CN110551699B - 一种定点突变改造的裂解性多糖单加氧酶及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定点突变改造的裂解性多糖单加氧酶及其构建方法与应用，属于基因工程领域。所述酶的活性在纤维素的结晶多糖降解中提供降解功能。本发明所述裂解性多糖单加氧酶突变体，是由野生型嗜热毁丝霉的裂解性多糖单加氧酶的氨基酸序列基础上，发生第34位由Arg突变为Leu，该突变酶和野生酶的最适温度都为85℃，突变酶的比活力比野生酶显著提高2倍左右，且在pH大于5.5时，突变酶的比活力较野生酶显著高出2倍左右。以微晶纤维素为底物时，纤维素酶与突变酶的协同反应所产葡萄糖含量较以纤维素酶单独降解底物显著提高了48.5％，可以看出突变酶显著提高了酶活力，可以降低工业应用的经济成本。

Description

一种定点突变改造的裂解性多糖单加氧酶及其构建方法与 应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种定点突变方法制备裂解性多糖单加氧酶突变体。

背景技术

虽然我国已经成为世界第二大经济体，但是依然面临着能源、资源和环境的挑战。石油资源面临枯竭，寻求可替代能源的再生资源急不可耐。生物乙醇是可再生且碳中性的生物液体燃料，可以缓解能源紧张的问题。所以从生物质提取乙醇一直是政府支持的重点。第一代从淀粉或糖中提取的生物燃料已经是一种成熟的技术，但由于它们对食物资源的依赖，加上缺乏足够的资源来满足未来的能源需求，所以意味着需要寻找替代能源。因此，从不可食用的木本植物中得到第二代生物燃料被认为是至关重要的。这种顽固材料主要由木质纤维素组成，包括纤维素、半纤维素和木质素，是地球上最丰富的生物聚合物。但是目前此类聚合物没有得到充分的利用，因此合理的利用这类资源将会对能源危机的缓解至关重要。

纤维素是木质纤维素中含量最丰富的组分，其降解后的组分单糖是发酵生成乙醇的主要成份。纤维素中的多糖主要是结晶多糖的形式存在，目前的纤维素酶对于降解此类结晶多糖的效率很低，因此时间和经济成本较高，限制了此类物质的再利用。最近发现的裂解性多糖单加氧酶(Lytic Polysaccharide Monooxygenases：LPMOs)的发现改变了这一现状，其作用于结晶多糖时，不仅能结合于多糖表面，还能通过氧化作用的方式断裂多糖的糖苷键，使得多糖的结构趋于松散，为之后酶的水解提供基础。然后再通过发酵生成生物乙醇，它开辟了采用可持续原料生产生物乙醇的新的可能性。LPMOs是一类新发现的铜离子依赖性的氧化酶，常具有多种模块化组合，能够高效氧化降解生物质多糖。近年来的研究表明，在木质纤维素降解酶系中加入LPMOs能显著提高其对结晶纤维素的转化效率，因此高催化活性LPMOs的研发可以降低工业规模的生产成本，提高经济效益。

定点突变技术是在已知的核苷酸序列中准确改变一个或多个碱基，从而改变组成蛋白质的一个或多个氨基酸残基，以研究蛋白质结构和功能的关系。近年来，定点突变技术在基因工程改造中发挥着巨大作用，在提高酶活，改善酶的催化特征等方面取得了非常有益的效果。但是该技术在LPMOs的改造中还应用较少，尤其对于真菌LPMOs，鲜有定点突变改造的文献报道。因此，定点突变改造真菌LPMOs的研究具有极佳的理论和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于利用定点突变的方法对真菌来源的裂解性多糖单加氧酶进行改造，获得酶活性提高的裂解性多糖单加氧酶突变体，降低工业应用的经济成本。

本发明所述裂解性多糖单加氧酶突变体，

所述突变体的氨基酸序列是在如SEQ ID No.3所示野生型嗜热毁丝霉的裂解性多糖单加氧酶的氨基酸序列基础上，第34位的Arg替换为Leu。

所述裂解性多糖单加氧酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

编码权利要求1所述突变体的基因。

优选地，所述编码突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述裂解性多糖单加氧酶突变体的用途，在最适温度85℃和最适pH7.5条件下，所述突变体的酶活是野生型的1.88倍。

一种重组载体，含有所述突变体的编码基因。

一种宿主细胞，其特征在于含有权5所述重组载体或权利要求1所述突变体的编码基因。

优选地，所述重组载体为pPIC9K-MtLPMO9A-R34L，所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。

一种获得所述裂解性多糖单加氧酶突变体的方法，步骤如下：

(1)构建包含所述裂解性多糖单加氧酶的编码基因的重组载体，所述重组载体以大肠杆菌为宿主；

(2)以所述步骤(1)中的重组载体为模板，利用如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示的引物对，通过反向PCR扩增得到包含有SEQ ID No.2所示的碱基序列的PCR产物，之后同时对PCR产物进行磷酸化反应和连接，自身环化成环状质粒；

(3)将所述步骤(2)得到的环状质粒转化入大肠杆菌中培养，获得含有裂解性多糖单加氧酶突变体的编码基因的重组载体；

(4)将所述步骤(3)中的重组载体转化至宿主细胞即毕赤酵母的感受态细胞中，获得含有裂解性多糖单加氧酶突变基因工程菌。

优选地，所述步骤(1)中，裂解性多糖单加氧酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。

优选地，所述步骤(2)中，反向PCR扩增过程中通过利用KOD-Plus-MutagenesisKit试剂盒进行。

优选地，所述步骤(2)中，所述PCR产物进行磷酸化反应和连接过程中，所用酶为T4多聚磷酸激酶和Ligation high连接酶。

有益效果

相比野生酶，本发明的突变酶的酶活力提高2倍左右，酶活力的提高可以有效的降低工业应用的经济成本。在最适温度85℃和最适pH7.5条件下，以2,6-二甲氧基苯酚为底物测定酶活力，野生酶的比活力为174.8U/g，突变酶的比活力为327.8U/g。以微晶纤维素为底物，相比纤维素酶单独作用时，纤维素酶与野生酶协同作用时，葡萄糖含量提高了23.9％，纤维素酶与突变酶协同作用时，葡萄糖含量提高了48.5％，其提高量是纤维素酶与野生酶协同作用所产葡萄糖提高量的2.03倍。

附图说明

图1为野生酶与突变酶的转化子的PCR验证，其中M:1kb Marker；1:野生酶的转化子；2:突变酶的转化子；

图2为野生酶与突变酶在pH7.5，不同温度条件下测定酶活力；

图3为野生酶与突变酶在温度85℃，不同pH条件下测定酶活力；

图4为降解微晶纤维素产生的葡萄糖含量。

具体实施方式

实施例1所述裂解性多糖单加氧酶突变体的制备

(1)构建重组质粒pPIC9K-MtLPMO9A：编码野生型嗜热毁丝霉的裂解性多糖单加氧酶(氨基酸序列SEQ ID No.3所示)的基因的重组载体。

首先根据原始氨基酸序列(GenBank:AKO82493.1)以酵母表达宿主进行密码子优化合成基因，得到经优化后的裂解性多糖单加氧酶编码基因(核苷酸序列如SEQ ID No.4)，将上述裂解性多糖单加氧酶编码基因和pPIC9K载体分别使用BamHI和EcoRI酶进行双酶切，然后分别进行回收，用连接酶将回收后的编码基因片段与pPIC9K载体进行连接，得到重组载体pPIC9K-MtLPMO9A，将重组载体pPIC9K-MtLPMO9A化转至克隆宿主E.coli Jm109，对得到的转化子测序验证是否为正确的基因克隆(与核苷酸序列SEQ ID No.4相同)，挑选测序正确的菌株，并提取重组载体pPIC9K-MtLPMO9A。

(2)构建重组质粒pPIC9K-MtLPMO9A-R34L：含有裂解性多糖单加氧酶突变体的编码基因的重组载体。

以重组质粒pPIC9K-MtLPMO9A为模板，以带有突变位点的寡聚核苷酸序列为引物对(如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示)，利用KOD-Plus-Mutagenesis Kit试剂盒反向PCR扩增得到包含有突变基因的碱基序列的PCR产物，然后利用试剂盒中的T4多聚磷酸激酶和Ligation high连接酶同时对PCR产物磷酸化反应和连接，自身环化成环状质粒；然后将环状质粒转入E.coli Jm109，涂布于含有卡那霉素抗性的固体LB培养基上37℃培养。挑取培养基上的单菌落进行测序验证，得到验证正确的转化子(参照附图1)。

(3)基因工程菌的构建：含有裂解性多糖单加氧酶突变基因工程菌。

从E.coli Jm109提取质粒，用DNA限制性内切酶SalI将质粒线性化，用琼脂糖凝胶电泳进行检测，将线性化后的质粒回收，然后电转至宿主细胞即毕赤酵母感受态GS115中，涂布于MD培养基，30℃培养2～3天后挑取转化子于含遗传霉素G418抗性的YPD培养基，先进行0.5mg/mL的G418抗性的筛选，然后挑取菌落大而饱满的克隆于含2mg/mL的G418抗性YPD培养基，最后进行4mg/mL的G418抗性筛选，最终筛选到拷贝数高的转化子。提取转化子中的基因组，进行对目标基因进行测序验证，验证正确的转化子为含有裂解性多糖单加氧酶突变体基因工程菌。

实施例2含有本发明裂解性多糖单加氧酶突变基因工程菌的表达与酶活力测定

(1)基因工程菌的表达：

将筛选出的基因工程菌置于5mL的YPD培养基30℃培养24h，然后转接1mL于含甘油的50mLBMGY培养基30℃培养16～18h，然后4000r/min离心10min收集细胞，用BMMY培养基进一步清洗细胞。最后将细胞重悬于BMMY中培养，每24h添加100％甲醇至终浓度为0.5％，进行诱导目标蛋白的表达。诱导表达6天后，12000r/min离心30min收集发酵液上清，即为粗酶液，用孔径0.22μm水系膜过滤。用Ni²⁺螯合琼脂糖树脂柱进行蛋白纯化，收集洗脱液，然后用10kDa的超滤管用MilliQwater进行置换buffer。纯化过程中目标蛋白用SDS-PAGE电泳鉴定，测定目标蛋白的蛋白浓度和酶活力，计算比活力。未经定点突变的野生菌除突变点外，其它遗传背景完全相同。

(2)酶活力测定

酶活力测定方法：以2,6-二甲氧基苯酚为底物，反应300s，在469nm波长下测定吸光值的变化。

最适温度的测定:将野生酶与突变酶在最适pH7.5下分别在不同的温度下测定酶活力，根据蛋白浓度计算比活力。由图2可以看出，突变酶和野生酶的最适温度都为85℃，其中突变酶的比活力是野生酶的1.88倍左右。

最适pH的测定：在最适温度85℃下，不同的pH缓冲体系中测定酶活力，计算比活力，由图3可以看出，两者的最适pH为7.5，突变酶和野生酶在pH小于5.5时比活力差异不大，但pH大于5.5时，突变酶的比活力显著高于野生酶的比活力。

在最适温度85℃和最适pH7.5条件下，以2,6-二甲氧基苯酚为底物测定酶活力，野生酶的比活力为174.8U/g，突变酶的比活力为327.8U/g，是野生酶比活力的1.88倍，其他酶活力以野生酶的酶活力作为100％计算相对酶活力。

(3)对纤维素的降解应用研究

反应体系为：10mg/mL的微晶纤维素，1mg/mL的野生酶以及本发明制备的突变酶(所述酶均为裂解性多糖单加氧酶),1mM抗坏血酸，在50mM的pH 6.0磷酸钠缓冲液反应48h，反应条件为45℃，500rpm。对照组不添加LPMO，其它反应条件都一致。48h反应结束后，每个反应体系添加1mg/mL的纤维素酶，反应2h，然后煮沸10min终止体系的反应，12000rpm离心10min，利用高效液相色谱法测定上清中葡萄糖的含量。

裂解性多糖单加氧酶与纤维素酶协同作用时(参照附图4)，可以显著提高对底物微晶纤维素的降解效率，以纤维素酶单独降解底物产生的葡萄糖作为100％，计算相对葡萄糖含量。相比纤维素酶单独作用时，纤维素酶与野生酶协同作用时，葡萄糖含量提高了23.9％，纤维素酶与突变酶协同作用时，葡萄糖含量提高了48.5％，其提高量是纤维素酶与野生酶协同作用所产葡萄糖提高量的2.03倍。其中以纤维素酶单独降解底物产生的葡萄糖实际含量为0.114mg/mL。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种定点突变改造的裂解性多糖单加氧酶及其构建方法与应用

<130> 1

<141> 2019-09-03

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Met Leu Thr Thr Thr Phe Ala Leu Leu Thr Ala Ala Leu Gly Val Ser

1 5 10 15

Ala His Tyr Thr Leu Pro Arg Val Gly Thr Gly Ser Asp Trp Gln His

20 25 30

Val Leu Arg Ala Asp Asn Trp Gln Asn Asn Gly Phe Val Gly Asp Val

35 40 45

Asn Ser Glu Gln Ile Arg Cys Phe Gln Ala Thr Pro Ala Gly Ala Gln

50 55 60

Asp Val Tyr Thr Val Gln Ala Gly Ser Thr Val Thr Tyr His Ala Asn

65 70 75 80

Pro Ser Ile Tyr His Pro Gly Pro Met Gln Phe Tyr Leu Ala Arg Val

85 90 95

Pro Asp Gly Gln Asp Val Lys Ser Trp Thr Gly Glu Gly Ala Val Trp

100 105 110

Phe Lys Val Tyr Glu Glu Gln Pro Gln Phe Gly Ala Gln Leu Thr Trp

115 120 125

Pro Ser Asn Gly Lys Ser Ser Phe Glu Val Pro Ile Pro Ser Cys Ile

130 135 140

Arg Ala Gly Asn Tyr Leu Leu Arg Ala Glu His Ile Ala Leu His Val

145 150 155 160

Ala Gln Ser Gln Gly Gly Ala Gln Phe Tyr Ile Ser Cys Ala Gln Leu

165 170 175

Gln Val Thr Gly Gly Gly Ser Thr Glu Pro Ser Gln Lys Val Ser Phe

180 185 190

Pro Gly Ala Tyr Lys Ser Thr Asp Pro Gly Ile Leu Ile Asn Ile Asn

195 200 205

Tyr Pro Val Pro Thr Ser Tyr Gln Asn Pro Gly Pro Ala Val Phe Arg

210 215 220

Cys

225

<210> 2

<211> 675

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atgttgacca ccaccttcgc tttgttgacc gctgctttgg gagtttctgc tcactacact 60

ttgccaagag tcggtactgg ttccgattgg caacacgtct tgagagccga caactggcag 120

aacaacggtt tcgttggtga cgtcaactcc gagcagatca gatgtttcca agctactcca 180

gctggtgctc aagatgtcta caccgttcaa gccggttcca ctgtcactta ccatgccaac 240

ccatccatct accaccccgg tccaatgcag ttctacttgg ctagagtccc agatggtcaa 300

gatgtcaagt cttggactgg tgagggtgct gtctggttca aggtttacga ggagcaacca 360

cagttcggtg cccaattgac ttggccatcc aacggaaagt cctccttcga ggtcccaatt 420

ccatcttgta tcagagccgg taactacttg ttgagagctg agcacattgc cttgcacgtt 480

gcccagtccc aaggtggtgc tcagttctac atctcttgcg cccagttgca agtcactggt 540

ggtggttcca ctgaaccatc ccaaaaggtc tccttccccg gtgcttacaa gtctaccgac 600

cccggtattt tgattaacat taattacccc gttcctacct cttaccaaaa ccccggtcca 660

gctgtcttca gatgt 675

<210> 3

<211> 225

<212> PRT

<213> 野生型裂解性多糖单加氧酶()

<400> 3

Met Leu Thr Thr Thr Phe Ala Leu Leu Thr Ala Ala Leu Gly Val Ser

1 5 10 15

Ala His Tyr Thr Leu Pro Arg Val Gly Thr Gly Ser Asp Trp Gln His

20 25 30

Val Arg Arg Ala Asp Asn Trp Gln Asn Asn Gly Phe Val Gly Asp Val

35 40 45

Asn Ser Glu Gln Ile Arg Cys Phe Gln Ala Thr Pro Ala Gly Ala Gln

50 55 60

Asp Val Tyr Thr Val Gln Ala Gly Ser Thr Val Thr Tyr His Ala Asn

65 70 75 80

Pro Ser Ile Tyr His Pro Gly Pro Met Gln Phe Tyr Leu Ala Arg Val

85 90 95

Pro Asp Gly Gln Asp Val Lys Ser Trp Thr Gly Glu Gly Ala Val Trp

100 105 110

Phe Lys Val Tyr Glu Glu Gln Pro Gln Phe Gly Ala Gln Leu Thr Trp

115 120 125

Pro Ser Asn Gly Lys Ser Ser Phe Glu Val Pro Ile Pro Ser Cys Ile

130 135 140

Arg Ala Gly Asn Tyr Leu Leu Arg Ala Glu His Ile Ala Leu His Val

145 150 155 160

Ala Gln Ser Gln Gly Gly Ala Gln Phe Tyr Ile Ser Cys Ala Gln Leu

165 170 175

Gln Val Thr Gly Gly Gly Ser Thr Glu Pro Ser Gln Lys Val Ser Phe

180 185 190

Pro Gly Ala Tyr Lys Ser Thr Asp Pro Gly Ile Leu Ile Asn Ile Asn

195 200 205

Tyr Pro Val Pro Thr Ser Tyr Gln Asn Pro Gly Pro Ala Val Phe Arg

210 215 220

Cys

225

<210> 4

<211> 675

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atgttgacca ccaccttcgc tttgttgacc gctgctttgg gagtttctgc tcactacact 60

ttgccaagag tcggtactgg ttccgattgg caacacgtca gaagagccga caactggcag 120

aacaacggtt tcgttggtga cgtcaactcc gagcagatca gatgtttcca agctactcca 180

gctggtgctc aagatgtcta caccgttcaa gccggttcca ctgtcactta ccatgccaac 240

ccatccatct accaccccgg tccaatgcag ttctacttgg ctagagtccc agatggtcaa 300

gatgtcaagt cttggactgg tgagggtgct gtctggttca aggtttacga ggagcaacca 360

cagttcggtg cccaattgac ttggccatcc aacggaaagt cctccttcga ggtcccaatt 420

ccatcttgta tcagagccgg taactacttg ttgagagctg agcacattgc cttgcacgtt 480

gcccagtccc aaggtggtgc tcagttctac atctcttgcg cccagttgca agtcactggt 540

ggtggttcca ctgaaccatc ccaaaaggtc tccttccccg gtgcttacaa gtctaccgac 600

cccggtattt tgattaacat taattacccc gttcctacct cttaccaaaa ccccggtcca 660

gctgtcttca gatgt 675

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ttgagagccg acaactggca gaaca 25

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gacgtgttgc caatcggaac c 21

Claims (9)

1.一种裂解性多糖单加氧酶突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列是在如SEQID No. 3所示野生型嗜热毁丝霉的裂解性多糖单加氧酶的氨基酸序列基础上，第34位的Arg替换为Leu。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。

4.权利要求1所述裂解性多糖单加氧酶突变体用于氧化降解生物质多糖的用途。

5.一种重组载体，其特征在于含有权利要求1所述突变体的编码基因。

6.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求5所述重组载体或权利要求1所述突变体的编码基因。

7.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为pPIC9K-MtLPMO9A-R34L。

8.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为毕赤酵母GS115。

9.权利要求1所述裂解性多糖单加氧酶突变体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）构建包含所述裂解性多糖单加氧酶的编码基因的重组载体，所述重组载体以大肠杆菌为宿主；

（2）以所述步骤（1）中的重组载体为模板，利用如SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6所示的引物对，通过反向PCR扩增得到包含有SEQ ID No. 2所示的碱基序列的PCR产物，之后同时对 PCR 产物进行磷酸化反应和连接，使其自身环化成环状质粒；

（3）将所述环状质粒转化入大肠杆菌中培养，获得含有裂解性多糖单加氧酶突变体的编码基因的重组载体；

（4）将所述步骤（3）中的重组载体转化至宿主细胞即毕赤酵母的感受态细胞中，获得含有裂解性多糖单加氧酶突变体基因工程菌。

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