CN103562216A - 纤维糊精和β-D-葡萄糖的增强型发酵 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于发酵纤维糊精和β-D-葡萄糖的组合物和方法。提供宿主细胞和具有葡萄糖酶活性的重组多肽。此外，还提供用于在含纤维糊精和β-D-葡萄糖的混合物的发酵过程中，提高细胞生长、化学品产量、以及在含纤维糊精和β-D-葡萄糖的消耗的方法。

Description

纤维糊精和β-D-葡萄糖的增强型发酵

相关申请的交叉引用

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技术领域

本发明涉及纤维糊精和β-D-葡萄糖的发酵。具体地，本发明涉及用于纤维糊精和β-D-葡萄糖的发酵的组合物，该组合物包括重组多肽和含有重组核苷酸和多肽的宿主细胞，以及其使用方法。本发明还涉及用于纤维糊精和β-D-葡萄糖的发酵的方法。

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背景技术

由于对能源安全，可持续发展和全球气候的改变逐渐关心，人们以开始对生物能源的深入研究。人们认为将植物基材料生物转化至生物燃料是化石燃料的化学生产的有吸引力的替换。

纤维素，植物的主要成分和地球上最丰富的有机化合物之一，是一种由β（1-4）连接的D-葡萄糖分子的长链构成的多糖。由于其糖基组合物，纤维素是用于生产生物燃料的丰富的潜在源材料。例如，糖可以被发酵成生物燃料，例如乙醇。为了使纤维素内的糖用于生产生物燃料，必须将纤维素分解成更小的分子。

纤维素可通过纤维素酶的作用而酶解。纤维素酶包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、和β-葡聚糖苷酶。纤维素酶的作用分开纤维素内的1-4β-D-糖苷键，并导致β-D-葡萄糖分子的最终释放。在纤维素分解为单个糖分子时，可形成不同长度的葡萄糖聚合物，作为中间分解产物。长度约为2-6个分子的葡萄糖聚合物来源于纤维素的水解，称为“纤维糊精”。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），也称为面包酵母，已经几千年来用于将己糖生物转化为乙醇。它也是使用最广泛的微生物，用于将D-葡萄糖发酵成乙醇的大规模工业化的生产中。酿酒酵母是非常合适的候选者，用于将植物基生物质生物转化为生物燃料。它具有研究的非常好的遗传学和生理学背景，充分的遗传工具，和对高浓度乙醇的耐受性高。酿酒酵母的低的发酵pH还可以防止发酵过程中的细菌污染。

近年来，证明了利用酿酒酵母对存在于纤维素水解物中的混合糖进行共同发酵的新方略（Ha et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108:504-509,2011;Li et al.,Mol.Biosyst.6(11):2129-2132,2010）。这种方法不仅便于纤维二糖和木糖的同时共发酵，而且由于纤维二糖和木糖共发酵的协同作用提高了乙醇的产率和产量。与葡萄糖发酵相比，由工程酿酒酵母（engineered S.cerevisiae）通过细胞内的水解进行的纤维二糖的发酵具有几个优点。首先，纤维二糖可以与其他糖例如木糖或半乳糖被共同消耗，而不受到葡萄糖的阻遏作用。第二，纤维二糖和其他糖的共同使用可提高总的生产率。第三，不需要昂贵的β-葡萄糖苷酶使完整的纤维素降解至葡萄糖。

除了上述优点，该纤维二糖的消耗率远远低于葡萄糖的消耗率。此外，在纤维二糖发酵过程中，在培养基中会积累有少量的葡萄糖和纤维糊精纤维三糖和纤维四糖。当细胞内的纤维二糖和葡萄糖的浓度高时，由于β-葡萄糖苷酶的转糖基作用的活性产生纤维三糖和纤维四糖。这些观察表明对于工程酿酒酵母的纤维二糖的发酵效率可能存在未知的限制步骤。

本文公开了利用微生物的、用于纤维糊精和β-D-葡萄糖分子的发酵的改进的组合物和方法。

发明内容

本发明的一些实施例满足该要求，提供具有葡萄糖变旋酶活性的重组多肽、含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组DNA的宿主细胞，以及它们的生产方法和使用。本发明的一些实施例满足该要求，提供用于纤维糊精和β-D-葡萄糖分子的发酵的方法，用于提高化学品的产量的方法，和用于提高细胞生长率的方法。

在一个实施例中，本发明提供宿主细胞，该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA，和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA，其中当在含有纤维二糖的培养基中生长时，该宿主细胞比缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞消耗更多的纤维二糖分子。

在另一个实施例中，本发明提供宿主细胞，该宿主细胞含有编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA，和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA，其中当在含有纤维二糖的培养基中生长时，该宿主细胞比缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞消耗更多的纤维二糖分子，其中该宿主细胞还包括编码一种或多种β-葡萄糖苷酶的重组DNA。

在另一个实施例中，本发明提供宿主细胞，该宿主细胞含有编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA，和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA，其中当在含有纤维二糖的培养基中生长时，该宿主细胞比缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞消耗更多的纤维二糖分子，其中具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:17,19,21,和23的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明提供宿主细胞，该宿主细胞含有编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA，和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA，其中当在含有纤维二糖的培养基中生长时，该宿主细胞比缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞消耗更多的纤维二糖分子，其中具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明提供用于发酵含纤维二糖的混合物的方法，该方法包括将该含纤维二糖的混合物与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA，其中当在含有纤维二糖的培养基中生长时，该宿主细胞比缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞消耗更多的纤维二糖分子；并在支持发酵的条件下孵化该宿主细胞。

在另一个实施例中，本发明提供用于发酵含纤维二糖的混合物的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞含有编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，细胞对纤维二糖消耗的增加。

在另一个实施例中，本发明提供用于发酵含纤维二糖的混合物的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，所述细胞对纤维二糖消耗的增加，其中该宿主细胞还包括编码一种或多种β-葡萄糖苷酶的重组DNA。

在另一个实施例中，本发明提供用于发酵含纤维二糖的混合物的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，所述细胞对纤维二糖消耗的增加，其中具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ IDNOs:17,19,21,和23的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明提供用于发酵含纤维二糖的混合物的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，细胞对纤维二糖消耗的增加，其中具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品的产量的增加。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品的产量的增加，其中该宿主细胞还包括编码一种或多种β-葡萄糖苷酶的重组DNA。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品产量的增加，其中具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:17,19,21,和23的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品产量的增加，其中具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品产量的增加，其中该化学品为醇。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品产量的增加，其中该化学品为醇，该宿主细胞还包括编码一种或多种β-葡萄糖苷酶的重组DNA。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品产量的增加，其中该化学品为醇，该具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:17,19,21,和23的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品产量的增加，其中该化学品为醇，该具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品产量的增加，其中该化学品为醇，该醇选自乙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、辛醇。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品产量的增加，其中该化学品为醇，该醇选自乙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、辛醇，其中该宿主细胞还包括编码一种或多种β-葡萄糖苷酶的重组DNA。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品产量的增加，其中该化学品为醇，该醇选自乙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、辛醇，其中该具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:17,19,21,和23的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品产量的增加，其中该化学品为醇，该醇选自乙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、辛醇，其中该具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品产量的增加，其中该化学品为萜类化合物、聚酮化合物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、或有机酸。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品产量的增加，其中该化学品为萜类化合物、聚酮化合物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、或有机酸，其中该宿主细胞还包括编码一种或多种β-葡萄糖苷酶的重组DNA。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品产量的增加，其中该化学品为萜类化合物、聚酮化合物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、或有机酸，其中该具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:17,19,21,和23的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高化学品的产量的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的化学品产量的增加，其中该化学品为萜类化合物、聚酮化合物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、或有机酸，其中该具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高细胞生长率的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的生长率的提高。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高细胞生长率的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的生长率的提高，其中该宿主细胞还包括编码一种或多种β-葡萄糖苷酶的重组DNA。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高细胞生长率的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的生长率的提高，其中该具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:17,19,21,和23的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明提供用于提高细胞生长率的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；并在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞的生长率的提高，其中该具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。

用于发酵含β-D-葡萄糖的混合物的方法，该方法包括将含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽接触，将含β-D-葡萄糖的混合物与细胞接触，其中含β-D-葡萄糖的混合物与细胞的接触伴随着或者在含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽接触之后；并在支持发酵的条件下孵化该细胞和含β-D-葡萄糖的混合物，其中含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽的接触导致，与含β-D-葡萄糖的混合物未与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽接触的情况相比，在发酵时该细胞对含β-D-葡萄糖的混合物消耗的增加。

用于发酵含β-D-葡萄糖的混合物的方法，该方法包括将含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽接触，将含β-D-葡萄糖的混合物与细胞接触，其中含β-D-葡萄糖的混合物与细胞的接触伴随着或者在含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽接触之后；并在支持发酵的条件下孵化该细胞和含β-D-葡萄糖的混合物，其中含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽的接触导致，与含β-D-葡萄糖的混合物未与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽接触的情况相比，在发酵时该细胞对含β-D-葡萄糖的混合物消耗的增加，其中该含β-D-葡萄糖的混合物通过纤维素的水解而获得。

用于发酵含β-D-葡萄糖的混合物的方法，该方法包括将含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽接触，将含β-D-葡萄糖的混合物与细胞接触，其中含β-D-葡萄糖的混合物与细胞的接触伴随着或者在含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽接触之后；并在支持发酵的条件下孵化该细胞和含β-D-葡萄糖的混合物，其中含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽的接触导致，与含β-D-葡萄糖的混合物未与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽接触的情况相比，在发酵时该细胞对含β-D-葡萄糖的混合物消耗的增加，其中该具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:17,19,21,和23的氨基酸序列的多肽。

用于发酵含β-D-葡萄糖的混合物的方法，该方法包括将含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽接触，将含β-D-葡萄糖的混合物与细胞接触，其中含β-D-葡萄糖的混合物与细胞的接触伴随着或者在含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽接触之后；并在支持发酵的条件下孵化该细胞和含β-D-葡萄糖的混合物，其中含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽的接触导致，与含β-D-葡萄糖的混合物未与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽接触的情况相比，在发酵时该细胞对含β-D-葡萄糖的混合物消耗的增加，其中该具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。

用于发酵含β-D-葡萄糖的混合物的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA，在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码该具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞对含β-D-葡萄糖的混合物的消耗的增加。

用于发酵含β-D-葡萄糖的混合物的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA，在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码该具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞对含β-D-葡萄糖的混合物的消耗的增加，其中该含β-D-葡萄糖的混合物通过纤维素的水解而获得。

用于发酵含β-D-葡萄糖的混合物的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA，在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码该具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞对含β-D-葡萄糖的混合物的消耗的增加，其中该具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:17,19,21,和23的氨基酸序列的多肽。

用于发酵含β-D-葡萄糖的混合物的方法，该方法包括提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA，在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码该具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致与缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞对含β-D-葡萄糖的混合物的消耗的增加，其中该具有变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。

在另一个实施例中，本发明提供含有编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA，和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组DNA的宿主细胞，其中当在含纤维二糖的培养基中生长时，该宿主细胞比缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞消耗更多的纤维二糖分子，其中该具有葡萄糖变旋酶活性的多肽含有一种或两种SEQ ID NO:28和29的氨基酸序列。在一些方面，该具有葡萄糖变旋酶活性的多肽含有SEQ ID NOs:28和29的氨基酸序列。在一些方面，该宿主细胞还包括编码一种或多种β-葡萄糖苷酶的重组DNA。

附图说明

图1展示了五种不同醛糖1-表异构酶的过表达对纤维二糖在工程酿酒酵母亲本菌株D452-BT中的利用的影响。该工程酿酒酵母在多复制质粒pRS423中表达重组纤维糊精转运子、β-葡萄糖苷酶、和醛糖1-表异构酶基因，如图例所示。该醛糖1-表异构酶基因和源生物（source organism）为：galM(大肠杆菌);GAL10-Sc(酿酒酵母，系统名称YBR019C);GAL10-Ps(树干毕赤酵母);YHR210C(酿酒酵母，系统名称YHR210C);YNR071C(酿酒酵母，系统名称YNR071C)。该对照生物表达重组纤维糊精转运子和β-葡萄糖苷，且包括空pRS423质粒。利用过表达该不同醛糖1-表异构酶的酿酒酵母发酵含纤维二糖的培养基，并测定每个菌株的纤维二糖的消耗量（左侧面板；以g/升测量），细胞生长（中间面板；测量600nm处的光密度），和乙醇产量（右侧面板；以g/升测量）。

图2展示了含有纤维二糖的培养基发酵过程中，乙醇产率、乙醇生产率，和乙醇浓度的比较，其中含纤维二糖的培养基的发酵通过在多复制质粒pRS423中表达重组纤维糊精转运子、β-葡萄糖苷酶、和醛糖1-表异构酶基因的酿酒酵母进行。该醛糖1-表异构酶基因和源生物为：GAL10-Sc(酿酒酵母,系统名称YBR019C);YHR210C(酿酒酵母,系统名称YHR210C);和YNR071C(酿酒酵母,系统名称YNR071C)。

图3展示了酿酒酵母GAL10/YBR019C的过表达对由酿酒酵母进行的纤维二糖的发酵的影响。通过表达重组纤维糊精转运子的对照酿酒酵母和过表达GAL10/YBR019C、重组纤维糊精转运子、和β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母发酵含有纤维二糖的培养基，并测定两种菌株的细胞生长（左侧面板；测量600nm处的光密度）；纤维二糖的消耗（中间面板；以g/升测量），和乙醇产量（右侧面板；以g/升测量）

图4展示了两种不同的醛糖1-表异构酶的过表达对纤维二糖在工程酿酒酵母亲代菌株SL01中利用的影响。该工程酿酒酵母在多复制质粒pRS424中表达重组纤维糊精转运子，β-葡萄糖苷酶，和醛糖1-表异构酶基因，如图例所示。该醛糖1-表异构酶基因和源生物为：scAEP(酿酒酵母，系统名称YHR210C)和ncAEP(粗糙脉孢菌，系统名称NCU09705)。该对照生物表达重组纤维糊精转运子和β-葡萄糖苷酶，并包含空pRS424质粒。通过过表达不同醛糖1-表异构酶的酿酒酵母发酵含有纤维二糖的培养基，并测量每个菌株的细胞生长（面板左上角；测量600nm处的光密度），纤维二糖的消耗（面板右上角；测量每升的纤维二糖的克数），葡萄糖的浓度（面板左下角；测量每升葡萄糖的克数），和乙醇产量（面板右下角；测量每升乙醇的克数）。

图5展示了从酿酒酵母敲除两种醛糖1-表异构酶基因时，酿酒酵母对纤维二糖的利用的影响。酿酒酵母含有三种假定醛糖1-表异构酶基因：YBR019C,YHR210C,和YNR071C。制备敲除YHR210C和YNR071C的以及敲除YBR019C和YHR210C基因的酿酒酵母SL01菌株。图例所示的不同的菌株为：“Δ(YHR+YNR)”(YHR210C和YNR071C敲除)，“Δ(YHR+GAL10)”(YHR210C和YBR019C敲除)，和“对照组”(未敲除醛糖1-表异构酶)。利用酿酒酵母醛糖1-表异构酶敲除菌株发酵含纤维二糖的培养基，测量每个菌株的细胞生长（顶部面板；测量600nm处的光密度）；纤维二糖的消耗（中间面板；测量每升的纤维二糖的克数），和乙醇产量（底部面板；测量每升乙醇的克数）。

图6展示了从酿酒酵母敲除一种醛糖1-表异构酶基因时，酿酒酵母对纤维二糖的利用的影响。酿酒酵母含有三种假定醛糖1-表异构酶基因：YBR019C,YHR210C,和YNR071C。制备敲除一种假定醛糖1-表异构酶基因的酿酒酵母SL01菌株。图例所示的不同的菌株为：ΔYHR(YHR210C敲除),ΔGAL10(YBR019C敲除),ΔYNR(YNR071C敲除)，和“对照组”(未敲除醛糖1-表异构酶)。利用酿酒酵母醛糖1-表异构酶敲除菌株发酵含纤维二糖的培养基，测量每个菌株的细胞生长（顶部面板；测量600nm处的光密度）；纤维二糖的消耗（中间面板；测量每升的纤维二糖的克数），和乙醇产量（底部面板；测量每升乙醇的克数）。

图7展示了利用含有纤维二糖转运子（cdt-1）和细胞内β-葡萄糖苷酶（gh1-1）基因的工程酿酒酵母D452-BT菌株进行的葡萄糖发酵（A）和纤维二糖发酵（B）的比较。符号：OD(○),葡萄糖

纤维二糖(▲),和乙醇(◆)。

图8展示了粗糙脉孢菌在蔗糖或含培养基的芒草水解液中的AEP的转录分析的比较。1,在蔗糖中16h;2,在芒草中16h;3,在芒草中40h;4,在芒草中112h;5,在芒草中232h。

图9展示了来自粗糙脉胞菌的两种AEPs和来自酿酒酵母的两种假定AEPs的氨基酸序列比对。

图10展示了通过含有纤维二糖发酵路径的BY4741ΔYHR,ΔYNR和ΔGAL菌株进行的纤维二糖发酵的对比。误差在15%内。符号：对照组(●),ΔYHR(▲),ΔYNR(■),和ΔGAL(◆)。

图11展示了在纤维二糖（A）或葡萄糖（B）中生长的BY4741AEP敲除菌株的具体AEP活性。一单位的AEP活性定义为除了非酶反应速率之外，在22℃下，1min内将1μmol的α-葡萄糖转化为β-葡萄糖的酶量。误差在15%以内。

图12展示了在含有纤维二糖发酵途径的工程酿酒酵母D452-BT中过表达AEP基因的三种酿酒酵母D452-BT菌株(GAL10-Sc,YHR210C,或YNR071C)对纤维二糖发酵的对比。在全部发酵结果中，值为两种独立发酵的平均，误差条表示标准误差。

具体实施方式

本发明涉及具有葡萄糖变旋酶活性的多肽及其使用方法，编码具有葡萄糖变旋酶活性的核苷酸，含有具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的组合物及其使用方法，和含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的核酸的组合物及其使用方法。本发明还涉及用于发酵含纤维糊精的材料的方法，在含纤维糊精的材料的发酵过程中提高纤维糊精的消耗的方法，在含纤维糊精的材料的发酵过程中提高化学品产量的方法，在含纤维糊精的材料的发酵过程中提高细胞生长的方法，以及进行这些方法的组合物。本发明还涉及发酵含β-D-葡萄糖的材料的方法，在含β-D-葡萄糖的材料的发酵过程中提高含β-D-葡萄糖的材料的消耗的方法，在含β-D-葡萄糖的材料的发酵过程中提高化学品产量的方法，在含β-D-葡萄糖的材料的发酵过程中提高细胞增长的方法，和用于进行这些方法的组合物。

纤维素和纤维糊精由β（1-4）连接的D-葡萄糖分子构成。纤维糊精或纤维素水解成单个葡萄糖分子导致β-D-葡萄糖分子的释放。对于用于生物，如酿酒酵母的各种代谢途径的葡萄糖分子而言，葡萄糖分子通常首先被己糖激酶磷酰化。在酿酒酵母中，己糖激酶优选或专门地磷酰化α-D-葡萄糖分子。α-D-葡萄糖分子可以通过变旋酶的作用由β-D-葡萄糖分子产生，该变旋酶可以使α和β形式的D-葡萄糖相互转变。

酿酒酵母对于α-D-葡萄糖和β-D-葡萄糖的利用的偏好是纤维素、纤维糊精、和β-D-葡萄糖分子转化为有用的发酵化学品，例如乙醇的潜在的限制步骤。因此，本文提供用于将β-D-葡萄糖分子转化为α-D-葡萄糖分子的组合物和方法。不希望被理论所束缚，通过促进β-D-葡萄糖分子至α-D-葡萄糖分子的转化，可增加酿酒酵母利用的β-D-葡萄糖分子和含有β-D-葡萄糖分子的材料，例如纤维糊精和纤维素。本文进一步提供用于通过酿酒酵母提高β-D-葡萄糖和纤维糊精的使用的组合物和方法。此外，本文公开的组合物和方法还包括通过生物合适地使用β-D-葡萄糖或其他糖分子的组合物和方法，该生物优先利用α或β形式的糖。

如文中所用的“醛糖1-表异构酶”指的是具有葡萄糖变旋酶活性的任何多肽，如下所定义的。如文中使用的“醛糖1-表异构酶”还指的是编码醛糖1-表异构酶多肽的多核苷酸。

如文中所用的，纤维糊精指的是不同长度的葡萄糖聚合物，包括，但不限于，纤维二糖（2个葡萄糖单体）、纤维三糖（3个葡萄糖单体）、纤维四糖（4个葡萄糖单体）、纤维五糖（5个葡萄糖单体）、和纤维六糖（6个葡萄糖单体）。

如文中所用的，糖涉及单糖类（例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖），二糖类（纤维二糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖），和低级多糖（通常含有3至10个单糖成分）。

本发明的多肽

如本文中所使用的，“多肽”是包括多个连续聚合的氨基酸残基（例如，至少约15个连续聚合的氨基酸残基）的氨基酸序列。该多肽可选择地包括修饰的氨基酸残基，未被密码子编码的天然存在的氨基酸残基，和非天然存在的氨基酸残基。

如本文中所使用的，“蛋白质”指的是氨基酸序列、寡肽、肽、多肽、或者其部分，无论是自然存在或合成的。

具有葡萄糖变旋酶活性的多肽

本文中公开了具有变旋酶活性的重组多肽。如本文中所使用的，“变旋酶活性”指的是将β-D-葡萄糖转化至α-D-葡萄糖和/或将α-D-葡萄糖转化至β-D-葡萄糖的酶的能力。“变旋酶活性”还指将其他糖的α和β形式之间进行转化的酶的能力，这些糖包括L-阿拉伯糖、D-木糖、D-半乳糖、麦芽糖和乳糖。

本文中公开的具有变旋酶活性的重组多肽包括，但不限于，酿酒酵母多肽GAL10/YBR019C(SEQ ID NO:17)、YHR210C(SEQ ID NO:19)和YNR071C(SEQ ID NO:21)，和粗糙脉孢菌多肽NCU09705(SEQ ID NO:23)。

在一个实施例中，具有葡萄糖变旋酶活性的多肽为酿酒酵母多肽GAL10/YBR019C。该酿酒酵母GAL10多肽在文献中被称为各种名称，包括醛糖1-表异构酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、UDP-半乳糖4-表异构酶，和变旋酶（mutarotase）。酿酒酵母GAL10是双功能酶，其中蛋白质的N-末端部分具有UDP-葡萄糖表异构酶活性（UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖之间转化），和蛋白质的C-末端部分具有变旋酶活性。在近期的期刊杂志上公开了酿酒酵母GAL10酶的晶体结构（见Thoden and Holden,(2005)J Biol Chem280(23):21900-21907）。

根据本发明的一方面，具有葡萄糖变旋酶活性的多肽为全长GAL10/YBR019C蛋白质（SEQ ID NO:17）。根据本发明的另一方面，具有葡萄糖变旋酶活性的多肽为具有GAL10/YBR019C蛋白质的约C端半段的多肽。另一方面，具有葡萄糖变旋酶活性的多肽为GAL10/YBR019C蛋白质(SEQ ID NO:30)(SEQ ID NO:17的氨基酸编号378-699)的Ile-378至Ser-699的氨基酸残基。另一方面，具有葡萄糖变旋酶活性的多肽为GAL10/YBR019C蛋白质(SEQ ID NO:31)(SEQ ID NO:17的氨基酸编号361-699)的氨基酸残基Glu-361至Ser-699。另一方面，具有葡萄糖变旋酶活性的多肽为GAL10/YBR019C蛋白质(SEQ ID NO:32)(SEQ ID NO:17的氨基酸编号364-699)的氨基酸残基Phe-364至Ser-699。本领域技术人员理解，可以制备额外截短形式的GAL10/YBR019C，其中去除主要涉及或完全涉及GAL10/YBR019C的异构酶活性的N末端氨基酸，保留变旋酶活性所需的C末端氨基酸。这种截短形式的GAL10/YBR019C可以被识别，例如，通过制备各种截短形式的GAL10/YBR019C蛋白质，并测试用于葡萄糖变旋酶活性的截短蛋白质。用于制备截短形式的蛋白质的方法在本领域是已知的，可以涉及，例如通过PCR产生截短形式的基因编码的GAL10/YBR019C蛋白质，克隆基因编码的截短形式的蛋白质至表达载体，利用表达载体转化宿主细胞，并在该宿主细胞中表达该蛋白质。

在另一个实施例中，具有变旋酶活性的多肽为酿酒酵母多肽YHR210C(SEQ ID NO:19)。一方面，YHR210C多肽序列基于序列同源性与GAL10/YBR019C蛋白质的氨基酸残基Phe-364至Ser-699对齐。

在另一个实施例中，具有变旋酶活性的多肽为酿酒酵母多肽YNR071C(SEQ ID NO:21)。一方面，YNR071C多肽序列基于序列同源性与GAL10/YBR019C蛋白质的氨基酸残基Phe-364至Ser-699对齐。

在另一个实施例中，具有变旋酶活性的多肽为粗糙脉孢菌多肽NCU09705(SEQ ID NO:23)。一方面，NCU09705多肽序列基于序列同源性可以与GAL10/YBR019C蛋白质的氨基酸残基Ala-386至Arg-697对齐。

在另一个实施例中，具有变旋酶活性的多肽为含有一个或两个以下氨基酸基序（aminoacid motifs）的多肽。

基序1：G-X-[VTI]-[VPI]-G-R-[VTY]-[AT]-N-R-[VILT](SEQ ID NO:28)（与GAL/YBR019C的残基424-434对应），其中X为氨基酸，对于括号中氨基酸位置，氨基酸为括号内的氨基酸的任意一个。例如，[VTI]是V、T或I。

基序2：T-[VPI]-[VI]-[MGN]-X-[STA]-[NSQHP]-H-[IST]-Y-[FW]-N-L(SEQ ID NO:29)（与GAL/YBR019C的残基530-542对应），其中X为氨基酸，对于括号中氨基酸位置，氨基酸为括号内的氨基酸的任意一个。例如，[VPI]是V、P或I。

一方面，具有葡萄糖变旋酶活性的多肽具有含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的氨基酸序列。一方面，具有葡萄糖变旋酶活性的多肽具有含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的氨基酸序列。一方面，具有葡萄糖变旋酶活性的多肽具有含有以上SEQ ID NO:28和SEQ IDNO:29的氨基酸序列的氨基酸序列。

在某些实施例中，具有葡萄糖变旋酶活性的多肽与GAL10/YBR019C,YHR210C,YNR071C或NCU09705的多肽具有约至少20%，约至少29%，约至少30%，约至少40%，约至少50%，约至少55%，约至少60%，约至少65%，约至少70%，约至少75%，约至少80%，约至少85%，约至少90%，约至少92%，约至少94%，约至少96%，约至少98%，约至少99%，或100%的氨基酸残基序列一致性。在某些实施例中，具有葡萄糖变旋酶活性的多肽为具有至少7,8,9,10,11,12,13,14,15,20,25,30,35,40,45,或50个GAL10/YBR019C,YHR210C,YNR071C或NCU09705多肽的连续氨基酸的多肽。

具有葡萄糖变旋酶活性的多肽包括重组多肽，该重组多肽为GAL10/YBR019C,YHR210C,和YNR071C,和NCU09705多肽的保守性修饰的变体（conservatively modifiedvariants）。文中使用的“保守性修饰的变体”包括向多肽序列的单个取代、删除或添加，导致利用化学性质相似的氨基酸取代氨基酸。本领域已知提供功能相似的氨基酸的保守性取代表。这种保守性修饰的变体并不排除本发明的多肽变体、异种同源基因、等位基因。以下八组包含彼此为保守性取代的氨基酸的例子：1）丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2）天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3）天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4）精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5）异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；6）苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7）丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；8）半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)（见例如Creighton,Proteins(1984)）。

具有葡萄糖变旋酶活性的重组多肽还包括是GAL10/YBR019C,YHR210C,YNR071C和NCU09705多肽的同源基因或直系同源基因的（orthologs）多肽。本文中使用的“同源性”指的是参考序列与第二序列的至少一部分片段的序列一致性。可通过本领域已知的任何方法识别同源性，优选地，通过BLAST工具，对照参考序列与单个的第二序列或序列的片段，或者序列的数据库。如下面所描述的，BLAST将基于一致性和相似性百分比比较序列。本文使用的“直系同源”指的是来源于共同的祖先基因的不同物种的基因。

本发明的多核苷酸

如本文中使用的，术语“多核苷酸”，“核酸序列”，“核酸的序列”及它们的变形通用于多聚脱氧核糖核苷酸（含有2-脱氧-D-核糖），多核糖核苷酸（含有D-核糖），或是嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的其他类型的多核苷酸，以及含有非核苷酸骨架的其他聚合物，唯有该聚合物含有核碱基，在该结构中允许碱基配对和碱基堆积，如DNA和RNA中。因此，这些术语包括已知类型的核酸序列修饰，例如用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间的修饰（inter-nucleotide modifications），例如，那些不带电荷的键合（如甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲酸酯等），带负电荷键合（如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等），带正电荷的键合（如氨烷基磷酰胺酯（aminoalkylphosphoramidates），氨烷基磷酸三酯）；这些含有侧基（pendantmoieties），例如，蛋白质（包括核酸酶，毒素，抗体，信号肽，聚-L-赖氨酸，等）；那些嵌入剂（例如吖啶、补骨脂素等）；那些含有螯合剂的（例如金属，放射性金属，硼素，氧化金属等）。如本文中使用的，用于核苷酸和多核苷酸的标记为生化命名委员会IUPAC-IUB推荐的那些。

编码具有变旋酶活性的多肽的多核苷酸

本发明包括编码具有变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸。本发明还涉及宿主细胞和使用该宿主细胞的方法，其中该宿主细胞包括编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的多核苷酸。

本发明的重组多核苷酸包括编码具有葡萄糖变旋酶活性的本文公开的多肽的任意多核苷酸。在一些方面，本发明的多核苷酸包括编码SEQ ID NO:17(GAL10/YBR019C多肽),SEQ ID NO:19(YHR210C多肽),SEQ ID NO:21(YNR071C多肽),SEQ ID NO:23(NCU09705多肽)的多肽的多核苷酸。在一些方面，本发明的多核苷酸包括多核苷酸：SEQ ID NO:16(编码GAL10/YBR019C多肽),SEQ ID NO:18(编码YHR210C多肽),SEQID NO:20(编码YNR071C多肽),和SEQ ID NO:22(编码NCU09705多肽)。

在某些方面，本发明的该重组多核苷酸包括与SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,和SEQ ID NO:22的多核苷酸具有约至少20%，约至少30%，约至少40%，约至少50%，约至少55%，约至少60%，约至少65%，约至少70%，约至少75%，约至少80%，约至少85%，约至少90%，约至少92%，约至少94%，约至少96%，约至少98%，约至少99%，或约至少100%的核苷酸残基序列的一致性的多核苷酸。

本发明的多核苷酸还包括编码多肽的多核苷酸，该多肽具有一个或两个SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29的氨基酸序列。

本发明的多核苷酸还包括编码GAL10/YBR019C,YHR210C,YNR071C,和NCU09705的多肽的保守性修饰变体的多核苷酸。本发明的多核苷酸还包括编码GAL10/YBR019C,YHR210C,YNR071C,和NCU09705的多肽的同源基因或直系同源基因的多核苷酸。

可通过本领域已知的任何合适的方法制备本发明的多核苷酸的序列，包括，例如直接化学合成或克隆。对于直接化学合成，核酸聚合物的形成通常涉及将3'-封端和5'-封端核苷酸单体顺序加入生长的核苷酸链的末端5'-羟基，其中通过生长的链的末端5'-羟基在添加的单体3'-位点上的亲和攻击实现每次添加，加入的单体通常为磷衍生物，例如磷酸三酯，亚磷酰胺等。这种方法在本领域是已知的，并在相关文本或文献中有所描述[e.g.,inMatteucci et al.,(1980)Tetrahedron Lett21:719-722;U.S.Pat.Nos.4,500,707;5,436,327;and5,700,637]。此外，利用合适的限制性内切酶分裂DNA，从而从天然来源中分离出所需序列，利用凝胶电泳分离该片段，然后通过本领域已知的技术，例如利用聚合酶链反应（PCR;e.g.,U.S.Pat.No.4,683,195）从凝胶中回收所需核酸序列。

可将本发明的每种多核苷酸结合至表达载体。“表达载体”或“载体”指的是这样的化合物和/或组合物：该化合物和/或组合物转化、转换、或感染宿主细胞，从而使该细胞表达核酸和/或蛋白质；所述载体不是天然存在于细胞中的物质，或者说是以非天然存在的方式作用于所述细胞的。“表达载体”包含将要被该宿主细胞表达的核酸序列（通常的RNA或DNA）。可选择地，该表达载体还包括帮助核酸进入宿主细胞的物质，例如病毒、脂质体、蛋白质涂层、或类似物。考虑用于本发明的该表达载体包括可以插入核酸序列的这些，以及任何优选的或需要的操作元素（operational elements）。进一步地，该表达载体必须是可以转化至宿主细胞并在其中复制。优选的表达载体为质粒，特别是这些具有限制性位点的这些，它们已被记载，并含有核酸序列的转录优选或必须的操作成分。这种质粒，以及其他表达载体在本领域是已知的。

可通过已知的方法引入单个多核苷酸，例如，使用限制性内切酶（如BamHI,EcoRI,HhaI,XhoI,XmaI等等）以劈开表达载体如质粒内的特定位点。该限制性内切酶产生单链末端，可退火为多核苷酸，该多核苷酸具有或合成有，带有与裂开的表达载体的末端互补的序列终点。使用合适的酶进行退火，例如DNA连接酶。本领域技术人员将理解，表达载体和理想多核苷酸通常通过相同的限制性内切酶来切割，从而确保表达载体的末端和多核苷酸的末端彼此互补。此外，DNA连接基因可用于帮助将核酸序列连接至表达载体。

可利用本领域通常的技术（如美国专利4,683,195）将单个多核苷酸系列结合起来。例如，每个理想多核苷酸可最初在单独的PCR中生成。然后，设计特异性引物，以使PCR产物的末端包含互补序列。当该PCR产物混合，变性，在退火时，在其3'末端具有匹配序列的链重叠，并且彼此作为引物。通过DNA聚合酶延伸该重叠，产生分子，在该分子中最初的序列“拼接”在一起。这样，单个多核苷酸系列可“拼接”在一起，然后同时转导至宿主细胞中。因此，实现了多个多核苷酸中的每一个的表达。

单个多核苷酸，或“拼接的”多核苷酸，随后纳入表达载体内。本发明并不限于多核苷酸纳入表达载体中的方法。本领域技术人员熟知用于将多核苷酸纳入表达载体中的必要步骤。典型的表达载体包含理想多核苷酸，该理想多核苷酸前面带有一个或多个调控区，以及核糖体结合位点，例如3-9个核苷酸长度、位于大肠杆菌初始密码子的上游的3-11个核苷酸处的核苷酸序列。见Shine and Dalgarno(1975)Nature254(5495):34-38and Steitz(1979)Biological Regulation and Development(ed.Goldberger,R.F.),1:349-399(Plenum,New York)。

本文中使用的术语“可操作地连接”指的是一种结构，其中控制序列位于相对于DNA序列或多核苷酸的编码序列的合适位置，以使控制序列知道多肽的表达。

调控区包括，例如含有启动子和操纵基因的区域。启动子可操作地连接至理想多核苷酸，从而通过RNA聚合酶开始多核苷酸的转录。操纵基因是与启动子相邻的核酸序列，其包括可结合阻遏蛋白的蛋白质结合域。当不存在阻遏蛋白时，通过启动子启动转录。当存在时，对操纵基因的蛋白质结合域具有特异性的阻遏蛋白结合至该操纵基因，从而抑制转录。这样，根据使用的特定的调控区，以及相应阻遏蛋白的存在与不存在，实现了对转录的控制。例如乳糖启动子（当与乳糖接触时，Lad阻遏蛋白将改变结构，从而防止Lad阻遏蛋白结合至操纵基因）和色氨酸启动子（当与色氨酸络合时，TrpR阻遏蛋白具有结合至操纵基因的结构；当不存在色氨酸时，该TrpR阻遏蛋白具有不能结合至操纵基因的结构）。另外例如tac启动子（见de Boer et al.,(1983)Proc Natl Acad Sci USA80(1):21-25）。本领域技术人员将理解，这些或其他表达载体可用于本发明，且本发明并不限于这些。

虽然任何合适的表达载体可用于纳入理想序列，但是容易获得的表达载体包括，但不限于，质粒，如pSClOl,pBR322,pBBRlMCS-3,pUR,pEX,pMRlOO,pCR4,pBAD24,pUC19；噬菌体，如Ml3噬菌体和λ噬菌体。当然，这种表达载体可以仅仅适用于特定的宿主细胞。本领域技术人员可以通过常规实验容易地确定任何特定的表达载体是否适用于任何给定的宿主细胞。例如，可将表达载体引入宿主细胞，随后检测该宿主细胞内含有的序列的存活率和表达。此外，可参照描述表达载体和它们对任何特定的宿主细胞的适应性的相关文本和文献。

序列比对和序列一致性

本领域已知用于对照序列比对的方法。例如，可利用数学算法来确定任意两个序列之间的序列一致性的百分比。这种数学算法的非限制性的例子如Myers和Miller(1988)CABIOS4:1117的算法；Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443453的同源性比对算法；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:24442448搜索相似性的方法；Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:58735877中修改的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264的算法。

这些数学算法的计算机执行过程可用于序列的比对，以确定序列一致性。这种实现包括但不限于，这种执行过程包括，但不限于，PC/基因程序中的CLUSTAL（由Intelligenetics,Mountain View,Calif获得）；ALIGN程序(2.0版)，和威斯康星州的遗传学分析软件包（Wisconsin Genetics Software Package），版本8中的GAP,BESTFIT,BLAST,FASTA,和TFASTA（由Genetics Computer Group(GCG),575Science Drive,Madison,Wis.,USA获得）。可利用默认参数进行使用这些程序的对照。Higgins et al.(1988)Gene73:237244(1988);Higgins et al.(1989)CABIOS5:151153;Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:1088190;Huang et al.(1992)CABIOS8:15565;和Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307331很好的描述了CLUSTAL程序。ALIGN程序是基于同上Myers和Miller(1988)的算法。当比较氨基酸序列时，PAM120重量残留表，12的空隙长度罚分，和4的空隙罚分可与ALIGN程序共同使用。Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序基于以上Karlin和Altschul(1990)的算法。BLAST核苷酸搜索可利用BLASTN程序进行，得分=100，字长=12，以获得与编码本发明的蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可利用BLASTX程序，得分=50，字长=3进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对（gappedalignments），使用如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389描述的空位BLAST（BLAST2.0）。或者，可以使用PSI-BLAST(BLAST2.0)进行检测分子间远距离关系的重复搜索。见同上的Altschul et al.(1997)。当使用BLAST,空位BLAST，或PSI-BLAST时，使用相应程序的（例如，用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白质的BLASTX）的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。也可以手动检查比对。

如本文中所使用的，序列一致性或上下文中两个核酸或多肽序列的一致性指的是两个序列中的残基，当在指定比较窗口（specified comparison window）最大化对应对齐时，二者相同。当序列一致性的百分比用于涉及蛋白质时，人们认识到不相同的且经常由于保守性氨基酸取代而不同的残基位置不会改变分子的功能性质，其中氨基酸残基被具有相似化学性质（例如电荷或疏水性）的其他氨基酸残基取代。当序列在保守替换不同时，序列一致性百分比可能被向上调整，以矫正替代的保守性性能。通过这种保守性替换而不同的序列称为具有序列相似性或相似性。用于进行这种调整的方法在本领域是公知的。通常这涉及将保守性替换评分为部分不匹配，而不是完全不匹配，从而提高序列一致性百分比。因此，例如，当具有一致性的氨基酸被评分为1，非保守性替换评分为0，那么保守性替换评分为0和1之间。计算非保守性替换的评分，例如，在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,Calif.)中执行。

除了上面所述的序列一致性的百分比，另一个两种核酸序列或多肽基本相同的标志在于由第一核酸编码的多肽与第二核酸编码的多肽的抗体进行免疫交叉反应，如下所述。因此，多肽通常大致与第二多肽是一致的，例如，当该两个肽仅仅保守性取代不同时。两个核酸序列基本一致的另一个标志是两个分子或它们的补体（complement）在严格条件下彼此杂交，如下所述。两种核酸序列基本一致的另一个标志是使用相同的引物扩增该序列。

包含具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的组合物

本发明还提供包含具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的组合物。一方面，提供具有葡萄糖变旋酶活性的重组多肽。一方面，提供含有一种或多种具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的宿主细胞。

具有葡萄糖变旋酶活性的重组多肽

在一些方面，提供具有葡萄糖变旋酶活性的重组多肽。在一些方面，具有葡萄糖变旋酶活性的重组多肽包括酿酒酵母多肽GAL10/YBR019C,YHR210C,和YNR071C，粗糙脉孢菌多肽NCU09705(SEQ ID NO:23)，及其变体，如上所述。在一些方面，具有葡萄糖变旋酶活性的重组多肽包括含有一种或两种SEQ ID NO:28和29的氨基酸的多肽。

具有葡萄糖变旋酶活性的重组多肽可通过标准分子生物学技术制备，例如Sambrook,J.etal.2000Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Third Edition)中所描述的那些。重组多肽可在转基因表达系统中表达和纯化。转基因表达系统可以是原核或真核的。转基因宿主细胞可以包括酵母和大肠杆菌（E.coli）。在一些方面，转基因宿主细胞可以在该宿主细胞外分泌该多肽。在一些方面，转基因宿主细胞可以在宿主细胞内保留该表达的多肽。

在一些方面，具有葡萄糖变旋酶活性的重组多肽被从宿主细胞中分离出。在一些方面，利用蛋白质“标签”制备具有葡萄糖变旋酶活性的重组多肽，以便于蛋白质纯化，例如GST-标签或聚-His标签。在一些方面，具有葡萄糖变旋酶活性的重组多肽可以纯化至高纯度（例如>99%纯度,>98%纯度,>95%纯度,>90%纯度,等）。可以通过本领域已知的各种技术纯化重组多肽，这些技术包括例如，离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、和亲和色谱法。

本发明的宿主细胞

本发明涉及含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸的宿主细胞。

“宿主细胞”和“宿主微生物”在本文中交替地用于指生物细胞，该生物细胞可以通过重组DNA或RNA的插入进行转化。这种重组DNA或RNA可以在表达载体中。因此，本文中描述的宿主微生物或细胞可以是原核生物（例如真细菌界生物）或真核细胞。本领域技术人员可以理解，原核细胞缺乏膜结合的核，而真核细胞具有膜结合的核。

任何原核或真核宿主细胞可用于本发明，只要它在核酸序列转化后能存活。优选地，该宿主细胞不会受到必要的核酸序列转导，随后的蛋白质（转运子）的表达，或所得中间体的不利影响。合适的真核细胞包括，但不限于，真菌，植物，昆虫或哺乳动物细胞。

在某些实施例中，该宿主为真菌菌株。本文中使用的“真菌”包括子囊菌门、接合菌门、壶菌门、担子菌门(如Hawksworth et al.,In,Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,8th edition,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK定义的)、卵菌门(如Hawksworth et al.,1995，如上，第171页中所引用的)和所有有丝分裂孢子真菌(Hawksworth et al.,1995,如上)。

在一些实施例中，真菌宿主为酵母菌株。本文使用的“酵母”包括产子囊酵母（Endomycetales）、产担孢子酵母（basidiosporogenous yeast），和属于不完全菌（Blastomycetes）的酵母。因为未来酵母的分类可能发生变化，对于本发明，酵母可根据酵母的生物学和活性中描述的定义（Skinner,F.A.,Passmore,S.M.,and Davenport,R.R.,eds,Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9,1980）。

在一些实施例中，该酵母宿主是假丝酵母（Candida）、汉逊酵母属（Hansenula）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）、毕赤酵母（Pichia）、接合酵母（Saccharomyces）、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces）、或罗维亚酵母（Yarrowia strain）。

在本发明的一些实施例中，该宿主细胞是酿酒菌属（Saccharomyces sp.），酿酒酵母，摩纳酵母（Saccharomyces monacensis），贝酵母，巴氏酵母，卡氏酵母，裂殖酵母（Saccharomyces pombe），克鲁维酵母（Kluyveromyces sp.），马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxiamus）,乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis），胞壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis），树干毕赤酵母（Pichia stipitis），嗜热侧孢霉（Sporotrichum thermophile），休哈塔假丝酵母（Candida shehatae），热带假丝酵母（Candida tropicalis），粗糙脉孢菌（Neurospora crassa），运动发酵单孢菌（Zymomonasmobilis）。在另一些实施例中，该酵母宿主可以是解脂耶罗维亚酵母，卡斯酒香酵母，或鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces roux）。

酿酒菌属可以包括酿酒菌株。Argueso等公开了通常用于生物乙醇生产的工业酿酒酵母菌株的基因组结构，以及对生物乙醇生产很重要的特定的基因多态性（Argueso et al.,Genome Research,19:2258-2270,2009）。

在另一个实施例中，该真菌宿主是丝状真菌菌株。“丝状真菌”包括真菌门亚门和卵菌门（如Hawksworth et al.,1995,所定义的，如上）的所有的丝状形式。该丝状真菌通常特征是几丁质，纤维素，葡聚糖，脱乙酰壳多糖，甘露聚糖，和其它复杂的多糖构成的菌丝体壁。通过菌丝伸长进行营养生长，碳的代谢是耗氧的。相反，通过酵母，如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽进行，碳的代谢可以是发酵。

在某些实施例中，该丝状真菌宿主为，但不限于，枝顶孢霉（Acremonium）,曲霉（Aspergillus）,链孢霉（Fusarium）,腐质霉（Humicola）,毛霉（Mucor）,毁丝霉属（Myceliophthora）,脉孢菌（Neurospora）,青霉菌（Penicillium）,节格孢（Scytalidium）,梭孢壳（Thielavia）,弯颈霉（Tolypocladium）,或木霉菌株（Trichoderma strain）。

在某些实施例中，丝状真菌宿主是泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，构巢曲霉，黑曲霉，或者米曲霉菌株。在一些实施例中，该丝状真菌宿主是杆孢状镰孢（Fusariumbactridioides），禾谷镰孢（Fusarium cerealis），克地镰刀菌（Fusariumcrookwellense），大刀镰孢（Fusarium culmorum），禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum），禾赤镰孢（Fusarium graminum），异孢镰孢（Fusarium heterosporum），合欢木镰孢（Fusarium negundi），尖镰孢（Fusarium oxysporum），多枝镰孢（Fusariumreticulatum），粉红镰孢（Fusarium roseum），接骨木镰刀菌（Fusarium sambucinum），肤色镰孢（Fusarium sarcochroum），拟枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides），硫色镰孢（Fusarium sulphureum），Fusarium torulosum，拟丝孢镰刀菌（Fusariumtrichothecioides），或粗糙脉胞菌菌株（Fusarium venenatum strain）。在另一些实施例中，该丝状真菌宿主是特异腐质霉（Humicola insolens），柔毛腐质霉（Humicolalanuginosa），米黑毛霉（Mucor miehei），嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila），粗糙脉胞菌（Neurospora crassa），产紫青霉（Penicillium purpurogenum），嗜热革节孢（Scytalidium thermophilum），嗜热侧孢霉（Sporotrichum thermophile），或斯梭孢壳霉菌属（Thielavia terrestris strain）。在另一个实施例中，该丝状真菌宿主是哈茨木霉（Trichoderma harzianum），康宁木霉（Trichoderma koningii），长梗木霉（Trichodermalongibrachiatum），里氏木霉（Trichoderma reesei），或者绿色木霉菌属（Trichodermaviride strain）。

在其他实施例中，该宿主细胞是原核的，在某些实施例中，该原核生物是大肠杆菌（E.coli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis），梭状芽孢杆菌（Clostridium sp.），梭状芽孢杆菌phytofermentans（Clostridiumphytofermentans）,嗜热梭状芽孢杆菌（Clostridium thermocellum）,拜氏梭状芽孢杆菌（Clostridium beijerinckii）,丙酮丁醇梭状芽孢杆菌(Moorella thermoacetica),嗜热厌氧菌（Thermoanaerobacterium saccharolyticum）,或者产酸克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）。在其他实施例中，该原核宿主细胞为Carboxydocella sp.,谷氨酸棒杆菌（Corynebacteriumglutamicum）,肠杆菌科细菌（Enterobacteriaceae）,菊欧氏杆菌（Erwinia chrysanthemi）,乳酸杆菌(Lactobacillus sp.),乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici),荚膜红假单胞菌（Rhodopseudomonas capsulata）,乳链球菌(Streptococcus lactis),弗氏弧菌(Vibrio furnissii),弗氏弧菌M1(Vibrio furnissii M1),热解纤维素孢芽孢杆菌(Caldicellulosiruptorsaccharolyticus),或者野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。在其他实施例中，该原核宿主细胞为蓝藻。细菌宿主细胞的其他例子包括，但不限于，大肠杆菌（Escherichia）,肠杆菌（Enterobacter）,固氮菌（Azotobacter）,欧文菌（Erwinia）,杆菌属（Bacillus）,假单胞菌（Pseudomonas）,克雷白氏杆菌（Klebsiella）,变形杆菌（Proteus）,沙门氏菌（Salmonella）,沙雷氏菌（Serratia）,志贺菌（Shigella）,根瘤菌（Rhizobia）,透明颤菌（Vitreoscilla）,聚球藻细菌（Synechococcus），集包蓝细菌（Synechocystis）,和副球菌（Paracoccus taxonomical）的这些种类。

本发明的宿主细胞可以在已经引入该宿主细胞中的重组核酸内转基因，且这种转基因宿主细胞不存在于自然界。合适的宿主细胞是一种能够表达一种或多种核酸构筑物，该核酸构筑物编码用于不同功能的一种或多种蛋白质。

文中使用的“重组核酸”或“异源核酸”或“重组多核苷酸”，“重组核苷酸”或“重组DNA”指的是核酸的聚合物，其中至少以下之一是正确的：（a）核酸序列与给定宿主细胞无关（即不能自然发现）；（b）该序列可在给定宿主细胞内自然发现，但是具有非天然的含量（例如大于预期）；或（c）核酸序列包括两种或多种子序列，该子序列在自然界中未发现彼此的相同的关系。例如，关于例子（c），重组核酸序列将具有来自设置为制备新功能核酸的无关基因的两种或多种序列。具体地，本发明描述了向向宿主细胞引入表达载体，其中表达载体含有用于编码不常在宿主细胞内发现的蛋白质的核酸序列，或者含有编码常在细胞中发现、但是受不同调控序列控制的蛋白质的核酸。参照宿主细胞的基因组，编码蛋白质的核酸序列为重组的。如本文中所使用的，术语“重组多肽”指的是由上述“重组核酸”或“异源核酸”或“重组多核苷酸”，“重组核苷酸”或“重组DNA”产生的多肽。

在一些实施例中，宿主细胞自然产生由本发明的多核苷酸编码的蛋白质。编码所需蛋白质的基因可以与宿主细胞异源，或者该基因与宿主细胞具有內源性，但是可操作地连接至异源启动子和/或控制区，其导致在宿主细胞内基因的更高的表达。在其他实施例中，该宿主细胞没有自然产生理想蛋白质，且包括能够表达产生那些分子的所需的一种或多种基因的异源核酸构筑物。

宿主细胞的成分

一方面，本发明的宿主细胞包括编码本文公开的具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA。一方面，本发明的宿主细胞过表达具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽（即该宿主细胞比缺乏编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞表达更多的具有变旋酶活性的多肽）。一方面，本发明的宿主细胞包括编码酿酒酵母GAL10/YBR019C多肽的重组DNA。另一方面，本发明的宿主细胞包括编码酿酒酵母YHR210C多肽的重组DNA。另一方面，本发明的宿主细胞包括编码酿酒酵母YNR071C多肽的重组DNA。另一方面，本发明的宿主细胞包括编码粗糙脉孢菌NCU09705多肽的重组DNA。另一方面，本发明的宿主细胞包括编码酿酒酵母GAL10/YBR019C,YHR210C,或者YNR071C多肽，或粗糙脉孢菌NCU09705多肽的变体或截短形式的重组DNA。另一方面，本发明的宿主细胞包括编码含SEQ ID NO:28和SEQ IDNO:29的氨基酸序列的一种或两种的多肽的重组DNA。

在某些方面，该多肽与GAL10/YBR019C,YHR210C,YNR071C,或NCU09705多肽具有至少20%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%，或至少100%的氨基酸一致性。

纤维糊精转运子

在某些实施例中，该宿主细胞还包括编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA。纤维糊精转运子是将纤维糊精分子从细胞外运输至细胞内和/或从细胞内运输至细胞外的任意的跨膜蛋白。在某些实施例中，该纤维糊精转运子为功能性片段，该功能性片段保持将纤维糊精分子从细胞外运输至细胞内和/或从细胞内运输至细胞外的能力。

本发明的重组纤维糊精转运子可被Supplemental Data,Dataset S1,page3in Tian et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106(52):22157-22162,2009中的表10；以及下表1和2所列的基因编码。

表1:编码纤维糊精转运子的序列的列表

表2:纤维糊精转运子直系同源基因的列表。

当不能获得登录号时，使用JGI编号。JGI编号使得能够通过该生物体的JGI基因组门户访问基因序列（可从以下页面登陆：genome.jgi-psf.org/programs/fungi/index.jsf）。黄曲霉或构巢曲霉识别符使得可分别通过cadre-genomes.org.uk/and webpagebroadinstitute.org/annotation/genome/aspergillus_group/MultiHome.html页面上的它们的基因组门户访问到基因。

在另一些实施例中，本发明的重组纤维糊精转运子与Supplemental Data,Dataset S1,page3in Tian et al.,2009中的表10；和表1和2中所列的任意基因编码的多肽具有约20%，至少约30%，至少约40%，至少约50%，至少约55%，至少约60%，至少约65%，至少约70%，至少约75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约92%，至少约94%，至少约94%，至少约96%，至少约98%，至少约99%，至少约100%的氨基酸残基序列的一致性。

此外，本发明的纤维糊精转运子包括，但不限于，NCU00801,NCU00809,NCU08114,XP_001268541.1,LAC2,NCU00130,NCU00821,NCU04963,NCU07705,NCU05137,NCU01517,NCU09133,和NCU10040。在某些实施例中，该重组纤维糊精转运子与NCU00801,NCU00809,NCU08114,XP_001268541.1,LAC2,NCU00130,NCU00821,NCU04963,NCU07705,NCU05137,NCU01517,NCU09133,或NCU10040中的任意序列编码的多肽具有至少约20%，至少约30%，至少约40%，至少约50%，至少约55%，至少约60%，至少约65%，至少约70%，至少约75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约92%，至少约94%，至少约94%，至少约96%，至少约98%，至少约99%，至少约100%的氨基酸残基序列的一致性。

在某些实施例中，该宿主细胞包括由NCU00801编码的纤维糊精转运子，也称为cdt-1或CBT1。在其他实施例中，该宿主细胞包括由NCU08114编码的纤维糊精转运子，也称为Cdt-2或CBT2。在某些实施例中，该重组纤维糊精转运子与Cdt-1(SEQ ID NO:33)或Cdt-2(SEQ ID NO:34)具有至少20%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%，或100%的氨基酸序列的一致性。

本发明合适的纤维糊精转运子还包括，但不限于，公开号为US2011/0262983的美国专利申请，和公开号为WO2011/123715的国际专利申请中公开的那些。例如，合适的纤维糊精转运子可以包括，但不限于，HXT2.1,HXT2.2,HXT2.3,HXT2.4,HXT2.5,HXT2.6,和HXT4。在某些实施例中，本发明的重组纤维糊精转运子与由公开号为US2011/0262983的美国专利申请，和公开号为WO2011/123715的国际专利申请中所列出的任意基因(如HXT2.1,HXT2.2,HXT2.3,HXT2.4,HXT2.5,HXT2.6,或HXT4)编码的多肽具有约20%，至少约30%，至少约40%，至少约50%，至少约55%，至少约60%，至少约65%，至少约70%，至少约75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约92%，至少约94%，至少约96%，至少约98%，至少约99%，至少约100%的氨基酸残基序列的一致性。

本发明的重组纤维糊精转运子可以包括，但不限于，由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸编码由以上所列的基因编码的多肽的保守性修饰的变体。本发明的重组纤维糊精转运子还包括由多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸编码由Supplemental Data,Dataset S1,page3inTian et al.,2009中的表10；表1和2，公开号为US2011/0262983的美国专利申请和公开号为WO2011/123715的国际专利申请中多列的任意基因编码的多肽的同源基因或直系同源基因。

在某些方面，本发明的纤维糊精转运子包括多肽：GenBank登录号CAZ81962.1（黑孢块菌）；GenBank登录号ABN65648.2（树干毕赤酵母）；GenBank登录号EDR07962（双色蜡蘑）；GenBank登录号BAE58341.1（米曲霉）；GenBank登录号DAA06789.1（酿酒酵母HXT1）；GenBank登录号CAA30053.1（乳酸克鲁维酵母LACP）；联合基因组研究所（JGI）蛋白质ID（PID）编号PID136620(S1)（黄孢原毛平革菌）；联合基因组研究所（JGI）蛋白质ID（PID）编号PID115604(JGI)(S2)（绵腐卧孔菌Postiaplacenta）；NCBI参考序列XP_001268541.1（棒曲霉）；NCBI参考序列XP_001387231（LAC2，树干毕赤酵母）。黄孢原毛平革菌和绵腐卧孔菌的基因组和分别从http://genome.jgipsf.org/Phchr1/Phchr1.home.html和http://genome.jgipsf.org/Pospl1/Pospl1.home.html访问得到。

在某些方面，该宿主细胞的纤维糊精转运子与对应于GenBank登录号CAZ81962.1（黑孢块菌）；GenBank登录号ABN65648.2（树干毕赤酵母）；GenBank登录号EDR07962（双色蜡蘑）；GenBank登录号BAE58341.1（米曲霉）；GenBank登录号DAA06789.1（酿酒酵母HXT1）；GenBank登录号CAA30053.1（乳酸克鲁维酵母LACP）；联合基因组研究所（JGI）蛋白质ID（PID）编号PID136620(S1)（黄孢原毛平革菌）；联合基因组研究所（JGI）蛋白质ID（PID）编号PID115604(JGI)(S2)（绵腐卧孔菌Postiaplacenta）；NCBI参考序列XP_001268541.1（棒曲霉）；NCBI参考序列XP_001387231（LAC2，树干毕赤酵母）的多肽具有至少约20%，至少约30%，至少约40%，至少约50%，至少约55%，至少约60%，至少约65%，至少约70%，至少约75%，至少约80%，至少约85%，至少约90%，至少约92%，至少约94%，至少约96%，至少约98%，至少约99%，至少约100%的氨基酸残基序列的一致性。

纤维糊精转运子的基序

一方面，纤维糊精转运子是主要协助转运蛋白超家族（MFS）糖转运子的成员。转运子的MFS的成员（转运分类#2.A.1）几乎总是由12个跨膜α螺旋，和细胞内的N-末端和C-末端构成（S.S.Pao,et al.,Microbiol Mol Biol Rev62,1(Mar,1998)）。虽然MFS转运子的基本序列差异很大，但是所有的共享大肠杆菌乳糖渗透酶（LacY）（J.Abramson et al.,Science301,610(Aug1,2003)），和大肠杆菌聚酰亚胺/甘油-3-磷酸(GlpT)(Y.Huang,et al.,Science301,616(Aug1,2003))的三级结构。在这些例子中，来自两个不同域的六个N-和C-末端螺旋通过螺旋6和7之间的长的细胞质环（cytoplasmic loop）连接起来。这种对称性对应于引起MFS的重复事件。底物在亲水腔内结合，该亲水腔由N-端域的螺旋1,2,4和5，以及C-端域的螺旋7,8,10和11形成。该腔通过螺旋3,6,9和12稳固。

MFS的糖转运子家族（转运子分类#2.A.1.1）是由跨膜螺旋6和12(PESPR(SEQ ID NO:9)/PETK(SEQ ID NO:10))，环2和8(GRR/GRK)(M.C.Maiden,et al.,Nature325,641(Feb12-18,1987))中发现的基序定义。该家族的整个隐马尔克夫模型（HMM）可在在pfam.janelia.org/family/PF00083#tabview=tab3看到。PROSITE(N.Hulo et al.,Nucleic AcidsRes34,D227(Jan1,2006))使用两个基序来识别该家族的成员。第一个是[LIVMSTAG]-[LIVMFSAG]-{SH}-{RDE}-[LIVMSA]-[DE]-{TD}-[LIVMFYWA]-G-R-[RK]-x(4,6)-[GSTA](SEQ ID NO:11)。第二个是[LIVMF]-x-G-[LIVMFA]-{V}-x-G-{KP}-x(7)-[LIFY]-x(2)-[EQ]-x(6)-[RK](SEQ ID NO:12)。作为如何读取PROSITE基序的例子，将以下基序[AC]-x-V-x(4)-{ED}翻译为[Ala or Cys]-any-Val-any-any-any-any-{anybut Glu or Asp}(SEQ ID NO:13)。

在假定纤维糊精转运子直系同源基因之间的T-COFFEE中产生多个序列比对，并确定由保守基序（conserved motifs）识别的纤维糊精转运子。使用PROSITE记号识别保守基序。跨膜螺旋1包括基序，[LIVM]-Y-[FL]-x(13)-[YF]-D(SEQ ID NO:1)。跨膜螺旋2包括基序，[YF]-x(2)-G-x(5)-[PVF]-x(6)-[DQ](SEQ ID NO:2)。连接跨膜螺旋2和跨膜螺旋3的环包括基序，G-R-[RK](SEQ ID NO:3)。跨膜螺旋5包括基序，R-x(6)-[YF]-N(SEQ IDNO:4)。跨膜螺旋6包括基序，WR-[IVLA]-P-x(3)-Q(SEQ ID NO:5)。跨膜螺旋6和跨膜螺旋7之间的序列包括该基序，P-E-S-P-R-x-L-x(8)-A-x(3)-L-x(2)-Y-H(SEQ ID NO:6)。跨膜螺旋7包括基序，F-[GST]-Q-x-S-G-N-x-[LIV](SEQ ID NO:7)。跨膜螺旋10和跨膜螺旋11以及二者之间的序列包括基序，L-x(3)-[YIV]-x(2)-E-x-L-x(4)-R-[GA]-K-G(SEQ IDNO:8)。

因此，本发明的某些方面涉及重组纤维糊精转运子，或者其功能片段，其含有一种或多种所公开的保守性基序。在某些实施例中，该重组纤维糊精转运子，或其功能片段，包括多肽，该多肽含有跨膜α-螺旋1，α-螺旋2，α-螺旋3，α-螺旋4，α-螺旋5，α-螺旋6，α-螺旋7，α-螺旋8，α-螺旋9，α-螺旋10，α-螺旋11，α-螺旋12，且跨膜α-螺旋1包含SEQID NO：1。在另一些实施例中，该重组纤维糊精转运子包括多肽，该多肽含有跨膜α-螺旋1，α-螺旋2，α-螺旋3，α-螺旋4，α-螺旋5，α-螺旋6，α-螺旋7，α-螺旋8，α-螺旋9，α-螺旋10，α-螺旋11，α-螺旋12，且跨膜α-螺旋2包含SEQ ID NO：2。在另一些实施例中，该重组纤维糊精转运子包括多肽，该多肽含有跨膜α-螺旋1，α-螺旋2，α-螺旋3，α-螺旋4，α-螺旋5，α-螺旋6，α-螺旋7，α-螺旋8，α-螺旋9，α-螺旋10，α-螺旋11，α-螺旋12，且连接跨膜α-螺旋2和跨膜α-螺旋3的环包含SEQ ID NO：3。在另一些实施例中，该重组纤维糊精转运子包括多肽，该多肽含有跨膜α-螺旋1，α-螺旋2，α-螺旋3，α-螺旋4，α-螺旋5，α-螺旋6，α-螺旋7，α-螺旋8，α-螺旋9，α-螺旋10，α-螺旋11，α-螺旋12，且跨膜α-螺旋5包含SEQ ID NO：4。在另一些实施例中，该重组纤维糊精转运子包括多肽，该多肽含有跨膜α-螺旋1，α-螺旋2，α-螺旋3，α-螺旋4，α-螺旋5，α-螺旋6，α-螺旋7，α-螺旋8，α-螺旋9，α-螺旋10，α-螺旋11，α-螺旋12，且跨膜α-螺旋6包含SEQ ID NO：5。在另一些实施例中，该重组纤维糊精转运子包括多肽，该多肽含有跨膜α-螺旋1，α-螺旋2，α-螺旋3，α-螺旋4，α-螺旋5，α-螺旋6，α-螺旋7，α-螺旋8，α-螺旋9，α-螺旋10，α-螺旋11，α-螺旋12，且跨膜α-螺旋6和跨膜α-螺旋7之间的序列包含SEQ ID NO：6。在另一些实施例中，该重组纤维糊精转运子包括多肽，该多肽含有跨膜α-螺旋1，α-螺旋2，α-螺旋3，α-螺旋4，α-螺旋5，α-螺旋6，α-螺旋7，α-螺旋8，α-螺旋9，α-螺旋10，α-螺旋11，α-螺旋12，且跨膜α-螺旋7包含SEQ IDNO：7。在另一些实施例中，该重组纤维糊精转运子包括多肽，该多肽含有跨膜α-螺旋1，α-螺旋2，α-螺旋3，α-螺旋4，α-螺旋5，α-螺旋6，α-螺旋7，α-螺旋8，α-螺旋9，α-螺旋10，α-螺旋11，α-螺旋12，且跨膜α-螺旋10和跨膜α-螺旋11，及它们之间的序列包含SEQ ID NO：8。

此外，每个上述实施例可以与任意数量的组合结合。根据上面任意一个实施例的重组纤维糊精转运子可以包括多肽，该多肽含有1,2,3,4,5,6,7，或任意个SEQ ID NOs:1-8，或者该多肽含有全部的SEQ ID NOs:1-8。例如，重组纤维糊精转运子可以包括含有多肽，该多肽含有跨膜α-螺旋1，α-螺旋2，α-螺旋3，α-螺旋4，α-螺旋5，α-螺旋6，α-螺旋7，α-螺旋8，α-螺旋9，α-螺旋10，α-螺旋11，α-螺旋12，其中跨膜α-螺旋1含有SEQID NO:1，连接跨膜α-螺旋2和跨膜α-螺旋3的环含有SEQ ID NO:3，跨膜α-螺旋7含有SEQ ID NO:7。或者，在另一个例子中，重组纤维糊精转运子可以包括多肽，该多肽含有跨膜α-螺旋1，α-螺旋2，α-螺旋3，α-螺旋4，α-螺旋5，α-螺旋6，α-螺旋7，α-螺旋8，α-螺旋9，α-螺旋10，α-螺旋11，α-螺旋12，其中跨膜α-螺旋2含有SEQ ID NO:2，跨膜α-螺旋3含有SEQ ID NO:3，跨膜α-螺旋6含有SEQ ID NO:5，跨膜α-螺旋10和跨膜α-螺旋11，以及它们之间的序列含有SEQ ID NO:8。

突变的纤维糊精转运子

本发明的其他方面涉及突变的纤维糊精转运子，其可用于增加本发明的纤维糊精转运子的功能和/或活性。突变的纤维糊精转运子可通过使编码本发明的纤维糊精转运子的多核苷酸进行突变来制备。在一些实施例中，本发明的突变的纤维糊精转运子可以包括至少一种突变，该突变包括，但不限于，点突变、错差突变、取代突变、移码突变、插入突变、重复突变、扩增突变、易位突变、反转突变，其导致纤维糊精转运子具有增加的功能和/或活性。

本领域已知在感兴趣的纤维糊精转运子中产生至少一种突变的方法，该方法包括，但不限于，随机诱变和筛选，位点定向诱变，PCR诱变、插入诱变、化学诱变、和辐射。

在一些实施例中，该突变的纤维糊精转运子包括一个或多个氨基酸取代。例如，本发明的纤维糊精转运子可以包含在氨基酸序列Cdt-1(SEQ ID NO:33)的位置对应的一个或多个位置上的氨基酸取代。合适的一个或多个位置包括，但不限于，与SEQ ID NO:33的氨基酸91对应的位置，与SEQ ID NO:33的氨基酸104对应的位置，与SEQ ID NO:33的氨基酸170对应的位置，SEQ ID NO:33的氨基酸174对应的位置，SEQ ID NO:33的氨基酸194对应的位置，SEQ ID NO:33的氨基酸213对应的位置，SEQ ID NO:33的氨基酸335对应的位置，和它们的组合。

在一个非限制性的例子中，在一个或多个位置的氨基酸取代为在与SEQ ID NO:33的氨基酸91对应的位置的甘氨酸（G）至丙氨酸（A）取代；在与SEQ ID NO:33的氨基酸104对应的位置的谷氨酰胺（Q）至丙氨酸（A）取代；在与SEQ ID NO:33的氨基酸170对应的位置的苯丙氨酸（F）至丙氨酸（A）取代；在与SEQ ID NO:33的氨基酸174对应的位置的精氨酸（R）至丙氨酸（A）取代；在与SEQ ID NO:33的氨基酸194对应的位置的谷氨酸（E）至丙氨酸（A）取代；在与SEQ ID NO:33的氨基酸213对应的位置的苯丙氨酸（F）至赖氨酸（L）取代；在与SEQ ID NO:33的氨基酸335对应的位置的苯丙氨酸（F）至丙氨酸（A）取代；或它们的组合。在某些优选实施例中，在一个或多个位置的氨基酸取代为在与SEQ ID NO:33的氨基酸91对应的位置的甘氨酸（G）至丙氨酸（A）取代和/或在与SEQ ID NO:33的氨基酸213对应的位置的苯丙氨酸（F）至赖氨酸（L）取代。

在一些实施例中，突变的纤维糊精转运子的增加的功能和/或活性导致宿主细胞消耗纤维糊精的速度比缺乏该突变的纤维糊精转运子的细胞消耗纤维糊精的速度快。例如，在含有突变的纤维糊精转运子的宿主细胞内的纤维糊精的消耗速度比含有相应野生型纤维糊精转运子的宿主细胞中的纤维糊精的消耗速度可以快至少5%，至少10%，至少15%，至少20%，至少25%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少100%，至少125%，至少150%，至少175%，至少200%，至少225%，至少250%，至少275%，至少300%，或者更高的比例。

β-葡萄糖苷酶

在某些实施例中，该宿主细胞还包括重组核苷酸，其中该核苷酸编码含有至少一个β-葡萄糖苷酶的催化域的多肽。如本文中使用的，β-葡萄糖苷酶指的是β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化非还原末端β-D-葡萄糖的水解，释放β-D-葡萄糖。β-葡萄糖苷酶的催化域具有确定的β-葡萄糖苷酶活性，例如，如Venturi et al.,J.Basic Microb.42(1)55-66,2002所描述的基本方法。β-葡萄糖苷酶的催化域为催化β-D-葡萄糖苷内的非还原末端残基的水解，释放葡萄糖的任何域。在一些方面，该β-葡萄糖苷酶为糖基水解酶家族1的成员。该组的成员可通过基序[LIVMFSTC]-[LIVFYS]-[LIV]-[LIVMST]-E-N-G-[LIVMFAR]-[CSAGN](SEQ ID NO:14)来识别。在此处，E为催化谷氨酸（webpageexpasy.org/cgi-bin/prosite-search-ac?PDOC00495）。在某些方面，编码β-葡萄糖苷酶的催化域的多核苷酸与宿主细胞异源。在一些方面，β-葡萄糖苷酶的催化域位于宿主细胞的细胞内。在一些方面，β-葡萄糖苷酶来自粗糙脉孢菌，在一些方面，β-葡萄糖苷酶为NCU00130(GH1-1)。在某些实施例中，该β-葡萄糖苷酶可以是NCU00130的直系同源。NCU00130的直系同源的例子包括，但不限于（列出GenBank登录号）：黑孢块菌,CAZ82985.1;米曲霉,BAE57671.1;绵腐卧孔菌,EED81359.1;黄孢原毛平革菌,BAE87009.1;乳酸克鲁维酵母,CAG99696.1;双色蜡蘑,EDR09330;葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）,EEQ37997.1;棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）,D64088和树干毕赤酵母,ABN67130.1。可以使用的其他β-葡萄糖苷酶包括来自糖基水解酶家族3那些。这些β-葡萄糖苷酶可通过以下基序PROSITE:[LIVM](2)-[KR]-x-[EQKRD]-x(4)-G-[LIVMFTC]-[LIVT]-[LIVMF]-[ST]-D-x(2)-[SGADNIT](SEQ ID NO:15)来识别。此处D为催化天冬氨酸。通常，可以使用任何β-葡萄糖苷酶，其含有NCBI序列COG2723中发现的β-葡萄糖苷酶/6-磷酸-β-葡萄糖苷酶/β-半乳糖苷酶的保守域（conserveddomain）。基于纤维糊精转运子，来自特定的β-葡萄糖苷酶的催化域可优选地包含于宿主细胞内。

制备和培养本发明的宿主细胞的方法

制备和培养本发明的宿主细胞的方法可以包括将含有本发明的重组多核苷酸的表达载体引入或转移入该宿主细胞。用于将表达载体转移入宿主细胞的方法在本领域是公知的。例如，利用表达载体转化大肠杆菌的方法涉及氯化钙的处理，其中通过钙沉淀引入该表达载体。其他盐，例如磷酸钙也可以用于以下类似的过程。此外，可使用电穿孔（即使用电流增加细胞对核酸序列的渗透性）转染（transfect）宿主细胞。同样，核酸序列的显微注射能提供转染宿主细胞。也可以使用其他方式，例如脂质复合物，脂质体，和树枝状聚合物。本领域技术人员可以利用这些或其他方法，通过理想序列转染宿主细胞。

该载体可以是自主复制载体，即以染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如质粒、染色体外因子、微型染色体、或人工染色体。该载体可以包括用于确保自我复制的任何工具。或者，该载体可以是当被引入宿主时，其整合至基因组，并与其整合入的染色体共同复制。进一步地，可以使用单个的载体或质粒，或者共同含有被引入宿主的基因组中的总的DNA的两个或多个载体或质粒，或者转座子。

该载体优选包括一种或多种选择标记，其允许转化的宿主的简单选择。选择标记是一种基因，其产物提供例如杀菌或耐病毒，耐重金属，营养缺陷型的原养性等。细菌细胞的选择可以基于基因，例如amp,gpt,neo,tet,camR和hyg基因所给予的抗菌剂耐药性。

酿酒酵母宿主的合适的标记为，例如ADE2,HIS3,LEU2,LYS2,MET3,TRP1,和URA3。用于丝状真菌宿主的选择标记包括，但不限于，amdS（乙酰胺酶）、argB（鸟氨酸氨甲酰基转移酶）、bar（草胺膦乙酰转移酶）、hph（潮霉素磷酸转移酶）、niaD（硝酸还原酶）、pyrG（乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶）、sC（硫酸腺苷酰转移酶）、和trpC（甲酸酯合酶），及等同物。优选用于曲霉的为构巢曲霉或米曲霉的amdS或pyrG基因，和吸水链霉菌的bar基因。优选用于木霉的为bar和amdS。

该载体优选含有一种成分，该成分使该载体整合至宿主基因组或使载体在细胞内独立于基因组自动复制。

为了整合至宿主基因组，载体可依赖于基因序列或者通过同源或非同源重组将载体整合至基因组中的载体的其它成分。或者，该载体可以包括额外的核苷酸序列，用于通过同源重组指导整合至宿主基因组。该额外的核苷酸序列使载体整合至宿主基因组中染色体上的准确位置。为了提高在准确位置整合的可能性，整合成分应该包括足够量的核酸，例如100-10,000个碱基对，优选400-10,000个碱基对，最优选800-10,000个碱基对，其与相应的靶序列高度同源，以增加同源重组的可能性。该整合成分可以是与宿主的基因组上的靶序列同源的任意序列。此外，该整合成分可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，该载体可通过非同源重组整合至宿主的基因组。

对于自主复制，该载体还包括复制起点，该复制起点使载体在宿主内自主复制。该复制起点可以是任何调节自主复制的质粒复制因子，其在细胞内起作用。术语“复制起点”或“质粒复制因子”在此处定义为能够使质粒或载体在体内复制的序列。在酵母宿主内使用的复制起点的例子为2微米（micron）复制起点，ARS1,ARS4，ARS1和CEN3的组合，ARS4和CEN6的组合。用于丝状真菌细胞的复制起点的例子如AMA1和ANS1(WO00/24883)。AMA1仅的分离和含有该基因的质粒或载体的构建可通过WO00/24883中公开的方法进行。

对于其他宿主，可以在例如J.D.Read,et al.,Applied and Environmental Microbiology,Aug.2007,p.5088–5096中找到克鲁维酵母的转化过程，在O.Delgado,et al.,FEMSMicrobiology Letters132,1995,23-26找到发酵单胞菌的转化过程，在US7,501,275中找到树干毕赤酵母的转化过程，和在WO2008/040387中找到梭状芽孢杆菌的转化过程。

可以将一个以上复制的基因插入宿主内，以增加基因产品的产量。基因复制数的增加可通过将至少一个额外的复制基因整合至宿主基因组来获得，或通过在核苷酸序列（其中细胞含有选自标记基因的扩增的复制）中包括一个可扩增的可选择标记基因来实现，从而通过在合适的选择剂存在下培养细胞，选择额外的基因复制。

用于连接上述成分以构建本发明的重组表达载体的方法在本领域是已知的（见例如Sambrook et al.,2001,同上）

利用至少一个表达载体转化该宿主细胞。当仅仅使用单个表达载体时（没有添加中间体），该载体将含有全部的必要的核酸序列。

一旦用表达载体转化宿主细胞，该宿主细胞被允许生长。宿主细胞在培养基中的生长可涉及发酵过程。本发明的方法可以包括培养宿主细胞，从而重组核酸在细胞中表达。对于微生物宿主，该方法需要在合适的培养基中培养细胞。在一些方面，细胞在合适的培养基中，在30℃下生长。本发明的生长培养基包括，例如但不限于，常见的商用制备的培养基，如Luria Bertani(LB)发酵液，沙氏葡萄糖（SD）发酵液，或酵母培养基（YM）发酵液。可以使用其他的定义的或合成的生长培养基，微生物和发酵科学领域的技术人员已知用于特定宿主细胞的生长的合适的培养基。温度范围和其他适于生长的条件在本领域是已知的。

根据本发明的一些方面，该培养基包括用于宿主细胞的碳源。这种“碳源”通常是指适合用于原核或简单真核细胞生长的碳的来源的底物或化合物。碳源可以是各种形式，包括但不限于，聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽等。这些包括，例如各种单糖，例如葡萄糖、低级多糖、多糖，生物质聚合物，如纤维素或半纤维素、木糖、树胶醛醣、二糖类，如蔗糖、饱和和非饱和脂肪酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、乙醇等，或它们的组合。该碳源还可以是光合作用的产物，包括但不限于葡萄糖。

在一些实施例中，该碳源是生物质聚合物（biomass polymer），例如纤维素或半纤维素。本文中描述的“生物质聚合物”为生物材料中所含有任何聚合物。该生物材料可以是活的或死的。生物质聚合物包括，例如纤维素，木聚糖，木糖，半纤维素，木质素，甘露聚糖，和通常在生物质中发现的其他材料。生物质聚合物的来源的非限制性的例子包括草（例如柳枝稷，芒草），稻壳，甘蔗渣，棉花，黄麻（jute），大麻，亚麻，竹子，剑麻，吕宋麻，麦秸，叶子，草屑，玉米秸秆，玉米棒，酒糟，豆科植物，高粱，甘蔗，甜菜渣（sugar beet pulp），木屑，锯末，和生物质能作物(如海甘蓝)。

除了合适的碳源，培养基必须包括合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂，和本领域已知的其他成分，适于各种糖的发酵和烃类及烃衍生物的生产所需的酶途径的促进和培养物的生长。反应可以在需氧或厌氧条件下进行，其中根据微生物的需要，需氧、缺氧或厌氧条件是优选的。当该宿主细胞生长和/或繁殖时，各种糖或生物质聚合物的生长所需的酶、转运子、或其它蛋白质的表达，糖的发酵，或烃或烃衍生物的合成受到影响。

含β-D-葡萄糖的混合物的发酵方法

在一个实施例中，提供用于含β-D-葡萄糖的混合物的发酵方法。一方面，通过将纤维素或纤维糊精化学或酶水解至β-D-葡萄糖来获得β-D-葡萄糖。

一方面，用于发酵含β-D-葡萄糖的混合物方法包括第一步，其中将含β-D-葡萄糖的混合物与本文公开的、具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽接触。在某些方面，具有D-葡萄糖变旋酶活性的多肽与GAL10/YBR019C,YHR210C,YNR071C,或NCU09705多肽具有至少20%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%，至少100%的氨基酸一致性。该方法包括第二步，其中在将含β-D-葡萄糖的混合物与具有D-葡萄糖变旋酶活性的多肽接触后，在将含β-D-葡萄糖的混合物与具有D-葡萄糖变旋酶活性的多肽接触的同时，将含β-D-葡萄糖的混合物与宿主细胞接触。一方面，该宿主细胞为酿酒酵母。在支持发酵的条件下，利用含β-D-葡萄糖的混合物培养该宿主细胞，其中该宿主细胞比接触了含β-D-葡萄糖的混合物、但没有接触具有葡萄糖变旋酶活性的重组多肽的细胞消耗更多的含β-D-葡萄糖的混合物中的β-D-葡萄糖。如本领域技术人员所理解的，将含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽接触通过将β-D-葡萄糖转化为α-D-葡萄糖，来降低该混合物中β-D-葡萄糖的含量。

另一方面，用于发酵含β-D-葡萄糖的混合物的方法包括第一步，其中将含β-D-葡萄糖的混合物与宿主细胞接触，其中该宿主细胞含有编码本文公开的、具有葡萄糖变旋酶活性的重组多核苷酸。一方面，该宿主细胞为酿酒酵母。在某些方面，该重组多核苷酸编码多肽，该多肽与GAL10/YBR019C,YHR210C,YNR071C,或NCU09705多肽具有至少20%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%，或至少100%的氨基酸一致性。该方法包括第二步，在支持发酵的条件下，利用含β-D-葡萄糖的混合物培养该细胞，从而使该重组多核苷酸得以表达，其中该宿主细胞比不含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸的细胞消耗更多的含β-D-葡萄糖的混合物中的β-D-葡萄糖。优选地，否则，含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸的宿主细胞，以及不含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸的宿主细胞将具有相同的遗传背景。

用于发酵含纤维糊精的混合物的方法

在一个实施例中，本发明提供用于发酵含纤维糊精的混合物的方法。一方面，通过纤维素的化学或酶水解获得纤维糊精。一方面，纤维糊精为纤维二糖。

一方面，用于发酵含纤维糊精的混合物的方法，该方法包括提供宿主细胞的第一步，其中该宿主细胞含有编码本文公开的、具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸。一方面，该宿主细胞为酿酒酵母。在某些方面，该重组多核苷酸编码多肽，该多肽与GAL10/YBR019C,YHR210C,YNR071C,或NCU09705具有至少20%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%，至少100%的氨基酸一致性。该方法包括第二步，在支持发酵的条件下，利用含纤维糊精的混合物培养该细胞，以使该重组多核苷酸得到表达。

另一方面，用于发酵含纤维糊精的混合物的方法包括提供宿主细胞的第一步，其中该宿主细胞含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸，和编码一种或多种纤维糊精转运子的重组多核苷酸。一方面，该宿主细胞为酿酒酵母。在某些方面，重组多核苷酸编码多肽，该多肽与GAL10/YBR019C,YHR210C,YNR071C,或NCU09705多肽具有至少20%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%，或至少100%的氨基酸一致性。在某些方面，重组多核苷酸编码纤维糊精转运子，该纤维糊精转运子与NCU00801或NCU08114多肽具有至少20%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%，或至少100%的氨基酸一致性。一方面，该宿主细胞还包含重组多核苷酸，该重组多核苷酸编码含有至少一个β-葡萄糖苷酶的催化域的多肽。这种重组多核苷酸可用于缺乏能源性利用纤维糊精能力的宿主细胞。一方面，β-葡萄糖苷酶的催化域为细胞内的。一方面，该β-葡萄糖苷酶来自粗糙脉胞菌。一方面，该β-葡萄糖苷酶由NCU00130编码。

该方法包括第二步，在支持发酵的条件下，利用含纤维糊精的混合物培养细胞，以使该重组多核苷酸得到表达。

在含纤维糊精的混合物的发酵过程中增加纤维糊精的消耗的方法

本发明还提供在含纤维糊精的混合物的发酵过程中，增加纤维糊精的消耗的方法。一方面，通过纤维素的化学或酶水解得到该纤维糊精。一方面，该纤维糊精为纤维二糖。

一方面，在含纤维糊精的混合物的发酵过程中，增加纤维糊精的消耗的方法包括第一步，提供宿主细胞，其中该宿主细胞含有编码本文公开的、具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸，和编码一种或多种纤维糊精转运子的重组多核苷酸。一方面，该宿主细胞为酿酒酵母。在某些方面，重组多核苷酸编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽，该多肽与GAL10/YBR019C,YHR210C,YNR071C,或NCU09705多肽具有至少20%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%，至少100%的氨基酸一致性。在某些方面，重组多核苷酸编码纤维糊精转运子，该纤维糊精转运子与NCU00801或NCU08114多肽具有至少20%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%，至少100%的氨基酸一致性。一方面，该宿主细胞还包含编码含有至少一种β-葡萄糖苷酶的催化域的多肽的重组多核苷酸。该重组多核苷酸用于缺乏利用纤维糊精的内生能力的宿主细胞。一方面，β-葡萄糖苷酶的催化域是细胞内的。一方面，该β-葡萄糖苷酶来自粗糙脉胞菌。一方面，该β-葡萄糖苷酶由NCU00130编码。

该方法包括第二步，在支持发酵的条件下，利用含纤维糊精的混合物培养该细胞，以使该重组多核苷酸得以表达，其中该宿主细胞比不含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸的细胞消耗更多的含纤维糊精的混合物中的纤维糊精。优选地，否则，含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸的宿主细胞，以及不含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸的宿主细胞将具有相同的遗传背景。

可通过本领域已知的方法测试宿主细胞消耗的纤维糊精。通常，通过利用高液相色谱法（HPLC）评价供细胞生长的培养基中的纤维糊精的浓度来测定细胞消耗的纤维糊精。优选地，否则，含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸的宿主细胞，以及不含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸的宿主细胞将具有相同的遗传背景。含有纤维糊精的培养基可能通过生物质聚合物，例如纤维素的酶处理而得到。

在含纤维糊精的混合物的发酵过程中增加化学品产量的方法

本发明还提供在含纤维糊精的混合物的发酵过程中，增加化学品的产量的方法。一方面，通过纤维素的化学或酶水解得到纤维糊精。一方面，该纤维糊精为纤维二糖。

一方面，在含纤维糊精的混合物的发酵过程中，增加化学品产量的方法包括第一步，提供宿主细胞，其中该宿主细胞含有编码本文公开的、具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸，和编码一种或多种纤维糊精转运子的重组多核苷酸。一方面，该宿主细胞为酿酒酵母。在某些方面，重组多核苷酸编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽，该多肽与GAL10/YBR019C,YHR210C,YNR071C,或NCU09705多肽具有至少20%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%，至少100%的氨基酸一致性。在某些方面，重组多核苷酸编码纤维糊精转运子，该纤维糊精转运子与NCU00801或NCU08114多肽具有至少29%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%，或至少100%的氨基酸一致性。一方面，该宿主细胞还包含编码含有至少一种β-葡萄糖苷酶的催化域的多肽的重组多核苷酸。该重组多核苷酸用于缺乏利用纤维糊精的内生能力的宿主细胞。一方面，β-葡萄糖苷酶的催化域是细胞内的。一方面，该β-葡萄糖苷酶来自粗糙脉胞菌。一方面，该β-葡萄糖苷酶由NCU00130编码。

该方法包括第二步，在支持发酵的条件下，利用含纤维糊精的混合物培养该细胞，以使该重组多核苷酸得以表达，其中在含纤维糊精的混合物的发酵过程中，该宿主细胞比不含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸的细胞产生更多的化学品。优选地，否则，含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸的宿主细胞，以及不含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸的宿主细胞将具有相同的遗传背景。

一方面，在含纤维糊精的混合物的发酵过程中产生的化学品包括在糖的发酵过程中由微生物宿主制备的任何产物。一方面，在含纤维糊精的混合物的发酵过程中产生的化学品为醇。一方面，在含纤维糊精的混合物的发酵过程中产生的化学品为乙醇、丙醇、或丁醇。

可通过本领域已知的任何方法测量通过宿主细胞产生的化学品的产量。通常，通过利用高液相色谱法（HPLC）评价供细胞生长的培养基中的化学品的浓度来测定细胞产生的化学品，如醇的产量。

在含纤维糊精的混合物的发酵过程中，增加细胞生长率的方法

本发明还提供在含纤维糊精的混合物的发酵过程中，增加细胞生长率的方法。一方面，通过纤维素的化学或酶水解获得纤维糊精。一方面，该纤维糊精为纤维二糖。

一方面，在含纤维糊精的混合物的发酵过程中，增加细胞生长率的方法包括第一步，提供宿主细胞，其中该宿主细胞含有编码本文公开的、具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸，和编码一种或多种纤维糊精转运子的重组多核苷酸。一方面，该宿主细胞为酿酒酵母。在某些方面，重组多核苷酸编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽，该多肽与GAL10/YBR019C,YHR210C,YNR071C,或NCU09705多肽具有至少20%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%，或至少100%的氨基酸一致性。在某些方面，重组多核苷酸编码纤维糊精转运子，该纤维糊精转运子与NCU00801或NCU08114多肽具有至少20%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，至少55%，至少60%，至少65%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少99%，或至少100%的氨基酸一致性。一方面，该宿主细胞还包含编码含有至少一种β-葡萄糖苷酶的催化域的多肽的重组多核苷酸。该重组多核苷酸用于缺乏利用纤维糊精的内生能力的宿主细胞。一方面，β-葡萄糖苷酶的催化域是细胞内的。一方面，该β-葡萄糖苷酶来自粗糙脉胞菌。一方面，该β-葡萄糖苷酶由NCU00130编码。

该方法包括第二步，在支持发酵的条件下，利用含纤维糊精的混合物培养该细胞，以使该重组多核苷酸得以表达，其中在含纤维糊精的混合物的发酵过程中，该宿主细胞比不含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸的细胞具有提高的生长率。优选地，否则，含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸的宿主细胞，以及不含有编码具有葡萄糖变旋酶活性的多肽的重组多核苷酸的宿主细胞将具有相同的遗传背景。

可通过本领域已知的任何方法测量通过宿主细胞的生长率。通常，通过光密度评价悬浮液中的细胞浓度，来测量细胞的生长率。

联合生物加工的方法

本文进一步提供了通过联合生物加工将含纤维素的材料转化为发酵产物的方法。联合生物加工将酶的产生，生物质的水解，和生物燃料的生产结合至单一步骤中。一方面，通过联合生物加工将含纤维素的材料转化为发酵产物的方法包括步骤：A）将含纤维素的材料与具有重组核酸的细胞接触，该重组核酸编码一种或多种纤维素酶，一种或多种纤维糊精转运子，一种或多种β-葡萄糖苷酶，和本文公开的、具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽；B）在支持纤维素降解和发酵的条件下，用表达重组核酸的细胞孵化该含纤维素的材料，以产生发酵产物。

由从含纤维素的材料的降解获得的糖制备的发酵产物包括，但不限于，乙醇，正丙醇，正丁醇，异丁醇，3-甲基-1-丁醇，2-甲基-1-丁醇，3-甲基-1-戊醇，辛醇。

用于产生纤维糊精和β-D-葡萄糖的方法

一方面，本发明的纤维糊精和β-D-葡萄糖从纤维素中产生。纤维素由β（1-4）连接的D-葡萄糖分子的长链构成。纤维素水解成更小的分子将产生连接在一起的约两个至六个β-D-葡萄糖分子（“纤维糊精”），或者单个的β-D-葡萄糖分子。一方面，纤维素水解产生的纤维糊精为纤维二糖。

一方面，由植物生物质获得纤维素。一方面，由藻类获得纤维素。一方面，由真菌类获得纤维素。另一方面，由细菌生物膜获得纤维素。

一方面，从木质纤维中获得纤维素。木质纤维素的主要成分是纤维素、半纤维素和木质素。本领域已知从木质纤维素制备纤维素的方法，该方法包括物理和化学过程。一方面，通过酸的水解从木质纤维素制备纤维素。一方面，通过蒸汽爆炸从木质纤维素制备纤维素。一方面，通过氨纤维膨胀（AFEX）从木质纤维素制备纤维素。

可通过酶或化学方法，将纤维素水解为纤维糊精和β-D-葡萄糖分子。

可以利用酸处理纤维素，将纤维素化学水解至纤维糊精和β-D-葡萄糖分子。一方面，在大气压力和室温下用酸处理纤维素。一方面，在大于大气压力和高于40℃的温度下，用酸处理纤维素。

利用纤维素酶处理纤维素，从而将纤维素酶水解至纤维糊精和β-D-葡萄糖分子。纤维素酶可以包括，例如，内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶，和β-葡萄糖苷酶。一方面，纤维素酶为重组纤维素酶。一方面，纤维素酶为耐热纤维素酶。一方面，在蛋白质的C端末端含有碳水化合物结合域（CBD）。

在一些方面，可以从天然表达纤维素酶的生物中直接分离出纤维素酶。在一些方面，可以利用来自生物的纤维素酶基因重组产生纤维素酶，其中该生物在宿主细胞的表达载体中天然表达纤维素酶。这种表达纤维素酶的类型的生物包括，例如真菌和细菌。

表达纤维素酶的真菌包括，但不限于，丝状真菌（Acremonium cellulolyticus）、acculeatus曲霉（Aspergillus acculeatus）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus）、黑曲霉（Aspergillus nige r）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、红褐肉座菌(Trichodermareesei)、白囊耙齿菌（Irpex lacteus）、绳状青霉（Penicillium funmiculosum）、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）、裂褶菌（Schizophyllum commune）、黄连白绢病病菌（Sclerotium rolfsii）、嗜热侧孢（Sporotrichum cellulophilum）、埃默森篮状菌（Talaromyces emersonii）、太瑞斯梭孢壳霉（Thielavia terrestris）、康宁木霉（Trichoderma koningii）、和绿色木霉（Trichoderma viride）。

表达纤维素酶的细菌包括，但不限于，解纤维热酸菌（Acidothermus cellulolyticus）、土壤杆菌（Agrobacterium sp.）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、食纤维梭菌（Clostridium cellulovorans）、热纤梭菌（Clostridium thermocellum）、多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）、菊果胶杆菌（Pectobacterium chrysanthami）、激烈热球菌（Pyrococcus furiousus）、白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）、链霉菌（Streptomycessp.）、高温放线菌（Thermoactinomyces sp.）、嗜热子囊菌（Thermobifida fusca）、弯曲高温单孢菌（Thermomonospora curvata）、嗜热海栖热袍菌（Thermotoga maritime）、和海栖热袍菌（Thermotoga neapolitana）。

可以理解的是，虽然本发明已经描述了具体的实施例，但是上述描述旨在解释而不是限制本发明的范围。在本发明范围内的其他方面、有点和更改对于本领域技术人员是显而易见的。

实施例

以下实施例仅仅用于解释，并不用于以任何方式限制本发明的任何方面。

实施例1：编码醛糖-1-表异构酶（AEP）的基因在用于发酵纤维二糖的酿酒酵母菌株

D452-BT中的过表达

为了研究AEP过表达对纤维糊精消耗量的影响，克隆编码AEP的各种基因，并在工程酿酒酵母中过表达各种基因，该工程酿酒酵母表达纤维糊精转运子（cdt-1），和细胞内β-葡萄糖苷酶（gh1-1）。从不同的微生物克隆用于AEP的五种基因，并在强促进子（PGK促进子或TEF促进子）的控制下，将其引入多复制质粒（pRS423）（表1）。

表1.来自酿酒酵母、树干毕赤酵母、和大肠杆菌的各种AEP基因

构筑物名称	基因名称	来源	编号
				pRS423-GAL10-Sc	GAL10	酿酒酵母	YBR019C
pRS423-GAL10-YHR210C	假定表异构酶	酿酒酵母	YHR2IOC
				pRS423-GAL10-YNRO71C	假定表异构酶	酿酒酵母	YNR071C
pRS423-GAL10-Ps	GAL10	树干毕赤酵母
				pRS423-galM-Ec	galM	大肠杆菌

利用酿酒酵母D452-BT菌株将每种构筑物引入工程纤维二糖，在酿酒酵母D452-BT菌株中，其中转运子(cdt-1)和β-葡萄糖苷酶(gh1-1)分别利用多复制质粒pRS426和pRS425在酿酒酵母D452-BT菌株中过表达。

为了比较纤维二糖的使用和乙醇的产量，在用纤维二糖预培养基本培养基之后，将这些转化体接种至250mL烧瓶内的50mL的YP-纤维二糖（80g/L）培养基中，初始ODs约为1.0。在100rpm，30℃下进行发酵实验。通过利用紫外可视分光光度计(Biomate5,Thermo,NY)检测600nm处的光密度（OD）来监控细胞的生长。利用配备有折光检测器的高效液相色谱仪（HPLC,Agilent Technologies1200Series）测试纤维二糖、葡萄糖、甘油、乙酸酯和乙醇的浓度。使用Rezex ROA-有机酸H⁺(8%)柱（Phenomenex Inc.,Torrance,CA），并用0.005N的H₂SO₄作为流动相，以0.6ml/min的流速，在50℃下洗脱该柱子。

各种醛糖-1-表异构酶对纤维二糖使用的比较

从利用六种新的构建菌株和亲代菌株的发酵实验可以发现，GAL10(YBR019C)和由来自酿酒酵母的YHR210C和YNR071C编码的两种假定醛糖-1-表异构酶的过表达表现了提高的纤维二糖的消耗率和乙醇的生产率（production rates）（图1）。来自树干毕赤酵母的GAL10和来自大肠杆菌的galM对纤维二糖的使用没有表现出任何效果（图1）。在22小时的时候，具有GAL10(YBR019C),YHR210C,和YNR071C的转化体消耗的纤维二糖的量（65,60,和55g/L）远远大于含有空质粒（pRS423）的对照菌株消耗的纤维二糖的量（48g/L）（表2）。因此，GAL10(YBR019C),YHR210C,和YNR071C的过表达导致乙醇的产量也分别从14g/L增加至22,20,和18g/L。醛糖-1-表异构酶基因的过表达引起的增高的纤维二糖消耗率和乙醇生产率使得乙醇的产量得到明显提高（从0.62至1.00,0.92,和0.83g/L-hr）。

表2在22h发酵中通过AEP过表达菌株产生的纤维二糖的消耗和乙醇的产量的比较

GAL10(YBR019C)的过表达对纤维二糖发酵的影响

为了确定GAL10(YBR019C)的过表达对纤维二糖发酵的影响，我们独立地利用GAL10(YBR019C)过表达菌株(D452-BT-423GAL10)和亲代菌株(D452BT)重复发酵实验。在YP-纤维二糖(80g/L)培养基和氧限制条件，30℃下进行发酵。如预期的，与对照菌株相比，在30h时，D452-BT-423GAL10表现了更高的细胞生长，纤维二糖消耗率，和乙醇生产率。在30h时，与对照菌株相比，D452-BT-423GAL10生长的更多（OD19vs.OD16），消耗更多的纤维二糖（80g/L vs.70g/L），并产生更多的乙醇（37g/L vs25g/L）（图3）。因此，通过GAL10(YBR019C)的过表达，乙醇的生产率（productivity）增加了50%(1.23vs.0.83g/L·h)。

实施例2：编码醛糖1-表异构酶（AEP）的基因在用于发酵纤维二糖的酿酒酵母菌株SL01中的过表达

在多复制质粒pRS424中克隆两种AEP基因，并在酿酒酵母菌株SL01中表达，该酿酒酵母菌株SL01含有在多复制质粒pRS425中的纤维糊精转运子(cdt-1)和β-葡萄糖苷酶(ghl-1)（表3）。利用HXT7促进子和HXT7终止子克隆每种AEP基因。空质粒pRS424也转化至SL01菌株，作为阴性对照。

表3.在SL01菌株中过表达的AEP基因的来源

构筑物名称	来源	GenBank ID
			scAEP	酿酒酵母	YHR210C
ncAEP	粗糙脉孢菌	NCU0970

在合成缺陷型培养基（synthetic dropout media）中培养酵母菌株，以维持质粒(无氨基酸和硫酸铵的0.17%Difco酵母氮源，0.5%硫酸铵，0.05%氨基酸缺陷混合物)。具有2%D-葡萄糖的YPA培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，0.01%硫酸腺嘌呤）用于培养酵母菌株。在30℃下，以100rpm的条件下，在无刻度的摇瓶内培养酿酒酵母，用于发酵。对于每种酵母菌株，首先在添加了20g/L葡萄糖的2mL SC-Ura-Leu培养基内培养单菌落，然后接种到250ml摇瓶内的50ml的相同培养基，以获得用于混合糖发酵研究的足够的细胞。在生长一天之后，将细胞降速，并接种至添加了80g/L纤维二糖的50mL的YPA培养基。根据制作商的方法，利用配备有Bio-Rad HPX-87H柱（Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA）和岛津RID-10A折光检测仪的岛津HPLC测定糖和乙醇的浓度。利用岛津CTO-20AC柱烤箱将HPX-87H柱保持在65℃。使用0.5mM的硫酸溶液作为流动相，恒定速度为0.6mL/min。将10μL过滤后的样品注入带有岛津SIL-20AC HT自动进样器的HPLC系统，且每次运行在注入25分钟后停止。利用一系列外部标准产生的标准曲线测定糖和乙醇的浓度。每个数据点代表重复样品的平均值。

如图4所示，过表达的AEP基因表现了轻微增加的生物质增长、纤维二糖消耗率、乙醇产量，和减少的葡萄糖积累。该纤维二糖的消耗率在scAEP-过表达菌株和ncAEP-过表达菌株中分别呈现了9%和8%的增长。乙醇生产率在scAEP-过表达菌株和ncAEP-过表达菌株中分别呈现了8%和25%的增长。葡萄糖积累速率在scAEP-过表达菌株和ncAEP-过表达菌株中都降低了：在48小时，scAEP-过表达菌株表现出比对照菌株少32%的葡萄糖积累，而ncAEP-过表达菌株表现出比对照菌株少9.5%葡萄糖积累（5.8,7.8和8.6g/L）。

实施例3：具有一个或两个敲除AEP基因的酿酒酵母

为了进一步研究酿酒酵母中的醛糖1-表异构酶基因的功能，使用基因敲除（knockout）策略。基于生物信息学研究，在酿酒酵母中识别三种醛糖1-表异构酶基因，包括YHR210c,YNR071c,和YBR019c。为了研究不同的敲除组合，我们构建了三种单AEP敲除菌株，包括ΔYHR210c,ΔYNR071c和ΔGAL10(YBR019c)，和两个双AEP敲除菌株，包括Δ(YHR210c+YNR071c)和Δ(YHR210c+GAL10)。在酿酒酵母菌株SL01中构建该AEP敲除菌株，所有的敲除菌株包括质粒pRS425-(ghl-1)-cdt1，该质粒编码纤维糊精转运子(cdt-1)和β-葡萄糖苷酶(ghl-1)。

在纤维二糖的使用中，该两个双敲除菌株表现了发酵能力的明显降低（表4和图5）：在48h，生物质产量从OD33明显降低至OD19.7(Δ(YHR210c+YNR071c))或OD17.5(Δ(YHR210c+GAL10))；在Δ(YHR210c+YNR071c)菌株中，纤维二糖的消耗率减少了10%，从1.65g/L/h至1.48g/L/h，Δ(YHR210c+GAL10)菌株中，纤维二糖的消耗率减少了18%，从1.65g/L/h至1.35g/L/h；在Δ(YHR210c+YNR071c)菌株中，乙醇生产率减少了34%，从0.483g/L/h至0.318g/L/h，在Δ(YHR210c+GAL10)菌株中，乙醇生产率减少了52%，从0.483g/L/h至0.234g/L/h。

三种单敲除菌株也表现了发酵能力的缺陷（图6）：在48h，该生物质产量从OD33显著降低至OD17(ΔYHR210c),OD19(ΔGAL10)或OD18(ΔYNR071c)；纤维二糖的消耗率从1.65g/L/h降低至1.48g/L/h(ΔYHR210c)，从1.43g/L/h(ΔGAL10)降低至1.46g/L/h(ΔYNR071c)；乙醇生产率从0.483g/L/h降低至0.360g/L/h(ΔYHR210c)或0.185g/L/h(ΔGAL10)。在ΔYNR071c菌株中，所有的乙醇都被作为碳源来消耗。

表4在AEP-敲除菌株中的发酵比较

在AEP敲除菌株中，特别是纤维二糖的消耗率存在24小时的延迟时间（lag time）。在这段时间内，任意的双敲除菌株消耗少量纤维二糖，这意味着因为醛糖1-表异构酶低表达水平，在体内葡萄糖的产生将被抑制，导致低的纤维二糖的消耗量和生物质的产量。由于醛糖1-表异构酶的缺乏的影响存在于整个培养过程中，这导致培养终止时低的生物质产量，乙醇产量和纤维二糖的消耗量。由于在Δ(YHR210c+YNR071c)双敲除菌株中，唯一起作用的醛糖1-表异构酶基因是GAL10，在Δ(YHR210c+GAL10)双敲除菌株中，唯一起作用的醛糖1-表异构酶基因是YNR071c，我们可以得出结论，YNR071c的表达水平和催化能力低于GAL10，因为Δ(YHR210c+GAL10)表现了比Δ(YHR210c+YNR071c)更低的生长率和更低的纤维二糖消耗率。

实施例4：葡萄糖和纤维二糖在含有cdt-1和gh1-1基因的酿酒酵母菌株D452-BT中的发酵率的比较

将纤维二糖转运子(cdt-1)和细胞内β-葡萄糖苷酶(gh1-1)引入酿酒酵母，该酿酒酵母使纤维二糖作为碳源而发酵（Ha et al.2011,如上;Li et al.2010,如上）。因为运输的纤维二糖水解为细胞内的两分子的葡萄糖，我们可以推测通过工程酿酒酵母产生的纤维二糖发酵率可与葡萄糖发酵率相似，只要纤维二糖的转运没有限速。但是，由含有cdt-1和gh1-1的工程酿酒酵母产生的纤维二糖的发酵率远远低于葡萄糖的发酵率。该工程酿酒酵母D452-BT在43h消耗80g/L的纤维二糖，并产生32.7g/L的乙醇，得到0.41g/g的乙醇产率，和1.9g/L-h的纤维二糖消耗率（图7）。但是，该工程酿酒酵母D452-BT在13h消耗80g/L葡萄糖，产生34.7g/L乙醇，得到0.44g/g的乙醇产率，和6.1g/L-h的葡萄糖消耗率。无论使用何种糖（单葡萄糖或二葡萄糖），虽然最终乙醇浓度和乙醇产率相似，但是纤维二糖的消耗率比葡萄糖的消耗率小三倍。该结果表明可能存在用于纤维二糖高效发酵的未知的限制步骤。

实施例5：在不同培养基中生长的粗糙脉胞菌的醛糖1-表异构酶的表达水平的基因表达谱分析

因为纤维二糖转运子(cdt-1)和细胞内β-葡萄糖苷酶(gh1-1)是从纤维分解菌和粗糙脉胞菌克隆得到，因此通过研究粗糙脉胞菌利用纤维素生物质的过程中获得的基因表达数据，寻找靶基因，以提高工程酿酒酵母进行的纤维二糖的发酵。根据使用纤维素基质和单糖的粗糙脉胞菌的之前的转录分析研究，当粗糙脉胞菌在芒草水解液中生长时，醛糖1-表异构酶(NCU08398,AEP-Nc)的表达水平比粗糙脉胞菌在含蔗糖的培养基中明显增加（Tian et al.2009）（图8）。该结果表明纤维二糖转运子(cdt-1)和细胞内β-葡萄糖苷酶(gh1-1)的高效的细胞内纤维二糖的利用率需要AEP-Nc更高的表达。这样，我们假设AEP更高的表达可以提高通过工程酿酒酵母进行的纤维二糖的发酵。

酿酒酵母中的GAL10基因编码具有AEP和UDP半乳糖4-表异构酶活性的双功能酶。三维结构分析揭示了Gal10占有半乳糖4-表异构酶域（N-末端区域）和醛糖1-表异构酶域（C-末端区域）(Sharma and Malakar2010)。当与AEP-Nc对齐时，Gal10表现出与AEP-Nc的氨基酸序列的24.7%的序列一致性（图9）。此外，我们发现两种假定AEP基因（YHR210C和YNR071C），其与Gal10具有高的氨基酸序列一致性（分别为50.6%和51.0%）。YHR210C和YNR071C的氨基酸序列与AEP-Nc序列具有24.2%和26.6%的序列一致性。

实施例6：酿酒酵母菌株BY4741中AEP基因的缺失

为了进一步检查假定AEPs在纤维二糖利用过程中的功能，将含有纤维二糖利用途径的质粒引入三种BY4741敲除的菌株，其缺失YHR210C,YNR071C,或GAL10基因。当所得具有纤维二糖利用途径的ΔYHR,ΔYNR,ΔGAL和对照菌株生长时，ΔYHR和ΔYNR菌株比野生型菌株表现出更好的纤维二糖的消耗量。有趣地，ΔGAL菌株表现了纤维二糖生长的完全缺失（图10）。在ΔYHR菌株和ΔYNR菌株中，纤维二糖的消耗率从0.78g/L-h升高至1.26g/L-h,或1.25g/L-h，这代表比野生型菌株相比增加了60.3%或59.9%。对于葡萄糖积累，ΔYHR和ΔYNR菌株比野生型菌株表现出更高的葡萄糖积累，这与ΔYHR和ΔYNR的纤维二糖的消耗率成比例。因此，葡萄糖的积累是由于纤维二糖的消耗而不是YHR210C或YNR071C基因的缺失。考虑到ΔYHR和ΔYNR菌株的更高的纤维二糖的消耗率，乙醇产量与纤维二糖的消耗相关。因此，ΔYHR菌株在所有菌株中表现了最高的乙醇生产率。但是，ΔGAL菌株消耗了少量的纤维二糖。在发酵的末端，仅仅观察到12.0g/L纤维二糖的消耗。因此，没有观察到ΔGAL菌株的葡萄糖积累或乙醇产量。

为了进一步探测AEPs的功能，我们测定AEP缺失菌株的AEP酶活性（图11）。当那些AEP缺失的菌株在作为唯一碳源的纤维二糖中生长时，ΔYHR菌株的特异性变旋酶的活性是对照菌株的45.7%，而ΔYNR菌株的特异性变旋酶活性是对照菌株的89.5%。在ΔGAL菌株中未检测到AEP活性（图11A）。使用葡萄糖作为唯一碳源的AEP活性测试非常不同。ΔYHR菌株与ΔYNR菌株的特异性变旋酶活性几乎在相同水平，基本是ΔGAL菌株和对照菌株的活性的3倍（图11B）。

实施例7：具有AEP基因过表达的酿酒酵母菌株

为了测试AEP过表达的效果，我们将便于AEP基因(GAL10,YHR210C,和YNR071C)的较强的表达水平的过表达试剂盒（overexpression cassettes）引入具有不同菌株背景的两种工程酿酒酵母菌株。对于AEP的过表达，使用在TEF1启动子CYC1终止子控制下的具有AEP的pRS423载体。对于纤维二糖利用途径，使用具有在PGK促进子和CYC1终止子控制下的基因的构筑物pRS426-cdt-1和pRS425-gh1-1(Galazka et al.2010,如上;Ha et al.2011,如上)。当酿酒酵母BY4741作为亲代菌株时，纤维二糖的发酵没有改善（未显示数据），但是当酿酒酵母D452-BT作为亲代菌株时，观察到纤维二糖的消耗率和乙醇的生产率得到增加（图12）。GAL10,YHR210C,和YNR071的所有的过表达导致改善的纤维二糖的发酵，而与YHR210C和YNR071过表达菌株相比，GAL10过表达菌株表现了最高的纤维二糖发酵率和乙醇产率。此外，在引入AEP基因后，纤维糊精的积累降低。因此，与对照菌株相比，在36h时，GAL10过表达菌株的纤维二糖消耗率增加了72%，乙醇生产率增加了119%。

实施例的讨论

对于纤维素生物燃料的生产，人们希望有效利用纤维素生物燃料中的两种最丰富的糖，葡萄糖和木糖。在过去的二十年中，有大量的努力通过遗传和代谢工程创造工程酿酒酵母，用于有效利用葡萄糖和木糖（Tantirungkij et al.,J.Ferment.Bioeng.75(2):83-88,1993;Kotter and Ciriacy,Appl.Microbiol.Biotechnol.38(6):776-783,1993;Ho et al.,Appl.Environ.Microbiol.64(5):1852-1859,1998;Jin et al.,Appl.Environ.Microbiol.69(1):495-503,2003;Hahn-

et al.,Adv.Biochem.Eng./Biotechnol.108:147-177,2007）。但是，葡萄糖和木糖的连续利用具有几个限制，例如来自木糖的低的乙醇生产率和低的乙醇产率(Jeffries and Jin,Appl.Microbiol.Biotechnol.63(5):495-509,2004;Hahn-et al.2007,如上)。为了解决这些问题，我们研究了用于纤维二糖和木糖的共发酵的新方法，其大幅提高了乙醇产率和生产率(Ha et al.2011,supra;Li et al.2010,如上)。但是，虽然它们具有相似的乙醇产率，但是纤维二糖发酵率比葡萄糖的发酵率慢三倍。这种结果表明对于纤维二糖的利用率可能存在未知的限制步骤。已知通过来自细胞膜的信号机制开始葡萄糖的诱导(Rolland et al.,FEMS Yeast Res.2(2):183-201,2002,;Santangelo,Microbiol.Mol.Biol.R.70(1):253-282,2006;Gancedo,Microbiol.Mol.Biol.R.62(2):334-361,1998)。但是，在纤维二糖发酵的情况下，由于通过细胞内的β-葡萄糖苷酶在纤维二糖的细胞内产生葡萄糖，因此，通常的葡萄糖信号机制可能不够，导致慢的纤维二糖的利用。

已知粗糙脉胞菌利用纤维二糖，并克隆和表征来自粗糙脉胞菌的纤维二糖转运子(CDT-1)和细胞内β-葡萄糖苷酶(GH1-1)(Galazka et al.,Science330(6000):84-86,2010)。因此，我们检查来自粗糙脉胞菌的转录分析数据，以寻找工程酿酒酵母的纤维二糖利用的限制步骤。有趣的，我们发现与含蔗糖的培养基相比，含有芒草水解液的基本培养基中AEP的表达水平高160倍。该结果表明AEP高的表达水平可促进粗糙脉胞菌对纤维二糖的利用。在工程纤维二糖的利用中，通过β-葡萄糖苷酶产生β形式的葡萄糖，虽然在体外糖异构体的相互转化自发发生，但是在体内β形式的糖和α形式的糖之间的相互转化不足够高（Fekete et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.105(20):7141-7146,2008;Bouffard et al.,J.Mol.Biol.244(3):269-278,1994）。因为已知酵母更喜欢α-葡萄糖，AEP的活性可限制有效的纤维二糖发酵的速度。

使用来自粗糙脉胞菌的AEP基因(AEP-Nc)作为BLAST搜索的探针序列，我们识别编码具有AEP和UDP半乳糖4-表异构酶活性的双功能酶的酿酒酵母中的GAL10基因。此外，我们识别酿酒酵母中的两种假定AEP基因(YHR210C和YNR071C)。GAL10,YHR210C,和YNR071C与AEP-Nc分别具有24.7%,24.2%,和26.6%的氨基酸序列一致性。YHR210C基因标注为未知功能的假定蛋白。但是，报道了它与GAL10的序列的相似性(Majumdar et al.,Eur.J.Biochem.271(4):753-759,2004)。对于YNR071C基因，它的功能是未知的。YHR210C和YNR071C与GAL10分别具有50.6%和51.0%的氨基酸序列一致性。

基于我们对于AEP敲除菌株的研究，可以作出结论，GAL10表异构酶在纤维二糖的利用中发挥了主导作用。在GAL10基因敲除的BY4741菌株中，纤维二糖几乎没有任何生长，且没有观察到AEP活性。但是，酶检测的结果表明，虽然GAL10是主导AEP，但是它的表达受到另外两种AEPs表达的抑制。在需要高水平AEP的纤维二糖发酵条件下，GAL10高效地表达，GAL10的缺失导致受限的AEP酶活性和无细胞生长。在葡萄糖发酵条件下，由于GAL10表达受到葡萄糖的抑制，ΔGAL菌株和对照菌株显示了几乎相同的酶活性。缺失的YHR210C和YNR071C不能抑制GAL10的表达，这解释了在ΔYHR和ΔYNR菌株中观察到的高的AEP活性。基于这种分析，在BY4741菌株中可能存在复杂AEP调节系统：当需要葡萄糖相互转化时，主导GAL10的表达被激活；当葡萄糖充足时，低活性的AEPs，如YHR210C和YNR071C表达出，但是GAL10表达被抑制。

AEP过表达的进一步研究受到BY4741菌株的差的发酵性能的限制。因此，使用更快的生长菌株D452-BT。通过将AEP基因引入酿酒酵母D452-BT，纤维二糖发酵率得到显著提高。虽然具有空pRS423载体的对照菌株在36h内，仅消耗了47g/L的纤维二糖，但是表达三种AEP基因中的一种的菌株在36h内消耗了72～80g/L。对照菌株与表达三种AEP基因中的一种的菌株之间的乙醇生产率的不同是更重要的。表达GAL10,YHR210C,和YNR071C的菌株36h的乙醇生产率比对照菌株的乙醇生产率分别高123%,110%,和69%。此外，AEP基因的过表达产生的最大的纤维糊精的积累从13g/L降低至7～11g/L。两者合计，通过将AEP基因引入具有纤维二糖发酵途径的工程酿酒酵母D452-BT，不仅仅细胞生长率，纤维二糖消耗率，和乙醇的生产率增加了，而且纤维糊精的积累降低了。

用于实施例的材料和方法

用于上述实施例的材料和方法包括：

菌株和质粒构筑物

酿酒酵母D452-BT(MATα,leu2,his3,ura3,can1)和酿酒酵母BY4741(MATa,his3,leu2,met15,ura3)用于纤维二糖代谢工程。从Open Biosystems(Huntsville,AL)购买三种AEP敲除菌株。大肠杆菌DH5(F–recA1 endA1 hsdR17[rK^–mK⁺]supE44thi-1 gyrA relA1)(Invitrogen,Gaithersburg,MD)用于基因克隆和操纵。为了来自粗糙脉胞菌的β-葡萄糖苷酶(gh1-1)和纤维糊精转运子(cdt-1)的表达，将两个开放阅读框（cdt-1和gh1-1）放置在PGK促进子和CYC1终止子之间，以分别产生pRS426-CDT-1和pRS425-BGL(Galazka et al.2010,supra;Ha et al.2011,如上)。将一个AEP基因(GAL10)和两个假定AEP基因(YHR210C和YNR071C)放置在TEF1促进子和CYC1终止子之间以产生pRS423-AEP。

pRS425质粒(New England Biolabs,Ipwich,MA)用于构建用于AEP敲除菌株的、包含gh1-1和cdt-1的质粒。将PYK1促进子和ADH1终止子分别加入纤维二糖转运子的N-末端和C-末端，而将TEF1促进子和PGK1终止子分别加入β-葡萄糖苷酶的N-末端和C-末端。

培养基和培养条件

在Luria-Bertani培养基中培养大肠杆菌；当需要时，将50μg/mL的氨苄青霉素加入培养基中。在含有20g/L的葡萄糖的YP培养基(10g/L酵母提取物,20g/L细菌用胰蛋白胨)中，在30℃下常规培养酵母菌株。为了利用氨基酸缺陷型标记选择转化体，使用酵母合成的完全（YSC）培养基，其含有6.7g/L的酵母氮源，20g/L的葡萄糖，20g/L琼脂，和提供合适的核苷酸和氨基酸的CSM-Leu-Trp-Ura(Bio101,Vista,CA)。

发酵实验

在YSC培养基中培养酵母细胞，其中YSC含有20g/L的葡萄糖以制备用于纤维二糖发酵的接种体。在用无菌水洗涤两次后，收获并接种中期指数相的细胞。所有的摇瓶发酵实验在250mL的烧瓶内、含有80g/L的纤维二糖的50mL的YP培养基中，30℃下，初始OD₆₀₀为约1.0，氧气有限的条件下进行。

酵母转化

使用酵母EZ-转化试剂盒(BIO101,Vista,Calif.)进行用于构建木糖和纤维二糖代谢途径的表达盒的转化。在含有20g/L的葡萄糖的YSC琼脂培养基中选择所有的转化体。根据需要添加氨基酸和核苷酸。

AEP酶法测试

细胞培养液在装满带有80g/L纤维二糖的5mL YP培养基的培养试管生长。细胞在30℃，250rpm下生长48h，然后根据制造商的说明，在Y-PER提取试剂(Thermal Scientific,Rockford,IL)中再悬浮。随后收集上清液，用于测量蛋白质浓度和AEP活性。为了测定总的蛋白质浓度，根据制造商的说明使用BCA蛋白质检测试剂(Thermal Scientific,Rockford,IL)。使用Synergy2多功能酶标仪测试OD₅₈₀处的吸光度的改变。根据制造商的说明，测定总蛋白浓度。为了测试AEP活性，将α-葡萄糖和β-葡萄糖之间的转化与β-D-葡萄糖脱氢酶催化的β-葡萄糖的氧化及NAD⁺的还原联系起来。制备含有0.34mM NAD⁺，0.5U的β-D-葡萄糖脱氢酶和50mM Tris/HCl缓冲液的实验混合物。将820μL的混合物吸移至UV玻璃管，然后加入130μL含AEP的溶液。通过添加50μL166μM新鲜配置的α-葡萄糖开始反应，并记录3分钟340nm处的吸光度的增加。

分析方法

利用紫外可见分光光度计(Biomate5,Thermo,NY)监控600nm处的光密度（OD）的细胞生长。利用使用Rezex ROA-有机酸H+(8%)柱(Phenomenex Inc.,Torrance,CA)的配备有折光检测仪的高效液相色谱(HPLC,Agilent Technologies1200Series)测定葡萄糖、木糖、木糖醇、甘油、乙酸酯和乙醇浓度。用0.005N的H₂SO₄，0.6ml/min流速，50℃下洗脱该柱。

Claims (22)

1.一种宿主细胞，包括：

a）编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA；

b）编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；

其中，当在含纤维二糖的培养基中生长时，所述宿主细胞比缺乏所述编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞消耗更多的纤维二糖分子。

2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞还包括编码一种或多种β-葡萄糖苷酶的重组DNA。

3.根据权利要求1或2所述的宿主细胞，其特征在于，所述具有葡萄糖变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:17,19,21和23的氨基酸序列的多肽。

4.根据权利要求1或2所述的宿主细胞，其特征在于，所述具有葡萄糖变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。

5.含纤维二糖的混合物的发酵方法，该方法包括：

a）将所述含纤维二糖的混合物与权利要求1至4中任意一项所述的宿主细胞接触，和

b）在支持发酵的条件下，孵化该宿主细胞。

6.含纤维二糖的混合物的发酵方法，该方法包括：

a）提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括：

i）编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA；

ii）编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；和

b）在培养基中培养宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致：与缺乏该编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，细胞对纤维二糖的消耗增加。

7.一种用于增加化学品产量的方法，该方法包括：

a）提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括：

i）编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA；

ii）编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；和

b）在培养基中培养宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致：与缺乏该编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，由该细胞生产的化学品的产量增加。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述化学品为醇。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述醇选自乙醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-戊醇、辛醇。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述化学品为萜类化合物、聚酮化合物、脂肪酸、脂肪酸衍生物、或有机酸。

11.用于增加细胞的生长率的方法，该方法包括：

a）提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括：

i）编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA；

ii）编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；和

b）在培养基中培养宿主细胞，以使编码该一种或多种纤维糊精转运子的和编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致：与缺乏编码该具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，细胞的生长率增加。

12.根据权利要求6至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞还包括编码一种或多种β-葡萄糖苷酶的重组DNA。

13.根据权利要求6至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有葡萄糖变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:17,19,21和23的氨基酸序列的多肽。

14.根据权利要求6至12中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有葡萄糖变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。

15.含β-D-葡萄糖的混合物的发酵方法，该方法包括：

a）将含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽接触；

b）将含β-D-葡萄糖的混合物与细胞接触，其中含β-D-葡萄糖的混合物与细胞的接触在含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽的接触之后进行，或者两种接触同时进行；以及

c）在支持发酵的条件下孵化该细胞和含β-D-葡萄糖的混合物；且

其中，含β-D-葡萄糖的混合物与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽的接触导致：同未与具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种重组多肽接触的含β-D-葡萄糖的混合物的消耗情况相比，细胞在发酵过程中对含β-D-葡萄糖的混合物的消耗增加。

16.含β-D-葡萄糖的混合物的发酵方法，该方法包括：

a）提供宿主细胞，其中该宿主细胞包括编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；和

b）在培养基中培养该宿主细胞，以使编码该具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA表达出来，其中编码该具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的表达导致：与缺乏该编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞相比，该细胞对含β-D-葡萄糖的混合物的消耗增加。

17.根据权利要求15至16中任一项所述的方法，其特征在于，所述含β-D-葡萄糖的混合物通过纤维素的水解获得。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有葡萄糖变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:17,19,21和23的氨基酸序列的多肽。

19.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其特征在于，所述具有葡萄糖变旋酶活性的多肽为含有选自SEQ ID NOs:28-32的氨基酸序列的多肽。

20.一种宿主细胞，包括：

a）编码一种或多种纤维糊精转运子的重组DNA；

b）编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA；

其中，当在含纤维二糖的培养基中生长时，所述宿主细胞比缺乏所述编码具有葡萄糖变旋酶活性的一种或多种多肽的重组DNA的相应宿主细胞消耗更多的纤维二糖分子，其中该具有葡萄糖变旋酶活性的多肽含有选自SEQ ID NO:28和29的一种或两种氨基酸序列。

21.根据权利要求20所述的宿主细胞，其特征在于，所述具有葡萄糖变旋酶活性的多肽包含SEQ ID NOs:28和29的氨基酸序列。

22.根据权利要求20或21所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞还包括编码一种或多种β-葡萄糖苷酶的重组DNA。

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