JP6335161B2 - 細胞表層発現用ポリヌクレオチド - Google Patents

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Description

本発明は、細胞表層発現用ポリヌクレオチドに関し、より詳細には、高い活性で細胞表層に提示される酵素を有する酵母の作製を可能とする細胞表層発現用ポリヌクレオチドに関する。
近年、化石燃料の枯渇が危惧される中、その代替燃料の開発が進められている。中でもバイオマスに由来するバイオエタノールが注目されている。バイオマスは、再生可能な資源であり、地球上に大量に存在し、そして使用しても大気中の二酸化炭素が増えず（カーボンニュートラル）、地球温暖化防止に寄与できるからである。
ソフトバイオマスの主成分であるセルロース、ヘミセルロースなどを本来資化することができない発酵微生物を、生物工学的手法を用いて改変することにより、非食用炭素源から直接エタノールを発酵させる試みがなされている。
このような生物工学的手法として細胞表層提示技術が好適に利用されている。細胞表層提示としては、細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカータンパク質を利用する方法が挙げられる。このようなＧＰＩアンカータンパク質として、種々のタンパク質が知られている（例えば、特許文献１〜４および非特許文献１〜５）。他方、細胞表層提示技術におけるタンパク質発現には、プロモーターも関与し得る。酵母細胞において高いプロモーター活性を示すプロモーターとしては、酵母ＳＥＤ１プロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、およびＡＤＨ１プロモーターなどが知られている（例えば、特許文献２〜４）。
特開２０１１−１６０７２７号公報 特開２００８−８６３１０号公報 特開２００７−１８９９０９号公報 特開２００５−２４５３３５号公報 特開２０１１−３０５６３号公報
Biotechnol. Lett.，2010年，第３２巻，第1131-1136頁 Mol. Microbiol.，2004年，第５２巻，第1413-1425頁 Appl. Environmen. Microbiol.，1997年，第６３巻，第615-620頁 Biotechnol. Lett.，2010年，第３２巻，第255-260頁 J. Bacteriol.，1997年，第１７９巻，第1513-1520頁 Nature Methods，2009年，第６巻，第343-345頁 Yeast, 1998年, 第１４巻, 115-132頁 Appl. Microbiol. Biotechnol.，2006年，第７２巻，第1136-1143頁 Appl. Microbiol. Biotechnol.，2010年，第８５巻，第1491-1498頁 Enzyme Microb. Technol.，2012年，第５０巻，第343-347頁
本発明は、高い活性で細胞表層に提示される酵素を有する酵母の作製を可能とする細胞表層発現用ポリヌクレオチドを提供することを目的とする。
本発明は、細胞表層発現用ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが、プロモーター、分泌シグナル配列、目的タンパク質をコードする配列、および細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域をコードする配列を含み、該プロモーターが、該細胞表層局在タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターである、ポリヌクレオチドを提供する。
１つの実施形態では、上記細胞表層局在タンパク質はＳＥＤ１またはＣＷＰ２である。
本発明はまた、細胞表層発現用ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、プロモーター、分泌シグナル配列、目的タンパク質をコードする配列、および細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域をコードする配列を含み、該プロモーターおよび該細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域をコードする配列が、Ｓｅｄ１およびＣｗｐ２のいずれかの遺伝子に由来する、ポリヌクレオチドを提供する。
１つの実施形態では、上記プロモーターおよび上記細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域をコードする配列がともに、Ｓｅｄ１遺伝子に由来する；または上記プロモーターおよび上記細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域をコードする配列がともに、Ｃｗｐ２遺伝子に由来する。
本発明はさらに、上記細胞表層発現用ポリヌクレオチドを含む、発現ベクターを提供する。
本発明はさらに、上記細胞表層発現用ポリヌクレオチドまたは上記発現ベクターが導入された、形質転換酵母を提供する。
１つの実施形態では、上記形質転換酵母は、ＳＥＤ１およびＳＳＤ１からなる群より選択される少なくとも１つを欠損している宿主酵母から得られる。
さらなる実施形態では、上記形質転換酵母は、ＳＥＤ１およびＳＳＤ１を欠損している宿主酵母から得られる。
１つの実施形態では、上記形質転換酵母は、セルロース分解酵素およびデンプン分解酵素からなる群から選択される少なくとも１つの酵素を細胞表層提示する。
本発明はまた、エタノールを製造する方法であって、
上記形質転換酵母を発酵培養する工程を含む、方法を提供する。
本発明によれば、高活性にて酵素などのタンパク質が細胞表層に提示される酵母の作製を可能とする細胞表層発現用ポリヌクレオチドが提供される。このようなポリヌクレオチドが導入された酵母は、その細胞表層に高活性のタンパク質を発現することができる。
ＢＧＬ１遺伝子のＧａｐ−Ａｇα１形質転換株、Ｇａｐ−Ｓｅｄ１形質転換株、Ｓｅｄ１−Ａｇα１形質転換株、およびＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株の培養の際のβ−グルコシダーゼ活性の経時変化を示すグラフである。 ＥＧＩＩ遺伝子のＧａｐ−Ａｇα１形質転換株、Ｇａｐ−Ｓｅｄ１形質転換株、Ｓｅｄ１−Ａｇα１形質転換株、およびＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株の培養４８時間後のエンドグルカナーゼ活性を示すグラフである。 ＢＧＬ１遺伝子のＧａｐ−Ａｇα１形質転換株、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株、およびＣｗｐ２−Ｃｗｐ２形質転換株の培養の際のβ−グルコシダーゼ活性の経時変化を示すグラフである。 ＢＧＬ１遺伝子のＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株、Ｃｗｐ２−Ｃｗｐ２形質転換株、およびＳｅｄ１−Ｃｗｐ２形質転換株の培養の際のβ−グルコシダーゼ活性の経時変化を示すグラフである。 ＢＧＬ１遺伝子のＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１Δ株およびＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１株の培養の際のβ−グルコシダーゼ活性の経時変化を示すグラフである。 ＢＧＬ１遺伝子のＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＳＤ１Δ株およびＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１株の培養の際のβ−グルコシダーゼ活性の経時変化を示すグラフである。 ＢＧＬ１遺伝子のＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１株、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１Δ株、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＳＤ１Δ株、およびＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１ΔＳＳＤ１Δの培養の際のβ−グルコシダーゼ活性の経時変化を示すグラフである。 ＥＧＩＩ遺伝子のＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株、Ｇａｐ−Ａｇα１形質転換株および空ベクター導入株（表層提示なし）の発酵培養の際のエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。 α−アミラーゼ−グルコアミラーゼ遺伝子共発現型Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株の培養の際のα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ活性の経時変化を示すグラフである。 α−アミラーゼ−グルコアミラーゼ遺伝子共発現型Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株の生デンプンからのエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。
本発明について、以下、詳細に説明する。
細胞表層発現用ポリヌクレオチドは、プロモーター、分泌シグナル配列、目的タンパク質をコードする配列、および細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドである。
（細胞表層局在タンパク質およびその細胞膜結合領域）
「細胞表層局在タンパク質」は、細胞表層に固定化または付着もしくは接着し、そこに局在するタンパク質をいう。細胞表層局在タンパク質としては、脂質で修飾されたタンパク質が知られており、この脂質が膜成分と共有結合することにより細胞膜に固定される。本明細書中では、それらの役割から、「細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域」をまとめて、単に「アンカー」とも称する。
細胞表層局在タンパク質の代表例として、ＧＰＩ（glycosyl phosphatidyl inositol：エタノールアミンリン酸−６マンノースα−１，２マンノースα−１，６マンノースα−１，４グルコサミンα−１，６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質）アンカータンパク質を挙げることができる。ＧＰＩアンカータンパク質は、そのＣ末端に糖脂質であるＧＰＩを有しており、このＧＰＩが細胞膜中のＰＩ（phosphatidyl inositol）と共有結合することによって細胞膜表面に結合する。
ＧＰＩアンカータンパク質のＣ末端へのＧＰＩの結合は、以下のようにして行われる。ＧＰＩアンカータンパク質は、転写および翻訳の後、Ｎ末端側に存在する分泌シグナルの作用により小胞体内腔に分泌される。ＧＰＩアンカータンパク質のＣ末端またはその近傍の領域に、ＧＰＩアンカーがＧＰＩアンカータンパク質と結合する際に認識されるＧＰＩアンカー付着シグナルと呼ばれる領域が存在する。小胞体内腔およびゴルジ体において、このＧＰＩアンカー付着シグナル領域が切断され、新たに生じるＣ末端にＧＰＩが結合する。
ＧＰＩが結合したタンパク質は、分泌小胞により細胞膜まで運ばれ、ＧＰＩが細胞膜のＰＩに共有結合することにより、細胞膜に固定される。さらに、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣ（ＰＩ−ＰＬＣ）によりＧＰＩアンカーが切断され、細胞壁に組み込まれることにより細胞壁に固定された状態で、細胞表面に提示される。
本発明では、細胞表層局在タンパク質であるＧＰＩアンカータンパク質の全体、またはその細胞膜結合領域であるＧＰＩアンカー付着シグナル領域を含む領域をコードするポリヌクレオチドを用いることができる。細胞膜結合領域（ＧＰＩアンカー付着シグナル領域）は、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端側の領域である。細胞膜結合領域は、ＧＰＩアンカー付着シグナル領域を含んでいればよく、融合タンパク質の酵素活性を阻害しない限り、ＧＰＩアンカータンパク質のその他の任意の部分を含んでいてもよい。
ＧＰＩアンカータンパク質は、酵母細胞で機能するタンパク質であればよい。このようなＧＰＩアンカータンパク質としては、例えば、α−またはａ−アグルチニン（ＡＧα１、ＡＧＡ１）、ＴＩＰ１、ＦＬＯ１、ＳＥＤ１、ＣＷＰ１およびＣＷＰ２が挙げられ、ＳＥＤ１およびＣＷＰ２が好ましい。
ＳＥＤ１は、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の定常期における主要な細胞表層局在タンパク質である。本タンパク質は、ストレスによって誘導され、細胞壁の完全性（integrity）の維持に寄与すると考えられている。ＳＥＤ１の遺伝子（Ｓｅｄ１）は、例えば、GenBankに登録された配列情報に基づき、当業者が通常用いる方法を用いて入手することができる（GenBank accession number NM_001180385；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：８５１６４９）。Ｓｅｄ１のタンパク質コーディング領域の塩基配列を配列番号１に示し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＳＥＤ１の細胞膜結合領域（ＧＰＩアンカー付着シグナル領域）は、例えば、配列番号２の１１０位から３３８位を含む領域である。ＳＥＤ１をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列の全長をコードするポリヌクレオチドであっても、またはアンカー機能を損なわない限り、一部の配列（例えば、配列番号２の１１０位から３３８位のアミノ酸配列を含む配列）をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
ＣＷＰ２とは、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の細胞表層局在タンパク質である。ＣＷＰ２の遺伝子（Ｃｗｐ２）は、例えば、GenBankに登録された配列情報に基づき、当業者が通常用いる方法を用いて入手することができる（GenBank accession number NM_001180025；ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：８５３７６５）。Ｃｗｐ２のタンパク質コーディング領域の塩基配列を配列番号３に示し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。ＣＷＰ２の細胞膜結合領域（ＧＰＩアンカー付着シグナル領域）は、例えば、配列番号４の２６位から９２位を含む領域である。ＣＷＰ２をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸配列の全長をコードするポリヌクレオチドであっても、またはアンカー機能を損なわない限り、一部（例えば、配列番号４の２６位から９２位のアミノ酸配列を含む配列）をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
本明細書において、ポリヌクレオチドは、開示されたアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、本発明において所望の機能または効果を実質的に有するタンパク質をコードするものであってもよい。開示されるアミノ酸配列に対するアミノ酸の変異（例えば、欠失、置換もしくは付加）は、いずれか１種類であってもよいし、２種類以上が組み合わされていてもよい。また、これらの変異の総数は、特に限定されないが、例えば、１個以上１０個以下、または１個以上５個以下である。アミノ酸置換の例としては、各機能または効果を実質的に保持する限りにおいていずれの置換であってもよいが、例えば、保存的置換が挙げられ、保存的置換としては、具体的には以下のグループ内（すなわち、括弧内に示すアミノ酸間）での置換が挙げられる：（グリシン、アラニン）、（バリン、イソロイシン、ロイシン）、（アスパラギン酸、グルタミン酸）、（アスパラギン、グルタミン）、（セリン、トレオニン）、（リジン、アルギニン）、（フェニルアラニン、チロシン）。
他の実施形態としては、ポリヌクレオチドは、開示されるアミノ酸配列に対して、例えば、７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ本発明において所望の機能または効果を実質的に有するタンパク質をコードするものであってもよい。アミノ酸配列における配列同一性はまた、７４％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上であり得る。
本明細書において配列の同一性または類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。配列の「同一性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、「類似性」とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸または配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarityと称される。同一性および類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性および類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラム（例えば、Altschulら, J. Mol. Biol.，1990，215:403-410；Altschylら，Nucleic Acids Res., 1997，25:3389-3402）を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
さらに他の実施形態として、ポリヌクレオチドは、開示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするものが挙げられる。ストリンジェントな条件とは、例えば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち開示される塩基配列と例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が例えば、１５ｍＭ〜７５０ｍＭ、５０ｍＭ〜７５０ｍＭ、または３００ｍＭ〜７５０ｍＭ、温度が例えば、２５℃〜７０℃、５０℃〜７０℃、または５５℃〜６５℃、そしてホルムアミド濃度が例えば、０％〜５０％、２０％〜５０％、または３５％〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、ナトリウム塩濃度が例えば、１５ｍＭ〜６００ｍＭ、５０ｍＭ〜６００ｍＭ、または３００ｍＭ〜６００ｍＭ、そして温度が例えば５０℃〜７０℃、５５℃〜７０℃、または６０℃〜６５℃である。ハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd Ed,, Cold Spring Harbor Laboratory（2001）に記載されている方法などの周知の方法で行うことができる。温度が高いほど、または塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり、より相同性の高いポリヌクレオチドを単離できる。
さらなる他の実施形態として、ポリヌクレオチドは、開示される塩基配列と例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、７８％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９５％以上、９８％以上、または９９％以上の同一性を有する塩基配列を有し、かつその所望の機能または効果を実質的に有するポリヌクレオチドが挙げられる。
例えば、分泌シグナル配列−細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子−ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードする配列を有する配列において、この細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子の全部または一部の配列を、目的タンパク質をコードする配列に置換することができる。
細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）は、これらを有する微生物から、既知の配列情報に基づいてプライマーまたはプローブを設計してＰＣＲまたはハイブリダイゼーション法などによって取得し得る。また、上記ポリヌクレオチドを含む既存のベクターから、切り出して利用することもできる。あるいはポリヌクレオチドは、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
（分泌シグナル配列）
「分泌シグナル配列」は、分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列である。
分泌シグナルペプチドは、ペリプラズムを含む細胞外に分泌される分泌性タンパク質のＮ末端に通常結合しているペプチドである。このペプチドは、生物間で類似した構造を有しており、例えば２０個程度のアミノ酸からなり、Ｎ末端付近に塩基性アミノ酸配列を有し、その後に疎水性アミノ酸を多く含んでいる。分泌シグナルは、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際にシグナルペプチダーゼにより分解されることにより除去される。
本発明においては、目的タンパク質を酵母の細胞外に分泌させることができる分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であれば、どのようなものでも用いることができ、その起源は問わない。例えば、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）などのグルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）のグルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド、酵母サッカロマイセス・セレビシエのα−またはａ−アグルチニンの分泌シグナルペプチド、酵母サッカロマイセス・セレビシエのα因子の分泌シグナルペプチドなどをコードする配列を好適に用いることができる。特に、分泌効率の点で、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列が好ましい。また、アスペルギルス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列も好ましいものとして挙げられる。目的タンパク質が本来有する分泌シグナルペプチドをコードする配列を利用することもできる。
（プロモーター）
プロモーターは、プロモーター活性を有していればよく、「プロモーター活性」とは、プロモーター領域に転写因子が結合し、転写を惹起する活性をいう。プロモーターは、所望のプロモーター領域を保有する菌体、ファージなどから、制限酵素を用いて切り出し得る。必要に応じて制限酵素認識部位またはクローニングベクターとの重複部位を設けたプライマーを用い、ＰＣＲで所望のプロモーター領域を増幅することによりプロモーター領域のＤＮＡ断片を得ることができる。また、既に判明しているプロモーター領域の塩基配列情報をもとにして、所望のプロモーターを化学合成してもよい。
細胞表層発現用ポリヌクレオチドに含まれるプロモーターは、好ましくは、アンカーとして用いられる細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域の細胞表層局在タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターである、あるいは、該遺伝子が本来（ネイティブに）有するプロモーターである。すなわち、プロモーターとアンカー（細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域）とが同種の遺伝子に由来することが好ましい。
本発明において用いられるプロモーターとしては、Ｓｅｄ１およびＣｗｐ２のプロモーターが好ましい。Ｓｅｄ１およびＣｗｐ２のプロモーターの塩基配列はそれぞれ、例えば、GenBankのSaccharomyces cerevisiae S288c chromosome IV, complete sequence（GenBank accession number NC_001136）およびSaccharomyces cerevisiae S288c chromosome XI, complete sequence（GenBank accession number NC_001143）に記載されている。Ｓｅｄ１およびＣｗｐ２のプロモーターの塩基配列をそれぞれ配列番号５および６に示す。
例えば、細胞表層局在タンパク質がＳＥＤ１である場合、細胞表層局在タンパク質をコードする配列としてその遺伝子Ｓｅｄ１のコーディング領域を用い、かつプロモーターとしてその遺伝子Ｓｅｄ１のプロモーターを用いること、そして細胞表層局在タンパク質がＣＷＰ２である場合、細胞表層局在タンパク質をコードする配列としてその遺伝子Ｃｗｐ２のコーディング領域を用い、かつプロモーターとしてその遺伝子Ｃｗｐ２のプロモーターを用いることが好ましい（これらの場合、プロモーターとアンカーとが同種の遺伝子に由来する）。他方、Ｓｅｄ１のプロモーターについて、遺伝子Ｃｗｐ２のコーディング領域を用いてもよく、Ｃｗｐ２のプロモーターについて、遺伝子Ｓｅｄ１のコーディング領域を用いてもよい。上記コーディング領域およびプロモーターについて、目的の機能を果たすものであれば、上記のように、それらの塩基配列において、１または２以上（例えば数個）のヌクレオチドが欠失、付加または置換などの変異された塩基配列であってもよい。
（目的タンパク質をコードする配列）
目的タンパク質の種類、もしくはその起源は特に限定されない。目的タンパク質の種類として、例えば、酵素、抗体、リガンド、蛍光タンパク質などが挙げられる。酵素としては、例えば、セルロース分解酵素、デンプン分解酵素、グリコーゲン分解酵素、キシラン分解酵素、キチン分解酵素、脂質分解酵素などが挙げられ、より具体的には、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼ、アミラーゼ（例えば、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼ）、リパーゼなどが挙げられる。
目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、イントロンを除いたｃＤＮＡ配列が好ましい。
目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、その全長をコードする配列であってもよく、目的タンパク質の活性を示すものであれば目的タンパク質の一部領域をコードする配列であってもよい。また、上記のように、目的タンパク質の活性を示す限り、天然型タンパク質をコードする塩基配列において、１または２以上（例えば数個）のヌクレオチドが欠失、付加または置換などの変異を含む塩基配列であってもよく、あるいは１または２以上（例えば数個）アミノ酸が欠失、付加または置換などの変異を含むアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列であってもよい。
目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子）は、酵素を産生する微生物から、既知の配列情報に基づいてプライマーまたはプローブを設計してＰＣＲまたはハイブリダイゼーション法などによって取得し得る。また、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む既存のベクターから、好ましくはその発現カセットの形態で切り出して利用することもできる。
目的タンパク質の一例として、以下、セルロース分解酵素およびデンプン分解酵素を例に挙げて説明する。
セルロース分解酵素は、β１，４−グリコシド結合を切断し得る任意の酵素をいう。任意のセルロース加水分解酵素生産菌に由来し得る。セルロース加水分解酵素生産菌としては、代表的には、アスペルギルス属（例えば、アスペルギルス・アクレアタス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、およびアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）、トリコデルマ属（例えば、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)）、クロストリディウム属（例えば、クロストリディウム・テルモセラム(Clostridium thermocellum)、セルロモナス属（例えば、セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi)およびセルロモナス・ウダ(Cellulomonas uda)）、シュードモナス属（例えば、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescence)）などに属する微生物が挙げられる。
以下、代表的なセルロース分解酵素として、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼについて説明するが、セルロース分解酵素はこれらに限定されない。
エンドグルカナーゼは、通常、セルラーゼと称される酵素であり、セルロースを分子内部から切断し、グルコース、セロビオース、およびセロオリゴ糖を生じる（「セルロース分子内切断」）。エンドグルカナーゼには５種類あり、それぞれエンドグルカナーゼＩ、エンドグルカナーゼＩＩ、エンドグルカナーゼＩＩＩ、エンドグルカナーゼＩＶ、およびエンドグルカナーゼＶと称される。これらの区別は、アミノ酸配列の差異であるが、セルロース分子内切断作用を有する点では共通する。例えば、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼ（特に、エンドグルカナーゼＩＩ：ＥＧＩＩ（例えば、特許文献５））が用いられ得るが、これに限定されない。
セロビオヒドロラーゼは、セルロースの還元末端または非還元末端のいずれかから分解してセロビオースを遊離する（「セルロース分子末端切断」）。セロビオヒドロラーゼには２種類あり、それぞれセロビオヒドロラーゼＩおよびセロビオヒドロラーゼＩＩと称される。これらの区別は、アミノ酸配列の差異であるが、セルロース分子末端切断作用を有する点では共通する。例えば、トリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼ（特に、セロビオヒドロラーゼＩＩ：ＣＢＨＩＩ（例えば、特許文献５））が用いられ得るが、これに限定されない。
β−グルコシダーゼは、セルロースの非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素である（「グルコース単位切断」）。β−グルコシダーゼは、アグリコンまたは糖鎖とβ−Ｄ−グルコースとのβ１，４−グリコシド結合を切断し得、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解してグルコースを生成し得る。β−グルコシダーゼは、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素の代表例である。β−グルコシダーゼは現在、１種類知られており、β−グルコシダーゼ１と称される。例えば、アスペルギルス・アクレアタス由来β−グルコシダーゼ（特に、β−グルコシダーゼ１：ＢＧＬ１（例えば、非特許文献８））が用いられ得るが、これに限定されない。
セルロースの良好な加水分解のために、セルロース加水分解様式の異なる酵素を組み合わせることが好ましい。セルロース分子内切断、セルロース分子末端切断、およびグルコース単位切断などの種々の異なるセルロース加水分解様式で作用する酵素が適宜、組み合わされ得る。それぞれの加水分解様式を有する酵素の例として、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼが挙げられるがこれらに限定されない。セルロース加水分解様式の異なる酵素の組合せは、例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼからなる群から選択され得る。セルロースの構成糖であるグルコースを最終的に生産できることが望ましいので、グルコースを生成し得る酵素を少なくとも１つ含むことが好ましい。グルコースを生成し得る酵素としては、グルコース単位切断酵素（例えば、β−グルコシダーゼ）に加え、エンドグルカナーゼもグルコースを生成し得る。例えば、酵母において、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、およびセロビオヒドロラーゼを表層提示させ得る。
以下、代表的なデンプン分解酵素として、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼについて説明するが、デンプン分解酵素はこれらに限定されない。
グルコアミラーゼは、正式名称がグルカン１，４−α−グルコシダーゼといい、１，４−α−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ、エキソ１，４−α−グルコシダーゼ、γ−アミラーゼ、リソソーマルα−グルコシダーゼあるいはアミログルコシダーゼを別名とする。糖鎖の非還元末端のα−１，４−結合をエキソ型に加水分解してブドウ糖１分子を産生する。α−１，６−結合も切断するものも知られている。グルコアミラーゼは、リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来グルコアミラーゼ（例えば、非特許文献９）が挙げられるが、これに限定されない。
α−アミラーゼは、別名を１，４−α−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼ、グリコゲナーゼといい、デンプンやグリコーゲンのα−１，４−結合を不規則に切断し、多糖ないしマルトース、オリゴ糖を生み出す酵素である。動物、植物、微生物に広く分布する普遍的な酵素である。α−アミラーゼとしては、例えば、ストレプトコッカス・ボビス（Streptococcus bovis）由来α−アミラーゼ（例えば、非特許文献１０）が挙げられるが、これに限定されない。
デンプンの良好な加水分解のために、デンプン加水分解様式の異なる酵素を組み合わせることが好ましい。１つの実施形態では、酵母は、α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼを共に表層提示し得る。
（ターミネーター）
細胞表層発現用ポリヌクレオチドは、さらにターミネーターを含むことができる。
ターミネーターは、ターミネーター活性を有していればよく、「ターミネーター活性」とは、ターミネーター領域において転写を終結させる活性をいう。ターミネーターは、ターミネーター活性を有しさえすればよく、所望のターミネーター領域を保有する菌体、ファージなどから、制限酵素を用いて切り出し得る。必要に応じて制限酵素認識部位またはクローニングベクターの挿入部位を設けたプライマーを用い、ＰＣＲで所望のターミネーター領域を増幅することによりターミネーター領域のＤＮＡ断片を得ることができる。また、既に判明しているターミネーター領域の塩基配列情報をもとにして、所望のターミネーターを化学合成してもよい。
ターミネーターとしては、α−アグルチニンターミネーター、ＡＤＨ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ）ターミネーター、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）ターミネーターなどが挙げられる。
（細胞表層発現用ポリヌクレオチドの構築）
アンカー（細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域）をコードする配列を、分泌シグナル配列と共に所望の配置で、目的タンパク質をコードする配列（構造遺伝子）と連結し、この連結物をプロモーターの下流に配置する。細胞表層発現用ポリヌクレオチドは、例えば、目的タンパク質が発現されたときに、アンカー（細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域）のＮ末端に連結されるように、上記配列を配置させる。すなわち、目的タンパク質をコードする配列は、アンカーをコードする配列の５’側に位置する。さらに、目的タンパク質をコードする配列は分泌シグナル配列の下流に配置される。
上述の因子（プロモーター、分泌シグナル配列、目的タンパク質をコードする配列、およびアンカーをコードする配列）の連結物の下流にターミネーターを配置することができる。
各種配列を含むＤＮＡの合成および結合は、当業者が通常用い得る技術で行われ得る。例えば、分泌シグナル配列と目的タンパク質の構造遺伝子との結合は、部位特異的突然変異法、もしくはOne-step isothermal assembly（非特許文献６）を用いて行うことができる。これらの方法を用いることにより、正確な分泌シグナル配列の切断および活性な酵素の発現が可能である。
細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域をコードする配列と共に目的タンパク質（例えば、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、またはβ−グルコシダーゼ）をコードする領域（構造遺伝子）、分泌シグナル、およびプロモーターおよびターミネーターなどの発現調節配列を含む公知のプラスミドから、適宜、ベクターの調製に適した形態で切り出して、インサートを調製することによって利用することもできる。
（発現ベクター）
発現ベクターは、プラスミドベクターであってもよく、あるいは人工染色体であってもよい。酵母を宿主とする場合、ベクターの調製が容易であり、また酵母細胞の形質転換が容易である点で、プラスミドの形態が好ましい。ＤＮＡの取得の簡易化の点からは、酵母と大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましい。必要に応じて、ベクターは、調節配列（オペレーター、エンハンサーなど）を含み得る。このようなベクターは、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製開始点（Ｏｒｉ）とＣｏｌＥ１の複製開始点とを有しており、酵母選択マーカー（以下に説明）および大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子など）を有する。
酵母選択マーカーとしては、公知の任意のマーカーが利用され得る。例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子（例えば、イミダゾールグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ３）をコードする遺伝子、リンゴ酸ベータ−イソプロピルデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）をコードする遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）をコードする遺伝子、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＲＧ４）をコードする遺伝子、Ｎ−（５'−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）をコードする遺伝子、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ４）をコードする遺伝子、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）をコードする遺伝子、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＵＲＡ１）をコードする遺伝子、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）をコードする遺伝子、およびアルファ−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＬＹＳ２）をコードする遺伝子など）が挙げられる。例えば、栄養要求性マーカー遺伝子（例えば、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＵＲＡ１、ＴＲＰ１欠損マーカーなど）が好ましく用いられ得る。
（酵母）
宿主として用いる酵母は、子のう菌酵母（Ascomycetous yeast）に属するものであればよく、特に限定されない。その中でもサッカロマイセス科（Saccharomycetaceae）に属するものが好ましく、サッカロマイセス属（Saccharomyces）であるものがより好ましい。
本発明の酵母は、本発明のポリヌクレオチドまたは発現ベクターを宿主となる酵母に導入することにより得られる。「導入」とは、ポリヌクレオチドまたは発現ベクター中の発現を目的とする遺伝子が宿主細胞に導入されるだけでなく、宿主細胞で発現されることも含む。導入方法は特に限定されず、公知の方法を採用できる。代表的には、上記説明した本発明の発現ベクターを用いて酵母を形質転換する方法が挙げられる。形質転換方法は、特に限定されず、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、酢酸リチウム法、プロトプラスト法などのトランスフェクション法やマイクロインジェクション法のような公知の方法を制限なく使用できる。導入された遺伝子は、プラスミドの形態で存在してもよく、または酵母の染色体に挿入された形態あるいは酵母の染色体に相同組換えにより組み込まれた形態で存在してもよい。
本発明のポリヌクレオチドが導入された酵母は、常法に従い、酵母選択マーカーによる形質または目的タンパク質の活性などを指標として選択することができる。
また、得られた酵母の細胞表層に目的タンパク質が固定（細胞表層提示）されていることは、常法により確認することができる。例えば、被験酵母に、このタンパク質に対する抗体と、ＦＩＴＣのような蛍光標識２次抗体またはアルカリフォスファターゼのような酵素標識２次抗体などとを作用させる方法、このタンパク質に対する抗体とビオチン標識２次抗体とを反応させた後さらに蛍光標識ストレプトアビジンを作用させる方法などが挙げられる。
複数種のタンパク質を細胞表層発現するように、酵母を形質転換することもできる。この場合、複数種のタンパク質のそれぞれをコードする配列の遺伝子発現カセットを含むそれぞれの発現ベクターを構築してもよく、複数の遺伝子発現カセットを１つの発現ベクターに入れることもできる。例えば、δインテグレーションを利用することができる（特許文献５）。
１つの実施形態では、形質転換のための宿主として、例えば、ＳＥＤ１およびＳＳＤ１からなる群より選択される少なくとも１つを欠損している酵母が用いられる。好ましくはＳＥＤ１欠損酵母、より好ましくはＳＥＤ１およびＳＳＤ１二重欠損酵母が宿主として用いられる。ＳＥＤ１については、上述のとおりである。ＳＳＤ１は、ＳＥＤ１などの酵母のストレス応答遺伝子に対する負の制御因子である。ＳＳＤ１遺伝子について、ＮＣＢＩ遺伝子登録番号はＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：８５１８８７である（Genbank accession number NM_001180601.1）。サッカロマイセス・セレビシエに由来するＳＳＤ１遺伝子の塩基配列およびそのコードアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３８および３９に示す。
上記のＳＥＤ１およびＳＳＤ１からなる群より選択される少なくとも１つを欠損している欠損酵母は、例えば、宿主酵母におけるこれらのタンパク質をコードする遺伝子の破壊または発現を抑制することによって行われ得る。このような「欠損」の実施形態としては、正常タンパク質の生産量の抑制、および機能しない変異体タンパク質の生産もしくは促進が挙げられる。そのための遺伝子操作としては、トランスジェニック、遺伝子ノックアウト、ノックインなどが挙げられる。１つの実施形態では、例えば、ＳＥＤ１およびＳＳＤ１二重欠損酵母は、ＳＥＤ１遺伝子およびＳＳＤ１遺伝子の両遺伝子を破壊した二重破壊株である。
このような欠損酵母は、公知の遺伝子配列情報に基づいて適宜プライマー等を作製し、上記遺伝子操作を行うことによって作製してもよく、市販の欠損株を用いてもよい。市販の欠損株としては、例えば、酵母サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株（MATα his3 leu2 met15 ura3株）のYeast Knockout Collection（Open Biosystems社より入手）などが挙げられる。
（エタノールの製造方法）
本発明によるセルロース分解酵素およびデンプン分解酵素からなる群から選択される少なくとも１つの酵素を細胞表層提示する酵母は、エタノールの製造に用いられ得る。１つの実施形態では、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を細胞表層提示する酵母（本明細書中、「セルラーゼ細胞表層提示酵母」ともいう）である。このような酵母は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼからなる群から選択される２種の酵素；またはエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼを細胞表層提示する酵母であってもよい。別の実施形態では、α−アミラーゼおよび／またはグルコアミラーゼを細胞表層提示する酵母（本明細書中、「アミラーゼ細胞表層提示酵母」ともいう）である。酵母は、セルロース分解酵素およびデンプン分解酵素を共に表層提示するものであってよい。好ましくは、細胞表層発現用カセットとして、遺伝子Ｓｅｄ１のコーディング領域およびその遺伝子Ｓｅｄ１のプロモーターを含むカセットが用いられる。
セルラーゼ細胞表層提示酵母は、セルロースおよびその糖化物を発酵基質として利用し得る。アミラーゼ細胞表層提示酵母は、デンプンおよびその糖化物を発酵基質として利用し得る。セルロースおよびその糖化物を含む発酵基質、ならびにデンプンおよびその糖化物を含む発酵基質について、それらの入手源または材料として、例えば、バイオマスが挙げられる。バイオマスとは、枯渇性資源ではない、現生生物体構成物質起源の産業資源をいう。すなわち、バイオマスとは、再生可能な、生物由来の有機性資源から化石資源を除いたものをいう。バイオマスは、セルロースおよび／またはデンプンを含み得る。バイオマスとしては、特に限定されず、例えば、資源作物またはその廃棄物が挙げられる。資源作物としては、特に限定されず、例えば、トウモロコシ、サトウキビが挙げられ、さらに資源作物の廃棄物の例としては、これらの処理工程で発生する廃棄物が挙げられる。リグノセルロース系バイオマスは、食糧と競合しない点で好ましい材料である。リグノセルロース系バイオマスとしては、特に限定されず、例えば、イネ、ムギ、ススキ、ヨシなどのイネ科植物の食糧となる部位を除く部位（例えば、籾殻、根、茎、葉）、およびこれらの部位でなる製品から生じた廃棄物が挙げられる。
必要に応じて、発酵基質材料（例えば、バイオマス）を、発酵に供する前に前処理してもよい。このような前処理は、「糖化」により、バイオマス中の多糖類（例えば、セルロースおよび／またはデンプン）をオリゴ糖または単糖に分解し得る。前処理方法としては、特に限定されないが、例えば、酵素法、希硫酸法、水熱分解法が挙げられる。コストの点で、希硫酸法、水熱分解法が好ましい。希硫酸法では、例えば、１％（v/v）〜５％（v/v）の希硫酸で材料を１８０℃〜２００℃にて５分〜１時間程度処理する。水熱分解法では、例えば、１３０℃〜３００℃にて１０ＭＰａ程度の水で材料を処理する。
表層提示酵母は、発酵に供する前に好気的条件下で培養することにより、その菌体量を増加させ得る。形質転換酵母の培養は、当業者に周知の方法により適宜実施できる。培地のｐＨは、例えば４〜６、好ましくは５である。好気的培養時の培地中の溶存酸素濃度は、例えば０．５ｐｐｍ〜６ｐｐｍ、好ましくは１ｐｐｍ〜４ｐｐｍ、より好ましくは２ｐｐｍである。培養温度は、例えば２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３５℃、より好ましくは３０℃である。酵母菌体量が例えば１０ｇ（湿潤量）／Ｌ以上、好ましくは１２．５ｇ（湿潤量）／Ｌ、より好ましくは１５ｇ（湿潤量）／Ｌ以上になるまで培養することが好ましく、培養時間は例えば２４時間〜９６時間程度である。
発酵培養では、酵母に一般的に適用される培養条件を適宜選択して用いることができる。典型的には、発酵のための培養のために、静置培養、振とう培養または通気攪拌培養等を用いることができる。通気条件は、嫌気条件下、微好気条件下、および好気条件などから適宜選択することができる。培養温度は、例えば２５℃〜４５℃、好ましくは３０℃〜４０℃、より好ましくは３５℃である。培養時間は、必要に応じて任意の時間が設定され得、例えば２４時間〜１２０時間などの範囲内の培養時間に設定することができる。ｐＨの調整は、無機あるいは有機酸、アルカリ溶液などを用いて行うことができる。発酵培地には、発酵基質に加えて、酵母の培養のために添加され得る培地成分を必要に応じてさらに含めることもできる。
エタノール発酵終了後、培養液（発酵液）からエタノール含有画分を回収する工程、さらにこれを精製または濃縮する工程を実施することもできる。これらの工程およびそれらに要する手段は、当業者によって適宜選択される。
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
本実施例で用いた酵母サッカロマイセス・セレビシエのＢＹ４７４１株（非特許文献７）は、Invitrogen社より入手した。
本実施例に示す全てのＰＣＲ法には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製）を用いて実施した。
本実施例に示す全ての酵母への遺伝子導入は、酢酸リチウム法によって実施した。
（実施例１：細胞表層提示用発現カセットを含有するベクターおよびセルラーゼ表層提示用ベクターの調製）
サッカロマイセス・セレビシエ由来の細胞表層局在タンパク質遺伝子Ｓｅｄ１（以下、便宜上「ＳＥＤ１」ともいう）について、ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノムを鋳型とし、プライマー対（SED1a-XhoI-F（配列番号７）およびSED1a-BsrGI-R（配列番号８））を用いて増幅し、コーディング領域を含むＤＮＡ断片を調製した。この断片をXhoIおよびBsrGIで処理し、同様に処理したベクタープラスミドpIBG13（栄養要求性マーカー遺伝子ＨＩＳ３、およびＢＧＬ１発現カセット（すなわち、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼの分泌シグナルペプチド配列、ＢＧＬ１のコーディング領域、α−アグルチニン遺伝子の３’側の半分の領域（α−アグルチニン遺伝子のコーディング領域の９９１位から１９５３位までのヌクレオチドからなる領域）、およびコーディング領域下流４４５ｂｐのターミネーター領域がこの順に配置されているカセット）を有する表層発現用ベクター：非特許文献８）に連結した。得られたプラスミドをpIBG13Sと命名した。
サッカロマイセス・セレビシエ由来の細胞表層局在タンパク質遺伝子Ｓｅｄ１について、ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノムを鋳型とし、プライマー対SED1p-CBA-F（配列番号９）およびSED1p-CBA-R（配列番号１０）を用いて増幅し、プロモーター領域を含むＤＮＡ断片を調製した。この断片を、ベクタープラスミドpIBG13を鋳型とし、プライマー対pIBGvsp-CBA-F（配列番号１１）およびpIBGvsp-CBA-R（配列番号１２）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られたプラスミドをpISpBG13と命名した。
アスペルギルス・アクレアタス由来β−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）遺伝子、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼＩＩ（ＥＧＩＩ）遺伝子、およびトリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼＩＩ（ＣＢＨＩＩ）遺伝子の調製は、以下のように行った。
ＢＧＬ１、ＥＧＩＩ、およびＣＢＨＩＩ遺伝子の各遺伝子断片を、ＰＣＲ法により、それぞれpIBG13、pδU-PGAGEGII（α−アグルチニン遺伝子の３’側の半分の領域を有するＥＧＩＩの表層発現用ベクター：特許文献５）、およびpδU-PGAGCGHII（α−アグルチニン遺伝子の３’側の半分の領域を有するセロビオヒドロラーゼIIの表層発現用ベクター：特許文献５）を鋳型として、ＢＧＬ１用プライマー対（BGL1-NcoI-F（配列番号１３）およびBGL1-PG-R（配列番号１４））、ＥＧＩＩ用プライマー対（EGII-NcoI-F（配列番号１５）およびEGII-XhoI-R（配列番号１６））、およびＣＢＨＩＩ用プライマー対（CBHII-CBA-F（配列番号１７）およびCBHIIaa-CBA-R（配列番号１８）（Ａｇα１連結用）、またはCBHII-CBA-F（配列番号１７）およびCBHIIsa-CBA-R（配列番号１９）（ＳＥＤ１連結用））を用いて増幅することにより調製した。
Ａｇα１遺伝子のコーディング領域の３’側の半分の領域を含むＤＮＡ断片、およびＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ断片を、ＰＣＲ法により、それぞれpIBG13、およびサッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノムを鋳型とし、Ａｇα１用プライマー対（AGα1a-PG-F（配列番号２０）およびAGα1a-BsrGI-R（配列番号２１））、およびＳＥＤ１用プライマー対（SED1a-PG-F（配列番号２２）およびSED1a-BsrGI-R（配列番号８））を用いて増幅することにより調製した。
ＢＧＬ１遺伝子断片の下流に、Ａｇα１遺伝子のコーディング領域の３’側の半分の領域を含むＤＮＡ断片、またはＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ断片がインフレームになるように連結したＤＮＡ断片（それぞれBGL1-Agα1、およびBGL1-SED1）を、ＰＣＲ法により、それぞれＢＧＬ１遺伝子断片と、Agα1遺伝子のコーディング領域の３’側の半分の領域を含むＤＮＡ断片、またはＳＥＤ１遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ断片を混合したものを鋳型として、BGL1-Agα1用プライマー対（BGL1-NcoI-F（配列番号１３）およびAGα1a-BsrGI-R（配列番号２１））、およびBGL1-SED1用プライマー対（BGL1-NcoI-F（配列番号１３）およびSED1a-BsrGI-R（配列番号８））を用いて増幅することにより調製した。
BGL1-Agα1およびBGL1-SED1断片をそれぞれNcoIおよびBsrGIで処理し、同様に処理したプラスミドpIBG13に、分泌シグナルの下流にインフレームになるように連結した。得られたそれぞれのプラスミドをpIBG-PG-Agα1およびpIBG-PG-Sed1と命名した。
ＥＧＩＩ遺伝子断片をNcoIおよびXhoIで処理し、同様に処理したプラスミドpIBG13またはpIBG13Sに、分泌シグナルの下流にインフレームになるように連結した。得られたそれぞれのプラスミドをpIEG-Agα1およびpIEG-Sed1と命名した。
Ａｇα１連結用ＣＢＨＩＩ、またはＳＥＤ１連結用ＣＢＨＩＩ遺伝子断片を、それぞれベクタープラスミドpIBG13またはpIBG13Sを鋳型とし、プライマー対AGα1acb-CBA-F（配列番号２３）およびpIBGscb-CBA-R（配列番号２４）、またはSED1acb-CBA-F（配列番号２５）およびpIBGscb-CBA-R（配列番号２４）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られたプラスミドをpICB-Agα1およびpICB-Sed1と命名した。
BGL1-Agα1、BGL1-SED1、EGII-Agα1、およびEGII-Sed1断片を、それぞれpIBG-PG-Agα1、pIBG-PG-Sed1、pIEG-Agα1、およびpIEG-Sed1をNcoIおよびBsrGIで処理することにより調製し、同様に処理したプラスミドpISpBG13に、分泌シグナルの下流にインフレームになるように連結した。得られたそれぞれのプラスミドをpISpBG-PG-Agα1、pISpBG-PG-Sed1、pISpEG-Agα1、およびpISpEG-Sed1と命名した。
ＰＣＲ法により、pISpBG13を鋳型とし、プライマー対SED1p-CBA-F（配列番号９）およびSED1p-CBA-R（配列番号１０）を用いて増幅し、ＳＥＤ１遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を調製した。この断片を、プラスミドpICB-Sed1を鋳型とし、プライマー対pIBGvsp-CBA-F（配列番号１１）およびpIBGvsp-CBA-R（配列番号１２）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られたプラスミドをpISpCB-Sed1と命名した。
ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノムを鋳型とし、プライマー対NCRv-CBA-F（配列番号２６）およびNCRleu2-CBA-R（配列番号２７）を用いて増幅し、サッカロマイセス・セレビシエゲノム上の非コーディング領域を含むＤＮＡ断片を調製した。
ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノムを鋳型とし、プライマー対LEU2nc-CBA-F（配列番号２８）およびLEU2v-CBA-R（配列番号２９）を用いて増幅し、サッカロマイセス・セレビシエ由来Ｌｅｕ２遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。
プラスミドpICB-Agα1を鋳型とし、プライマー対pIBGvleu2-CBA-F（配列番号３０）およびpIBGvncr-CBA-R（配列番号３１）を用いて増幅した断片に、非コーディング領域を含むＤＮＡ断片、およびＬｅｕ２遺伝子を含むＤＮＡ断片を、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られたプラスミドをpINCCB-Agα1と命名した。
プラスミドpISpCB-Sed1を鋳型とし、プライマー対pIBGvleu2-CBA-F（配列番号３０）およびpIBGvncr-CBA-R（配列番号３１）を用いて増幅した断片に、非コーディング領域を含むＤＮＡ断片、およびＬｅｕ２遺伝子を含むＤＮＡ断片を、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られたプラスミドをpINCCB-Sed1と命名した。
サッカロマイセス・セレビシエ由来の細胞表層局在タンパク質遺伝子Ｃｗｐ２（以下、便宜上「ＣＷＰ２」ともいう）について、ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノムを鋳型とし、プライマー対CWP2pv-CBA-F（配列番号３２）およびCWP2ps-CBA-R（配列番号３３）を用いて増幅し、プロモーター領域を含むＤＮＡ断片を調製した。この断片を、プラスミドpISpBG-PG-Sed1を鋳型とし、プライマー対pIBGsc2p-CBA-F（配列番号３４）およびpIBGvc2p-CBA-R（配列番号３５）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られたプラスミドをpIC2BG-PG-Sed1と命名した。
サッカロマイセス・セレビシエ由来の細胞表層局在タンパク質遺伝子ＣＷＰ２について、ＰＣＲ法により、サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株ゲノムを鋳型とし、プライマー対CWP2a-PG-F（配列番号３６）およびCWP2a-BsrGI-R（配列番号３７）を用いて増幅し、コーディング領域を含むＤＮＡ断片を調製した。
ＢＧＬ１遺伝子断片の下流に、ＣＷＰ２遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ断片がインフレームになるように連結したＤＮＡ断片（BGL1-CWP2）を、ＰＣＲ法により、それぞれＢＧＬ１遺伝子断片と、ＣＷＰ２遺伝子のコーディング領域を含むＤＮＡ断片を混合したものを鋳型として、プライマー対BGL1-NcoI-F（配列番号１３）およびCWP2a-BsrGI-R（配列番号３７）を用いて増幅することにより調製した。
BGL1-CWP2断片をNcoIおよびBsrGIで処理し、同様に処理したプラスミドpISpBG-PG-Sed1、およびpIC2BG-PG-Sed1に、分泌シグナルの下流にインフレームになるように連結した。得られたそれぞれのプラスミドをpISpBG-PG-Cwp2、およびpIC2BG-PG-Cwp2と命名した。
（実施例２：セルラーゼ表層提示酵母の調製）
ＢＧＬ１、およびＥＧＩＩ遺伝子の各プラスミド（pIBG-PG-Agα1、またはpIEG-Agα1）をNdeIで処理し、それぞれ酵母サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株（MATα his3 leu2 met15 ura3株）に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。これらの形質転換株を各遺伝子のＧａｐ−Ａｇα１形質転換株と称する。
ＢＧＬ１、およびＥＧＩＩ遺伝子の各プラスミド（pIBG-PG-Sed1、またはpIEG-Sed1）をNdeIで処理し、それぞれ酵母サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株（MATα his3 leu2 met15 ura3株）に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。これらの形質転換株を各遺伝子のＧａｐ−Ｓｅｄ１形質転換株と称する。
ＢＧＬ１、およびＥＧＩＩ遺伝子の各プラスミド（pISpBG-PG-Agα1、またはpISpEG-Agα1）をNdeIで処理し、それぞれ酵母サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株（MATα his3 leu2 met15 ura3株）に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。これらの形質転換株を各遺伝子のＳｅｄ１−Ａｇα１形質転換株と称する。
ＢＧＬ１、およびＥＧＩＩ遺伝子の各プラスミド（pISpBG-PG-Sed1、またはpISpEG-Sed1）をNdeIで処理し、それぞれ酵母サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株（MATα his3 leu2 met15 ura3株）に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。これらの形質転換株を各遺伝子のＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株と称する。
ＢＧＬ１遺伝子の各プラスミド（pISpBG-PG-Cwp2、またはpIC2BG-PG-Cwp2）をNdeIで処理し、それぞれ酵母サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株（MATα his3 leu2 met15 ura3株）に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。これらの形質転換株をＢＧＬ１遺伝子のＳｅｄ１−Ｃｗｐ２、およびＣｗｐ２−Ｃｗｐ２形質転換株と称する。
ＣＢＨＩＩ遺伝子のプラスミド（pINCCB-Agα1）をNdeIで処理し、ＥＧＩＩ遺伝子のＧａｐ−Ａｇα１形質転換株（MATα leu2 met15 ura3株）に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。この形質転換株をＥＧＩＩ−ＣＢＨＩＩ遺伝子共発現型Ｇａｐ−Ａｇα１形質転換株と称する。
ＣＢＨＩＩ遺伝子のプラスミド（pINCCB-Sed1）をNdeIで処理し、ＥＧＩＩ遺伝子のＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株（MATα leu2 met15 ura3株）に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。この形質転換株をＥＧＩＩ−ＣＢＨＩＩ遺伝子共発現型Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株と称する。
細胞表層発現用ポリヌクレオチドを含まないベクタープラスミドpRS403（HIS3酵母発現ベクター：Agilent Technologies社）をNdeIで処理し、酵母サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株（MATα his3 leu2 met15 ura3株）に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。この形質転換株を空ベクター導入株と称する。
（実施例３：β−グルコシダーゼ活性の検討１）
ＢＧＬ１遺伝子のＧａｐ−Ａｇα１形質転換株、Ｇａｐ−Ｓｅｄ１形質転換株、Ｓｅｄ１−Ａｇα１形質転換株、およびＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株について、β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性を検討した。
菌体をＳＤ培地（ロイシン、メチオニン、およびウラシルを補充）５ｍＬに移植し、３０℃、１８０ｒｐｍにて１８時間培養し（前培養）、次いで１×ＹＰＤ培地５０ｍＬに移植し（初発ＯＤ６００＝０．０５）、３０℃、１５０ｒｐｍにて培養した（本培養）。本培養開始からの２４時間経過ごとに培養液をそれぞれ回収し、菌体のβ−グルコシダーゼ活性の測定は、以下のように行った：
（１）菌体を蒸留水で２回洗浄；
（２）反応液５００μＬ（組成：１０ｍＭ ｐＮＰＧ（ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド）１００μＬ（最終濃度２ｍＭ）；５００ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０） ５０μＬ（最終濃度５０ｍＭ）；蒸留水２５０μＬ；および酵母１００μＬ）（最終菌体濃度１〜１０ｇ湿潤菌体／Ｌ））を調製し、５００ｒｐｍ、３０℃にて１０分間反応；
（３）反応終了後、３Ｍ Ｎａ２ＣＯ３ ５００μＬを加え反応を停止；そして
（４）１０，０００ｇで５分間遠心後、上清の４００ｎｍにおける吸光度ＡＢＳ４００を測定。１分間で１μmolのｐＮＰ（ｐ−ニトロフェノール）を遊離する酵素量を１Ｕとする。
この結果を図１に示す。図１中の記号は以下の通りである：白丸、Ｇａｐ−Ａｇα１形質転換株（Ｇａｐ−Ａｇα１型）；白菱形、Ｇａｐ−Ｓｅｄ１形質転換株（Ｇａｐ−Ｓｅｄ１型）；白三角、Ｓｅｄ１−Ａｇα１形質転換株（Ｓｅｄ１−Ａｇα１型）；および白四角、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株（Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１型）。図１に示されるように、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株は、Ｇａｐ−Ａｇα１形質転換株、Ｇａｐ−Ｓｅｄ１形質転換株、およびＳｅｄ１−Ａｇα１形質転換株と比較して顕著に高いＢＧＬ活性を示すことが観察された。このように、Ｓｅｄ１（ＳＥＤ１）のプロモーターとアンカーとをセットで用いると相乗効果が生じ、個別に用いた場合に比べてＢＧＬ活性が大きく向上することが示される。
（実施例４：エンドグルカナーゼ活性の検討）
ＥＧＩＩ遺伝子のＧａｐ−Ａｇα１形質転換株、Ｇａｐ−Ｓｅｄ１形質転換株、Ｓｅｄ１−Ａｇα１形質転換株、およびＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株について、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）活性を検討した。
菌体をＳＤ培地（ロイシン、メチオニン、およびウラシルを補充）５ｍＬに移植し、３０℃、１８０ｒｐｍにて１８時間培養し（前培養）、次いで１×ＹＰＤ培地５０ｍＬに移植し（初発ＯＤ６００＝０．０５）、３０℃、１５０ｒｐｍにて培養した（本培養）。本培養開始からの４８時間後に培養液をそれぞれ回収し、菌体のエンドグルカナーゼ活性の測定は、以下のように行った：
（１）菌体を蒸留水で２回洗浄；
（２）反応液２５００μＬ（組成：セラザイムＣタブレット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ社製）１錠；５００ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０） ２５０μＬ（最終濃度５０ｍＭ）；蒸留水２０００μＬ；および酵母２５０μＬ（最終菌体濃度１０ｇ湿潤菌体／Ｌ））を調製し、静置、３８℃にて４時間反応；
（３）反応終了後、１０，０００ｇで５分間遠心後、上清の５９０ｎｍの吸光度ＡＢＳ５９０を測定。
この結果を図２に示す。図２中、横軸は左から順にＧａｐ−Ａｇα１形質転換株（Ｇａｐ−Ａｇα１）、Ｇａｐ−Ｓｅｄ１形質転換株（Ｇａｐ−Ｓｅｄ１）、Ｓｅｄ１−Ａｇα１形質転換株（Ｓｅｄ１−Ａｇα１）、およびＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株（Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１）の結果を示し、縦軸は５９０ｎｍでの吸光度を示す。図２に示されるように、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株は、Ｇａｐ−Ａｇα１形質転換株、Ｇａｐ−Ｓｅｄ１形質転換株、およびＳｅｄ１−Ａｇα１形質転換株と比較して顕著に高いＥＧ活性を示すことが観察された。このように、ＥＧにおいても、Ｓｅｄ１（ＳＥＤ１）のプロモーターとアンカーとをセットで用いると相乗効果が生じ、個別に用いた場合に比べて活性が大きく向上することが示される。
（実施例５：β−グルコシダーゼ活性の検討２）
ＢＧＬ１遺伝子のＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株、Ｇａｐ−Ａｇα１形質転換株、およびＣｗｐ２−Ｃｗｐ２形質転換株について、実施例３と同様にして、β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性を検討した。
この結果を図３に示す。図３中の記号は以下の通りである：白丸、Ｇａｐ−Ａｇα１形質転換株（Ｇａｐ−Ａｇα１型）；白四角、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株（Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１型）；および白三角、Ｃｗｐ２−Ｃｗｐ２形質転換株（Ｃｗｐ２−Ｃｗｐ２型）。図３に示されるように、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株においてＧａｐ−Ａｇα１形質転換株と比較して顕著に高いＢＧＬ活性が見られただけではなく、Ｃｗｐ２−Ｃｗｐ２形質転換株においてもこのようなＢＧＬ活性の顕著な増大が観察された。このように、同種の遺伝子に由来するアンカーとプロモーターとをセットで用いることによる活性向上効果は、Ｓｅｄ１のセットを用いた場合に限定されず、Ｃｗｐ２（ＣＷＰ２）など他の細胞表層局在タンパクのセットを用いた場合にも見られた。
（実施例６：水熱処理稲ワラ加水分解の検討）
ＥＧＩＩ−ＣＢＨＩＩ遺伝子共発現型Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株、ＥＧＩＩ−ＣＢＨＩＩ遺伝子共発現型Ｇａｐ−Ａｇα１形質転換株、および空ベクター導入株について、水熱処理稲ワラ加水分解に対する効果を検討した。
菌体をＳＤ培地（メチオニン、およびウラシルを補充）１０ｍＬに移植し、３０℃、１８０ｒｐｍにて１８時間培養し（前培養）、次いで１×ＹＰＤ培地５００ｍＬに移植し（初発ＯＤ６００＝０．０５）、３０℃にて静置培養した（本培養）。本培養開始からの４８時間後に培養液をそれぞれ回収し、菌体を蒸留水で２回洗浄し、加水分解処理に用いた。
稲ワラを１３０〜３００℃、１０ＭＰａ程度の水にて処理し、固形分を回収したものを水熱処理稲ワラとして用いた。
加水分解処理は、以下の条件下で行った：
水熱処理稲ワラ １００ｇ乾燥重／Ｌ
酵母エキス １０ｇ／Ｌ
ペプトン ２０ｇ／Ｌ
クエン酸ナトリウム緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ５．０）
酵母菌体 １００ｇ湿潤菌体重量／Ｌ
合計 １０ｍＬ
上記を回転式発酵装置に入れ、市販酵素剤を添加せずに、３８℃、３５ｒｐｍ、９６時間反応させた。
空ベクター導入株（表層提示なし）では９６時間後も水熱処理稲ワラに変化は見られなかった。ＥＧＩＩ−ＣＢＨＩＩ遺伝子共発現型Ｇａｐ−Ａｇα１形質転換株では４８時間以降に徐々に加水分解にともなう流動性の上昇が見られた。ＥＧＩＩ−ＣＢＨＩＩ遺伝子共発現型Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株では１５時間で大幅な流動性の上昇が見られた。このようなＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株によれば、水熱処理稲ワラを加水分解し、流動性を大きく上昇させることができた。
（実施例７：β−グルコシダーゼ活性の検討３）
ＢＧＬ１遺伝子のＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株、Ｃｗｐ２−Ｃｗｐ２形質転換株、およびＳｅｄ１−Ｃｗｐ２形質転換株について、実施例３と同様にして、β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性を検討した。
この結果を図４に示す。図４中の記号は以下の通りである：白四角、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株（Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１型）；白三角、Ｃｗｐ２−Ｃｗｐ２形質転換株（Ｃｗｐ２−Ｃｗｐ２型）；および黒三角、Ｓｅｄ１−Ｃｗｐ２形質転換株（Ｓｅｄ１−Ｃｗｐ２型）。図４に示されるように、Ｓｅｄ１−Ｃｗｐ２形質転換株では、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株およびＣｗｐ２−Ｃｗｐ２形質転換株ほどの活性増大は見られなかったが、Ｇａｐ−Ａｇα１形質転換株と比較して活性の増大が観察された。
（実施例８：ＳＥＤ１遺伝子破壊株における表層提示β−グルコシダーゼ活性の検討）
本実施例では、ＢＹ４７４１株およびそのＳＥＤ１遺伝子破壊株（ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１Δ株）のそれぞれについて、遺伝子Ｓｅｄ１のコーディング領域およびプロモーターを用いて調製したβ−グルコシダーゼ細胞表層提示酵母のβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性を検討した。
ＢＹ４７４１株およびＢＹ４７４１ ＳＥＤ１Δ株のそれぞれについて、上記実施例２に記載のように、ＢＧＬ１遺伝子のプラスミドpISpBG-PG-Sed1を用いて形質転換した。なお、ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１Δ株は、Yeast Knockout Collection Parental Strain - BY4741（Open Biosystems社）から入手した。得られたそれぞれの形質転換株、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１Δ株およびＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１株について、実施例３と同様にして、β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性を検討した。
この結果を図５に示す。図５中の記号は以下の通りである：黒丸、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１Δ株（ＳＥＤ１Δ株）；および黒四角、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１株（ＢＹ４７４１株）。図５に示されるように、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１Δ株では、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１株と比較して表層ＢＧＬ活性の最大値が上昇し、特に培養７２時間以降のＢＧＬ活性が顕著に増大していた。
（実施例９：ＳＳＤ１遺伝子破壊株における表層提示β−グルコシダーゼ活性の検討）
本実施例では、ＢＹ４７４１株およびそのＳＳＤ１遺伝子破壊株（ＢＹ４７４１ ＳＳＤ１Δ株）のそれぞれについて、遺伝子Ｓｅｄ１のコーディング領域およびプロモーターを用いて調製したβ−グルコシダーゼ細胞表層提示酵母のβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性を検討した。
ＢＹ４７４１株およびＢＹ４７４１ ＳＳＤ１Δ株のそれぞれについて、実施例２に記載のように、ＢＧＬ１遺伝子のプラスミドpISpBG-PG-Sed1を用いて形質転換した。なお、ＢＹ４７４１ ＳＳＤ１Δ株は、Yeast Knockout Collection Parental Strain - BY4741（Open Biosystems社）から入手した。得られたそれぞれの形質転換株、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＳＤ１Δ株およびＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１について、実施例３と同様にして、β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性を検討した。
この結果を図６に示す。図６中の記号は以下の通りである：黒三角、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＳＤ１Δ株（ＳＳＤ１Δ株）；および黒四角、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１株（ＢＹ４７４１株）。図６に示されるように、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＳＤ１Δ株では、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１株と比較して、表層ＢＧＬ活性の最大値に大きな上昇は見られなかったものの、培養４８時間後のＢＧＬ活性がやや向上していた。さらに、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＳＤ１Δ株では、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１株と比較して、培養４８時間後では１．１６倍、９６時間後では１．２６倍に増大しており、培養によって得られた菌体が持つＢＧＬ活性の総量が大きく増大した。
（実施例１０：二重破壊株における表層提示β−グルコシダーゼ活性の検討）
本実施例では、ＢＹ４７４１株についてＳＥＤ１遺伝子およびＳＳＤ１遺伝子の両遺伝子を破壊した株（二重破壊株）を、ＢＹ４７４１株、ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１Δ株およびＢＹ４７４１ ＳＳＤ１Δ株とともに、遺伝子Ｓｅｄ１のコーディング領域およびプロモーターを用いて調製したβ−グルコシダーゼ細胞表層提示酵母のβ−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性について検討した。
Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１株の二重破壊株を、以下のように調製した。ＰＣＲ法により、プラスミドpTEF1/Zeo（Invitrogen社より入手）を鋳型とし、プライマー対SED1d-zeo-F1（配列番号４０）およびSED1d-zeo-R1（配列番号４１）を用いて、ゼオシン耐性遺伝子を含み、かつ両端にそれぞれＳＥＤ１遺伝子の上流および下流の領域と相同性を持つ３０ｂの配列を付与された約１．１ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。さらに、この断片を鋳型とし、プライマー対SED1d-zeo-F2（配列番号４２）およびSED1d-zeo-R2（配列番号４３）を用いて再度ＰＣＲ法による増幅を行い、ゼオシン耐性遺伝子を含み、かつ両端にそれぞれＳＥＤ１遺伝子の上流および下流の領域と相同性を持つ８０ｂの配列を付与された約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片を、上記実施例９で得られたＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＳＳＤ１Δ株に供し、酢酸リチウム法により形質転換し、ゼオシン耐性の株を選抜して、ＳＥＤ１およびＳＳＤ１についての二重破壊株を獲得した。この獲得した形質転換株をＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１ΔＳＳＤ１Δ株と称する。
Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１株、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１Δ株、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＳＤ１Δ株、およびＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１ΔＳＳＤ１Δ株について、実施例３と同様にして、β−グルコシダーゼ（ＢＧＬ）活性を検討した。
この結果を図７に示す。図７中の記号は以下の通りである：白菱形、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１株（ＢＹ４７４１）；黒四角、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１Δ株（ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１Δ）；黒三角、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＳＤ１Δ株（ＢＹ４７４１ ＳＳＤ１Δ）；および黒丸、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１ΔＳＳＤ１Δ株（ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１ΔＳＳＤ１Δ）。図７に示されるように、二重破壊株を宿主としてＳＥＤ１型表層提示カセットを発現させた場合（Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１ΔＳＳＤ１Δ株）、ＳＥＤ１の単独破壊株が宿主の場合（Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１Δ株）を上回る表層ＢＧＬ活性の最大値および上昇速度が見られた。さらに得られる菌体量についても、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１ΔＳＳＤ１Δ株では、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１株と比較して４８時間後では１．１０倍、９６時間後では１．２０倍に増大し、ＳＳＤ１の単独破壊株が宿主の場合（Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換ＢＹ４７４１ ＳＥＤ１Δ株）と実質的に同様の効果が見られた。
（実施例１１：エタノール生産能の検討）
ＥＧＩＩ遺伝子のＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株およびＧａｐ−Ａｇα１形質転換株について、エタノール生産能を検討した。
本実施例では、ＥＧＩＩ遺伝子を細胞表層発現させた２種のＥＧＩＩ表層提示株、すなわちＥＧＩＩ表層提示Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株およびＥＧＩＩ表層提示Ｇａｐ−Ａｇα１形質転換株、ならびに空ベクター導入株（表層提示なし）を用いた。本検討は、発酵培養のために以下の組成の培養液を用いた以外は、実施例６の手順に従い、実施した：
水熱処理稲ワラ １００ｇ乾燥重／Ｌ
酵母エキス １０ｇ／Ｌ
ペプトン ２０ｇ／Ｌ
クエン酸ナトリウム緩衝液 ５０ｍＭ（ｐＨ５．０）
酵母菌体 １００ｇ湿潤菌体重量／Ｌ
酵素剤（Ｃｔｅｃ２：Novozymes社製）１ＦＰＵ／１０ｍＬ
合計 １０ｍＬ
この結果を図８に示す。図８中の記号は以下の通りである：黒丸、ＥＧＩＩ表層提示Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株（Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１型）；黒三角、ＥＧＩＩ表層提示Ｇａｐ−Ａｇα１形質転換株（Ｇａｐ−Ａｇα１型）；および黒四角、空ベクター導入株（表層提示なし）。図８に示されるように、ＥＧＩＩ表層提示Ｇａｐ−Ａｇα１形質転換株では、表層提示なしの空ベクター導入株と比較して水熱処理稲ワラの同時糖化発酵おけるエタノール生産速度および収率に大きな差が見られなかったのに対し、Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株では、これらが顕著に増大した。
（実施例１２：アミラーゼ表層提示用ベクターの調製）
リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子、およびストレプトコッカス・ボビス由来α−アミラーゼ遺伝子の調製は、以下のように行った。
グルコアミラーゼ遺伝子断片を、ＰＣＲ法により、pδU-PGGluRAG（α−アグルチニン遺伝子の３’側の半分の領域を有するグルコアミラーゼの表層発現用ベクター：非特許文献９）を鋳型として、プライマー対pIBGvsp-CBA-F（配列番号１１）およびGA-CBA-R（配列番号４４）を用いて増幅することにより調製した。
酵母サッカロマイセス・セレビシエのα因子の分泌シグナルペプチドをコードする断片およびストレプトコッカス・ボビス由来α−アミラーゼ遺伝子を含む遺伝子断片を、ＰＣＲ法により、pUPGSBAAG（α−アグルチニン遺伝子の３’側の半分の領域を有するα−アミラーゼの表層発現用ベクター：非特許文献１０）を鋳型として、α−アミラーゼ用プライマー対AA-CBA-F（配列番号４５）およびAA-CBA-R（配列番号４６）を用いて増幅することにより調製した。
グルコアミラーゼ遺伝子、またはα因子分泌シグナルペプチドコード断片およびα−アミラーゼ遺伝子を含む遺伝子断片を、それぞれベクタープラスミドpINCCB-Sed1またはpISpBG-PG-Sed1を鋳型とし、プライマー対SED1aga-CBA-F（配列番号４７）およびSED1p-CBA-R（配列番号１０）、またはSED1aaa-CBA-F（配列番号４８）およびSED1p-CBA-R2（配列番号４９）を用いて増幅した断片と、One-step isothermal assemblyにより連結した。得られたプラスミドをpINCGA-Sed1およびpISpAA-Sed1と命名した。
（実施例１３：アミラーゼ表層提示酵母の調製）
α−アミラーゼ遺伝子のプラスミド（pISpAA-Sed1）をNdeIで処理し、酵母サッカロマイセス・セレビシエＢＹ４７４１株（MATα his3 leu2 met15 ura3株）に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。この形質転換株をα−アミラーゼ遺伝子のＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株と称する。
グルコアミラーゼ遺伝子のプラスミド（pINCGA-Sed1）をNdeIで処理し、α−アミラーゼ遺伝子のＳｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株（MATα leu2 met15 ura3株）に供し、酢酸リチウム法により形質転換した。この形質転換株をα−アミラーゼ−グルコアミラーゼ遺伝子共発現型Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株と称する。
（実施例１４：α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ活性の検討）
α−アミラーゼ−グルコアミラーゼ遺伝子共発現型Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株について、α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ活性を検討した。
菌体をＳＤ培地（メチオニン、およびウラシルを補充）５ｍＬに移植し、３０℃、１８０ｒｐｍにて１８時間培養し（前培養）、次いで１×ＹＰＤ培地５０ｍＬに移植し（初発ＯＤ６００＝０．０５）、３０℃、１５０ｒｐｍにて培養した（本培養）。本培養開始からの２４時間経過ごとに培養液をそれぞれ回収し、菌体を蒸留水で２回洗浄した。菌体のα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ活性の測定は、それぞれα−アミラーゼ測定キット（キッコーマン株式会社製）および糖化力測定キット（キッコーマン株式会社製）を用いて、ｐＨ５．０、３７℃にて行った。
この結果を図９に示す。図９中、白菱形はα−アミラーゼ活性測定の結果を示し、白四角はグルコアミラーゼ活性測定の結果を示す。図９に示されるように、α−アミラーゼ−グルコアミラーゼ遺伝子共発現型Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株は、高いα−アミラーゼ活性とグルコアミラーゼ活性を同時に示すことが観察された。このように、デンプン分解酵素（α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ）においても、セルロース分解酵素（エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼ）と同様の細胞表層提示が可能であることが示された。
（実施例１５：デンプン同時糖化発酵の検討）
α−アミラーゼ−グルコアミラーゼ遺伝子共発現型Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株について、生デンプンからのエタノール生産能を検討した。
菌体をＳＤ培地（メチオニン、およびウラシルを補充）１０ｍＬに移植し、３０℃、１８０ｒｐｍにて１８時間培養し（前培養）、次いで１×ＹＰＤ培地５００ｍＬに移植し（初発ＯＤ６００＝０．０５）、３０℃、１５０ｒｐｍにて培養した（本培養）。本培養開始からの７２時間後に培養液を回収し、菌体を蒸留水で２回洗浄し、同時糖化発酵に用いた。
とうもろこし由来デンプン（和光純薬工業株式会社製）を生デンプンとして用いた。
加水分解処理は、以下の条件下で行った：
生デンプン ２００ｇ乾燥重／Ｌ
酵母エキス １０ｇ／Ｌ
ペプトン ２０ｇ／Ｌ
酵母菌体 ５０ｇ湿潤菌体重量／Ｌ
合計 ５ｍＬ
上記を回転式発酵装置に入れ、市販酵素剤を添加せずに、３０℃、３５ｒｐｍ、１２０時間反応させた。
この結果を図１０に示す。α−アミラーゼ−グルコアミラーゼ遺伝子共発現型Ｓｅｄ１−Ｓｅｄ１形質転換株によれば、市販酵素剤を添加することなく酵母菌体のみで生デンプンを加水分解し、直接エタノールに変換することができた。
高活性にて酵素などのタンパク質が細胞表層に提示される酵母の作製を可能とする細胞表層発現用ポリヌクレオチドが提供される。このようなポリヌクレオチドが導入された酵母は、その細胞表層に高活性のタンパク質を発現することができる。例えば、タンパク質がセルロース分解酵素の場合、セルロース系バイオマスからのバイオ燃料（エタノール、ブタノール、イソプレノイドなど）や化学品ポリマー原料（イソプロパノール、アミノ酸、有機酸、キノン類など）の生産に応用することができる。バイオマスの有効利用は、環境への負荷を低減するだけでなく、化石資源の利用によるＣＯ２排出を抑制することが期待できる。

Claims (7)

  1. 細胞表層発現用ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、プロモーター、分泌シグナル配列、目的タンパク質をコードする配列、および細胞表層局在タンパク質またはその細胞膜結合領域をコードする配列をこの順番で含み、該プロモーターが、該細胞表層局在タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターであり、該細胞表層局在タンパク質がＳＥＤ１である、ポリヌクレオチド。
  2. 請求項１に記載の細胞表層発現用ポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
  3. 請求項１に記載の細胞表層発現用ポリヌクレオチドまたは請求項２に記載の発現ベクターが導入された、形質転換酵母。
  4. ＳＥＤ１およびＳＳＤ１からなる群より選択される少なくとも１つを欠損している宿主酵母から得られる、請求項３に記載の形質転換酵母。
  5. ＳＥＤ１およびＳＳＤ１を欠損している宿主酵母から得られる、請求項４に記載の形質転換酵母。
  6. セルロース分解酵素およびデンプン分解酵素からなる群から選択される少なくとも１つの酵素を細胞表層提示する、請求項３から５のいずれかに記載の形質転換酵母。
  7. エタノールを製造する方法であって、
    請求項６に記載の形質転換酵母を発酵培養する工程を含む、方法。
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