肠杆菌菌株B-X，X代表一种大肠杆菌菌株，取值为正整数；
表3 构建醇脱氢酶基因缺陷型大肠杆菌时打靶DNA片段供体菌株及对应引物
其余方法步骤同步骤一；
步骤五、构建过表达木糖脱氢酶基因和/或2-酮酸脱羧酶基因的重组载体质粒及含有所述重组载体质粒的重组大肠杆菌菌株C-X
1.过表达一个基因
(1)将载体质粒pTrc99a采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个木糖脱氢酶基因或一个2-酮酸脱羧酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增木糖脱氢酶基因或2-酮酸脱羧酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTRM-Y-X，Y表示质粒中含有的基因个数，取值为正整数，本步骤重组载体质粒为pTRM-1-X；
(3)将重组载体质粒pTRM-1-X转化入重组大肠杆菌菌株B-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒pTRM-1-X的重组大肠杆菌菌株C-X；
2.共同过表达两个基因
(1)将步骤五1(1)构建的重组载体质粒pTRM-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒pTRM-1-X中没有的另一个木糖脱氢酶基因或另一个2-酮酸脱羧酶基因，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTRM-2-X；
(3)将重组载体质粒pTRM-2-X转化入重组大肠杆菌菌株B-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒pTRM-2-X的重组大肠杆菌菌株C-X；
共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤五2类似；
其中，当过表达的基因为2-酮酸脱羧酶基因mdlC时：
限制性内切酶为Nco I和BamH I；以恶臭假单胞菌12633的基因组为模板，采用PCR扩增2-酮酸脱羧酶基因mdlC的基因片段，上游引物mdlC-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ IDNo.15，下游引物mdlC-A的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.16；
当过表达的基因为木糖脱氢酶基因xylB时：
限制性内切酶为BamH I和Hind III；以新月柄杆菌CB15基因组为模板，采用PCR方法扩增木糖脱氢酶基因xylB的基因片段，使用添加了RBS的上游引物xylB-的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.17；下游引物xylB-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.18；
步骤六、构建过表达醛脱氢酶基因的重组载体质粒及含有所述重组载体质粒的重组大肠杆菌菌株D-X
1.过表达一个基因
(1)将载体质粒pDHC29采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个醛脱氢酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增醛脱氢酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒PDH-Y-X，即PDH-1-X；
(3)将重组载体质粒PDH-1-X转化入重组大肠杆菌菌株C-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒PDH-1-X的重组大肠杆菌菌株D-X；
2.共同过表达两个基因
(1)将步骤六1(1)构建的重组载体质粒PDH-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒PDH-1-X中没有的另一个醛脱氢酶基因或硫解酶基因tesB，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒PDH-2-X；
(3)将重组载体质粒PDH-2-X转化入重组大肠杆菌菌株C-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒PDH-2-X的重组大肠杆菌菌株D-X；
共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤六2类似；
所述重组大肠杆菌菌株D-X为所述的一种重组大肠杆菌Ⅰ；
步骤七、构建过表达木糖酸脱水酶基因的重组质粒及含有所述重组质粒的重组大肠杆菌菌株
1.过表达一个基因
(1)将重组载体质粒pTRM-Y-X采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个木糖酸脱水酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增木糖酸脱水酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTRMD-Y-X，即pTRMD-1-X；
(3)将重组载体质粒pTRMD-1-X转化进入重组大肠杆菌菌株B-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒pTRMD-1-X的重组大肠杆菌菌株E-X；
2.共同过表达两个基因
(1)将步骤七1(1)构建的重组载体质粒pTRMD-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒pTRMD-1-X中没有的另一个木糖酸脱水酶基因，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pTRMD-2-X；
(3)将重组载体质粒pTRMD-2-X转化入大肠杆菌菌株B-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒pTRMD-2-X的重组大肠杆菌菌株E-X；
共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤七2类似；
步骤八、敲除重组大肠杆菌菌株中2-酮酸还原酶基因
1.在去除卡那霉素抗性基因的重组大肠杆菌菌株B-X中敲除2-酮酸还原酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株F-X；去除大肠杆菌菌株F-X的卡那霉素抗性基因；
当2-酮酸还原酶基因为2-酮酸还原酶基因yiaE时，采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的2-酮酸还原酶基因yiaE缺陷型大肠杆菌菌株JW5656，上游引物yiaE-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.19，下游引物yiaE-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.20；其余方法同步骤一；
2.将步骤七制得的重组载体质粒pTRMD-Y-X转化进入重组大肠杆菌菌株F-X，得到含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株F-X；
3.将步骤六制得的重组载体质粒pDH-Y-X转化进入含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株F-X，得到重组大肠杆菌菌株G-X；
步骤九、敲除重组大肠杆菌菌株中丙酮醛合酶基因
1.在重组大肠杆菌菌株F-X中敲除丙酮醛合酶基因，制备得到重组大肠杆菌菌株H-X；
当丙酮醛合酶基因为丙酮醛合酶基因mgsA时，采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的丙酮醛合酶基因mgsA缺陷型大肠杆菌菌株JW5129-1，上游引物mgsA-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.21，下游引物mgsA-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.22；其余方法同步骤一；
2.将步骤七制得的重组载体质粒pTRMD-Y-X转化进入重组大肠杆菌菌株H-X，得到含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株H-X；
3.将步骤六制得的重组载体质粒pDH-Y-X转化进入含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株H-X，得到重组大肠杆菌菌株I-X；
步骤十、敲除重组大肠杆菌菌株中的葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG
1.在重组大肠杆菌菌株F-X中敲除葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG，制备得到重组大肠杆菌菌株J-X；
采用从耶鲁大学菌种保藏中心购买的葡萄糖特异性转运蛋白酶II CBGlc基因ptsG缺陷型大肠杆菌菌株JW1087-2，上游引物ptsG-S的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.23，下游引物ptsG-AN的序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.24；其余方法同步骤一；
2.将步骤七制得的重组载体质粒pTRMD-Y-X转化进入重组大肠杆菌菌株J-X，得到含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株J-X；
3.将步骤六制得的重组载体质粒pDH-Y-X转化进入含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株J-X，得到重组大肠杆菌菌株K-X；
步骤十一、构建过量表达NADH氧化酶基因的重组大肠杆菌
1.将步骤七制得的重组载体质粒pTRMD-Y-X分别转化进入重组大肠杆菌菌株H-X和重组大肠杆菌菌株J-X，得到含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株H-X和含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株J-X；
2.过表达一个基因
(1)将载体质粒pDH-Y-X采用限制性内切酶处理成线性化载体，用琼脂糖凝胶电泳纯化；以含有一个NADH氧化酶基因的相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增NADH氧化酶基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pDHN-Y-X，即pDHN-1-X；
(3)将重组载体质粒pDHN-1-X分别转化进入含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株H-X的感受态细胞和含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株J-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒pDHN-1-X的重组大肠杆菌菌株L-X；
3.共同过表达两个基因
(1)将步骤十一1构建的重组载体质粒pDHN-1-X，采用限制性内切酶处理成线性化载体质粒，并采用琼脂糖凝胶电泳纯化；将重组载体质粒pDHN-1-X中没有的另一个NADH氧化酶基因，以其相应微生物菌种基因组为模板，用PCR扩增得到该基因片段，PCR扩增所得的基因片段采用相应的限制性内切酶处理，用琼脂糖凝胶电泳纯化；
(2)用T4 DNA连接酶将PCR扩增的基因片段与线性化载体质粒连接，获得重组载体质粒pDHN-2-X；
(3)将重组载体质粒pDHN-2-X分别转化进入含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株H-X的感受态细胞和含有重组载体质粒pTRMD-Y-X的重组大肠杆菌菌株J-X的感受态细胞，筛选，测序验证正确，得到含有重组载体质粒pDHN-2-X的重组大肠杆菌菌株L-X；
共同过表达三个以上的基因时，方法与步骤十一3类似；
所述重组大肠杆菌菌株E-X、重组大肠杆菌菌株G-X、重组大肠杆菌菌株I-X、重组大肠杆菌菌株K-X和重组大肠杆菌菌株L-X为所述的一种重组大肠杆菌Ⅱ。
8.根据权利要求7所述的一种重组大肠杆菌，其特征在于：PCR反应扩增体系如表1所示，PCR反应条件如表2所示：
表1 PCR反应扩增体系
ddH2O 33μL dNTP混和液 8μL 上游引物 2μL 下游引物 2μL PCR扩增缓冲液 50μL DNA聚合酶PrimerSTAR 1μL 扩增用DNA模板 4μL 合计 100μL
表2 PCR反应条件
9.一种重组大肠杆菌生物合成3,4-二羟基丁酸的方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
(1)接种环蘸取如权利要求1～6任一项所述重组大肠杆菌的菌液于LB固体培养基上重复划线过夜培养，得到活化的所述重组大肠杆菌的单菌落；
(2)挑取单菌落接种于普通LB培养中，于30℃～40℃培养，摇床转速100r/min～250r/min，过夜培养；
(3)发酵培养基采用LB液体培养基，根据重组大肠杆菌中重组载体质粒的抗性，加入相应抗生素，加入CaCO3以调节发酵过程中的pH>5；将步骤(2)培养好的菌液转接于发酵培养基，在30℃～35℃，100r/min～250r/min条件下进行发酵，转接6h后加入终浓度为5g/L～50g/L的底物以及终浓度为0.1mmol/L～10mmol/L IPTG诱导，发酵48h～72h发酵结束；所述底物为D-木糖，或D-木糖和葡萄糖。
10.一种重组大肠杆菌生物合成3,4-二羟基丁酸的方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
(1)接种环蘸取如权利要求7所述重组大肠杆菌的菌液于LB固体培养基上重复划线过夜培养，得到活化的所述重组大肠杆菌的单菌落；
(2)挑取单菌落接种于LB培养基中，于30℃～40℃培养，摇床转速100r/min～250r/min，过夜培养；
(3)发酵培养基采用LB液体培养基，根据重组大肠杆菌中重组载体质粒的抗性，加入相应抗生素，加入CaCO3以调节发酵过程中的pH>5；将步骤(2)培养好的菌液转接于发酵培养基，在30℃～35℃，100r/min～250r/min条件下进行发酵，转接6h后加入终浓度为5g/L～50g/L的底物以及终浓度为0.1mmol/L～10mmol/L IPTG诱导，发酵48h～72h发酵结束；所述底物为D-木糖，或D-木糖和葡萄糖。
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