CN109468305B

CN109468305B - 木糖异构酶突变体、编码该酶的dna分子、导入该dna分子的重组菌株及它们的应用

Info

Publication number: CN109468305B
Application number: CN201711485502.8A
Authority: CN
Inventors: 佟毅; 张子剑; 贾力耕; 沈乃东; 何太波; 宋思琦; 苏立国; 张媛; 王靖; 张广昊; 吴延东; 李义; 袁敬伟
Original assignee: COFCO BIOCHEMICAL ENERGY (ZHAODONG) CO LTD; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd; Cofco Jilin Bio Chemical Technology Co Ltd
Current assignee: COFCO BIOCHEMICAL ENERGY (ZHAODONG) CO LTD; Cofco Nutrition and Health Research Institute Co Ltd; Cofco Jilin Bio Chemical Technology Co Ltd
Priority date: 2017-12-29
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2037-12-29
Also published as: CN109468305A

Abstract

本发明涉及具有提高的催化活性的木糖异构酶突变体、编码该酶的DNA分子、含有该DNA分子的重组菌株及它们的应用。通过对天然木糖异构酶中特定位点的氨基酸残基进行突变，能够获得催化活性提高的木糖异构酶突变体，并且所获得的木糖异构酶突变体具有较高的热稳定性；进而，通过合成生物学方法构建的含有该木糖异构酶突变体的重组酵母可有效应用于C5糖和C6糖共发酵产乙醇，发酵效率和乙醇产率得以显著提高。因此，本发明的木糖异构酶突变体及重组菌株在化工、能源、食品、医药等领域具有广泛应用价值，可高效地进行糖‑醇转化发酵。

Description

木糖异构酶突变体、编码该酶的DNA分子、导入该DNA分子的重组菌株及它们的应用

技术领域

本发明涉及蛋白质工程和基因工程领域。具体而言，本发明涉及具有提高的催化活性的木糖异构酶突变体、编码该酶的DNA分子、导入该DNA分子的重组菌株及它们的应用。

背景技术

木糖异构酶(Xylose isomerase，XI；EC 5.3.1.5)能够催化五碳糖D-木糖转化为D-木酮糖，在微生物体内的糖代谢过程中起着重要作用，也具有极其广阔的工业应用价值。特别地，在天然微生物中，存在两种将木糖代谢为木酮糖的途径，包括经由木糖异构酶的途径以及经由木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的途径。在细菌(如密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、锈赤霉链霉菌(Streptomyces rubiginosus)、节杆菌属(Arthrobacter sp.)和大肠埃希氏菌(Escherichia coli))、少数真菌(如梨囊鞭菌属(Piromyces)和根囊鞭菌属(Orpinomyces))以及植物(如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大麦(Hordeum vulgare)和水稻(Oryza sativa))等中，通过木糖异构酶的作用，仅需一步反应即可将木糖直接异构化为木酮糖。

在纤维素乙醇菌株开发中，菌株对木糖的利用及转化为乙醇的能力是最为关键的。利用木糖异构酶构建发酵半纤维素水解产物木糖来生产乙醇的重组菌株成为研究热点。就此而言，一方面，迄今为止在酵母、特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中能够表达出的具有活性的木糖异构酶较少；另一方面，在木糖代谢途径中，木糖异构酶为关键限速酶，直接影响木糖在酵母中的代谢速度。因此，新型木糖异构酶的开发和分子改造尤为重要。源于真菌及嗜热细菌的木糖异构酶能够在酵母中表达并显示出活性，并参与酵母木糖代谢途径的构建。基于木糖异构酶特定的催化机理进行理性设计并提高其催化效率，对构建新型高效利用木糖的重组酵母而言具有重要的应用意义和价值。

然而，如何有效地得到具有提高的催化活性的木糖异构酶并将其在工业生产中加以应用，在本领域中仍罕有报道，不能满足实际需求。

发明内容

本发明的发明人通过研究发现，通过对天然木糖异构酶中特定位点的氨基酸残基进行突变，能够获得催化活性提高的木糖异构酶突变体，并且所获得的木糖异构酶突变体具有较高的热稳定性；进而，通过合成生物学方法构建的含有该木糖异构酶突变体的重组酵母可有效应用于C5糖和C6糖共发酵产乙醇，发酵效率和乙醇产率得以显著提高。

因此，根据第一方面，本发明提供了木糖异构酶突变体，其中，所述木糖异构酶突变体在天然木糖异构酶氨基酸序列(SEQ ID No.13)中引入了如下突变中的一种或多种：Ala144Thr、Asn145Asp、Lys415Ala、Asn145Asp/Lys415Ala、Gly307Lys以及Gly307Arg。在一些优选实施方式中，所述木糖异构酶突变体具有选自于如下氨基酸序列中任一者的氨基酸序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5以及SEQ IDNo.6。

根据第二方面，本发明提供了编码如第一方面所述的木糖异构酶突变体的DNA分子。在一些优选实施方式中，所述DNA分子具有选自于如下核苷酸序列中任一者的核苷酸序列：SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11以及SEQ IDNo.12。

根据第三方面，本发明提供了导入如第二方面所述的DNA分子的重组菌株。在一些优选实施方式中，所述重组菌株是重组酵母菌株。

根据第四方面，本发明提供了如第一方面所述的木糖异构酶突变体、如第二方面所述的DNA分子以及如第三方面所述的重组菌株在C5糖和C6糖共发酵产乙醇中的用途。

有益效果

本发明的木糖异构酶突变体可以将木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖等单糖异构化，转化为细菌、酵母、真菌等微生物可以利用的糖类，并通过自身代谢途径或通过代谢工程途径转化为3-磷酸甘油醛、丙酮酸或乙酰辅酶A等代谢中间体；进而，3-磷酸甘油醛、丙酮酸或乙酰辅酶A等代谢中间体经过宿主本身的代谢，可发酵为具有工业应用价值的化合物单体，如乳酸、乙醇、丁酸、丁醇、戊二醇等化合物。

另一方面，本发明的重组菌株在以木糖或葡萄糖-木糖为碳源的合成培养基中进行发酵实验时，24h内木糖利用率达到99％，总糖醇转化率达到90％以上；在应用于秸秆酶解液的C5糖和C6糖共发酵产乙醇时，木糖利用率为91.24％，葡萄糖-木糖混合糖转化为乙醇的转化率为87.32。

因此，本发明的木糖异构酶突变体及重组菌株在化工、能源、食品、医药等领域具有广泛应用价值，可高效地进行糖-醇转化发酵。

附图说明

图1：本发明的木糖异构酶突变体的蛋白电泳胶图。

图2：本发明的木糖异构酶突变体的诱导发酵酶活。

图3：本发明的木糖异构酶突变体和天然木糖异构酶活性对比。

图4：本发明的重组酿酒酵母0918MUT和对照重组酿酒酵母0918WT在含有40g/L木糖作为碳源的培养基中的生长曲线对比。

图5：本发明的重组酿酒酵母0918MUT和对照重组酿酒酵母0918WT在含有40g/L木糖作为碳源的培养基中的发酵曲线对比。

图6：本发明的重组酿酒酵母0918MUT在含有80g/L葡萄糖和40g/L木糖作为碳源的培养基中的发酵曲线。

图7：本发明的重组酿酒酵母0918MUT在秸秆酶解液中的发酵曲线。

具体实施方式

根据已发表的文献中对XI序列的同源性分析的报道，木糖异构酶可分为两大类：I类木糖异构酶通常含有约390个残基，序列同源性超过50％；II类木糖异构酶则含有约440个残基。与I类木糖异构酶相比，II类木糖异构酶在N-末端明显延长了约50个氨基酸残基；同时，二者的C-末端结构也有较大差异。本发明所针对的木糖异构酶属于II类木糖异构酶。在本发明中，所使用的天然木糖异构酶来源于Metagenomic insights into thecarbohydrate-active enzymes carried by the microorganisms adhering to soliddigesta in the rumen of cows，Lingling Wang等，PLOS ONE，November 2013，Volume 8，Issue 11，e78507。该天然木糖异构酶的氨基酸序列全长共包含439个氨基酸(SEQ IDNo.13)。

为改善蛋白质的期望性质，可对蛋白质进行理性设计，而蛋白质的理性设计通常基于其晶体结构。通过在Protein Data Bank(PDB)中进行序列比对，得到了在2015年底报道的序列一致性为75％、相似性为83％的晶体结构(PDB ID：4XKM)。晶体结构显示，该XI为同源四聚体且亚基之间没有二硫键；每个亚基的催化结构域折叠成αβ桶：折叠成桶状的平行β片层被位于桶外沿的α螺旋连接，活性中心处于连接β片层羧端与α螺旋羧端8段环链构成的一个漏斗状空腔的底部。

根据已发表的文献报道，在木糖作为底物参与木糖异构酶催化反应的过程中，采取“open-chain conformation”，即开环构象，而并非游离单糖状态下的半缩醛环状构象。木糖异构酶在催化过程中将开环后的醛糖(木糖，D-xylose)转化为酮糖(木酮糖，D-xylulose)的反应如下式所示。

木糖异构酶的最适pH偏碱性，通常在7.0-9.0之间。同时，木糖异构酶的活力及稳定性与二价金属离子有着非常密切的关系。二价金属阳离子Mn²⁺、Mg²⁺及Co²⁺可以稳定和激活木糖异构酶的活性，而Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Ca²⁺、Ag⁺和Hg²⁺等离子则会抑制其催化活性。不同来源的木糖异构酶可能需要不同的金属离子来使其保持较高的催化活性，对于上文所述的4XKM晶体结构，所使用的配位离子为Mn²⁺。

根据已经阐明的催化机理，每个木糖异构酶亚基中心都有一个深陷的催化活性口袋。每个活性中心包含两个二价金属离子结合位点以及与底物结合和催化过程相关的保守残基。两个Mn²⁺金属配位离子均形成了非常标准的八面体配位。其中，结构离子Mn1²⁺与Glu270、Asp309、Asp311和一个水分子中的氧原子以及His273的Nε2原子形成配位；而催化离子Mn2²⁺则与Glu234、Glu270、Asp298、Asp341以及底物木糖的O3和O5形成配位。通过配位的金属离子Mn2²⁺与底物之间的紧密结合使得底物发生反应一侧(O1-O2侧)的His102参与催化过程，作为质子供体(催化过程中的广义碱)；同时O1和O2通过水分子与Thr143的羧基以及Ala144的骨架羰基形成氢键网络，该水分子作为催化过程中的广义酸并极化底物中的羰基，从而促进烯醇式中间体的形成。

根据序列比对结果可知，上述保守的催化和结合残基(包括His102、Thr143、Ala144、Glu234、Glu270、His273、Asp298、Asp309、Asp311、Asp341共10个残基)在目的蛋白中均能一一对应。本领域技术人员清楚知晓的是，上述10个位点均参与关键的催化与底物结合，不应进行突变。然而，在本发明的木糖异构酶理性设计方法中，却出人意料地发现利用骨架羰基氧原子参与催化反应过程的Ala144具有一定设计空间。

从而，在本发明的一些实施方式中，木糖异构酶突变体可以在天然木糖异构酶(氨基酸序列如SEQ ID No.13所示)的基础上具有Ala144处的突变；在本发明的一些优选实施方式中，木糖异构酶突变体可以在天然木糖异构酶的基础上具有突变Ala144Thr。

进而，本发明人通过对天然木糖异构酶的氨基酸序列进行更深入的研究和分析，通过计算机模拟并加以实验验证，从中挑选出了多个潜在位点进行突变测试，合成编码基因并表达成功，由此确定可对木糖异构酶催化活性带来改进的突变除了上述Ala144Thr外，还包括Asn145Asp、Lys415Ala、Asn145Asp/Lys415Ala、Gly307Lys以及Gly307Arg。

因此，在本发明的一些实施方式中，本发明提供了木糖异构酶突变体，其中，所述木糖异构酶突变体在天然木糖异构酶氨基酸序列(SEQ ID No.13)中引入了如下突变中的一种或多种：Ala144Thr、Asn145Asp、Lys415Ala、Asn145Asp/Lys415Ala、Gly307Lys以及Gly307Arg。在一些优选实施方式中，所述木糖异构酶突变体具有选自于如下氨基酸序列中任一者的氨基酸序列：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5以及SEQ ID No.6。

在本发明的另一些实施方式中，本发明提供了编码木糖异构酶突变体的DNA分子。在一些优选实施方式中，所述DNA分子具有选自于如下核苷酸序列中任一者的核苷酸序列：SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11以及SEQ IDNo.12。

根据本发明一个优选的实施方式，本发明的DNA分子可通过以下方式获得：例如采用PCR等方法获得天然木糖异构酶基因(例如，如SEQ ID No.14所示的核苷酸序列)，通过定点突变法等将目的突变导入，制备编码各木糖异构酶突变体的DNA分子。对于定点突变法并没有特别限定，例如，可以通过使用市售的QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司制造)等进行定点突变。作为引入定点突变的方法，例如，Gapped duplex法和Kunkel法都是已知的。

根据本发明另一个优选的实施方式，也可以通过化学合成得到本发明的DNA分子。根据本发明一个特别优选的实施方式，为提高突变体在宿主细胞内的表达效率，可将天然木糖异构酶的编码序列(SEQ ID No.14)替换为由宿主细胞(例如酵母细胞)偏爱密码子组成的DNA序列，引入目的突变后，再通过化学合成的方式制备本发明的DNA分子。

在本发明的另一些实施方式中，本发明提供了用于表达木糖异构酶突变体的重组菌株。所述重组菌株例如可利用细菌、酵母、丝状真菌等具有工业生产潜力的菌株来制备，但本发明并不限于此。

在一些优选实施方式中，所述重组菌株可为重组酿酒酵母、毕赤酵母(Pichia)、假丝酵母(Candida)、多型汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、球拟酵母(Torulopsis)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)和克鲁维酵母(Kluyveromyces)菌株，但本发明并不限于此。在一些更优选的实施方式中，所述重组菌株为重组酿酒酵母菌株或重组毕赤酵母菌株。在一个最为优选的实施方式中，所述重组菌株为重组酿酒酵母菌株0918MUT，所述重组酿酒酵母菌株于2017年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.15103。

本发明的重组酿酒酵母菌株具有以下一种或多种特征：

1、过表达异源或同源的磷酸戊糖途径关键基因；

2、磷酸戊糖代谢途径代谢流量增加；

3、具有高效己糖或戊糖的同源或异源转运通道；

4、糖酵解途径代谢阻遏效应低；

5、非专一性戊糖氧化酶缺失或表达量下调；

6、对乙醇、有机酸、糖类具有高耐受性；

7、对糠醛、呋喃类化合物具有高耐受性；

8、氧化磷酸化途径代谢阻遏。

本发明的用于表达木糖异构酶突变体的重组菌株可利用重组载体来制备。本领域已知用于将目的基因片段连接至载体来构建重组载体的各种方法，例如但不限于经典的“酶切-连接”方法、Invitrogen公司开发的Gateway克隆系统、Clontech公司开发的Creator克隆系统、Stephen Elledge实验室开发的Univector克隆系统以及基于IIs型限制性内切酶的Golden Gate克隆法(例如，采用ThermoFisher提供的GeneArt Type IIs AssemblyKits试剂盒)。在一个优选的实施方式中，采用Golden Gate方法构建得到本发明的重组载体：在目标片段的上下游分别连接启动子和终止子，得到目标基因表达盒；同时，将启动子、抗性基因和终止子依次连接，得到抗性基因表达盒；基于出发菌株(例如酿酒酵母)的基因组，采用PCR方法扩增得到靶向插入部位的上下游同源臂序列；将目标基因表达盒、抗性基因表达盒及上下游同源臂串联连接，得到重组载体。

随后，可采用本领域的常规方法将重组载体导入出发菌株(例如酿酒酵母)中，例如但不限于显微注射、基因枪、转化(例如电转化)、感染或转染。上述显微注射、基因枪、转化、感染或转染均为本领域的常规操作。例如，转化是指通过采用分子生物学和基因工程中的一些已知方法处理细胞，使经处理的细胞处于感受态并与外源DNA接触，从而使外源DNA进入处于感受态的细胞中。常用的转化方法包括原生质体转化法、化学转化法和电穿孔转化法。感染是指用经人工改造的噬菌体活病毒作为载体，将该载体与目的DNA序列重组后，在体外用噬菌体或病毒的外壳蛋白将重组DNA包装成有活力的噬菌体或病毒，从而以感染的方式使重组DNA进入宿主细胞中。转染是指通过CaCl₂、电穿孔等方法将细胞处理成感受态细胞，然后使该感受态细胞接受重组的噬菌体DNA。

最后，在将重组载体导入出发菌株(例如酿酒酵母)中之后，通过筛选标记(例如抗性基因)筛选出阳性克隆并通过对基因组DNA进行测序验证而得到重组菌株(例如重组酿酒酵母菌株)。

其中，本发明采用的克隆载体可为本领域已知的能够用于各种出发菌株(例如酿酒酵母)的任意商业化克隆载体(包括但不限于pGAPZαA载体、pHC11载体、pPIC9K载体、pUC19载体等)或者可为本领域技术人员能够利用常规方法构建的载体。

在一些优选实施方式中，本发明提供了含有编码木糖异构酶突变体的DNA分子的重组酿酒酵母的构建方法，其中，将编码木糖异构酶突变体的基因XI和木酮糖激酶(xylulokinase，XK)基因以及磷酸核酮糖差向异构酶基因RPE1、磷酸核酮糖异构酶基因RKI1、转醛酶基因TAL1

和转酮酶基因TKL1(下文中也将RPE1基因、RKI1基因、TAL1基因和TKL1基因这四个基因统称为“TTRR基因”)整合到酿酒酵母染色体中，

来引入XI木糖代谢途径、使XK过表达并增强PPP途径，由此能够获得将木糖高效转化为乙醇的共发酵C5糖和C6糖的重组酿酒酵母菌株。

实施例

以下实施例将对本发明作进一步的说明，但并不用于限制本发明。

本发明中所用的目标基因可不受限制地通过以下方式获得：根据已在本领域公知的数据库上公布的相关目标基因序列进行人工合成；或者利用PCR方法从相应来源(例如，菌株)的基因组中扩增目标基因。

其中，若无特殊说明，实施例中所用试剂均为商购可得，所用方法均为本领域常规方法。在重组酿酒酵母菌株的制备和鉴定过程中，例如还可以参见CN106554924A中所公开的方法，但本发明不限于此。

实施例1：木糖异构酶突变体的制备及活性测定

本发明所述的木糖异构酶突变体优选通过如下方法获得，但是对于本领域技术人员来说，可根据实际需要对各操作中的具体参数进行适当调整，这是本领域技术人员在阅读了本发明的基础上可容易完成的。

1.编码木糖异构酶突变体的基因片段的获得

下文以木糖异构酶突变体Ala144Thr为例进行具体阐述。

委托英潍捷基Invitrogen公司合成编码天然木糖异构酶的基因片段(SEQ IDNo.14)，为克隆目的，在其两端引入EcoR I和Not I酶切位点。利用EcoR I酶和Not I酶进行双酶切后，将其克隆到同样进行双酶切的pPIC9K载体的多克隆位点中。经转化、筛选、测序后，确认成功克隆了编码天然木糖异构酶的基因片段。

委托英潍捷基Invitrogen公司合成编码本发明的木糖异构酶突变体Ala144Thr的基因片段(SEQ ID No.7)，为克隆目的，在其两端引入EcoR I和Not I酶切位点。利用EcoR I酶和Not I酶进行双酶切后，将其克隆到同样进行双酶切的pPIC9K载体的多克隆位点中。经转化、筛选、测序后，确认成功克隆了编码木糖异构酶突变体Ala144Thr的基因片段。2.木糖异构酶突变体表达菌株的构建和筛选

选取毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K进行构建和表达，对序列的酶切位点进行分析，选取EcoR I/Not I位点进行双酶切构建。选用毕赤酵母GS115菌株作为表达菌株。

如上所述构建插入编码木糖异构酶(作为对照的天然木糖异构酶和本发明的木糖异构酶突变体)的基因片段的pPIC9K-XI载体，将构建好的pPIC9K-XI载体经过限制性内切酶Sal I线性化后，对毕赤酵母GS115菌株进行电击转化，在含有遗传霉素的平板上进行涂布，30℃培养3-5天，将获得的转化子进行PCR验证并测序。经过序列比对，确定插入序列与SEQ ID No.7的核苷酸序列一致(对照载体的插入序列与SEQ ID No.14的核苷酸序列一致)。将获得的阳性克隆进行诱导发酵，28℃、300rpm、1％甲醇诱导7天，取第1、2、3、4、5、6、7天的发酵液进行SDS-PAGE电泳分析。具体方法参考Invitrogen毕赤酵母手册操作方法。

结果如图1所示。图1示出了本发明的木糖异构酶突变体Ala144Thr第5天的发酵液的SDS-PAGE结果。可见，获得了正确大小的目的蛋白。3.木糖异构酶突变体的酶活测定

根据如下方法进行木糖异构酶突变体的酶活测定：使700mmol/L D-木糖和0.5ml适当稀释的粗酶液(即，第1、2、3、4、5、6、7天的发酵液)在含有10mmol/L MnCl₂的50mmol/LTris-HCl(pH 7.0)缓冲液中分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃反应20min，加入150μl 50％三氯乙酸(终止反应)和185μl 2M Na₂CO₃中和反应缓冲液。取0.5ml所得溶液并向其中加入0.04U SDH(山梨醇脱氢酶，sigma公司)和0.15mM NADH(还原性烟氨酸腺嘌呤二核苷酸)，立即混匀，在340nm下检测NADH被氧化的量(即在340nm处做时间扫描)。根据标准曲线求得木酮糖量。木糖异构酶(XI)的一个比活力单位(U/mg)定义为：每mg酶蛋白每分钟转化底物的μmol/L数。蛋白含量测定参照Bradford(1976)的考马斯亮兰(Comassieblue)法。

结果如图2和图3所示。由图2可以看出，本发明所获得的木糖异构酶突变体具有出色的酶活。特别地，由图3可以看出，本发明所获得的木糖异构酶突变体在20℃～60℃下具有与天然木糖异构酶相当的比酶活(U/mg)；并且，本发明所获得的木糖异构酶突变体还具有较高的热稳定性，在70℃和80℃下的比酶活明显优于天然木糖异构酶。

实施例2重组酿酒酵母菌株的构建

1.含有XI基因表达盒和XK基因表达盒的重组质粒的构建

1.1含有XI基因表达盒或XK基因表达盒的质粒的构建

利用Golden Gate方法，将XI基因(SEQ ID No.7或SEQ ID No.14)与TEF2p启动子(SEQ ID No.15)和CYC1t终止子(SEQ ID No.16)组装在pUC19载体上，构建为XI基因表达盒。

利用Golden Gate方法，将XK基因(基因号398366094)与PGK1p启动子(SEQ IDNo.17)和PGK1t终止子(SEQ ID No.18)组装在pUC19载体上，构建为XK基因表达盒。

1.2含有XI基因表达盒和XK基因表达盒的重组质粒的构建

利用Golden Gate方法，将构建好的XI基因表达盒、XK基因表达盒、抗性标签ClonNAT表达盒(SEQ ID No.19)、酿酒酵母同源整合位点δ1(SEQ ID No.20)和δ2(SEQ IDNo.21)进行组装。该重组质粒用于整合筛选ClonNAT基因、目的基因XI表达和目的基因XK过表达，以及，其中所含的δ1和δ2片段用于整合酿酒酵母基因组。

2.串联含有TTRR基因的重组质粒(下文称为“TTRR重组质粒”)的构建2.1RPE1基因、RKI1基因、TAL1基因和TKL1基因的获得

以酿酒酵母或毕赤酵母基因组DNA为模板，根据GenBank数据库中已知的RPE1基因(基因号296145901)、RKI1基因(基因号296148095)、TAL1基因(基因号296146878)和TKL1基因(基因号296148717)的序列设计引物，通过PCR方法扩增上述基因得到相应的基因片段。

或者，参考Xiong M，Chen G，Barford J.，Alteration of xylose reductasecoenzyme preference to improve ethanol production by Saccharomyces cerevisiaefrom high xylose concentrations.Bioresour Technol.，2011，102(19)：9206-15(以引用的方式将其内容整体并入本文)中所公开的引物，以酿酒酵母基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到RPE1、RKI1、TAL1和TKL1基因片段。

2.2TTRR重组质粒的构建

通过Golden Gate方法，将RPE1基因、RKI1基因、TAL1基因、TKL1基因、抗性基因KanMX(SEQ ID No.22)、同源臂FPS1(SEQ ID No.23)和FPS2(SEQ ID No.24)组装。该重组质粒用于将酿酒酵母同源RPE1、RKI1、TAL1、TKL1基因过表达，利用抗性标签KanMX进行重组菌株筛选，同源臂FPS1和FPS2用于整合酿酒酵母基因组。

3.重组酿酒酵母菌株的制备

采用本领域已知的方法将步骤1中获得的XI-XK重组质粒和步骤2中获得的TTRR重组质粒通过同源重组整合进酿酒酵母的基因组中。其中，转化酿酒酵母的方法可使用本领域技术人员已知的各种转化方法，例如电转化法、醋酸锂化学转化法等。

将获得的转化子挑取单菌落在YEPX固体培养基上30℃静置培养2天，选取较大的菌落，提取基因组DNA进行基因组PCR并测序，确认XI基因成功整合到酵母基因组上，得到阳性转化子。挑取基因组检测阳性的单菌落接种于30ml YEPX液体培养基(4％木糖、2％蛋白胨、1％酵母粉，pH 7.0)中，30℃、150rpm培养72h，利用高效液相色谱(HPLC)检测木糖及乙醇含量。重组菌株表现出不同的木糖利用率及木糖-乙醇转化率，挑选出木糖利用率及木糖-乙醇转化率都高的菌株进行后续实验。

实施例3重组酿酒酵母菌株在木糖培养基中的适应性进化

将挑选出的菌株在YEPX培养基中进行适应性进化，具体方法如下：将YEPX平板上的单菌落挑到含有5ml YEPX的试管中，30℃、200rpm过夜培养，并对培养后的菌液用分光光度计测定600nm吸光值。取200μl过夜培养菌液接种到含新鲜YEPX培养基的试管中，过夜培养后测定600nm吸光值，重复该操作过程，直至重组酿酒酵母菌株在木糖培养基中的菌体密度稳定。在适应性进化过程中，对重组酿酒酵母菌株的木糖利用率及糖醇转化率进行检测。

将适应性进化到一定阶段的重组酿酒酵母菌株进行YEPX平板划线，分离单菌落，并对单菌落进行以木糖为唯一碳源的发酵筛选实验。

实验步骤如下：

1、将YEPX平板上的单菌落分别接种到含有20ml YEPX的摇瓶中，30℃、200rpm培养过夜；

2、取一定种子液在8000rpm条件下离心10min，用生理盐水洗一次，接种于40mlYEPX培养基(40g/L木糖)中，30℃、150rpm发酵72h；

3、取0h和72h样品进行HPLC检测，计算木糖利用率及糖醇转化率。

在导入天然木糖异构酶和本发明木糖异构酶突变体的重组菌株中分别挑选出木糖利用率及糖醇转化率最高的重组酿酒酵母菌株，获得一株含有天然木糖异构酶基因的重组酿酒酵母菌株，命名为0918WT；并获得一株含有木糖异构酶突变体的重组酿酒酵母菌株，命名为0918MUT。该0918MUT菌株于2017年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.15103。

实施例4重组酿酒酵母菌株在木糖培养基中的生长和发酵实验

种子制备：取-80℃保藏于甘油管中的重组酿酒酵母菌株CGMCC No.15103 1ml并接种至100ml YEPX培养基中，30℃、220rpm培养16h，取1ml培养液转接至100ml YEPD培养基中。

发酵：取种子液20ml在8000rpm条件下离心10min，用生理盐水洗一次，接种于200ml YEPX培养基(含40g/L木糖)中，30℃、150rpm下进行发酵，取发酵0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h的样品进行HPLC检测，并测定OD_600nm吸光值。

YEPX培养基：40g木糖、10g酵母粉、20g蛋白胨、1000ml水，116℃灭菌15min。

YEPD培养基：20g葡萄糖、10g酵母粉、20g蛋白胨、1000ml水，116℃灭菌15min。

结果如图4和图5所示。可以看出，在相同发酵条件下，以木糖为单一碳源的合成培养基中，0918MUT菌株的生长速度明显快于0918WT菌株并且发酵结束时的细胞密度远高于0918WT菌株(参见图4)；此外，0918MUT菌株对木糖的代谢速度明显高于0918WT菌株(参见图5)。

实施例5重组酿酒酵母菌株在葡萄糖和木糖混合培养基中的发酵实验

发酵：取种子液20ml在8000rpm条件下离心10min，用生理盐水洗一次，接种于200ml YEPDX培养基(含80g/L葡萄糖、40g/L木糖中)，30℃、150rpm进行发酵，取发酵0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h的样品进行HPLC检测，并测定OD_600nm吸光值。

YEPDX培养基：80g葡萄糖、40g木糖、10g酵母粉、20g蛋白胨、1000ml水，116℃灭菌15min。

结果如图6所示。可以看出，在以木糖和葡萄糖为混合碳源的合成培养基中，0918MUT菌株在保留高效葡萄糖代谢能力的基础上，还可以快速代谢木糖进行发酵，在葡萄糖代谢后8h内将木糖完全消耗，混合糖的总糖醇转化率达到90％。

实施例6重组酿酒酵母菌株在玉米秸秆酶解液中的发酵实验

本实施例6引用专利申请CN201410548925.X中所述的方法进行玉米秸秆酶解液制备。

种子制备：取-80℃保藏于甘油管中的重组酿酒酵母菌株CGMCC No.15103 1ml并接种至含100ml YEPX培养基的摇瓶中，16h后测定OD_600nm吸光值，取1ml培养液转接至含200ml YEPD培养基的摇瓶中。

发酵：取种子液20ml在8000rpm条件下离心10min，用生理盐水洗一次，用1ml生理盐水悬浮接种至200ml秸秆酶解液培养基(主要成分为葡萄糖、木糖、纤维二糖、阿拉伯糖、乙酸)中，初始接种量控制为1g干细胞/L发酵液(等效接种OD为1)，通过保鲜膜包扎在30℃、150rpm下进行厌氧发酵，取发酵0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h的样品进行液相色谱进样分析葡萄糖、木糖、乙醇含量。

结果如图7所示。可以看出，在秸秆酶解液培养基中，0918MUT菌株可以在48h内将葡萄糖和木糖高效转化为乙醇，并且不受秸秆酶解液中乙酸、糠醛、呋喃等抑制物的影响。木糖利用率可以达到91.24％，总糖醇转化率达到87.32％。

序列表

<110> 吉林中粮生化有限公司中粮营养健康研究院有限公司中粮生化能源(肇东)有限公司

<120> 木糖异构酶突变体、编码该酶的DNA分子、导入该DNA分子的重组菌株及它们的应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 439

<212> PRT

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aacgtgatgg cattccacta ttatgacccc gagaaggttg tgatgggaaa gaagatgaaa 120

gactggctga agtttgccat ggcatggtgg cacaccctgg gtggcgcttc tgcagaccag 180

tttggcggac agacccgctc ctatgagtgg gacaaggctg aggacgctgt tcagcgtgcc 240

aaggacaaga tggacgccgg tttcgagatc atggacaagc tcggcatcga atatttctgc 300

ttccacgacg tggacctcgt agaggagggc gccaccatcg cagagtatga ggagcgcatg 360

aaggccatta ctgactatgc tcaggagaag atgaagcagt tccccaacat caagttgctg 420

tggggtaccg ccgatgtctt tggtaacaag cgctatgcca acggtgcttc caccaatccc 480

gacttcgacg tagtggcacg tgctatcgtc cagatcaaga acgctatcga cgccaccatc 540

aagctcggcg gcaccaacta tgtgttctgg ggcggacgtg agggctatat gagcctcctc 600

aacaccgacc agaagcgtga gaaggagcac atggccacca tgctgaccat ggcccgcgac 660

tacgcacgcg caaagggctt caagggcacc ttcctcatcg agccgaaacc catggagcct 720

tccaagcacc agtatgatgt cgacactgag actgtgatcg gattcctccg cgctcatgga 780

ctcgacaagg acttcaaggt gaacatcgag gtgaaccacg ccacattggc cggccacacc 840

ttcgagcacg aactggcttg cgccgtggat gccggtatgc tgggttcaat cgacgccaac 900

cgtggtgacg ctcagaacgg ctgggatacc gaccagttcc ccatcgacaa cttcgaactc 960

acacaggcta tgctggagat catccgcaat ggtggtctgg gcaatggcgg caccaacttc 1020

gatgccaaga tccgtcgtaa ctccaccgac cttgaggacc tcttcatcgc tcacatcagc 1080

ggtatggatg ccatggcccg cgctcttgag aacgctgccg ccatcctgga ggagagtgaa 1140

ctgcccgcta tgaagaagga gcgctatgcc agcttcgaca gcggcatcgg caaggacttc 1200

gaggaaggca aactcaccct cgagcaggct tatgagtatg gcaagaaagt agaagagccg 1260

aaacagattt ctggcaagca ggagaagtac gagaccatcg tcgccctgta ctgcaagtaa 1320

<210> 9

<211> 1320

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列 Lys415Ala突变体核苷酸序列)

<400> 9

atggcaaaag agtattttcc gtttaccggt aagattcctt tcgaaggaaa agagagcaag 60

aacgtgatgg cattccacta ttatgacccc gagaaggttg tgatgggaaa gaagatgaaa 120

gactggctga agtttgccat ggcatggtgg cacaccctgg gtggcgcttc tgcagaccag 180

tttggcggac agacccgctc ctatgagtgg gacaaggctg aggacgctgt tcagcgtgcc 240

aaggacaaga tggacgccgg tttcgagatc atggacaagc tcggcatcga atatttctgc 300

ttccacgacg tggacctcgt agaggagggc gccaccatcg cagagtatga ggagcgcatg 360

aaggccatta ctgactatgc tcaggagaag atgaagcagt tccccaacat caagttgctg 420

tggggtaccg ccaatgtctt tggtaacaag cgctatgcca acggtgcttc caccaatccc 480

gacttcgacg tagtggcacg tgctatcgtc cagatcaaga acgctatcga cgccaccatc 540

aagctcggcg gcaccaacta tgtgttctgg ggcggacgtg agggctatat gagcctcctc 600

aacaccgacc agaagcgtga gaaggagcac atggccacca tgctgaccat ggcccgcgac 660

tacgcacgcg caaagggctt caagggcacc ttcctcatcg agccgaaacc catggagcct 720

tccaagcacc agtatgatgt cgacactgag actgtgatcg gattcctccg cgctcatgga 780

ctcgacaagg acttcaaggt gaacatcgag gtgaaccacg ccacattggc cggccacacc 840

ttcgagcacg aactggcttg cgccgtggat gccggtatgc tgggttcaat cgacgccaac 900

cgtggtgacg ctcagaacgg ctgggatacc gaccagttcc ccatcgacaa cttcgaactc 960

acacaggcta tgctggagat catccgcaat ggtggtctgg gcaatggcgg caccaacttc 1020

gatgccaaga tccgtcgtaa ctccaccgac cttgaggacc tcttcatcgc tcacatcagc 1080

ggtatggatg ccatggcccg cgctcttgag aacgctgccg ccatcctgga ggagagtgaa 1140

ctgcccgcta tgaagaagga gcgctatgcc agcttcgaca gcggcatcgg caaggacttc 1200

gaggaaggca aactcaccct cgagcaggct tatgagtatg gcgcgaaagt agaagagccg 1260

aaacagattt ctggcaagca ggagaagtac gagaccatcg tcgccctgta ctgcaagtaa 1320

<210> 10

<211> 1320

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列 Asn145Asp/Lys415Ala突变体核苷酸序列)

<400> 10

atggcaaaag agtattttcc gtttaccggt aagattcctt tcgaaggaaa agagagcaag 60

aacgtgatgg cattccacta ttatgacccc gagaaggttg tgatgggaaa gaagatgaaa 120

gactggctga agtttgccat ggcatggtgg cacaccctgg gtggcgcttc tgcagaccag 180

tttggcggac agacccgctc ctatgagtgg gacaaggctg aggacgctgt tcagcgtgcc 240

aaggacaaga tggacgccgg tttcgagatc atggacaagc tcggcatcga atatttctgc 300

ttccacgacg tggacctcgt agaggagggc gccaccatcg cagagtatga ggagcgcatg 360

aaggccatta ctgactatgc tcaggagaag atgaagcagt tccccaacat caagttgctg 420

tggggtaccg ccgatgtctt tggtaacaag cgctatgcca acggtgcttc caccaatccc 480

gacttcgacg tagtggcacg tgctatcgtc cagatcaaga acgctatcga cgccaccatc 540

aagctcggcg gcaccaacta tgtgttctgg ggcggacgtg agggctatat gagcctcctc 600

aacaccgacc agaagcgtga gaaggagcac atggccacca tgctgaccat ggcccgcgac 660

tacgcacgcg caaagggctt caagggcacc ttcctcatcg agccgaaacc catggagcct 720

tccaagcacc agtatgatgt cgacactgag actgtgatcg gattcctccg cgctcatgga 780

ctcgacaagg acttcaaggt gaacatcgag gtgaaccacg ccacattggc cggccacacc 840

ttcgagcacg aactggcttg cgccgtggat gccggtatgc tgggttcaat cgacgccaac 900

cgtggtgacg ctcagaacgg ctgggatacc gaccagttcc ccatcgacaa cttcgaactc 960

acacaggcta tgctggagat catccgcaat ggtggtctgg gcaatggcgg caccaacttc 1020

gatgccaaga tccgtcgtaa ctccaccgac cttgaggacc tcttcatcgc tcacatcagc 1080

ggtatggatg ccatggcccg cgctcttgag aacgctgccg ccatcctgga ggagagtgaa 1140

ctgcccgcta tgaagaagga gcgctatgcc agcttcgaca gcggcatcgg caaggacttc 1200

gaggaaggca aactcaccct cgagcaggct tatgagtatg gcgcgaaagt agaagagccg 1260

aaacagattt ctggcaagca ggagaagtac gagaccatcg tcgccctgta ctgcaagtaa 1320

<210> 11

<211> 1320

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列 Gly307Lys突变体核苷酸序列)

<400> 11

atggcaaaag agtattttcc gtttaccggt aagattcctt tcgaaggaaa agagagcaag 60

aacgtgatgg cattccacta ttatgacccc gagaaggttg tgatgggaaa gaagatgaaa 120

gactggctga agtttgccat ggcatggtgg cacaccctgg gtggcgcttc tgcagaccag 180

tttggcggac agacccgctc ctatgagtgg gacaaggctg aggacgctgt tcagcgtgcc 240

aaggacaaga tggacgccgg tttcgagatc atggacaagc tcggcatcga atatttctgc 300

ttccacgacg tggacctcgt agaggagggc gccaccatcg cagagtatga ggagcgcatg 360

aaggccatta ctgactatgc tcaggagaag atgaagcagt tccccaacat caagttgctg 420

tggggtaccg ccaatgtctt tggtaacaag cgctatgcca acggtgcttc caccaatccc 480

gacttcgacg tagtggcacg tgctatcgtc cagatcaaga acgctatcga cgccaccatc 540

aagctcggcg gcaccaacta tgtgttctgg ggcggacgtg agggctatat gagcctcctc 600

aacaccgacc agaagcgtga gaaggagcac atggccacca tgctgaccat ggcccgcgac 660

tacgcacgcg caaagggctt caagggcacc ttcctcatcg agccgaaacc catggagcct 720

tccaagcacc agtatgatgt cgacactgag actgtgatcg gattcctccg cgctcatgga 780

ctcgacaagg acttcaaggt gaacatcgag gtgaaccacg ccacattggc cggccacacc 840

ttcgagcacg aactggcttg cgccgtggat gccggtatgc tgggttcaat cgacgccaac 900

cgtggtgacg ctcagaacaa gtgggatacc gaccagttcc ccatcgacaa cttcgaactc 960

acacaggcta tgctggagat catccgcaat ggtggtctgg gcaatggcgg caccaacttc 1020

gatgccaaga tccgtcgtaa ctccaccgac cttgaggacc tcttcatcgc tcacatcagc 1080

ggtatggatg ccatggcccg cgctcttgag aacgctgccg ccatcctgga ggagagtgaa 1140

ctgcccgcta tgaagaagga gcgctatgcc agcttcgaca gcggcatcgg caaggacttc 1200

gaggaaggca aactcaccct cgagcaggct tatgagtatg gcaagaaagt agaagagccg 1260

aaacagattt ctggcaagca ggagaagtac gagaccatcg tcgccctgta ctgcaagtaa 1320

<210> 12

<211> 1320

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(人工序列 Gly307Arg突变体核苷酸序列)

<400> 12

atggcaaaag agtattttcc gtttaccggt aagattcctt tcgaaggaaa agagagcaag 60

aacgtgatgg cattccacta ttatgacccc gagaaggttg tgatgggaaa gaagatgaaa 120

gactggctga agtttgccat ggcatggtgg cacaccctgg gtggcgcttc tgcagaccag 180

tttggcggac agacccgctc ctatgagtgg gacaaggctg aggacgctgt tcagcgtgcc 240

aaggacaaga tggacgccgg tttcgagatc atggacaagc tcggcatcga atatttctgc 300

ttccacgacg tggacctcgt agaggagggc gccaccatcg cagagtatga ggagcgcatg 360

aaggccatta ctgactatgc tcaggagaag atgaagcagt tccccaacat caagttgctg 420

tggggtaccg ccaatgtctt tggtaacaag cgctatgcca acggtgcttc caccaatccc 480

gacttcgacg tagtggcacg tgctatcgtc cagatcaaga acgctatcga cgccaccatc 540

aagctcggcg gcaccaacta tgtgttctgg ggcggacgtg agggctatat gagcctcctc 600

aacaccgacc agaagcgtga gaaggagcac atggccacca tgctgaccat ggcccgcgac 660

tacgcacgcg caaagggctt caagggcacc ttcctcatcg agccgaaacc catggagcct 720

tccaagcacc agtatgatgt cgacactgag actgtgatcg gattcctccg cgctcatgga 780

ctcgacaagg acttcaaggt gaacatcgag gtgaaccacg ccacattggc cggccacacc 840

ttcgagcacg aactggcttg cgccgtggat gccggtatgc tgggttcaat cgacgccaac 900

cgtggtgacg ctcagaaccg ctgggatacc gaccagttcc ccatcgacaa cttcgaactc 960

acacaggcta tgctggagat catccgcaat ggtggtctgg gcaatggcgg caccaacttc 1020

gatgccaaga tccgtcgtaa ctccaccgac cttgaggacc tcttcatcgc tcacatcagc 1080

ggtatggatg ccatggcccg cgctcttgag aacgctgccg ccatcctgga ggagagtgaa 1140

ctgcccgcta tgaagaagga gcgctatgcc agcttcgaca gcggcatcgg caaggacttc 1200

gaggaaggca aactcaccct cgagcaggct tatgagtatg gcaagaaagt agaagagccg 1260

aaacagattt ctggcaagca ggagaagtac gagaccatcg tcgccctgta ctgcaagtaa 1320

<210> 13

<211> 439

<212> PRT

<213> unknown(未知)

<400> 13

Met Ala Lys Glu Tyr Phe Pro Phe Thr Gly Lys Ile Pro Phe Glu Gly

1 5 10 15

Lys Glu Ser Lys Asn Val Met Ala Phe His Tyr Tyr Asp Pro Glu Lys

20 25 30

Val Val Met Gly Lys Lys Met Lys Asp Trp Leu Lys Phe Ala Met Ala

35 40 45

Trp Trp His Thr Leu Gly Gly Ala Ser Ala Asp Gln Phe Gly Gly Gln

50 55 60

Thr Arg Ser Tyr Glu Trp Asp Lys Ala Glu Asp Ala Val Gln Arg Ala

65 70 75 80

Lys Asp Lys Met Asp Ala Gly Phe Glu Ile Met Asp Lys Leu Gly Ile

85 90 95

Glu Tyr Phe Cys Phe His Asp Val Asp Leu Val Glu Glu Gly Ala Thr

100 105 110

Ile Ala Glu Tyr Glu Glu Arg Met Lys Ala Ile Thr Asp Tyr Ala Gln

115 120 125

Glu Lys Met Lys Gln Phe Pro Asn Ile Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala

130 135 140

Asn Val Phe Gly Asn Lys Arg Tyr Ala Asn Gly Ala Ser Thr Asn Pro

145 150 155 160

Asp Phe Asp Val Val Ala Arg Ala Ile Val Gln Ile Lys Asn Ala Ile

165 170 175

Asp Ala Thr Ile Lys Leu Gly Gly Thr Asn Tyr Val Phe Trp Gly Gly

180 185 190

Arg Glu Gly Tyr Met Ser Leu Leu Asn Thr Asp Gln Lys Arg Glu Lys

195 200 205

Glu His Met Ala Thr Met Leu Thr Met Ala Arg Asp Tyr Ala Arg Ala

210 215 220

Lys Gly Phe Lys Gly Thr Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Met Glu Pro

225 230 235 240

Ser Lys His Gln Tyr Asp Val Asp Thr Glu Thr Val Ile Gly Phe Leu

245 250 255

Arg Ala His Gly Leu Asp Lys Asp Phe Lys Val Asn Ile Glu Val Asn

260 265 270

His Ala Thr Leu Ala Gly His Thr Phe Glu His Glu Leu Ala Cys Ala

275 280 285

Val Asp Ala Gly Met Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Arg Gly Asp Ala

290 295 300

Gln Asn Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Ile Asp Asn Phe Glu Leu

305 310 315 320

Thr Gln Ala Met Leu Glu Ile Ile Arg Asn Gly Gly Leu Gly Asn Gly

325 330 335

Gly Thr Asn Phe Asp Ala Lys Ile Arg Arg Asn Ser Thr Asp Leu Glu

340 345 350

Asp Leu Phe Ile Ala His Ile Ser Gly Met Asp Ala Met Ala Arg Ala

355 360 365

Leu Glu Asn Ala Ala Ala Ile Leu Glu Glu Ser Glu Leu Pro Ala Met

370 375 380

Lys Lys Glu Arg Tyr Ala Ser Phe Asp Ser Gly Ile Gly Lys Asp Phe

385 390 395 400

Glu Glu Gly Lys Leu Thr Leu Glu Gln Ala Tyr Glu Tyr Gly Lys Lys

405 410 415

Val Glu Glu Pro Lys Gln Ile Ser Gly Lys Gln Glu Lys Tyr Glu Thr

420 425 430

Ile Val Ala Leu Tyr Cys Lys

435

<210> 14

<211> 1320

<212> DNA

<213> unknown(未知)

<400> 14

atggcaaaag aatattttcc gtttactggt aaaattcctt tcgagggaaa ggatagtaaa 60

aatgtaatgg ctttccatta ttacgagccc gagaaagtcg tgatgggaaa gaagatgaag 120

gactggctga agttcgcaat ggcctggtgg cacacactgg gaggcgcttc tgcagaccag 180

ttcggtggtc aaactcgcag ctatgagtgg gacaaggctg aatgccccgt acagcgtgca 240

aaggataaga tggacgctgg tttcgagatc atggataagc tgggtatcga gtacttctgc 300

ttccacgatg tagacctcgt tgaggaggct cccaccatcg ctgagtacga ggagcgcatg 360

aaggccatca ccgactacgc tcaggagaag atgaagcagt tccccaatat caagctgctc 420

tggggtaccg caaacgtatt cggcaacaag cgttatgcca atggcgcttc taccaacccc 480

gatttcgatg tggttgctcg tgcgattgtt cagatcaaga actctatcga cgctaccatc 540

aagcttggtg gtaccaacta tgtgttctgg ggtggtcgtg agggctacat gagcctgttg 600

aacaccgacc agaagcgtga gaaggagcac atggctacga tgctgggtat ggctcgtgac 660

tatgctcgcg ctaagggatt caagggtacg ttcctgattg agccgaagcc gatggagcct 720

tcaaagcacc agtatgatgt ggacacagag accgtgattg gcttcctgaa ggcacatggt 780

ctggataagg acttcaaggt gaacatcgag gtgaaccacg ctacattggc tggtcacacc 840

ttcgagcacg aactggcttg tgctgttgac gctggtatgc tgggttctat cgacgctaac 900

cgcggtgatg cccagaacgg ctgggatacc gaccagttcc ccatcgacaa ctttgagctg 960

acacaggcta tgctggagat catccgcaac ggtggtctgg gcaatggcgg taccaatttc 1020

gacgccaaga tccgtcgtaa ttctaccgac ctcgaggatc tcttcatcgc tcatatcagc 1080

ggtatggatg ccatggcccg cgccctgatg aatgcagccg atattcttga gaactctgaa 1140

ctgcccgcaa tgaagaaggc tcgctacgca agcttcgaca gcggtatcgg taaggacttc 1200

gaggatggca agctgacctt cgagcaggtt tacgagtatg gtaagaaggt tgaagagccg 1260

aagcagacct ctggcaagca ggagaagtac gagacaatcg tcgccctcca ctgcaaataa 1320

<210> 15

<211> 558

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(TEF2p启动子)

<400> 15

ggggccgtat acttacatat agtagatgtc aagcgtaggc gcttcccctg ccggctgtga 60

gggcgccata accaaggtat ctatagaccg ccaatcagca aactacctcc gtacattcat 120

gttgcaccca cacatttata cacccagacc gcgacaaatt acccataagg ttgtttgtga 180

cggcgtcgta caagagaacg tgggaacttt ttaggctcac caaaaaagaa agaaaaaata 240

cgagttgctg acagaagcct caagaaaaaa aaaattcttc ttcgactatg ctggaggcag 300

agatgatcga gccggtagtt aactatatat agctaaattg gttccatcac cttcttttct 360

ggtgtcgctc cttctagtgc tatttctggc ttttcctatt tttttttcca tttttctttc 420

tctctttcta atatataaat tctcttgcat tttctatttt tctctctatc tattctactt 480

gtttattccc ttcaaggttt ttttttaagg agtacttgtt tttagaatat acggtcaacg 540

aactataatt aactaaac 558

<210> 16

<211> 229

<212> DNA

<213> Artificial Sequence( CYC1t终止子)

<400> 16

tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60

aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120

tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180

acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacg 229

<210> 17

<211> 721

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(PGK1p启动子)

<400> 17

aggcatttgc aagaattact cgtgagtaag gaaagagtga ggaactatcg catacctgca 60

tttaaagatg ccgatttggg cgcgaatcct ttattttggc ttcaccctca tactattatc 120

agggccagaa aaaggaagtg tttccctcct tcttgaattg atgttaccct cataaagcac 180

gtggcctctt atcgagaaag aaattaccgt cgctcgtgat ttgtttgcaa aaagaacaaa 240

actgaaaaaa cccagacacg ctcgacttcc tgtcttccta ttgattgcag cttccaattt 300

cgtcacacaa caaggtccta gcgacggctc acaggttttg taacaagcaa tcgaaggttc 360

tggaatggcg ggaaagggtt tagtaccaca tgctatgatg cccactgtga tctccagagc 420

aaagttcgtt cgatcgtact gttactctct ctctttcaaa cagaattgtc cgaatcgtgt 480

gacaacaaca gcctgttctc acacactctt ttcttctaac caagggggtg gtttagttta 540

gtagaacctc gtgaaactta catttacata tatataaact tgcataaatt ggtcaatgca 600

agaaatacat atttggtctt ttctaattcg tagtttttca agttcttaga tgctttcttt 660

ttctcttttt tacagatcat caaggaagta attatctact ttttacaaca aatataaaac 720

a 721

<210> 18

<211> 423

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(PGK1t终止子)

<400> 18

ttgaattgaa ttgaaatcga tagatcaatt tttttctttt ctctttcccc atcctttacg 60

ctaaaataat agtttatttt attttttgaa tattttttat ttatatacgt atatatagac 120

tattatttat cttttaatga ttattaagat ttttattaaa aaaaaattcg ctcctctttt 180

aatgccttta tgcagttttt ttttcccatt cgatatttct atgttcgggt tcagcgtatt 240

ttaagtttaa taactcgaaa attctgcgtt cgttaaagct ttcgagaagg atattatttc 300

gaaataaacc gtgttgtgta agcttgaagc ctttttgcgc tgccaatatt cttatccatc 360

tattgtactc tttagatcca gtatagtgta ttcttcctgc tccaagctca tcccacttgc 420

aac 423

<210> 19

<211> 1123

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(抗性标签ClonNAT表达盒)

<400> 19

gacatggagg cccagaatac cctccttgac agtcttgacg tgcgcagctc aggggcatga 60

tgtgactgtc gcccgtacat ttagcccata catccccatg tataatcatt tgcatccata 120

cattttgatg gccgcacggc gcgaagcaaa aattacggct cctcgctgca gacctgcgag 180

cagggaaacg ctcccctcac agacgcgttg aattgtcccc acgccgcgcc cctgtagaga 240

aatataaaag gttaggattt gccactgagg ttcttctttc atatacttcc ttttaaaatc 300

ttgctaggat acagttctca catcacatcc gaacataaac aaccatgggt accactcttg 360

acgacacggc ttaccggtac cgcaccagtg tcccggggga cgccgaggcc atcgaggcac 420

tggatgggtc cttcaccacc gacaccgtct tccgcgtcac cgccaccggg gacggcttca 480

ccctgcggga ggtgccggtg gacccgcccc tgaccaaggt gttccccgac gacgaatcgg 540

acgacgaatc ggacgacggg gaggacggcg acccggactc ccggacgttc gtcgcgtacg 600

gggacgacgg cgacctggcg ggcttcgtgg tcatctcgta ctcggcgtgg aaccgccggc 660

tgaccgtcga ggacatcgag gtcgccccgg agcaccgggg gcacggggtc gggcgcgcgt 720

tgatggggct cgcgacggag ttcgccggcg agcggggcgc cgggcacctc tggctggagg 780

tcaccaacgt caacgcaccg gcgatccacg cgtaccggcg gatggggttc accctctgcg 840

gcctggacac cgccctgtac gacggcaccg cctcggacgg cgagcggcag gcgctctaca 900

tgagcatgcc ctgcccctaa tcagtactga caataaaaag attcttgttt tcaagaactt 960

gtcatttgta tagttttttt atattgtagt tgttctattt taatcaaatg ttagcgtgat 1020

ttatattttt tttcgcctcg acatcatctg cccagatgcg aagttaagtg cgcagaaagt 1080

aatatcatgc gtcaatcgta tgtgaatgct ggtcgctata ctg 1123

<210> 20

<211> 248

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(酿酒酵母同源整合位点δ1)

<400> 20

ctcgagggat ataggaatcc tcaaaatgga atctatattt ctacatacta atattacgat 60

tattcattcc gttttatatg tttatatttc attgatccta ttacattatc aatccttgcg 120

tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt tgcgtcatct tctaagccag 180

ccgtatatga taatatacta gtaatgtaaa tactagttag tagatgatag ttgatttcta 240

ttccaaca 248

<210> 21

<211> 239

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(酿酒酵母同源整合位点δ2)

<400> 21

aacagctgat gaagcaggtg ttgttgtctg ttgagagtta gccttagtgg aagccttctc 60

acattcttct gttttggaag ctgaaacgtc taacggatct tgatttgtgt ggacttcctt 120

agaagtaacc gaagcacagg cgctaccatg agaaatgggt gaatgttgag ataattgttg 180

ggattccatt gttgataaag gctataatat taggtataca gaatatacta gaagttctc 239

<210> 22

<211> 1357

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(抗性基因KanMX)

<400> 22

cagtatagcg accagcattc acatacgatt gacgcatgat attactttct gcgcacttaa 60

cttcgcatct gggcagatga tgtcgaggcg aaaaaaaata taaatcacgc taacatttga 120

ttaaaataga acaactacaa tataaaaaaa ctatacaaat gacaagttct tgaaaacaag 180

aatcttttta ttgtcagtac tgattagaaa aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat 240

ttattcatat caggattatc aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga 300

gaaaactcac cgaggcagtt ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg 360

actcgtccaa catcaataca acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt 420

gagaaatcac catgagtgac gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagctt atgcatttct 480

ttccagactt gttcaacagg ccagccatta cgctcgtcat caaaatcact cgcatcaacc 540

aaaccgttat tcattcgtga ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc gctgttaaaa 600

ggacaattac aaacaggaat cgaatgcaac cggcgcagga acactgccag cgcatcaaca 660

atattttcac ctgaatcagg atattcttct aatacctgga atgctgtttt gccggggatc 720

gcagtggtga gtaaccatgc atcatcagga gtacggataa aatgcttgat ggtcggaaga 780

ggcataaatt ccgtcagcca gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc attggcaacg 840

ctacctttgc catgtttcag aaacaactct ggcgcatcgg gcttcccata caatcgatag 900

attgtcgcac ctgattgccc gacattatcg cgagcccatt tatacccata taaatcagca 960

tccatgttgg aatttaatcg cggcctcgaa acgtgagtct tttccttacc catggttgtt 1020

tatgttcgga tgtgatgtga gaactgtatc ctagcaagat tttaaaagga agtatatgaa 1080

agaagaacct cagtggcaaa tcctaacctt ttatatttct ctacaggggc gcggcgtggg 1140

gacaattcaa cgcgtctgtg aggggagcgt ttccctgctc gcaggtctgc agcgaggagc 1200

cgtaattttt gcttcgcgcc gtgcggccat caaaatgtat ggatgcaaat gattatacat 1260

ggggatgtat gggctaaatg tacgggcgac agtcacatca tgcccctgag ctgcgcacgt 1320

caagactgtc aaggagggta ttctgggcct ccatgtc 1357

<210> 23

<211> 340

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(同源臂FPS1)

<400> 23

tccatatatg ttaaaatgct tcagagatgt ttctttaatg tgccgtccaa caaaggtatc 60

ttctgtagct tcctctattt tcgatcagat ctcatagtga gaaggcgcaa ttcagtagtt 120

aaaagcgggg aacagtgtga atccggagac ggcaagattg cccggccctt tttgcggaaa 180

agataaaaca agatatattg cactttttcc accaagaaaa acaggaagtg gattaaaaaa 240

tcaacaaagt ataacgccta ttgtcccaat aagcgtcggt tgttcttctt tattatttta 300

ccaagtacgc tcgagggtac attctaatgc attaaaagac 340

<210> 24

<211> 390

<212> DNA

<213> Artificial Sequence(同源臂FPS2)

<400> 24

gaaaacagac aagaaaaaga aacaaataat atagactgat agaaaaaaat actgcttact 60

accgccggta taatatatat atatatatat atttacatag atgattgcat agtgttttaa 120

aaagctttcc taggttaagc tatgaatctt cataacctaa ccaactaaat atgaaaatac 180

tgacccatcg tcttaagtaa gttgacatga actcagcctg gtcacctact atacatgatg 240

tatcgcatgg atggaaagaa taccaaacgc taccttccag gttaatgata gtatccaaac 300

ctagttggaa tttgccttga acatcaagca gcgattcgat atcagttggg agcatcaatt 360

tggtcattgg aataccatct atgcttttct 390

Claims

1.一种木糖异构酶突变体，其中，

所述木糖异构酶突变体在如SEQ ID No.13所示的天然木糖异构酶氨基酸序列中引入了Ala144Thr突变；

所述木糖异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码如权利要求1所述的木糖异构酶突变体的DNA分子。

3.如权利要求2所述的DNA分子，其中，所述DNA分子的核苷酸序列由SEQ ID No.7组成。

4.导入如权利要求2或3所述的DNA分子的重组菌株。

5.如权利要求4所述的重组菌株，其中，所述重组菌株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、毕赤酵母(Pichia)、假丝酵母(Candida)、多型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、球拟酵母(Torulopsis)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或克鲁维酵母(Kluyveromyces)菌株。

6.如权利要求5所述的重组菌株，其中，所述重组菌株为酿酒酵母菌株或毕赤酵母菌株。

7.一株重组酿酒酵母菌株0918MUT，所述重组酿酒酵母菌株于2017年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.15103。

8.如权利要求1所述的木糖异构酶突变体、如权利要求2或3所述的DNA分子、如权利要求4-6中任一项所述的重组菌株以及如权利要求7所述的重组酿酒酵母菌株在C5糖和C6糖共发酵产乙醇中的用途。