CN111593014A

CN111593014A - 联产1,3-丙二醇和d-1,2,4-丁三醇的方法

Info

Publication number: CN111593014A
Application number: CN202010591058.3A
Authority: CN
Inventors: 诸葛斌; 刘郁青; 李玉石; 陆信曜; 宗红
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-06-24
Filing date: 2020-06-24
Publication date: 2020-08-28
Anticipated expiration: 2040-06-24
Also published as: CN111593014B

Abstract

本发明公开了联产1,3‑丙二醇和D‑1,2,4‑丁三醇的方法，属于发酵技术领域以及生物技术领域。本发明提供了一种可高效转化甘油和木糖联产1,3‑丙二醇和D‑1,2,4‑丁三醇的重组克雷伯氏菌，此重组克雷伯氏菌以克雷伯氏菌为宿主，表达编码木糖脱氢酶的基因xdh、编码2‑酮异戊酸脱羧酶的基因kivD以及编码木糖酸脱水酶的基因yjhG；将此重组克雷伯氏菌接种至含有甘油和木糖的发酵培养基中发酵48h，即可使发酵液中1,3‑丙二醇的产量高达18.1g/L、D‑1,2,4‑丁三醇的产量高达3.3g/L，此时，发酵液中甘油的转化率高达45.3％、木糖的转化率高达12.3％。

Description

联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇的方法

技术领域

本发明涉及联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇的方法，属于发酵技术领域以及生物技术领域。

背景技术

1,3-丙二醇(1,3-propanediol，1,3-PDO)为无色、无臭，具有咸味和吸湿性的黏稠液体。在聚氨酯行业中，它常用作聚酯多元醇的原料、聚醚多元醇的起始剂和聚氨酯的扩链剂等；在有机化工行业中，它是重要的单体和中间体，最主要的用途是作为聚合物单体合成聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)。因此，1,3-丙二醇的市场容量巨大。

目前，工业上常通过将可生产1,3-丙二醇的肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)接种至含有甘油的发酵培养基中进行发酵以生产1,3-丙二醇。但是，肺炎克雷伯菌以甘油作为碳源生产1,3-丙二醇时还原力不足，这直接导致了甘油的转化率低下以及1,3-丙二醇的产量低下(具体可见参考文献：付晓萌.利用木糖途径对克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇代谢中NAD(P)H-NAD(P)的研究[D].[硕士学位论文].无锡:江南大学生物工程学院,2015.)。

研究表明，木糖的加入可有效增加肺炎克雷伯菌以甘油作为碳源生产1,3-丙二醇时的还原力，进而提高肺炎克雷伯菌以甘油作为碳源生产1,3-丙二醇时的甘油转化率和1,3-丙二醇产量(具体可见参考文献：陈琳,王领民,金平,等.甘油和木糖共发酵生产1,3-丙二醇的研究[J].化学工程,2013,41(07):5-8.)。但是，木糖的价格偏高，并且，木糖在1,3-丙二醇生产过程中的转化率低下，这严重限制了木糖在1,3-丙二醇生产中的应用。

因此，急需找到一种提高木糖在1,3-丙二醇生产过程中的转化率的方法。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种木糖转化率高的生产1,3-丙二醇的方法。

[技术方案]

为解决本发明的技术问题，本发明提供了一种重组克雷伯氏菌，所述重组克雷伯氏菌以克雷伯氏菌(Klebsiella)为宿主，表达编码木糖脱氢酶的基因xdh、编码2-酮异戊酸脱羧酶的基因kivD以及编码木糖酸脱水酶的基因yjhG。

在本发明的一种实施方式中，所述克雷伯氏菌为肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)。

在本发明的一种实施方式中，所述木糖脱氢酶来源于新月柄杆菌(Caulobactercrescentus)。

在本发明的一种实施方式中，所述木糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码木糖脱氢酶的基因xdh的核苷酸序列如SEQID No.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述2-酮异戊酸脱羧酶来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。

在本发明的一种实施方式中，所述2-酮异戊酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码2-酮异戊酸脱羧酶的基因kivD的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述木糖酸脱水酶来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)。

在本发明的一种实施方式中，所述木糖酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述编码木糖酸脱水酶的基因yjhG的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组克雷伯氏菌以克雷伯氏菌(Klebsiella)为宿主，以pEtac质粒为表达载体，表达编码木糖脱氢酶的基因xdh、编码2-酮异戊酸脱羧酶的基因kivD以及编码木糖酸脱水酶的基因yjhG。

本发明还提供了一种联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇的方法，所述方法为先将上述重组克雷伯氏菌接种至含有甘油和木糖的发酵培养基中进行发酵，获得发酵液，然后将发酵液进行提取，获得1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为35～40℃。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为37℃。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的转速为170～200rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的转速为180rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含葡萄糖10g/L、木糖30g/L、甘油20g/L、酵母粉7.5g/L、氯化钠15g/L、蛋白胨15g/L、MgSO₄ 2g/L、(NH₄)₂SO₄ 2g/L、KH₂PO₄ 7.5g/L、FeSO₄·7H₂O 0.005g/L、VB₁₂ 5g/L以及微量元素溶液100μL/L；所述微量元素溶液的成分包含ZnCl₂ 0.7g/L、MnCL₂·4H₂O 1g/L、H₃BO₃ 0.6g/L、CoCL₂·6H₂O 2g/L、CuCL₂0.2g/L、NiCL₂·6H₂O 0.25g/L以及Na₂MoO₄·2H₂O 0.35g/L。

本发明还提供了上述重组克雷伯氏菌或上述方法在生产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇方面的应用。

[有益效果]

(1)本发明提供了一种可高效转化甘油和木糖联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇的重组克雷伯氏菌，此重组克雷伯氏菌以克雷伯氏菌为宿主，表达编码木糖脱氢酶的基因xdh、编码2-酮异戊酸脱羧酶的基因kivD以及编码木糖酸脱水酶的基因yjhG；将此重组克雷伯氏菌接种至含有甘油和木糖的发酵培养基中发酵48h，即可使发酵液中1,3-丙二醇的产量高达18.1g/L、D-1,2,4-丁三醇的产量高达3.3g/L，此时，发酵液中甘油的转化率高达45.3％、木糖的转化率高达12.3％。

(2)本发明提供了一种高效转化甘油和木糖联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇的方法，此方法为将表达编码木糖脱氢酶的基因xdh、编码2-酮异戊酸脱羧酶的基因kivD以及编码木糖酸脱水酶的基因yjhG的重组克雷伯氏菌接种至含有甘油和木糖的发酵培养基中进行发酵；利用此方法发酵48h，即可使发酵液中1,3-丙二醇的产量高达18.1g/L、D-1,2,4-丁三醇的产量高达3.3g/L，此时，发酵液中甘油的转化率高达45.3％、木糖的转化率高达12.3％；并且，由于D-1,2,4-丁三醇价值较高，利用此方法转化甘油和木糖联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇的价效高达12.31元/L，远高于单独合成1,3-丙二醇，利润较高。

附图说明

图1：重组质粒pEtac-yjhG-tac-kivD-tac-xdh的酶切酶切验证结果；其中，M：2503DNA marker；1：XbaⅠ单酶切产物；2：XbaⅠ和NcoⅠ双酶切产物。

图2：重组质粒pEtac-yjhG-tac-kivD-tac-xdh的质粒图谱。

图3：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中生物量的变化。

图4：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中甘油和1,3-丙二醇含量的变化。

图5：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中木糖和D-1,2,4-丁三醇含量的变化。

图6：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中2,3-丁二醇含量的变化。

图7：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中琥珀酸含量的变化。

图8：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中乳酸含量的变化。

图9：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中乙酸含量的变化。

图10：不同肺炎克雷伯菌发酵获得的发酵液中乙醇含量的变化。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110购自上海北诺生物科技有限公司；下述实施例中涉及的肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)JI22914购自标准品信息网，产品编号为：JI22914。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L。

LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 10g/L、琼脂15g/L。

发酵培养基：葡萄糖10g/L、木糖30g/L、甘油20g/L、酵母粉7.5g/L、氯化钠15g/L、蛋白胨15g/L、MgSO₄ 2g/L、(NH₄)₂SO₄ 2g/L、KH₂PO₄ 7.5g/L、FeSO₄·7H₂O 0.005g/L、VB₁₂5g/L以及微量元素溶液100μL/L；所述微量元素溶液的成分包含ZnCl₂ 0.7g/L、MnCL₂·4H₂O1g/L、H₃BO₃ 0.6g/L、CoCL₂·6H₂O 2g/L、CuCL₂ 0.2g/L、NiCL₂·6H₂O 0.25g/L以及Na₂MoO₄·2H₂O 0.35g/L。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

发酵液中生物量的测定：通过紫外分光光度计检测发酵液的OD₆₀₀值，细胞干重(DCW)与测得的OD₆₀₀值的对应关系公式为0.36g/L＝1OD₆₀₀。

发酵液中甘油、木糖、1,3-PDO、BT、2,3-丁二醇、乙酸、琥珀酸、乙醇以及乳酸含量的测定：将发酵液经10000g离心15min后，取500μL上清液经0.22μm水系微孔滤膜处理后进行液相检测；色谱柱为Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm，9μm)；流动相为5mmol·L^-1H₂SO₄；柱温为60℃；流速为0.6mL·min^-1；进样体积为20μL；检测器为紫外检测器和示差折光检测器。

实施例1：重组肺炎克雷伯菌的构建

具体步骤如下：

合成来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的编码木糖酸脱水酶的基因yjhG(SEQID No.6)；将合成得到的编码2-酮异戊酸脱羧酶的基因kivD与重组质粒pEtac-kivD-tac-xdh(记载于文献“Jing P Y,Cao X,Lu X Y,etc.Modification of an engineeredEscherichia coli by a combined strategy of deleting branch pathway,fine-tuning xylose isomerase expression,and substituting decarboxylase to improve1,2,4-butanetriol production[J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2018,126(5):547-552.”中，tac启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示)经限制性内切酶Xba I和Nco I酶切后进行连接，得到连接产物；将连接产物转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21，得到转化产物；将转化产物涂布在LB固体培养基(含有50μg·mL^-1卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证(验证结果见图1)以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pEtac-yjhG-tac-kivD-tac-xdh(质粒图谱见图2)；将获得的重组质粒pEtac-yjhG-tac-kivD-tac-xdh电击转化肺炎克雷伯菌(KlebsiellaPneumoniae)JI22914，得到转化产物；将转化产物涂布于LB固体培养基(含有10μg·mL^-1卡那霉素)，于37℃恒温培养箱中倒置培养36h，得到转化子；挑取转化子接种至LB液体培养基中，于37℃恒温培养箱中、120～180rpm的条件下摇瓶培养36h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组肺炎克雷伯菌JI22914/pEtac-yjhG-tac-kivD-tac-xdh。

实施例2：1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇的联产

具体步骤如下：

以肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)JI22914为对照，将实施例1获得的重组肺炎克雷伯菌JI22914/pEtac-yjhG-tac-kivD-tac-xdh的单菌落划线接种于LB固体培养基中，于37℃培养12～14h，形成单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基中，37℃、100rpm下培养12h，得到一级种子液；按照1％(v/v)的接种量将一级种子液转接到新的LB液体培养基中，37℃、100rpm下培养8h，得到二级种子液；按照4％(v/v)的接种量将二级种子液转接到发酵培养基中，37℃、150rpm下震荡培养48h，得到发酵液。

检测发酵液中的生物量、甘油含量、1,3-丙二醇含量、木糖含量、D-1,2,4-丁三醇含量、2,3-丁二醇含量、琥珀酸酯含量、乳酸盐含量以及乙醇含量变化，检测结果见图3-10。计算发酵液中甘油的转化率，并且，计算发酵液中木糖的转化率；

其中，甘油的转化率＝(1,3-丙二醇浓度/甘油浓度)×100％；

木糖的转化率＝(D-1,2,4-丁三醇浓度/木糖浓度)×100％。

由图3-10可知，发酵48h时，重组肺炎克雷伯菌JI22914/pEtac-yjhG-tac-kivD-tac-xdh发酵获得的发酵液中1,3-丙二醇的产量高达18.1g/L、D-1,2,4-丁三醇的产量高达3.3g/L、甘油的转化率高达45.3％、木糖的转化率高达12.3％，而肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)JI22914发酵获得的发酵液中1,3-丙二醇的产量仅有16g/L、D-1,2,4-丁三醇的产量为0g/L、甘油的转化率仅有40％、木糖的转化率为0％。可见，重组肺炎克雷伯菌JI22914/pEtac-yjhG-tac-kivD-tac-xdh可高效转化甘油和木糖联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇，而肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)JI22914无此能力。

甘油的市值为6元/kg、木糖的市值为178元/kg、1,3-丙二醇的市值为20元/kg、D-1,2,4-丁三醇的市值为3720元/kg，根据产物价值计算利用重组肺炎克雷伯菌JI22914/pEtac-yjhG-tac-kivD-tac-xdh转化甘油和木糖联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇的价效，计算结果为12.31元/L，可见，利用重组肺炎克雷伯菌JI22914/pEtac-yjhG-tac-kivD-tac-xdh转化甘油和木糖联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇的利润较高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇的方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 249

<212> PRT

<213> 新月柄杆菌

<400> 1

Met Ser Ser Ala Ile Tyr Pro Gln Leu Lys Gly Lys Arg Val Val Ile

1 5 10 15

Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ile Gly Ala Gly Leu Val Ala Gly Phe Val

20 25 30

Arg Gln Gly Ala Glu Val Ile Phe Leu Asp Ile Val Asp Ala Asp Ser

35 40 45

Gln Ala Leu Val Ala Glu Leu Ser Lys Asn Ala Ala Ile Ala Pro Val

50 55 60

Tyr Lys Arg Cys Asp Leu Met Asp Ile Asp Ala Leu Lys Ala Val Phe

65 70 75 80

Ala Glu Ile Gly Asp Val Asp Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Asn Asp

85 90 95

Asp Arg His Ser Leu Ser Asp Leu Thr Pro Glu Tyr Trp Asp Asn Arg

100 105 110

Ile Gly Val Asn Leu Arg His Met Val Phe Ala Ala Gln Ala Val Ala

115 120 125

Asp Gly Met Arg Lys Arg Gly Gly Gly Ala Ile Ile Asn Phe Gly Ser

130 135 140

Ile Ser Trp His Leu Gly Leu Glu Asp Leu Val Leu Tyr Glu Thr Ala

145 150 155 160

Lys Ala Gly Ile Glu Gly Met Ser Arg Ala Leu Ala Arg Glu Leu Gly

165 170 175

Pro Asp Asp Ile Arg Val Thr Cys Val Val Pro Gly Asn Val Lys Thr

180 185 190

Lys Arg Gln Glu Lys Trp Tyr Thr Pro Glu Gly Glu Ala Glu Ile Val

195 200 205

Lys Ala Gln Cys Leu Lys Gly Arg Ile Leu Pro Asp His Val Ala Ser

210 215 220

Leu Val Leu Phe Leu Ala Ser Asp Asp Ala Ser Leu Cys Thr Gly His

225 230 235 240

Glu Tyr Trp Ile Asp Ala Gly Trp Arg

245

<210> 2

<211> 750

<212> DNA

<213> 新月柄杆菌

<400> 2

atgtcctcag ccatctatcc ccagctgaag ggcaagcgcg tcgtcatcac cggcggcggt 60

tcgggcatcg gcgcgggcct cgtcgccggc ttcgtgcgcc agggcgccga ggtgatcttc 120

ctcgacatcg tcgacgcgga ctcccaggcc ctggtcgccg agttgtcgaa gaacgcggcc 180

atcgcgcccg tctacaagcg ctgcgacctg atggacatcg acgcgctgaa ggcggtcttc 240

gccgagatcg gcgacgtcga cgttctggtc aacaacgccg gcaacgacga ccgtcacagc 300

ctgtcggacc tgacgcccga atactgggac aaccgcatcg gcgtgaacct gcgccacatg 360

gtgttcgcgg cccaggccgt cgcggacggc atgaggaagc gcggcggcgg cgccatcatc 420

aacttcggct cgatcagctg gcacctgggc ctggaggacc tcgtcctcta cgaaaccgcc 480

aaggccggca tcgagggcat gtcccgggcg ctggcccgcg agctgggtcc cgacgacatc 540

cgcgtcacct gcgtggtgcc aggcaacgtc aagaccaagc gccaggagaa gtggtacacg 600

ccggaaggcg aggccgagat cgtcaaggcc cagtgcctga agggccgcat cctgcccgat 660

cacgtcgctt cgctggtgct gttcctggcc tcggacgacg cctcgctctg caccggtcac 720

gagtactgga tcgacgccgg ctggcgttga 750

<210> 3

<211> 548

<212> PRT

<213> 乳酸乳球菌

<400> 3

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1 5 10 15

Ile Glu Glu Ile Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu Gln Phe Leu

20 25 30

Asp Gln Ile Ile Ser His Lys Asp Met Lys Trp Val Gly Asn Ala Asn

35 40 45

Glu Leu Asn Ala Ser Tyr Met Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Thr Lys Lys

50 55 60

Ala Ala Ala Phe Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser Ala Val

65 70 75 80

Asn Gly Leu Ala Gly Ser Tyr Ala Glu Asn Leu Pro Val Val Glu Ile

85 90 95

Val Gly Ser Pro Thr Ser Lys Val Gln Asn Glu Gly Lys Phe Val His

100 105 110

His Thr Leu Ala Asp Gly Asp Phe Lys His Phe Met Lys Met His Glu

115 120 125

Pro Val Thr Ala Ala Arg Thr Leu Leu Thr Ala Glu Asn Ala Thr Val

130 135 140

Glu Ile Asp Arg Val Leu Ser Ala Leu Leu Lys Glu Arg Lys Pro Val

145 150 155 160

Tyr Ile Asn Leu Pro Val Asp Val Ala Ala Ala Lys Ala Glu Lys Pro

165 170 175

Ser Leu Pro Leu Lys Lys Glu Asn Ser Thr Ser Asn Thr Ser Asp Gln

180 185 190

Glu Ile Leu Asn Lys Ile Gln Glu Ser Leu Lys Asn Ala Lys Lys Pro

195 200 205

Ile Val Ile Thr Gly His Glu Ile Ile Ser Phe Gly Leu Glu Lys Thr

210 215 220

Val Thr Gln Phe Ile Ser Lys Thr Lys Leu Pro Ile Thr Thr Leu Asn

225 230 235 240

Phe Gly Lys Ser Ser Val Asp Glu Ala Leu Pro Ser Phe Leu Gly Ile

245 250 255

Tyr Asn Gly Thr Leu Ser Glu Pro Asn Leu Lys Glu Phe Val Glu Ser

260 265 270

Ala Asp Phe Ile Leu Met Leu Gly Val Lys Leu Thr Asp Ser Ser Thr

275 280 285

Gly Ala Phe Thr His His Leu Asn Glu Asn Lys Met Ile Ser Leu Asn

290 295 300

Ile Asp Glu Gly Lys Ile Phe Asn Glu Arg Ile Gln Asn Phe Asp Phe

305 310 315 320

Glu Ser Leu Ile Ser Ser Leu Leu Asp Leu Ser Glu Ile Glu Tyr Lys

325 330 335

Gly Lys Tyr Ile Asp Lys Lys Gln Glu Asp Phe Val Pro Ser Asn Ala

340 345 350

Leu Leu Ser Gln Asp Arg Leu Trp Gln Ala Val Glu Asn Leu Thr Gln

355 360 365

Ser Asn Glu Thr Ile Val Ala Glu Gln Gly Thr Ser Phe Phe Gly Ala

370 375 380

Ser Ser Ile Phe Leu Lys Ser Lys Ser His Phe Ile Gly Gln Pro Leu

385 390 395 400

Trp Gly Ser Ile Gly Tyr Thr Phe Pro Ala Ala Leu Gly Ser Gln Ile

405 410 415

Ala Asp Lys Glu Ser Arg His Leu Leu Phe Ile Gly Asp Gly Ser Leu

420 425 430

Gln Leu Thr Val Gln Glu Leu Gly Leu Ala Ile Arg Glu Lys Ile Asn

435 440 445

Pro Ile Cys Phe Ile Ile Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Val Glu Arg Glu

450 455 460

Ile His Gly Pro Asn Gln Ser Tyr Asn Asp Ile Pro Met Trp Asn Tyr

465 470 475 480

Ser Lys Leu Pro Glu Ser Phe Gly Ala Thr Glu Asp Arg Val Val Ser

485 490 495

Lys Ile Val Arg Thr Glu Asn Glu Phe Val Ser Val Met Lys Glu Ala

500 505 510

Gln Ala Asp Pro Asn Arg Met Tyr Trp Ile Glu Leu Ile Leu Ala Lys

515 520 525

Glu Gly Ala Pro Lys Val Leu Lys Lys Met Gly Lys Leu Phe Ala Glu

530 535 540

Gln Asn Lys Ser

545

<210> 4

<211> 1647

<212> DNA

<213> 乳酸乳球菌

<400> 4

atgtatacag taggagatta cctattagac cgattacacg agttaggaat tgaagaaatt 60

tttggagtcc ctggagacta taacttacaa tttttagatc aaattatttc ccacaaggat 120

atgaaatggg tcggaaatgc taatgaatta aatgcttcat atatggctga tggctatgct 180

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aatggattag caggaagtta cgccgaaaat ttaccagtag tagaaatagt gggatcacct 300

acatcaaaag ttcaaaatga aggaaaattt gttcatcata cgctggctga cggtgatttt 360

aaacacttta tgaaaatgca cgaacctgtt acagcagctc gaactttact gacagcagaa 420

aatgcaaccg ttgaaattga ccgagtactt tctgcactat taaaagaaag aaaacctgtc 480

tatatcaact taccagttga tgttgctgct gcaaaagcag agaaaccctc actccctttg 540

aaaaaggaaa actcaacttc aaatacaagt gaccaagaaa ttttgaacaa aattcaagaa 600

agcttgaaaa atgccaaaaa accaatcgtg attacaggac atgaaataat tagttttggc 660

ttagaaaaaa cagtcactca atttatttca aagacaaaac tacctattac gacattaaac 720

tttggtaaaa gttcagttga tgaagccctc ccttcatttt taggaatcta taatggtaca 780

ctctcagagc ctaatcttaa agaattcgtg gaatcagccg acttcatctt gatgcttgga 840

gttaaactca cagactcttc aacaggagcc ttcactcatc atttaaatga aaataaaatg 900

atttcactga atatagatga aggaaaaata tttaacgaaa gaatccaaaa ttttgatttt 960

gaatccctca tctcctctct cttagaccta agcgaaatag aatacaaagg aaaatatatc 1020

gataaaaagc aagaagactt tgttccatca aatgcgcttt tatcacaaga ccgcctatgg 1080

caagcagttg aaaacctaac tcaaagcaat gaaacaatcg ttgctgaaca agggacatca 1140

ttctttggcg cttcatcaat tttcttaaaa tcaaagagtc attttattgg tcaaccctta 1200

tggggatcaa ttggatatac attcccagca gcattaggaa gccaaattgc agataaagaa 1260

agcagacacc ttttatttat tggtgatggt tcacttcaac ttacagtgca agaattagga 1320

ttagcaatca gagaaaaaat taatccaatt tgctttatta tcaataatga tggttataca 1380

gtcgaaagag aaattcatgg accaaatcaa agctacaatg atattccaat gtggaattac 1440

tcaaaattac cagaatcgtt tggagcaaca gaagatcgag tagtctcaaa aatcgttaga 1500

actgaaaatg aatttgtgtc tgtcatgaaa gaagctcaag cagatccaaa tagaatgtac 1560

tggattgagt taattttggc aaaagaaggt gcaccaaaag tactgaaaaa aatgggcaaa 1620

ctatttgctg aacaaaataa atcataa 1647

<210> 5

<211> 655

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 5

Met Ser Val Arg Asn Ile Phe Ala Asp Glu Ser His Asp Ile Tyr Thr

1 5 10 15

Val Arg Thr His Ala Asp Gly Pro Asp Gly Glu Leu Pro Leu Thr Ala

20 25 30

Glu Met Leu Ile Asn Arg Pro Ser Gly Asp Leu Phe Gly Met Thr Met

35 40 45

Asn Ala Gly Met Gly Trp Ser Pro Asp Glu Leu Asp Arg Asp Gly Ile

50 55 60

Leu Leu Leu Ser Thr Leu Gly Gly Leu Arg Gly Ala Asp Gly Lys Pro

65 70 75 80

Val Ala Leu Ala Leu His Gln Gly His Tyr Glu Leu Asp Ile Gln Met

85 90 95

Lys Ala Ala Ala Glu Val Ile Lys Ala Asn His Ala Leu Pro Tyr Ala

100 105 110

Val Tyr Val Ser Asp Pro Cys Asp Gly Arg Thr Gln Gly Thr Thr Gly

115 120 125

Met Phe Asp Ser Leu Pro Tyr Arg Asn Asp Ala Ser Met Val Met Arg

130 135 140

Arg Leu Ile Arg Ser Leu Pro Asp Ala Lys Ala Val Ile Gly Val Ala

145 150 155 160

Ser Cys Asp Lys Gly Leu Pro Ala Thr Met Met Ala Leu Ala Ala Gln

165 170 175

His Asn Ile Ala Thr Val Leu Val Pro Gly Gly Ala Thr Leu Pro Ala

180 185 190

Lys Asp Gly Glu Asp Asn Gly Lys Val Gln Thr Ile Gly Ala Arg Phe

195 200 205

Ala Asn Gly Glu Leu Ser Leu Gln Asp Ala Arg Arg Ala Gly Cys Lys

210 215 220

Ala Cys Ala Ser Ser Gly Gly Gly Cys Gln Phe Leu Gly Thr Ala Gly

225 230 235 240

Thr Ser Gln Val Val Ala Glu Gly Leu Gly Leu Ala Ile Pro His Ser

245 250 255

Ala Leu Ala Pro Ser Gly Glu Pro Val Trp Arg Glu Ile Ala Arg Ala

260 265 270

Ser Ala Arg Ala Ala Leu Asn Leu Ser Gln Lys Gly Ile Thr Thr Arg

275 280 285

Glu Ile Leu Thr Asp Lys Ala Ile Glu Asn Ala Met Thr Val His Ala

290 295 300

Ala Phe Gly Gly Ser Thr Asn Leu Leu Leu His Ile Pro Ala Ile Ala

305 310 315 320

His Gln Ala Gly Cys His Ile Pro Thr Val Asp Asp Trp Ile Arg Ile

325 330 335

Asn Lys Arg Val Pro Arg Leu Val Ser Val Leu Pro Asn Gly Pro Val

340 345 350

Tyr His Pro Thr Val Asn Ala Phe Met Ala Gly Gly Val Pro Glu Val

355 360 365

Met Leu His Leu Arg Ser Leu Gly Leu Leu His Glu Asp Val Met Thr

370 375 380

Val Thr Gly Ser Thr Leu Lys Glu Asn Leu Asp Trp Trp Glu His Ser

385 390 395 400

Glu Arg Arg Gln Arg Phe Lys Gln Leu Leu Leu Asp Gln Glu Gln Ile

405 410 415

Asn Ala Asp Glu Val Ile Met Ser Pro Gln Gln Ala Lys Ala Arg Gly

420 425 430

Leu Thr Ser Thr Ile Thr Phe Pro Val Gly Asn Ile Ala Pro Glu Gly

435 440 445

Ser Val Ile Lys Ser Thr Ala Ile Asp Pro Ser Met Ile Asp Glu Gln

450 455 460

Gly Ile Tyr Tyr His Lys Gly Val Ala Lys Val Tyr Leu Ser Glu Lys

465 470 475 480

Ser Ala Ile Tyr Asp Ile Lys His Asp Lys Ile Lys Ala Gly Asp Ile

485 490 495

Leu Val Ile Ile Gly Val Gly Pro Ser Gly Thr Gly Met Glu Glu Thr

500 505 510

Tyr Gln Val Thr Ser Ala Leu Lys His Leu Ser Tyr Gly Lys His Val

515 520 525

Ser Leu Ile Thr Asp Ala Arg Phe Ser Gly Val Ser Thr Gly Ala Cys

530 535 540

Ile Gly His Val Gly Pro Glu Ala Leu Ala Gly Gly Pro Ile Gly Lys

545 550 555 560

Leu Arg Thr Gly Asp Leu Ile Glu Ile Lys Ile Asp Cys Arg Glu Leu

565 570 575

His Gly Glu Val Asn Phe Leu Gly Thr Arg Ser Asp Glu Gln Leu Pro

580 585 590

Ser Gln Glu Glu Ala Thr Ala Ile Leu Asn Ala Arg Pro Ser His Gln

595 600 605

Asp Leu Leu Pro Asp Pro Glu Leu Pro Asp Asp Thr Arg Leu Trp Ala

610 615 620

Met Leu Gln Ala Val Ser Gly Gly Thr Trp Thr Gly Cys Ile Tyr Asp

625 630 635 640

Val Asn Lys Ile Gly Ala Ala Leu Arg Asp Phe Met Asn Lys Asn

645 650 655

<210> 6

<211> 1968

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 6

atgtctgttc gcaatatttt tgctgacgag agccacgata tttacaccgt cagaacgcac 60

gccgatggcc cggacggcga actcccatta accgcagaga tgcttatcaa ccgcccgagc 120

ggggatctgt tcggtatgac catgaatgcc ggaatgggtt ggtctccgga cgagctggat 180

cgggacggta ttttactgct cagtacactc ggtggcttac gcggcgcaga cggtaaaccc 240

gtggcgctgg cgttgcacca ggggcattac gaactggaca tccagatgaa agcggcggcc 300

gaggttatta aagccaacca tgccctgccc tatgccgtgt acgtctccga tccttgtgac 360

gggcgtactc agggtacaac ggggatgttt gattcgctac cataccgaaa tgacgcatcg 420

atggtaatgc gccgccttat tcgctctctg cccgacgcga aagcagttat tggtgtggcg 480

agttgcgata aggggcttcc ggccaccatg atggcactcg ccgcgcagca caacatcgca 540

accgtgctgg tccccggcgg cgcgacgctg cccgcaaagg atggagaaga caacggcaag 600

gtgcaaacca ttggcgcacg cttcgccaat ggcgaattat ctctacagga cgcacgccgt 660

gcgggctgta aagcctgtgc ctcttccggc ggcggctgtc aatttttggg cactgccggg 720

acatctcagg tggtggccga aggattggga ctggcaatcc cacattcagc cctggcccct 780

tccggtgagc ctgtgtggcg ggagatcgcc agagcttccg cgcgagctgc gctgaacctg 840

agtcaaaaag gcatcaccac ccgggaaatt ctcaccgata aagcgataga gaatgcgatg 900

acggtccatg ccgcgttcgg tggttcaaca aacctgctgt tacacatccc ggcaattgct 960

caccaggcag gttgccatat cccgaccgtt gatgactgga tccgcatcaa caagcgcgtg 1020

ccccgactgg tgagcgtact gcctaatggc ccggtttatc atccaacggt caatgccttt 1080

atggcaggtg gtgtgccgga agtcatgttg catctgcgca gcctcggatt gttgcatgaa 1140

gacgttatga cggttaccgg cagcacgctg aaagaaaacc tcgactggtg ggagcactcc 1200

gaacggcgtc agcggttcaa gcaactcctg ctcgatcagg aacaaatcaa cgctgacgaa 1260

gtgatcatgt ctccgcagca agcaaaagcg cgcggattaa cctcaactat caccttcccg 1320

gtgggcaata ttgcgccaga aggttcggtg atcaaatcca ccgccattga cccctcgatg 1380

attgatgagc aaggtatcta ttaccataaa ggtgtggcga aggtttatct gtccgagaaa 1440

agtgcgattt acgatatcaa acatgacaag atcaaggcgg gcgatattct ggtcattatt 1500

ggcgttggac cttcaggtac agggatggaa gaaacctacc aggttaccag tgccctgaag 1560

catctgtcat acggtaagca tgtttcgtta atcaccgatg cacgtttctc gggcgtttct 1620

actggcgcgt gcatcggcca tgtggggcca gaagcgctgg ccggaggccc catcggtaaa 1680

ttacgcaccg gggatttaat tgaaattaaa attgattgtc gcgagcttca cggcgaagtc 1740

aatttcctcg gaacccgtag cgatgaacaa ttaccttcac aggaggaggc aactgcaata 1800

ttaaatgcca gacccagcca tcaggattta cttcccgatc ctgaattgcc agatgatacc 1860

cggctatggg caatgcttca ggccgtgagt ggtgggacat ggaccggttg tatttatgat 1920

gtaaacaaaa ttggcgcggc tttgcgcgat tttatgaata aaaactga 1968

<210> 7

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggagcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 60

tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 120

gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 180

gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 240

cacacaggaa aca 253

Claims

1.一种重组克雷伯氏菌，其特征在于，所述重组克雷伯氏菌以克雷伯氏菌(Klebsiella)为宿主，表达编码木糖脱氢酶的基因xdh、编码2-酮异戊酸脱羧酶的基因kivD以及编码木糖酸脱水酶的基因yjhG。

2.如权利要求1所述的一种重组克雷伯氏菌，其特征在于，所述克雷伯氏菌为肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)。

3.如权利要求1或2所述的一种重组克雷伯氏菌，其特征在于，所述木糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.如权利要求1-3任一项所述的一种重组克雷伯氏菌，其特征在于，所述2-酮异戊酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

5.如权利要求1-4任一项所述的一种重组克雷伯氏菌，其特征在于，所述木糖酸脱水酶的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。

6.如权利要求1-5任一项所述的一种重组克雷伯氏菌，其特征在于，所述重组克雷伯氏菌以克雷伯氏菌(Klebsiella)为宿主，以pEtac质粒为表达载体，表达编码木糖脱氢酶的基因xdh、编码2-酮异戊酸脱羧酶的基因kivD以及编码木糖酸脱水酶的基因yjhG。

7.一种联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求1-6任一项所述的重组克雷伯氏菌接种至含有甘油和木糖的发酵培养基中进行发酵，获得发酵液，然后将发酵液进行提取，获得1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇。

8.如权利要求7所述的一种联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，所述发酵的温度为35～40℃。

9.如权利要求7或8所述的一种联产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇的方法，其特征在于，所述发酵的转速为170～200rpm。

10.权利要求1-6任一项所述的重组克雷伯氏菌或权利要求7-9任一项所述的方法在生产1,3-丙二醇和D-1,2,4-丁三醇方面的应用。