CN105143447A - 具有木糖异构酶活性的蛋白质及其用途 - Google Patents

具有木糖异构酶活性的蛋白质及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供具有木糖利用能力的真核细胞。提供了一种具有木糖异构酶活性并且具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与SEQ？ID？NO:1表示的氨基酸序列比对时从N末端侧起按所述顺序包含由SEQ？ID？NO:2至7表示的第1基序至第6基序，并且以另一氨基酸替换第6基序的氨基酸序列中的天冬酰胺(N)。

Description

具有木糖异构酶活性的蛋白质及其用途
技术领域
(关申请的交互引用)
本申请涉及2013年3月28日提交的日本专利申请号2013-070584和2014年2月12日提交的日本专利申请号2014-024878并且要求所述日本申请的优先权，其全部内容通过引用的方式并入本文。
本申请涉及一种具有新木糖异构酶活性的蛋白质，并且涉及以木糖作为碳源使用这种蛋白质产生有用物质的技术。
背景技术
作为用于纤维素乙醇生产工艺的发酵微生物，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)不能够利用植物生物量中大量包含的木糖。因此，向酿酒酵母赋予木糖利用能力的研究正在进行中。为此目的，研究向酵母引入2个类型的途径。一个是使用木糖还原酶(XR)和木糖醇脱氢酶(XDH)的途径(XR-XDH途径)。然而，该途径中存在中间代谢物积累和乙醇产率下降的缺点。同时，在途径(XI途径)使用木糖异构酶(XI)的情况下，不存在这种缺点，但是出现另一个缺点，即与XR-XDH途径相比，木糖消耗速率缓慢。因此，关于高效XI的各种研究正在进行中。
已经实施对源自梨囊鞭菌属物种(Piromycessp.)E2的XI的改善，其中将所述XI报告为能够在酵母中发挥作用的第一种XI(专利文献1，非专利文献1)。另外，也已经实施对源自黄色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)的XI的改善(专利文献2)。另外，也已经实施对源自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的XI的改善(专利文献3)。另外，已经报道源自黄胸散白蚁(Reticulitermessperatus)肠内原生生物的XI，其中与之前已知的XI相比，所述XI具有更高的酵母木糖消耗能力(专利文献4)。
引文目录
专利文献
[专利文献1]日本专利申请公开号2008-79564
[专利文献2]WO2011/150313
[专利文献3]WO2010/070549
[专利文献4]日本专利申请公开号2011-147445
非专利文献
[非专利文献1]LeeS,JellisonT,AlperHS.ApplEnvironMicrobiol,2012；78(16):5708-16
发明概述
但是，专利文献1和非专利文献1中XI的木糖消耗速率仍太低。另外，就专利文献1中的XI而言，未公开在酵母中的活性。同时，就专利文献2中的XI而言，尽管已经认可改善了转基因酵母在木糖培养基中的生长速率，但是发酵性能不清楚。另外，就专利文献3中的XI而言，在木糖培养基中的生长特性和发酵性能不清楚。另外，就专利文献4中描述的XI而言，虽然XI在酵母中的能力已经改善，但是要寻求对其进一步改善。
在这类情形下，仍然需要有利于改善酵母中木糖消耗能力并改善发酵能力的XI。
根据本说明书，提供了具有可用于改善酵母的木糖发酵能力的XI活性的蛋白质及其用途。
技术问题的解决方案
本发明人集中在源自黄胸散白蚁肠内原生生物的XI(下文称作“RsXI”)并且发现可以通过引入置换另一氨基酸的点突变修饰XI，改善酵母的木糖发酵能力。另外，发现引入XI中的氨基酸置换突变还在具有相似氨基酸序列的另一种XI中有效。基于该研究结果，下文公开了以下手段。
[1]具有木糖异构酶活性并且具有氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列比对时从所述蛋白质的N末端起按以下顺序包含以下第1至第6基序，并且以另一氨基酸替换第6基序的氨基酸序列中的天冬酰胺(N)：
第1基序：FXXXXKXXXXXXXXHDXD(SEQIDNO:2)
其中X表示天然存在的氨基酸，
第2基序：XXXXXXXWGGREGYXXLXNT(SEQIDNO:3)
其中X表示天然存在的氨基酸，
第3基序：XXXXXXXXEPKPXEPXXHQYDXD(SEQIDNO:4)
其中X表示天然存在的氨基酸，
第4基序：LXXXXXXNXEXNHXXLXXHXXXH(SEQIDNO:5)
其中X表示天然存在的氨基酸，
第5基序：XGSXDXNXGXXXXGWDXDXXP(SEQIDNO:6)
其中X表示天然存在的氨基酸，和
第6基序：GGXNFDXKXRR(SEQIDNO:7)
[2]根据[1]的蛋白质，其中：
第1基序由FXXXXKXGXXXXXFHDXD(SEQIDNO:8)表示，
第2基序由XXXXXVFWGGREGYXXLLNT(SEQIDNO:9)表示，
第3基序由XXXXXFXIEPKPXEPXXHQYDXD(SEQIDNO:10)表示，
第4基序由LXXXFKXNXEXNHXXLAGHXXXH(SEQIDNO:11)表示，
第5基序由XGSXDXNXGXXXXGWDTDXFP(SEQIDNO:12)表示，并且
第6基序由GGXNFDXKXRR(SEQIDNO:13)表示。
[3]根据项[1]或[2]的蛋白质，其中：
第1基序由FEXXXKXGXXXXCFHDXD(SEQIDNO:102)表示，
(其中位置3是F或I或L；位置4是A或M；位置5是E或Q或S或T；位置7是L或M；位置9是I或V；位置10是E或K或P；位置11是F或Y；位置12是F或Y；并且位置17是A或I或V)，
第2基序由GXXXYVFWGGREGYXXLLNT(SEQIDNO:103)表示，
(其中，位置2是A或G；位置3是V或K或E；位置4是G或N；位置15是E或M；并且位置16是S或T)，
第3基序由XXXXXFXIEPKPXEPXXHQYDXD(SEQIDNO:10)表示，
(其中，位置1是G或N；位置2是F或H；位置3是K或D或L；位置4是G或P；位置5是D或T或I；位置7是L或Y；位置13是K或M；位置16是M或T；位置17是K或T；并且位置22是F或V)，
第4基序由LXKXFKXNXEXNHAXLAGHTFXH(SEQIDNO:104)表示，
(其中，位置2是D或E；位置4是D或Y；位置7是L或M或V；位置9是I或L；位置11是A或T或V；位置15是T或W；并且位置22是Q或E)，
第5基序由XGSXDANXGXXXXGWDTDXFP(SEQIDNO:105)表示，
(其中，位置1是F或L；位置4是I或V；位置8是Q或R或T；位置10是D或N；位置11是P或Y；位置12是L或N或Q；位置13是L或N，并且位置19是E或Q)，以及
第6基序由GGXNFDXKXRR(SEQIDNO:13)表示，
(其中，位置3是I或L或T；位置7是A或S；并且位置9是T或V)。
[4]根据[1]至[3]中任一项的蛋白质，其包含选自半胱氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸的替换第6基序中天冬酰胺(N)的氨基酸。
[5]根据[1]至[4]中任一项的蛋白质，其包含替换天冬酰胺的苏氨酸或半胱氨酸。
[6]根据[1]至[5]中任一项的蛋白质，其中
第1基序由与SEQIDNO:24表示的氨基酸序列具有65％或更大同一性的氨基酸序列组成，
第2基序由与SEQIDNO:25表示的氨基酸序列具有75％或更大同一性的氨基酸序列组成，
第3基序由与SEQIDNO:26表示的氨基酸序列具有65％或更大同一性的氨基酸序列组成，
第4基序由与SEQIDNO:27表示的氨基酸序列具有70％或更大同一性的氨基酸序列组成，
第5基序由与SEQIDNO:28表示的氨基酸序列具有70％或更大同一性的氨基酸序列组成，并且
第6基序由与SEQIDNO:29表示的氨基酸序列具有70％或更大同一性的氨基酸序列组成。
[7]DNA，其编码根据[1]至[6]中任一项的蛋白质。
[8]用于真核细胞的转化载体，其含有根据[7]的DNA。
[9]真核细胞，其含有根据[7]的DNA。
[10]根据[9]的真核细胞，其是酵母。
[11]根据[10]的真核细胞，其中酵母属于选自以下的任一个属：酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hancenula)、克勒克氏酵母属(Klocckera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、耶罗维亚酵母属(Yarrowia)和伊萨酵母属(Issatchenkia)。
[12]根据[9]至[11]任一项的真核细胞，其产生分泌的纤维素酶。
[13]根据[9]至[12]中任一项所述的真核细胞，其具有产生选自以下任一种物质的外源或内源基因：乙醇、乳酸、乙酸、1,3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、乙烯、甘油、法呢醇、香叶基香叶醇和鲨烯。
[14]用于产生具有赋予的或改善的木糖利用能力的真核细胞的方法，其包括将根据[7]的DNA导入真核细胞用于转化的步骤。
[15]用于生产有用物质的方法，其包括在木糖存在下培养根据[9]至[13]中任一项所述的真核细胞的步骤
[16]根据[15]的生产方法，其中有用物质是选自以下的任一种：乙醇、乳酸、乙酸、1,3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、乙烯、甘油、法呢醇、香叶基香叶醇和鲨烯。
附图简述
[图1]图1是显示在酵母中有活性的XI的氨基酸序列与RsXI的氨基酸序列的同一性的图。
[图2]图2是显示RsXI和其他在酵母中具有活性的XI的序列标志(logo)分析结果和基序分析结果的图。
[图3]图3是显示RsXI和其他在酵母中具有活性的XI的氨基酸序列比对的图。
[图4]图4是对在酵母中具有活性的XI的每个基序显示同一性的图。
[图5]图5是显示利用木糖作为碳源时生长试验结果(比生长速率)的图。
[图6]图6是显示利用木糖作为碳源时发酵试验结果(木糖和乙醇随时间变化)的图。
[图7]图7是显示利用木糖作为碳源时发酵试验结果(72小时内木糖消耗量)的图。
[图8]图8是显示利用木糖作为碳源时发酵试验结果(72小时内木糖消耗量)的图。
[图9]图9是对利用木糖作为碳源的多种变异株显示发酵试验结果(72小时内木糖消耗量)的图A至D。
实施方案的详述
下文的公开内容涉及一种新的XI，所述XI与RsXI即源自黄胸散白蚁肠内原生生物的木糖异构酶具有某些关系并且可用于增强真核细胞如酵母的木糖利用能力。发明人已经发现针对RsXI发现的有效增强酵母的木糖利用能力的置换突变还相对于另一种XI而言有效增强真核细胞的木糖利用能力。将与RsXI具有共同基序的另一种XI视为具有与RsXI相似的功能的XI。在真核细胞中表达修饰的XI情况下，其中向基序中的天冬酰胺引入置换突变，可以显示木糖异构酶活性并且可以改善宿主真核细胞的木糖利用能力。下文将适当参考附图详细描述当前说明书的公开内容。
(具有木糖异构酶活性的蛋白质)
与RsXI的SEQIDNO:1表示的氨基酸序列比对时，本发明的蛋白质可以包括1个或2个或更多个下文描述的第1基序至第6基序(SEQIDNO:2至7)。第1基序至第6基序可以从氨基酸序列N端侧按所述顺序含于本发明的蛋白质中。
全部基序均存在于RsXI中，并且根据与这类其他XI的多重比对结果，发明人通过基序分析还在其他XI中找到了这些基序。
本发明的蛋白质含有优选地第1基序至第6基序中的至少第6基序。该蛋白质优选地还含有第4基序，更优选地还含有第5基序，仍然更优选地还含有第3基序，甚至更优选地还含有第1基序，并且仍然甚至更优选地还含有第2基序。
在基序分析中，通过蛋白质BLAST(数据库：非冗余蛋白质序列，Algorism参数：默认设置)查找到RsXI的氨基酸序列。相对于其他前500个类似氨基酸序列和RsXI的氨基酸序列，进行比对分析。从比对分析的结果，将6个特征性结构域的共有序列定义为基序序列。
作为类似氨基酸序列的这类其他XI命中的例子包括图1中所示的在酵母中具有活性的10种XI。XI与RsXI的SEQIDNO:1表示的氨基酸序列的同一性是46％至63％并且不是特别地高，然而，这些XI共同具有第1基序至第6基序并且与SEQIDNO:1中的相应基序具有高的同一性。可以使用SEQIDNO:1表示的RsXI的氨基酸序列，在公众已知的数据库中找到这类其他XI。
图2中显示了通过多重比对SEQIDNO:1表示的氨基酸序列和图1中所示10种XI的氨基酸序列(SEQIDNO:14至23)的序列标志分析和基序分析的结果以及就每个基序而言的同一性。在图2中按同一性百分数的递降顺序描述同一性。图3显示RsXI和其他10种XI的多重比对分析结果。图4显示就其他在酵母中具有活性的XI的每个基序而言的同一性。
本领域技术人员可以通过使用各种公众已知的数据库如蛋白质BLAST(其是前述的公众已知数据库)，执行多重比对。对用于多重比对的技术或用于获得共有序列的技术不存在具体限制并且可以使用多种技术，如ClustalW：http://align.genome.jp/；HMMER(隐匿马尔科夫模型)：http://hmmer.wustl.edu/；MultiAlin：http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html；和mkdom/xdom：http://prodes.toulouse.inra.fr/prodom/xdom/。另外，可以从多重比对结果提取出高度保守的氨基酸。这种技术也是本领域技术人员熟知的。例如，使用Weblogo3.3(http://weblog.berkeley.esu/)，可以产生高度保守氨基酸的标志。在图2中所示的序列标志分析中，保守性更高的氨基酸显示得更大。另外，从这种序列标志分析中，指明高保守区域(基序)的基序分析是可能的。
如本领域技术人员已经熟知，本文中“同一性”和“相似性”是在两个或更多个蛋白质或两个或更多个多核苷酸之间通过比较序列所确定的关系。本领域中“同一性”还意指蛋白质序列或多核苷酸序列之间序列不变性的程度，如通过蛋白质序列或多核苷酸序列之间比对所确定，在一连串的部分序列之间比对也可以确定其同一性。另外，“相似性”意指蛋白质序列或多核苷酸序列之间序列相关性的程度，如通过蛋白质序列或多核苷酸序列之间比对所确定，在一连串的部分序列之间比对也可以确定其相似性。更具体地，“相似性”由序列同一性或保守性(可以维持特定氨基酸或氨基酸序列的物理和化学特性的替换)决定。“相似性”称作稍后描述的检索结果BLAST序列同源性中的相似性。确定“同一性”或“相似性”的优选方法设计成在待测试的序列之间产生最长比对结果。用于确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编码。可以例如使用Altschul等人(例如，AltschulSF,GishW,MillerW,MyersEW,LipmanDJ,J.MolBiol,215:P403-410(1990)；AltschylSF,MaddenTL,SchafferAA,ZhangJ,MillerW,LipmanDJ,25NucleicAcidsRes.25:p3389-3402(1997))的BLAST(基本局部比对检索工具)程序，确定“同一性”和“相似性”。在使用软件如BLAST的情况下，优选但不限于使用默认值。
(第1基序)
第1基序由FXXXXKXXXXXXXXHDXD(SEQIDNO:2)表示。第1基序由18个氨基酸组成并对应于SEQIDNO:1表示的氨基酸序列的位置88至位置105。推定在该基序中，在位置15(H)和位置18(D)处的氨基酸残基是构成活性部位的残基(Hu,H.,H.Liu和Y.Shi.,1997.ThereactionpathwayoftheisomerizationofD-xylosecatalyzedbytheenzymeD-xyloseisomerase:atheoreticalstudy,Proteins27:545-55)。
在SEQIDNO:2表示的第1基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸：
位置2：D或E
位置3：F或I或L或M
位置4：A或C或F或I或L或M或Y
位置5：D或E或H或N或Q或S或T
位置7：L或M
位置8：D或G或N或S
位置9：A或I或L或T或V
位置10：D或E或G或K或P
位置11：F或H或Y
位置12：F或L或W或Y
位置13：A或C或S或T
位置14：F或W，和
位置17：A或I或K或R或T或V。
第1基序优选地由FXXXXKXGXXXXXFHDXD(SEQIDNO:8)表示。同时，由SEQIDNO:8至13表示的第1基序至第6基序定义为这样的结构域，所述结构域是通过执行上文用RsXI(SEQIDNO:1)的氨基酸序列和图1中所示的XI(其在酵母中的活性经证实)的氨基酸序列(SEQIDNO:14至23)限定的已进行的序列比对相似的另一个比对分析，与通过比对分析所获得的前500个基序序列相符的结构域。
在SEQIDNO:8表示的第1基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸：
位置2：D或E
位置3：F或I或L
位置4：A或M
位置5：E或Q或S或T
位置7：L或M
位置9：I或V
位置10：E或G或K或P
位置11：F或H或Y
位置12：F或W或Y
位置13：C或T，和
位置17：A或I或K或R或V。
第1基序更优选地由FEXXXKXGXXXXCFHDXD(SEQIDNO:102)表示。在SEQIDNO:102表示的第1基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸。这个第1基序基于用RsXI的氨基酸序列(SEQIDNO:1)和分别源自梨囊鞭菌属物种E2、植发酵梭菌、多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的XI的氨基酸序列进行比对分析的结果。
位置3：F或I或L
位置4：A或M
位置5：E或Q或S或T
位置7：L或M
位置9：I或V
位置10：E或K或P
位置11：F或Y
位置12：F或Y，和
位置17：A或I或V
第1基序优选地包含与对应于RsXI第1基序的氨基酸序列具有60％或更大同一性的氨基酸序列，其中所述RsXI第1基序由FEFMSKLGVEYFCFHDAD(SEQIDNO:24)表示。第1基序更优选地包含与SEQIDNO:24表示的氨基酸序列具有65％或更大、仍然更优选地70％或更大、和甚至更优选地75％或更大的同一性的氨基酸序列。同一性可以是80％或更大，可以是85％或更大，可以是90％或更大，并且还可以是95％或更大。
如从图2显而易见，相对于第1基序，图1中所示的10种在酵母中具有活性的XI优选地就氨基酸序列同一性而言具有66％或更大、优选地70％或更大、更优选地75％或更大、并且还优选地80％或更大的同一性。
(第2基序)
第2基序由XXXXXXXWGGREGYXXLXNT(SEQIDNO:3)表示。第2基序由20个氨基酸组成并对应于SEQIDNO:1表示的RsXI的氨基酸序列的位置182至201。
在SEQIDNO:2表示的第2基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸：
位置1：D或G或K或N
位置2：A或G或S
位置3：A或E或K或Q或S或T或V
位置4：G或N
位置5：F或Y
位置6：V或T
位置7：F或L
位置15：A或D或E或H或M
位置16：C或N或S或T，和
位置18：H或L或W。
第2基序优选地由XXXXXVFWGGREGYXXLLNT(SEQIDNO:9)表示。在SEQIDNO:9表示的第2基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸：
位置1：G或N
位置2：A或G
位置3：V或K或E或T
位置4：G或N
位置5：F或Y
位置15：E或M或H，和
位置16：S或T。
第2基序更优选地由GXXXYVFWGGREGYXXLLNT(SEQIDNO:103)表示，在SEQIDNO:103表示的第2基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸。这个第2基序基于用RsXI的氨基酸序列(SEQIDNO:1)和分别源自梨囊鞭菌属物种E2、植发酵梭菌、多形拟杆菌和乳酸乳球菌的XI的氨基酸序列进行比对分析的结果。
位置2：A或G
位置3：V或K或E
位置4：G或N
位置15：E或M，和
位置16：S或T
第2基序优选地包含与对应于RsXI第2基序的氨基酸序列具有60％或更大同一性的氨基酸序列，其中所述RsXI第2基序由GGVGYVFWGGREGYETLLNT(SEQIDNO:25)表示。第2基序更优选地包含与SEQIDNO:25表示的氨基酸序列具有65％或更大、仍然更优选地70％或更大、和甚至更优选地75％或更大的同一性的氨基酸序列。同一性可以是80％或更大，可以是85％或更大，可以是90％或更大，并且还可以是95％或更大。
如从图2显而易见，相对于第2基序，图1中所示的10种在酵母中具有活性的XI优选地具有75％或更大、优选地80％或更大、更优选地85％或更大、仍然更优选地90％或更大、并且甚至更优选地95％或更大的氨基酸序列同一性。
(第3基序)
第3基序由XXXXXXXXEPKPXEPXXHQYDXD(SEQIDNO:4)表示。第3基序由23个氨基酸组成并对应于SEQIDNO:1表示的RsXI的氨基酸序列的位置225至位置247。推定在该基序中，在位置9(E)和位置11(K)处的氨基酸残基是构成活性部位的残基。
在SEQIDNO:4表示的第3基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸：
位置1：G或N
位置2：F或H或Y
位置3：D或E或K或L或N或Q或R或T
位置4：G或P
位置5：A或D或I或N或Q或T
位置6：F或L或M
位置7：F或L或Y
位置8：I或L
位置13：K或M或Q
位置16：M或S或T
位置17：K或S或T，和
位置22：F或T或V或Y。
第3基序优选地由XXXXXFXIEPKPXEPXXHQYDXD(SEQIDNO:10)表示。在SEQIDNO:10表示的第3基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸：
位置1：G或N
位置2：F或H
位置3：K或D或T或E或L
位置4：G或P
位置5：D或Q或T或I
位置7：F或L或Y
位置13：K或M
位置16：M或S或T
位置17：K或T，和
位置22：F或V或Y。
就SEQIDNO:10表示的氨基酸序列中的第3基序而言，基于用RsXI的氨基酸序列(SEQIDNO:1)和分别源自梨囊鞭菌属物种E2、植发酵梭菌(Clostridiumphytofermentans)、多形拟杆菌和乳酸乳球菌的XI的氨基酸序列进行比对分析的结果，以下氨基酸是优选的：
位置1：G或N
位置2：F或H
位置3：K或D或L
位置4：G或P
位置5：D或T或I
位置7：L或Y
位置13：K或M
位置16：M或T
位置17：K或T，和
位置22：F或V.
第3基序优选地包含与对应于RsXI第3基序的氨基酸序列具有60％或更大同一性的氨基酸序列，其中所述RsXI第3基序由GFKGDFYIEPKPKEPTKHQYDFD(SEQIDNO:26)表示。第3基序更优选地包含与SEQIDNO:26表示的氨基酸序列具有65％或更大、仍然更优选地70％或更大、和甚至更优选地75％或更大的同一性的氨基酸序列。同一性可以是80％或更大，可以是85％或更大，可以是90％或更大，并且还可以是95％或更大。
如从图2显而易见，关于第3基序，图1中所示的10种在酵母中具有活性的XI优选地具有65％或更大、优选地70％或更大、更优选地75％或更大、仍然更优选地80％或更大、甚至更优选地85％或更大、仍然甚至更优选地90％或更大、并且甚至更优选地95％或更大的氨基酸序列同一性。
(第4基序)
第4基序由LXXXXXXNXEXNHXXLXXHXXXH(SEQIDNO:5)表示。第4基序由23个氨基酸组成并对应于SEQIDNO:1表示的RsXI的氨基酸序列的位置260至位置282。推定在该基序中，在位置10(E)和位置13(K)处的氨基酸残基是构成活性部位的残基。
在SEQIDNO:5表示的第4基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸：
位置2：D或E或K或L或N或Q
位置3：D或E或G或K或N或P或Q
位置4：D或E或H或Y
位置5：F或I或V
位置6：K或R
位置7：F或I或L或M或V
位置9：I或L
位置11：A或G或P或T或V
位置14：A或T
位置15：N或T或W
位置17：A或S
位置18：F或G或Q
位置20：C或D或S或T
位置21：F或H或M或Y，和
位置22：D或E或H或M或Q。
第4基序优选地由LXXXFKXNXEXNHXXLAGHXXXH(SEQIDNO:11)表示。在SEQIDNO:11表示的第4基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸：
位置2：D或E或N
位置3：K或Q
位置4：D或Y
位置7：I或L或M或V
位置9：I或L
位置11：A或P或T或V
位置14：A或T
位置15：T或W
位置20：C或T
位置21：F或H，和
位置22：Q或E。
第4基序更优选地由LXKXFKXNXEXNHAXLAGHTFXH(SEQIDNO:104)表示。在SEQIDNO:104表示的第4基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸。这个第4基序基于用RsXI的氨基酸序列(SEQIDNO:1)和分别源自梨囊鞭菌属物种E2、植发酵梭菌、多形拟杆菌和乳酸乳球菌的XI的氨基酸序列进行比对分析的结果。
位置2：D或E
位置4：D或Y
位置7：L或M或V
位置9：I或L
位置11：A或T或V
位置15：T或W，和
位置22：Q或E
第4基序优选地包含与对应于RsXI第4基序的氨基酸序列具有60％或更大同一性的氨基酸序列，其中所述RsXI第4基序由LEKDFKLNIEANHATLAGHTFQH(SEQIDNO:27)表示。第4基序更优选地包含与SEQIDNO:27表示的氨基酸序列具有65％或更大、仍然更优选地70％或更大、和甚至更优选地75％或更大的同一性的氨基酸序列。同一性可以是80％或更大，可以是85％或更大，可以是90％或更大，并且还可以是95％或更大。
如从图2显而易见，关于第4基序，图1中所示的10种在酵母中具有活性的XI优选地具有73％或更大、优选地75％或更大、更优选地80％或更大、仍然更优选地85％或更大、并且甚至更优选地90％或更大的氨基酸序列同一性。
(第5基序)
第5基序由XGSXDXNXGXXXXGWDXDXXP(SEQIDNO:6)表示。第5基序由21个氨基酸组成并对应于SEQIDNO:1表示的RsXI的氨基酸序列的位置293至位置303。推定在该基序中，在位置5(D)、位置16(D)和位置18(D)处的氨基酸残基是构成活性部位的残基。
在SEQIDNO:6表示的第5基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸：
位置1：F或L
位置4：I或L或V
位置6：A或S
位置8：M或Q或R或T
位置10：D或H或N或S
位置11：A或K或L或M或P或T或V或Y
位置12：L或N或Q或D
位置13：I或L或N
位置17：I或T
位置19：E或Q，和
位置20：F或Y。
第5基序优选地由XGSXDXNXGXXXXGWDTDXFP(SEQIDNO:12)表示。在SEQIDNO:12表示的第5基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸：
位置1：F或L
位置4：I或V
位置6：A或S
位置8：Q或R或T
位置10：D或N或S
位置11：L或M或P或Y
位置12：D或L或N或Q
位置13：L或N，和
位置19：E或Q。
第5基序更优选地由XGSXDANXGXXXXGWDTDXFP(SEQIDNO:105)表示。在SEQIDNO:105表示的第5基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸。这个第5基序基于用RsXI的氨基酸序列(SEQIDNO:1)和分别源自梨囊鞭菌属物种E2、植发酵梭菌、多形拟杆菌和乳酸乳球菌的XI的氨基酸序列进行比对分析的结果。
位置1：F或L
位置4：I或V
位置8：Q或R或T
位置10：D或N
位置11：P或Y
位置12：L或N或Q
位置13：L或N，和
位置19：E或Q
第6基序优选地包含与对应于RsXI第5基序的氨基酸序列具有60％或更大同一性的氨基酸序列，其中所述RsXI第5基序由LGSVDANTGDPLLGWDTDEFP(SEQIDNO:28)表示。第5基序更优选地包含与SEQIDNO:28表示的氨基酸序列具有65％或更大、仍然更优选地70％或更大、和甚至更优选地75％或更大的同一性的氨基酸序列。同一性可以是80％或更大，可以是85％或更大，可以是90％或更大，并且还可以是95％或更大。
如从图2显而易见，关于第5基序，图1中所示的10种在酵母中具有活性的XI优选地具有71％或更大、优选地75％或更大、并且更优选地80％或更大的氨基酸序列同一性。
(第6基序)
第6基序由GGXNFDXKXRR(SEQIDNO:7)表示。第6基序由11个氨基酸组成并对应于SEQIDNO:1表示的RsXI的氨基酸序列的位置335至位置345。推定在该基序中，在位置6(D)处的氨基酸残基是构成活性部位的残基。
在SEQIDNO:7表示的第6基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸：
位置3：F或I或L或M或T或V
位置7：A或C或S或T，和
位置9：I或L或P或T或V。
第6基序优选地由GGXNFDXKXRR(SEQIDNO:13)表示。在SEQIDNO:13表示的第6基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸：
位置3：F或I或L或T
位置7：A或C或S，和
位置9：T或V。
在SEQIDNO:13表示的第6基序中的相应X(天然存在的氨基酸)优选地是以下氨基酸。这个第6基序基于用RsXI的氨基酸序列(SEQIDNO:1)和分别源自梨囊鞭菌属物种E2、植发酵梭菌、多形拟杆菌和乳酸乳球菌的XI的氨基酸序列进行比对分析的结果。
位置3：I或L或T
位置7：A或S，和
位置9：T或V
第6基序优选地包含与对应于RsXI第6基序的氨基酸序列具有60％或更大同一性的氨基酸序列，其中所述RsXI第6基序由GGLNFDSKVRR(SEQIDNO:29)表示。第6基序更优选地包含与SEQIDNO:29表示的氨基酸序列具有65％或更大、仍然更优选地70％或更大、和甚至更优选地75％或更大的同一性的氨基酸序列。同一性可以是80％或更大，可以是85％或更大，可以是90％或更大，并且还可以是95％或更大。
如从图2显而易见，相对于第6基序，图1中所示的10种在酵母中具有活性的XI优选地具有72％或更大、优选地75％或更大、更优选地80％或更大、仍然更优选地85％或更大、并且甚至更优选地90％或更大的氨基酸序列同一性。
本发明的蛋白质具有其中第6基序中的天冬酰胺(N)是另一种氨基酸的氨基酸序列。换而言之，它具有其中第6基序中的天冬酰胺(N)置换为另一种氨基酸的氨基酸序列。第6基序中的天冬酰胺认为具有改善真核细胞的木糖利用(发酵)能力的重要价值，原因在于XI与RsXI具有某种关系。
对置换第6基序中N的其他氨基酸不存在具体限制，并且本领域技术人员可以通过以下方式指定这些氨基酸：通过公众已知的诱变方法向第6基序中天冬酰胺位置引入点突变以产生修饰的蛋白质、将修饰的蛋白质引入真核细胞如酵母中并与野生型蛋白比较改善的木糖利用能力。
优选的其他氨基酸的例子包括半胱氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸。优选通过将天冬酰胺置换为前述任一氨基酸的突变。在一些情况下，半胱氨酸或苏氨酸是更优选的。
相对于本发明蛋白质第1基序至第6基序的全部同一性优选地是65％或更大，并且更优选地任何同一性是70％或更大。
另外，相对于本发明蛋白质第2基序至第4基序的全部同一性优选地是75％或更大、并且更优选地80％或更大。
另外，本发明蛋白质优选地具有相对于SEQIDNO:1表示的RsXI的氨基酸序列具有45％或更大同一性的氨基酸序列并且更优选地具有同一性为50％或更大的氨基酸序列。
相对于多种基序的相应氨基酸序列和SEQIDNO:1表示的RsXI氨基酸序列具有预定范围内的同一性的氨基酸序列是通过从所讨论的氨基酸序列缺失、置换或添加一个或几个氨基酸所衍生的氨基酸序列。氨基酸序列中的氨基酸突变即缺失、置换和添加，可以单独出现或其2种或更多种类型的组合出现。另外，对突变总数不存在具体限制，只要同一性处于特定范围内即可。
本发明的蛋白质具有木糖异构酶活性。“XI活性”是使木糖异构化成木酮糖的活性。可以利用作为这种异构化反应的底物的木糖的量减少或由该反应产生的木酮糖的量，通过已知方法测量XI活性。“具有XI活性”单纯意指存在XI活性。优选地，这意味XI活性等于或大于由SEQIDNO:1或SEQIDNO:14-23任一者所代表的氨基酸序列组成的蛋白质的XI活性。XI活性可以以本发明蛋白质或以如表达本发明蛋白质的真核细胞(如酵母)的细胞裂解物的含XI级分对木糖的消耗量或消耗速率或木酮糖的产生量来测量。XI活性优选地是至少70％或更大、优选地至少80％或仍然更优选地至少90％或最优选地至少100％的由SEQIDNO:1或SEQIDNO:14-23任一者所代表的氨基酸序列组成的蛋白质或在指定位点具有天冬酰胺的本发明蛋白质(一般是野生型木糖异构酶)的XI活性。
当本发明蛋白质在真核细胞如酵母中表达时，真核细胞的木糖利用能力优选地高于相同条件下对特定位置是天冬酰胺的等同于本发明蛋白质的蛋白质(一般地，为具有野生型木糖异构酶活性的蛋白质(野生型蛋白))所评价的木糖利用能力。木糖利用能力例如在木糖存在下由真核细胞生长量(速率)、木糖消耗量(速率)、发酵生产量(例如乙醇)等评价。这是因为木糖利用能力是最终需要的功能。木糖利用能力优选地如野生型蛋白的木糖利用能力的110％那样高或更高，更优选地120％或更高、仍然更优选地130％或更高、甚至更优选地150％或更高、仍然甚至更优选地200％或更高、然而甚至更优选地250％或更高并且最优选地300％或更高。
本发明蛋白质的例子包括这些蛋白质，它们具有在SEQIDNO:1和SEQIDNO:14至23中第6基序的天冬酰胺位置处含有除天冬酰胺之外的氨基酸的氨基酸序列。即，例子包括相对于RsXI，具有由SEQIDNO:30表示的氨基酸序列的蛋白质；相对于源自植发酵梭菌的XI，具有由SEQIDNO:31表示的氨基酸序列的蛋白质；相对于源自艰难梭菌(Clostridiumdifficile)的XI，具有由SEQIDNO:32表示的氨基酸序列的蛋白质；相对于源自死亡梭杆菌(Fusobacteriummortiferum)的XI，具有由SEQIDNO:33表示的氨基酸序列的蛋白质；相对于源自多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的XI，具有由SEQIDNO:34表示的氨基酸序列的蛋白质；相对于源自Cyllamycesaberensisn的XI，具有由SEQIDNO:35表示的氨基酸序列的蛋白质；相对于源自脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)的XI，具有由SEQIDNO:36表示的氨基酸序列的蛋白质；相对于源自根囊鞭菌属物种(Orpinomycessp.)ukk1的XI，具有由SEQIDNO:37表示的氨基酸序列的蛋白质；相对于源自梨囊鞭菌属物种(Piromycessp.)E2的XI，具有由SEQIDNO:38表示的氨基酸序列的蛋白质；相对于源自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的XI，具有由SEQIDNO:39表示的氨基酸序列的蛋白质；和相对于源自玻璃海鞘(Cionaintestinals)的XI，具有由SEQIDNO:40表示的氨基酸序列的蛋白质。
另外，本发明蛋白质例如包括具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与SEQIDNO:1和SEQIDNO:14至23表示的任何氨基酸序列具有70％或更大、优选地75％或更大、仍然更优选地80％或更大、甚至更优选地85％或更大、仍然甚至更优选地90％或更大、然而甚至更优选地95％或更大并且最优选地98％或更大的同一性以及在对应于SEQIDNO:1位置337的位置处具有除天冬酰胺之外置换天冬酰胺的氨基酸(优选例子是半胱氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸；将天冬酰胺置换为任何氨基酸的突变是优选的；并且在一些情况下优选半胱氨酸和苏氨酸)。同时，表述“对应于的位置”意指当比对相对于基础氨基酸序列如SEQIDNO:1具有某种氨基酸序列同一性的待比较氨基酸序列时，待比较氨基酸序列的与基础氨基酸序列的特定位置相对应的位置。在SEQIDNO:14至23表示的氨基酸序列中，与位置337相对应的位置是位置337、位置337、位置335、位置339、位置338、位置339、位置338、位置338、位置337和位置357。
本发明蛋白质优选地是具有下述氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与SEQIDNO:1、SEQIDNO:14、17、21和22表示的任何氨基酸序列具有70％或更大、优选地75％或更大、更优选地75％或更大、仍然更优选地80％或更大、甚至更优选地85％或更大、仍然甚至更优选地90％或更大、然而甚至更优选地95％或更大并且最优选地98％或更大的同一性以及在对应于SEQIDNO:1位置337的位置处将天冬酰胺置换为除天冬酰胺之外的氨基酸(优选例子是半胱氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸；将天冬酰胺置换为任何氨基酸的突变是优选的；并且在一些情况下优选半胱氨酸和苏氨酸)。
本发明的蛋白质是通过多种方法可获得的。例如，本发明蛋白质可以通过以下方式获得，使用选自SEQIDNO:1和SEQIDNO:14至23的氨基酸序列或编码该氨基酸序列的核苷酸序列作为查询序列，借助公众已知的同源性检索、基序分析等提取具有同一性不低于某个水平的第1基序至第5基序的蛋白质；并且向提取的蛋白质的第5基序中的天冬酰胺位置引入突变。由本领域技术人员根据公众已知的技术向氨基酸序列位点特异性引入突变是可能的。本领域技术人员熟知的制备编码氨基酸序列经修饰的蛋白质的DNA的方法例子包括位点定向诱变法(KramerW和FritzH-J：MethodsEnzymol154:350,1987)。
备选地，可以使用例如，将特定天冬酰胺位置置换为SEQIDNO:1和SEQIDNO:14至23中另一种氨基酸的SEQIDNO:30至40或编码与查询序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列，提取在特定天冬酰胺处含有除天冬酰胺之外氨基酸的蛋白质。还在自然界中，通过核苷酸序列的突变，蛋白质的编码氨基酸序列的突变可能发生。
另外，可以使用编码由SEQIDNO:1、14至23或30至40表示的氨基酸序列的DNA或其互补链作为探针，通过杂交技术分离DNA，并且可以获得由该DNA编码的本发明蛋白质的野生型，随后将其修饰；或可以直接获得本发明的蛋白质。另外，使用与该DNA或互补链特异性杂交的寡核苷酸作为引物，可以通过PCR反应获得本发明蛋白质的野生型，随后进行修饰；或可以直接获得本发明的蛋白质。可以由本领域技术人员常规地如上获得本发明的蛋白质。
就杂交技术而言，杂交反应应当优选地在严格条件下实施。下文将描述严格条件。
通过以下方式制备本发明的蛋白质：以含有编码本发明蛋白质的DNA构建体转化适宜的宿主如真核细胞，通过本领域技术人员熟知的常规方法培养转化的宿主细胞，并从培养的细胞或培养基收获本发明的蛋白质。该技术是本领域技术人员熟知的。
(编码本发明蛋白质的DNA)
本发明的DNA是具有编码本发明蛋白质的核苷酸序列的DNA。本发明的DNA可以通过合成方式制备编码本发明蛋白质的DNA或如上文所述，通过位点定向诱变法、杂交技术、PCR等获得。
杂交中的严格条件指例如其中形成所谓特异性杂合体而不形成非特异性杂合体的条件。例如，包括这样的条件，从而与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11或13任一项所代表的核苷酸序列具有高同一性如至少70％同一、优选地至少80％同一性、更优选地至少85％、或仍然更优选地至少90％、或最优选地至少95％同一性的DNA的互补链与该DNA杂交，而具有较低同一性的DNA的互补链不与该DNA杂交。一般地，Na盐浓度是15至750mM、优选地50至750mM，更优选地300至750mM，温度是25至70℃，优选地50至70℃，更优选地55至65℃，并且甲酰胺浓度是0％至50％，优选地20％至50％，更优选地35％至45％。另外，严格条件包括杂交后的滤膜洗涤条件，一般地，Na盐浓度是15至600mM，优选地50至600mM，更优选地300至600mM，并且温度是50至70℃，优选地是55至70℃，更优选地是60至65℃。
在编码特定氨基酸序列的核苷酸序列中，可以将编码预定氨基酸序列的核苷酸序列中的至少一个碱基按照遗传编码简并性置换为另一个种类的碱基，而不改变蛋白质的氨基酸序列。因此，本发明的DNA包括这样的DNA，其编码按照遗传编码简并性通过置换修饰的核苷酸序列。本发明DNA可以用为真核细胞(如酵母)中表达而优化的核苷酸序列构成。
(用于转化的载体)
本文中公开的用于转化的载体包含适宜启动子下游的本发明DNA，其与启动子可操作地连接。启动子的例子包括如下文描述在真核细胞等中有功能的各种启动子和诱导型启动子如GAL启动子。用于转化的重组载体还可以配有终止子、增强子、复制起点(ori)、标记物等，并且可以根据需要适当地选择这类元件。另外，在重组载体意在将所需DNA片段植入染色体中的情况下，如对于基因置换，重组载体具有与染色体上预定域相对应的同源域。另外，本发明的载体可以利用适当选择的市售酵母表达载体等构建。
构建重组载体所要求的这类一般操作由本领域技术人员常规实施，并且本领域技术人员可以通过适当地参考实验技术手册，例如T.Maniatis,J.Sambrook等人,"MolecularCloning,ALaboratoryManual",ColdSpringHarborLaboratory,1982,1989,2001实施这些操作。
(真核细胞)
本文中公开的真核细胞是含有本发明DNA的真核细胞。本发明的真核细胞一般是通过本发明载体转化的经转化真核细胞。DNA可以在宿主细胞中滞留于染色体外部，但是优选地滞留在染色体上。另外，为了显示高木糖利用能力，例如优选地滞留其多个副本。
对作为下文公开的转化体的宿主的真核细胞不存在具体限制。从物质生产等的观点看，它可以是曲霉(Aspergillus)或其他霉菌或酵母。曲霉属物种的例子包括棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、米曲霉(Aspergillusorizae)等。酵母的例子包括各种已知的酵母、包括酿酒酵母和其他酵母属(Saccharomyces)酵母、粟酒裂殖酵母属(Schizosaccharomycespombe)和其他裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)酵母、休哈塔假丝酵母(Candidashehatae)和其他假丝酵母属(Candida)酵母、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)和其他毕赤酵母属(Pichia)酵母、汉逊酵母属(Hansenula)酵母、克勒克氏酵母属(Klocckera)酵母、许旺酵母属(Schwanniomyces)酵母和耶罗维亚酵母属(Yarrowia)酵母、丝孢酵母属(Trichosporon)酵母、酒香酵母属(Brettanomyces)酵母、管囊酵母属(Pachysolen)酵母、Yamadazyma酵母、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)和其他克鲁维酵母属(Kluyveromyces)酵母、东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)和其他伊萨酵母属(Issatchenkia)酵母等。这些酵母当中，从工业利用的观点看，优选酵母属酵母。这些酵母属酵母当中，优选酿酒酵母。
DNA由宿主以它可以表达的方式携带。即，它可以在合适启动子控制下连接，并且也可以提供终止子、增强子、复制起点(ori)、标记物等。启动子可以是诱导型或组成型的。酵母中的组成型启动子的例子包括3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)启动子、醇脱氢酶1(ADH1)启动子、组氨酸营养功能基因(HIS3)启动子、细胞色素bc1复合体(CYC1)启动子和高渗响应性7基因(HOR7)启动子和这些启动子的修饰物。
真核细胞也可以是在胞外或在细胞表面上分泌型表达纤维素酶或半纤维素酶的一种真核细胞。例子包括葡聚糖内切酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶和各种其他纤维素酶以及半纤维素酶和其他生物质降解酶。这类蛋白质的表达允许有效利用除衍生自木质纤维素的木质素之外的糖。本说明书中公开的转化体也可以是一种已经根据需要给予基因工程修饰如引入外源基因或破坏内源基因的转化体。
真核细胞可以是一种能够通过发酵产生所需的有用化学物质的真核细胞，如下文所解释。可以向能够产生有用化学物质的真核细胞提供参与产生这种有用化学物质的内源基因和/或外源基因。也可以破坏所需的内源基因。酵母通常通过厌氧发酵产生乙醇，但是已经通过基因工程修饰等转化以使其能够产生另一种有用化学物质的宿主也是可能的。有用化学物质的例子不仅包括乙醇，还包括乳酸、乙酸、1,3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、乙烯和甘油。优选地，转化体能够产生这些物质中的一种或两种或更多种作为有用物质。本说明书中公开的转化体的宿主可以包含对产生有机酸如乳酸的酵母等的基因修饰等(日本专利申请公开号2003-259878、日本专利申请公开号2006-006271、日文专利申请公开号2006-20602、日本专利申请公开号2006-75133、日本专利申请公开号2006-2966377和日本专利申请公开号2007-89466)。
向宿主细胞引入载体的方法包括磷酸钙法、转化法、转染法、接合法、原生质体融合法、电穿孔法、脂转染法、乙酸锂法和本领域已知的任何其他方法。这些技术在出版的书籍中描述，包括上文提到的文本。可以通过在引入载体的酵母当中按标记基因筛选或表达基因的活性，获得本说明书的转化体。
(产生有用化学物质的方法)
提供了本说明书中公开的有用化学物质生产方法，以及在木糖存在下培养真核细胞的步骤。因为真核细胞具有木糖利用能力，它可以有效地使用所含的任何木糖作为碳源，并将它以本说明书中公开的生产方法转化成有用物质。因此，甚至当培养基含有木质纤维素的糖，包括木糖时，可以有效地利用这种生物质碳源并且将其转化成有用物质。除木糖之外，木质纤维素糖可以包括葡萄糖，以及半纤维素分解产物。
木糖包括阿糖基木聚糖、葡糖醛酸木聚糖和其他木聚糖。在自然界中，这些聚合物形成半纤维素的一个组分，并且在木质纤维素和生物质的其他形式等中存在。木糖可以通过用木聚糖内切酶、木糖苷酶等消化木聚糖获得。
有用化学物质也可以是这样的化合物，其不是本来的代谢物，而是通过将葡萄糖代谢系统的一种或两种或更多种酶以遗传方式工程化置换、添加等使酵母能够产生的一个化学物质。有用化学物质的例子包含乙醇以及低级醇、乳酸、乙酸和其他有机酸。此外，还有通过添加类异戊二烯合成途径获得的1,3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、甘油和乙烯、法呢醇、香叶基香叶醇、鲨烯和其他类萜和精细化学品(辅酶Q10、维生素和其他原料等)。另外，包括因糖酵解系统中的修饰所获得的丙三醇、塑料、合成原料等和生物炼制技术中使用的其他材料。由于酵母具有醇发酵高性能，所以转化体可以在含碳源(包括木糖)的培养基中有效产生乙醇。具有醇发酵高性能的酵母通过糖酵解系统的修饰而具有高的有机酸和其他有用物质性能。
在培养步骤中，使用含有木糖作为碳源的培养基。另外，培养基可以含有葡萄糖。优选地，碳源衍生自生物质碳源，包括木质纤维素。此外，当酵母表达纤维素酶并具有纤维素代谢能力时，纤维素或其部分降解的产物可以包含于培养基中。
培养步骤可以根据从适用于真核宿主细胞的一般培养条件适当选择的培养条件完成。一般地，可以使用静置培养、振荡培养或通气搅拌培养等作为发酵培养。通气条件可以适当地设定为厌氧条件、微有氧条件或有氧条件。培养温度不作具体限制，并且可以处于25℃至55℃范围内。培养时间可以根据需要设定，并且可以是数小时至约150小时。可以用无机酸或有机酸或碱溶液等调节pH。可以将抗生素如氨苄青霉素或四环素根据需要在培养期间添加至培养基。
借助培养步骤，根据所用微生物的有用物质产生能力，产生有用化学物质。例如，用具有产乙醇能力的真核细胞获得乙醇。因生物基因修饰等具有产生乳酸和其他有机酸的能力的真核细胞可以用来产生乳酸等。在完成有用物质产生步骤后，可以是从培养液收集含有有用物质的级分的步骤，和纯化或浓缩有用物质的另一个步骤。收集、纯化过程和其他过程可以根据有用物质的类型等适当地选择。
有用物质产生步骤可以后续从培养液收集含有有用物质的级分的步骤，和提炼或浓缩这个级分的又一个步骤。收集步骤和提炼步骤或其他步骤可以根据有用物质的类型等适当选择。
(筛选具有木糖异构酶活性的蛋白质的方法)
本说明书提供一种筛选具有木糖异构酶活性的蛋白质的方法。本发明的筛查方法可以包括步骤：与SEQIDNO:1表示的氨基酸序列比对时评估修饰的蛋白质的木糖异构酶活性，其中修饰的蛋白质从所述蛋白质的N末端按所述顺序含有以下第1基序至第6基序，并且以另一种氨基酸替换具有木糖异构酶活性的蛋白质的第6基序的氨基酸序列中的天冬酰胺(N)。根据该方法，可以获得在木糖异构酶活性方面改善的修饰蛋白质。特别地，可以获得可用于酵母中表达的修饰的蛋白质。待置换的前述另一种氨基酸选自多种天然存在的氨基酸，并且这些当中，可以例举半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸和缬氨酸，尤其是半胱氨酸和苏氨酸。就修饰的蛋白质中第1基序至第6基序而言，可以使用上文描述的优选实施方案。
作为获得这种修饰的蛋白质的蛋白质源，可以将RsXI的氨基酸序列作为查询序列由蛋白质BLAST(数据库使用非冗余蛋白质序列，并且Algorism参数处于默认设置)检索，并且可以使用其他相似氨基酸序列的前500种；并且它们当中，优选地可以例举前400种、前300种、前200种或前100种的蛋白质。可以使用如上文所述的比对分析鉴定第6基序中天冬酰胺的位置。值得注意地，可以通过如上文讨论的获得蛋白质的方法获得待筛选的修饰的蛋白质。
(用于产生具有木糖异构酶活性的蛋白质的方法)
根据本说明书，还提供了一种用于产生具有木糖异构酶活性的蛋白质的方法。本发明的生产方法可以包括步骤：产生具有木糖异构酶活性的蛋白质，所述蛋白质是修饰的蛋白质，所述修饰的蛋白质与SEQIDNO:1表示的氨基酸序列比对时从该蛋白质的N末端按所述顺序含有以下第1基序至第6基序，并且以另一种氨基酸替换具有木糖异构酶活性的蛋白质的第6基序的氨基酸序列中的天冬酰胺(N)。根据该方法，可以容易地产生具有木糖异构酶活性的修饰的蛋白质。对于其他氨基酸、蛋白质源和基序的多个方面，可以类似于上文所述的筛选方法来应用上文所述的多个方面。
实施方案
下文使用实施例详细解释本发明教导，但是本发明不受实施例限制。下文描述的遗传重组操作根据MolecularCloning:ALaboratoryManual(T.Maniatis等人,ColdSpringHarborLaboratory)进行。
以下实施例中所用的培养基的组成如下：
SD液体培养基：6.7g/L无氨基酸酵母氮源和20g/LD-葡萄糖
SD琼脂培养基：6.7g/L无氨基酸酵母氮源，20g/LD-葡萄糖，和20g/L琼脂
SX液体培养基：6.7g/L无氨基酸酵母氮源，和20g/LD-木糖
SX琼脂培养基：6.7g/L无氨基酸酵母氮源，20g/LD-木糖，和20g/L琼脂
SX液体培养基50：6.7g/L无氨基酸酵母氮源，和50g/LD-木糖
第一实施方案
(通过易错PCR在RsXI基因中引入突变)
使用GeneMorphII(来自Stratagene)，以pRS436GAP-RsXIC1-O作为模板实施易错PCR，其中向所述pRS436GAP-RsXIC1-O插入源自黄胸散白蚁肠内原生生物的针对酵母密码子优化的木糖异构酶基因RsXI-C1-opt(GenBank：HV438143)。该反应以如下循环实施30次循环：95℃2分钟，95℃1分钟，60℃1分钟，和72℃1分钟30秒，并且随后在72℃反应10分钟。所用引物的序列如下：
pRSSacII-AAA-ATG-F4：5'-GAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACAAACAAACCGCGGAAAATG-3'(SEQIDNO:41)和
pRSXhoI-TAA-R3：5'-GTGAATGTAAGCGTGACATAACTAATTACATGATGCGGCCCTCGAGTTA-3'(SEQIDNO:42)。
使用ZeroBluntTOPOPCR克隆试剂盒，将扩增的DNA片段克隆至PCR-BluntIITOPO(来自Invitrogen)，并且分析插入的DNA片段。作为结果，证实在DNA片段中随机引入每1000个碱基平均3个突变(错误率0.3％)。
第二实施方案
(酵母基因表达用基本质粒的构建)
构建低拷贝型转基因载体pRS316GAP。使用引物TDH3p-CYC1t-IF-F和R，以pRS436GAP(DDBJ登录号：AB304862)作为模板实施PCR。采用以下循环，使用PrimeSTARHSDNA聚合酶(TakaraBioInc.)实施PCR：98℃10秒，55℃15秒，72℃1分钟30秒并重复30个循环。所用引物的序列如下：
TDH3p-CYC1t-IF-F：5'-TCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGC-3'
(SEQIDNO:43)，和
TDH3p-CYC1t-IF-R：5'-GATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGC-3'(SEQIDNO:44)。
使用In-FusionAdvantagePCR克隆试剂盒(TakaraBioInc.)在限制性酶PvuII消化的pRS316(NBRP登录号：BYP562)中插入产生的DNA片段。获得的质粒命名为pRS316GAP。
第三实施方案
(向酵母引入源自变异XI基因文库的DNA)
将通过易错PCR产生的DNA片段或通过使用pRS436-GAP-RsXIC1-O作为模板、使用pRSSacII-AAA-ATG-F4和pRsXhoI-TAA-R3作为引物并使用PrimeSTARHSDNA聚合酶作为聚合酶的PCR产生的DNA片段(对照)与限制性酶SacII和XhoI消化的pRS316GAP混合，并使用Frozen-EZYeastTransformationII(ZymoResearch)，在酿酒酵母W600W株中引入(参见日本专利申请公开号2011-147445)，所述菌株随后在5mLSD液体培养基中培养。
第四实施方案
(在使用木糖作为碳源的培养基中富集培养)
在2日培养后，将第三实施方案中的SD培养液添加至5mLSX液体培养基，并在30℃和70转/分钟在BioPhotorecorderTVS062CA(Advantech)中培养。将细胞在距开始培养的第7日从培养液回收，并且添加至5mL新鲜SX液体培养基至初始培养液浓度的OD(600nm)为0.1。使用BioPhotorecorder，将溶液在30℃和70转/分钟培养7日，并且从培养液回收细胞。将细胞铺展在SX琼脂培养基上并在30℃培养。选择生长快于酵母的引入RsXI-C1-optDNA片段的菌落，在SD琼脂培养基上划线，并纯化培养的菌落，作为选定的菌株。
第五实施方案
(自选定菌株提取质粒和测序分析)
使用酵母质粒微量制备试剂盒Zymoprep(ZymoResearch)，从根据第四实施方案的生长试验中的比生长速率而言居前10位的菌株和已经引入RsXI-C1-opt的菌株提取质粒。作为分析提取的质粒中RsXI-C1-opt基因结构域的结果，识别出5个类型的突变体序列。突变体XI基因分别命名为RsXIC1O-T76I、RsXIC1O-E125G、RsXIC1O-I286F、RsXIC1O-N337T和RsXIC1O-K384E；并且用于相应基因的酵母表达载体命名为pRS316GAP-RsXlC1O-T76I、pRS316GAP-RsXIC1O-E125G、pRS316GAP-RsXIC1O-I286F、pRS316GAP-RsXIC1O-N337T、和pRS316GAP-RsXIC10-K384E。另外，野生型RsXl-C1-opt的酵母表达载体命名为pRS316GAP-RsXIC1O。
第六实施方案
(向酵母引入突变基因)
使用Frozen-EZ酵母转化II(ZymoResearch)，将第五实施方案中制备的质粒按照与第三实施方案相同的方式引入酿酒酵母W600W菌株的酵母中(参见日文专利申请公开号2011-147445)，并且将酵母铺展在SD琼脂培养基上并在30℃培养。将长出的菌落在新鲜的SD琼脂培养基上划线并培养以纯化。纯化后获得的选定菌株以及所用的质粒命名如下。
WR701Is：pRS316GAP-RsXlC1O-T76I
WR702Gs：pRS316GAP-RsXIC1O-E125G
WR703Fs：pRS316GAP-RsXIC1O-I286F
WR704Ts：pRS316GAP-RsXIC1O-N337T
WR705Es：pRS316GAP-RsXIC10-K384E，和
WR700s：pRS316GAP-RsXIC1O
第七实施方案
(利用木糖作为碳源的基因修饰酵母的生长试验)
在含有木糖作为碳源的培养基中实施生长试验以评价第六实施方案中获得的酵母的木糖利用能力。5个类型在第六实施方案中制备的菌株在SD液体培养基中培养24小时，并且将细胞回收并且用灭菌水洗涤。此后，向L形试管内准备的SX液体培养基中添加细胞并且启动生长试验。在使用BioPhotorecorderTVSO62CA时30℃，70转/分钟的培养条件下的生长试验期间，按20分钟间隔测量培养液的OD(660nm)。图5中显示相应菌株的比生长速率的比较。
如图5中所示，证实已经引入RsXIC1O-I286F的WR703Fs菌株、已经引入RsXIC1O-N337T的WR704Ts菌株和已经引入RsXIC1O-K384E的WR705Es菌株比生长速率高于已经引入野生型RsXI-C1-opt的WR700s菌株。其中，WR704Ts菌株的比生长速率1.6倍于WR700s菌株。
第八实施方案
(利用木糖作为碳源的基因修饰酵母的发酵试验)
将WR700s菌株和WR704Ts菌株接种在5mLSD液体培养基中并培养24小时。接下来，将1mL培养液添加至50mLSD液体培养基并培养24小时。将细胞回收并用灭菌水洗涤2次。对于发酵试验，使用以丁基橡胶封闭牢固密封的具有螺盖的耐压试管。通过添加酵母悬液至发酵培养基的最终OD(600nm)为10，制备5mLSX液体培养基50并将它在30℃和180转/分钟发酵。按自行决定的时序，将等分试样的发酵液体采样并通过液相色谱就木糖和乙醇进行分析。作为液相色谱柱，将HPX-87H柱(Bio-RAD)在60℃使用，并且作为检测器，使用差示折射率检测器RID-10A(ShimadzuCorporation)。对于流动相，使用0.05％硫酸溶液并且以流速0.8mL/min供应。图6显示相应菌株的发酵培养基中木糖浓度和乙醇浓度的时间依赖性变化。在本上下文中，发酵试验重复4次，并显示为平均值。
如图6中所示，WR704Ts菌株的木糖消耗速率和乙醇产生速率比WR700s菌株高大约2.5倍，并且发酵72小时所致木糖消耗量对于WR700s菌株是大约12g/L，但是对于WR704Ts菌株是大约30g/L。从上文已经显而易见，可以通过将RsXI的位置337处的天冬酰胺置换为苏氨酸，改善酵母的木糖利用能力。
第九实施方案
(氨基酸点突变文库的构建及引入酵母)
构建了靶向RsXIC10m的第337位氨基酸(天冬酰胺)的氨基酸点突变文库，其中对所述RsXIC10m证实了酵母中木糖利用能力的改善作用。使用第五实施方案中描述的pRS316GAP-RsXIC1O作为模板、下表1中列出的引物和QuickChangeLightningMultiSite-DirectedMutagenesis试剂盒(AgilentTechnologies,Inc.)根据该试剂盒所附的方案，实施反应。使用获得的反应液，转化ECOS感受态大肠杆菌DH5α(NipponGeneCo.,Ltd.)并从长出的菌落提取质粒。通过测序，鉴定到一个突变基因座并且获得向酵母引入每种突变体XI的质粒，所述的每种突变体XI具有18种突变中的任一种，除了天冬酰胺和苏氨酸之外(丙氨酸：A，精氨酸：R，天冬氨酸：D，半胱氨酸：C，谷氨酰胺：G，谷氨酸：E，甘氨酸：G，组氨酸：H，异亮氨酸：I，亮氨酸：L，赖氨酸：K，甲硫氨酸：M，苯丙氨酸：F，脯氨酸：P，丝氨酸：S，色氨酸：W，酪氨酸：Y，和缬氨酸：V)(表1)。随后使用Frozen-EZ酵母转化II，将获得的质粒引入W600W菌株中，随后W600W菌株铺展在SD琼脂培养基上。将长出的菌落划线在新鲜的SD琼脂培养基上并培养以纯化菌落。表1中显示了获得的基因修饰酵母、用于向酵母中引入突变体Xl的质粒和引入的突变体XI基因。
表1
第十实施方案
(利用木糖作为碳源的基因修饰酵母的发酵试验)
将表1中的18种重组酵母、WR700s菌株和WR704Ts菌株接种至体积为每孔2mL的96孔StorageBlock(CorningIncorporated)中所制备的1mLSD液体培养基，并且在恒定温度培养摇床M-BR-022UP(TaitecCorporation)中在30℃和1500转/分钟培养24小时。接下来，将200微升培养液添加至96孔StorageBlock中所制备的1mLSD液体培养基中并在相似条件下培养24小时。将细胞回收，用无菌水洗涤两次，并悬浮在无菌水中以制备酵母悬液。发酵试验在以下条件下进行。在96孔StorageBlock中如此准备1mLSX液体培养基，从而在其中添加酵母悬液至最终OD(600nm)为1。为了建立厌氧条件，将每个孔用TiterStickHC(KajixxCo.,Ltd.)全密封，并且发酵在M-BR-022UP中在30℃和1500转/分钟条件下实施。按自行决定的时序，将等分试样的发酵液体采样并如第八实施方案中那样，通过液相色谱就木糖和乙醇进行分析。图7显示从发酵开始至此后72小时，已经引入XI的酵母的木糖消耗量。发酵试验重复2次或更多次，并显示平均值。
如图7中所示，发酵72小时后已经引入野生型RsXI基因(RsXI-C1-opt)的WR700s菌株的木糖消耗量是2.6g/L，并且第七实施方案中所示的WR704Ts菌株的木糖消耗量是7.2g/L。证实从点突变文库获得的18种菌株当中，3个菌株WR704Cs、WR704Vs，和WR704As中木糖消耗量改善，超过WR700s(分别地是8.9g/L、5.3g/L和4.0g/L)。其中，WR704Cs菌株的木糖消耗量超过WR704Ts菌株，并且证实改善木糖消耗量至高达WR700s3.5倍的水平。从上文显而易见，可以通过将RsXl的位置337处的天冬酰胺置换为苏氨酸、半胱氨酸、缬氨酸和丙氨酸中的任一者(编码该蛋白质的DNA分别由SEQIDNO:71至74表示)，改善酵母的木糖利用能力1.5倍或更多。
第十一实施方案
(向其他XI引入氨基酸点突变)
研究了通过相对于RsXI第337位氨基酸的突变所获得的木糖利用能力改善作用是否在源自其他生物学物种的XI中可重复。使用针对酵母密码子优化的源自梨囊鞭菌属物种E2的木糖异构酶基因和源自植发酵梭菌的木糖异构酶基因(日本专利申请公开号2011-147445)作为模板，以及下表2中列出的引物，合成了引入突变的DNA片段PiXIO-N338T和CpXIO-N337T(SEQIDNO:75和SEQIDNO:76)，其中所述突变将对应于RsXI第337位氨基酸残基的天冬酰胺置换为苏氨酸。另外，作为对照，还同时地合成未引入突变的DNA片段PiXIO和CpXIO。使用In-FusionHDPCR克隆试剂盒(TakaraBioInc.)，将获得的DNA片段插入限制性酶SacII和XhoI消化的pRS316GAP中，以获得基因转导质粒。随后使用Frozen-EZ酵母转化II，将获得的质粒引入W600W菌株中，随后W600W菌株铺展在SD琼脂培养基上。将长出的菌落划线在新鲜的SD琼脂培养基上并培养以纯化菌落。表2中显示了获得的基因修饰酵母、用于向酵母中引入突变体Xl的质粒和引入的突变体XI基因。
表2
第十二实施方案
(利用木糖作为碳源的基因修饰酵母的发酵试验)
将表2中列出的4种重组酵母接种在5mLSD液体培养基中，并且在30℃和100转/分钟培养24小时。在5mL新鲜制备的SD液体培养基中，添加200微升培养液，并在相似条件下培养24小时。将细胞回收，用无菌水洗涤两次，并悬浮在无菌水中以制备酵母悬液。发酵试验在以下条件下进行。在96孔StorageBlock中如此准备1mLSX液体培养基，从而对于WP700s菌株和WP704Ts菌株，向其中添加酵母悬液至最终OD(600nm)为10，并且对于WC700s菌株和WC704Ts菌株，添加酵母悬液至最终OD(600nm)为50。为了建立厌氧条件，将每个孔用TiterStickHC全密封，并且发酵在30℃和1500转/分钟条件下实施。按自行决定的时序，将等分试样的发酵液体采样并如第八实施方案中那样，类似地通过液相色谱就木糖和乙醇进行分析。图8显示从发酵开始至此后72小时，已经引入XI的酵母的木糖消耗量。发酵试验重复2次或更多次，并显示平均值。
如图8A中所示，已经引入源自野生型梨囊鞭菌属物种E2的XI基因(PiXIO)的WP700s菌株在发酵72小时后的木糖消耗量是2.4g/L，但是已经引入突变型Xl基因(PiXIO-N338T)的WP704Ts菌株的木糖消耗量是7.3g/L。上文证实了与WP700s菌株相比，WP704Ts菌株的木糖消耗量改善3.1倍。
另外，如图8B中所示，已经引入源自野生型植发酵梭菌的XI基因(CpXIO)的WC700s菌株在发酵72小时后的木糖消耗量是1.8g/L，但是已经引入突变型XI基因(CpXIO-N337T)的WC704Ts菌株的木糖消耗量是2.2g/L。上文证实了与WC700s菌株相比，WC704Ts菌株的木糖消耗量改善1.2倍。从上文已经显而易见，通过向对应于RsXI第337位置的位置引入突变，PiXI或CpXI类似地改善酵母的木糖利用能力。
第十三实施方案
(向源自其他生物学物种的XI引入突变)
就报告了其在酵母中活性的源自梨囊鞭菌属物种E2的XI(PiXI)、源自植发酵梭菌(Clostridiumphytofermentans)的XI(CpXI)、源自多形拟杆菌的XI(BtXI)和源自乳酸乳球菌的XI(LlXI)而言，研究是否可以通过将对应于RsXI第337位置的天冬酰胺的氨基酸置换为丙氨酸、半胱氨酸、苏氨酸或缬氨酸，获得对木糖利用能力的改善作用。表3显示用于转导突变的菌株、质粒、基因和引物，并且表4显示引物序列。
表3
表4
Seq ID 引物名 序列
77 PiXI-opt-IF-F2 5′-ataaacaaacaaaccgcggaaaatggctaaggaatacttcccacaaatccaaaagattaaattcgaggg-3′
78 PiXI-opt-IF-R2 5′-tgatgcggccctcgagttattggtacatagcaacaattgcttcatacaattcttgtttaccac-3′
86 PiXIO-N338A-FP-F 5′-atcagaggtggtggttttgttacaggtggtaccgctttcgatgcaaaaaccag-3′
87 PiXIO-N338C-FP-F 5′-atcagaggtggtggttttgttacaggtggtacctgtttcgatgcaaaaaccag-3′
88 PiXIO-N338T-FP-F 5′-atcagaggtggtggttttgttacaggtggtaccactttcgatgcaaaaaccag-3′
89 PiXIO-N338V-FP-F 5′-atcagaggtggtggttttgttacaggtggtaccgttttcgatgcaaaaaccag-3′
79 CpXI-opt-IF-F2 5′-ataaacaaacaaaccgcggaaaatgaagaattacttcccaaatgtcccagaagtgaaatatgaaggccc-3′
8O CpXI-opt-IF-R2 5′-tgatgcggccctcgagtcatctaaacaagatgttattgacaatagtctccaagacttcttgtc-3′
9O CpXIO-N337A-FP-F 5′-tgaaagctggaggctttactaatggtggtctagcttttgatgctaaggttagaagaggcag-3′
91 CpXIO-N337C-FP-F 5′-tgaaagctggaggctttactaatggtggtctatgttttgatgctaaggttagaagaggcag-3′
92 CpXIO-N337T-FP-F 5′-tgaaagctggaggctttactaatggtggtctaacttttgatgctaaggttagaagaggcag-3′
93 CpXIO-N337V-FP-F 5′-tgaaagctggaggctttactaatggtggtctagtttttgatgctaaggttagaagaggcag-3′
81 BtXI-IF-F 5′-ataaacaaacaaaccgcggaaaatggcaacaaaagaattttttccgggaattgaaaagattaaatttg-3′
82 BtXI-IF-R 5′-tgatgcggccctcgagttaatacatattcagaattgcctcataaagttcttgcttgc-3′
94 BtXI-N339A-FP-F 5′-cggtaccggtggtacggcttttgatgctaaaacccgtcgtaattctactgatc-3′
95 BtXI-N339C-FP-F 5′-cggtaccggtggtacgtgttttgatgctaaaacccgtcgtaattctactgatc-3′
96 BtXI-N339T-FP-F 5′-cggtaccggtggtacgacttttgatgctaaaacccgtcgtaattctactgatc-3′
97 BtXI-N339V-FP-F 5′-cggtaccggtggtacggtttttgatgctaaaacccgtcgtaattctactgatc-3′
84 LlXI-opt-IF-F 5′-ataaacaaacaaaccgcggaaaatggcctactttaacgacatcgcaccaatcaaatacgaaggtactaag-3′
85 LlXI-opt-IF-R 5′-tgatgcggccctcgagttataccaagtagtcgttcaaaacactctttatgtattccaaatgg-3′
98 LlXIO-N337A-FP-F 5′-gaacggtggtttgggtaaaggtggtatagcttttgatgccaaagtcagaagaacatc-3′
99 LlXIO-N337C-FP-F 5′-gaacggtggtttgggtaaaggtggtatatgttttgatgccaaagtcagaagaacatc-3′
100 LlXIO-N337T-FP-F 5′-gaacggtggtttgggtaaaggtggtataacttttgatgccaaagtcagaagaacatc-3′
101 LlXIO-N337V-FP-F 5′-gaacggtggtttgggtaaaggtggtatagtttttgatgccaaagtcagaagaacatc-3′
(模板DNA的制备)
如下进行引入点突变的模板DNA的制备。就PiXI和CpXI而言，使用其中优化密码子以便在酵母中表达的源自梨囊鞭菌属物种E2木糖异构酶基因和源自植发酵梭菌木糖异构酶基因作为模板以及表4中列出的引物(SEQIDNO：77、78、79和80)，合成相应的DNA片段。使用In-FusionHDPCR克隆试剂盒，将获得的DNA片段插入限制性酶SacII和XhoI消化的pRS316GAP中，以构建pRS316GAP-PiXIO和pRS316GAP-CpXIO(表3)。
就BtXI而言，使用ATCC(美国典型培养物保藏中心)提供的源自多形拟杆菌VPI5482的基因组DNA(ATCC29148D)作为模板，合成DNA片段。表4中列出所用的引物(SEQIDNO：81、82)。使用In-FusionHDPCR克隆试剂盒，将获得的DNA片段插入限制性酶SacII和XhoI消化的pRS316GAP中，以构建pRS316GAP-BtXI(表3)。
就LlXI而言，基于专利文献3中描述的氨基酸序列和从Genbank获得的氨基酸序列(Genbank：AAD20249)，合成其中优化密码子以便在酵母中表达的合成基因LlXIO(SEQIDNO:83)(GenscriptCorporation(www.Genscript.com))。接下来，使用制备的LlXIO作为模板和表4中列出的引物(SEQIDNO:84、85)，合成DNA片段。使用In-FusionHDPCR克隆试剂盒，将获得的DNA片段插入限制性酶SacII和XhoI消化的pRS316GAP中，以构建pRS316GAP-LlXIO(表3)。
使用pRS316GAP-PiXIO、pRS316GAP-CpXIO、pRS316GAP-LlXIO和pRS316GAP-BtXI作为模板、表4中列出的引物(SEQIDNO:86至101)和QuickChangeLightningMultiSite-DirectedMutagenesis试剂盒(AgilentTechnologies,Inc.)，根据试剂盒随附的方案实施反应。使用获得的反应液，实施ECOS(Trademark)感受态大肠杆菌DH5α(NipponGeneCo.,Ltd.)的转化，并且从长出的菌落提取质粒。通过测序，鉴定突变的基因座，并且对于每种XI，获得用于转导的4种变体XI基因的质粒，其中天冬酰胺置换为半胱氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸(表3)。
随后使用Frozen-EZ酵母转化II，将获得的质粒引入W600W菌株中并将该菌株铺展在SD琼脂培养基上。将长出的菌落划线在新鲜的SD琼脂培养基上并培养以纯化菌落。
第十四实施方案
(利用木糖作为碳源的基因修饰酵母的发酵试验)
在96孔StorageBlock中制备的1mLSD液体培养基中，接种表3中列出的20种重组酵母并在恒定温度培养摇床M-BR-022UP中于30℃和1500转/分钟培养24小时。随后，向新的96孔StorageBlock中制备的1mLSD液体培养基中添加200微升培养液并在相似条件下培养24小时。将细胞回收，用无菌水洗涤两次，并随后悬浮在无菌水中以制备酵母悬液。
在以下条件下开展发酵试验。在96孔StorageBlock中准备1mLSX液体培养基(6.7g/L无氨基酸酵母氮源和20g/L木糖)，其中如此添加酵母悬液，从而培养基的最终OD600变成10。随后，如第十二实施方案中那样实施发酵，并通过液相色谱分析木糖和乙醇。图9显示从发酵开始至此后72小时，已经引入各种XI基因的酵母的木糖消耗量。发酵试验重复2次或更多次，并显示平均值。
如图9A中所示，WP700s(WT)菌株在发酵72小时后的木糖消耗量是2.8g/L，然而与之相反，已经引入其中天冬酰胺置换为半胱氨酸、苏氨酸或缬氨酸的突变型XI基因的WP704Cs(C)、WP704Ts(T)菌株和WP704Vs(V)菌株的木糖消耗量分别是5.1g/L、4.1g/L和3.9g/L，以证实木糖利用能力的改善。类似地，就其他XI而言，对于已经引入其中天冬酰胺在CpXI情况下置换为半胱氨酸或缬氨酸(图9A)、在BtXI情况下置换为半胱氨酸或苏氨酸(图9C)和在LlXI情况下置换为半胱氨酸、苏氨酸或丙氨酸(图9D)的突变型XI基因的菌株，证实木糖利用能力改善。
如以上结果，显而易见类似于RsXI，在XI源自其他生物体情况下如PiXI、CpXI、BtXI和LlXI，可以通过在与RsXI中第337位置处天冬酰胺相对应的基因座处引入突变，改善酵母的木糖利用能力。
序列表独立文本
SEQIDNO:2-13、201-105：木糖异构酶中的共有序列
SEQIDNO:30-40：木糖异构酶突变体
SEQIDNO:41-70、77-101：引物
SEQIDNO:71-76：木糖异构酶突变体

Claims (16)

1.具有木糖异构酶活性并且具有氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列与SEQIDNO:1所示的氨基酸序列比对时从所述蛋白质的N末端起按以下顺序包含以下第1至第6基序，并且以另一氨基酸替换第6基序的氨基酸序列中的天冬酰胺(N)：
第1基序：FXXXXKXXXXXXXXHDXD(SEQIDNO:2)
其中X表示天然存在的氨基酸，
第2基序：XXXXXXXWGGREGYXXLXNT(SEQIDNO:3)
其中X表示天然存在的氨基酸，
第3基序：XXXXXXXXEPKPXEPXXHQYDXD(SEQIDNO:4)
其中X表示天然存在的氨基酸，
第4基序：LXXXXXXNXEXNHXXLXXHXXXH(SEQIDNO:5)
其中X表示天然存在的氨基酸，
第5基序：XGSXDXNXGXXXXGWDXDXXP(SEQIDNO:6)
其中X表示天然存在的氨基酸，和
第6基序：GGXNFDXKXRR(SEQIDNO:7)
其中X表示天然存在的氨基酸。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其中：
第1基序由FXXXXKXGXXXXXFHDXD(SEQIDNO:8)表示，
第2基序由XXXXXVFWGGREGYXXLLNT(SEQIDNO:9)表示，
第3基序由XXXXXFXIEPKPXEPXXHQYDXD(SEQIDNO:10)表示，
第4基序由LXXXFKXNXEXNHXXLAGHXXXH(SEQIDNO:11)表示，
第5基序由XGSXDXNXGXXXXGWDTDXFP(SEQIDNO:12)表示，并且
第6基序由GGXNFDXKXRR(SEQIDNO:13)表示。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其中：
第1基序由FEXXXKXGXXXXCFHDXD(SEQIDNO:102)表示，
(其中位置3是F或I或L；位置4是A或M；位置5是E或Q或S或T；位置7是L或M；位置9是I或V；位置10是E或K或P；位置11是F或Y；位置12是F或Y；并且位置17是A或I或V)，
第2基序由GXXXYVFWGGREGYXXLLNT(SEQIDNO:103)表示，
(其中，位置2是A或G；位置3是V或K或E；位置4是G或N；位置15是E或M；并且位置16是S或T)，
第3基序由XXXXXFXIEPKPXEPXXHQYDXD(SEQIDNO:10)表示，
(其中，位置1是G或N；位置2是F或H；位置3是K或D或L；位置4是G或P；位置5是D或T或I；位置7是L或Y；位置13是K或M；位置16是M或T；位置17是K或T；并且位置22是F或V)，
第4基序由LXKXFKXNXEXNHAXLAGHTFXH(SEQIDNO:104)表示，
(其中，位置2是D或E；位置4是D或Y；位置7是L或M或V；位置9是I或L；位置11是A或T或V；位置15是T或W；并且位置22是Q或E)，
第5基序由XGSXDANXGXXXXGWDTDXFP(SEQIDNO:105)表示，
(其中，位置1是F或L；位置4是I或V；位置8是Q或R或T；位置10是D或N；位置11是P或Y；位置12是L或N或Q；位置13是L或N，并且位置19是E或Q)，以及
第6基序由GGXNFDXKXRR(SEQIDNO:13)表示，
(其中，位置3是I或L或T；位置7是A或S；并且位置9是T或V)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质，其包含选自半胱氨酸、苏氨酸、缬氨酸和丙氨酸的氨基酸替换了第6基序中的天冬酰胺(N)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白质，其包含替换了天冬酰胺的苏氨酸或半胱氨酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的蛋白质，其中
第1基序由与SEQIDNO:24表示的氨基酸序列具有65％或更大同一性的氨基酸序列组成，
第2基序由与SEQIDNO:25表示的氨基酸序列具有75％或更大同一性的氨基酸序列组成，
第3基序由与SEQIDNO:26表示的氨基酸序列具有65％或更大同一性的氨基酸序列组成，
第4基序由与SEQIDNO:27表示的氨基酸序列具有70％或更大同一性的氨基酸序列组成，
第5基序由与SEQIDNO:28表示的氨基酸序列具有70％或更大同一性的氨基酸序列组成，并且
第6基序由与SEQIDNO:29表示的氨基酸序列具有70％或更大同一性的氨基酸序列组成。
7.DNA，其编码根据权利要求1至6中任一项所述的蛋白质。
8.用于真核细胞的转化载体，其含有根据权利要求7所述的DNA。
9.真核细胞，其含有根据权利要求7所述的DNA。
10.根据权利要求9所述的真核细胞，其是酵母。
11.根据权利要求10所述的真核细胞，其中酵母属于选自以下的任一个属：酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hancenula)、克勒克氏酵母属(Klocckera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、耶罗维亚酵母属(Yarrowia)和伊萨酵母属(Issatchenkia)。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的真核细胞，其产生分泌的纤维素酶。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的真核细胞，其具有产生选自以下任一种物质的外源或内源基因：乙醇、乳酸、乙酸、1,3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、乙烯、甘油、法呢醇、香叶基香叶醇和鲨烯。
14.用于产生具有赋予的或改善的木糖利用能力的真核细胞的方法，其包括将根据权利要求7所述的DNA导入真核细胞用于转化的步骤。
15.用于生产有用物质的方法，其包括在木糖存在下培养根据权利要求9至13中任一项所述的真核细胞的步骤。
16.根据权利要求15所述的生产方法，其中有用物质是选自以下的任一种：乙醇、乳酸、乙酸、1,3-丙二醇、丙醇、丁醇、琥珀酸、乙烯、甘油、法呢醇、香叶基香叶醇和鲨烯。
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