KR102268749B1 - 히스타민 결합 단백질 및 효모 표면 발현 단백질을 포함하는 재조합 효모 - Google Patents
히스타민 결합 단백질 및 효모 표면 발현 단백질을 포함하는 재조합 효모 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 히스타민 결합 단백질 및 효모 표면 발현 단백질을 포함하는 재조합 효모에 관한 것이다.
Description
본 발명은 히스타민 결합 단백질 및 효모 표면 발현 단백질을 포함하는 재조합 효모에 관한 것이다.
히스타민은 즉각적이고 신속한 반응이 필요할 때 주로 분비되는 면역 매개체이다. 이 히스타민은 우리 몸에서 정상적으로 조절될 때 문제가 되지 않지만, 과다 분비되거나 히스타민을 분해하는 효소가 부족하면 체내의 자가 면역 질환을 매개하는 부작용을 일으킬 수 있다. 특히, 아토피 및 건선과 같은 피부 질환에서, 이러한 히스타민의 작용은 종종 혈관 확장 및 피부 신경 자극을 매개하여 가려움증을 유발한다.
항히스타민제는 G 단백질 연결 수용체 (GPCR)의 한 유형인 히스타민 수용체에 결합하고, 이를 비활성화시키는 길항제이다. 히스타민 수용체는 활성화 및 비활성화의 두 가지 형태로 변환되고, 히스타민 수용체는 활성화 된 경우에만 작동 할 수 있다. 현재, 항히스타민제 중에서 H1 및 H2 수용체 억제제가 임상적으로 사용되고 있다. H1 항히스타민제는 널리 사용되며 위장관 감염 및 알레르기 질환뿐만 아니라 구토 안정화, 진정 및 진통에도 사용된다. 특히 H1 항히스타민제는 알레르기성 비염, 두드러기, 과민증, 아토피성 피부염 및 천식과 같은 알레르기 증상의 완화를 위해 처방된다. 항히스타민제는 증상에 대한 근본적인 해결책은 아니지만, 알레르기 증상을 완화하고 삶의 질을 향상시키는 데 사용된다. 항히스타민제는 주로 알약으로 섭취되며 소화관을 통해 흡수되어 몸 전체에 퍼진다. 따라서 항히스타민제는 히스타민 수용체를 억제시켜 히스타민으로 인한 부작용을 억제한다. 하지만 항히스타민은 히스타민 수용체 외에 다른 수용체에 작용하여 졸음, 피로, 기억 상실 및 주의력 결핍과 같은 중추 신경계 부작용과 변비, 설사, 구역 및 구토와 같은 소화 장애를 유발한다.
흡혈 진드기의 경우 흡혈 시 숙주 동물의 면역반응을 억제시키기 위하여 히스타민 결합 단백질(Histamine binding protein, HBP)을 분비한다. 분비된 단백질은 히스타민을 내부에 가두어 히스타민 수용체에 결합하지 못하도록 막는 특징을 가지고 있다. 부작용이 있는 항히스타민제를 대체하기 위해, 흡혈 진드기에 의해 분비되는 히스타민 결합 단백질(Histamine Binding Protein, HBP)을 사용한다.
이에, 본 발명자들은 히스타민 결합 단백질을 대량으로 생산하기 위해, 효모 표면에서 발현하는 히스타민 결합 재조합 단백질을 개발하기 위해 노력한 결과, 히스타민 결합 단백질 및 효모 표면 발현 단백질을 코딩하는 유전자를 하나의 벡터에 도입하여 발현시킨 결과, 효모의 표면에서 히스타민 결합 단백질이 생산되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 히스타민 결합 단백질 (histamine binding protein; HBP), 효모 표면 발현 단백질 (Cwp2p2) 및 효모 표면 발현 단백질 (Cwp2p2)의 신호 펩타이드를 포함하는, 히스타민 결합 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터가 형질 전환된 효모를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터가 형질 전환된 효모를 포함하는 히스타민 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 히스타민 결합 단백질 (histamine binding protein; HBP), 효모 표면 발현 단백질 (Cwp2p2) 및 효모 표면 발현 단백질 (Cwp2p2)의 신호 펩타이드를 포함하는, 히스타민 결합 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
상기 벡터는 pYES 2일 수 있다.
상기 히스타민 결합 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 효모 표면 발현 단백질을 코딩하는 유전자는 염기서열 2의 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 벡터가 형질 전환된 효모를 제공할 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 벡터가 형질 전환된 효모를 포함하는 히스타민 억제용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 히스타민 결합 단백질 및 효모 발현 단백질을 포함하는 재조합 단백질은 히스타민과 결합하여, 히스타민에 의한 질환을 치료하는 효과를 기대할 수 있다.
도 1은 본 발명의 효모 균주 표면에 히스타민 결합 단백질이 발현 벡터의 개열 지도이다.
도 2는 MBTL-GWL-1 벡터가 발현됐을 시 재조합 효모 균주의 표면을 나타낸 모식도이다.
도 3은 형질전환된 효모 내 히스타민 결합 단백질을 1차 항체를 재조합 효모에 부착한 한 뒤, 1차 항체에만 부착되는 형광이 달려있는 2차 항체를 부착 시킨 뒤, 형광 현미경으로 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 히스타민 결합 단백질이 발현된 GWL-1과 1000 ppm 히스타민 수용액을 단순 교반으로 반응시킨 후 LC/MS 분석을 통해 히스타민 농도를 분석한 결과이다.
도 5는 초음파 분쇄를 통해 재조합 효모 균주를 파쇄시키고 1000 ppm 히스타민 수용액과 단순 교반으로 반응시킨 후 LC/MS 분석을 통해 히스타민 농도를 분석한 결과이다.
도 2는 MBTL-GWL-1 벡터가 발현됐을 시 재조합 효모 균주의 표면을 나타낸 모식도이다.
도 3은 형질전환된 효모 내 히스타민 결합 단백질을 1차 항체를 재조합 효모에 부착한 한 뒤, 1차 항체에만 부착되는 형광이 달려있는 2차 항체를 부착 시킨 뒤, 형광 현미경으로 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 히스타민 결합 단백질이 발현된 GWL-1과 1000 ppm 히스타민 수용액을 단순 교반으로 반응시킨 후 LC/MS 분석을 통해 히스타민 농도를 분석한 결과이다.
도 5는 초음파 분쇄를 통해 재조합 효모 균주를 파쇄시키고 1000 ppm 히스타민 수용액과 단순 교반으로 반응시킨 후 LC/MS 분석을 통해 히스타민 농도를 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 히스타민 결합 단백질을 대량으로 생산하기 위해, 효모 표면에서 발현하는 히스타민 결합 재조합 단백질을 개발하기 위해 노력한 결과, 히스타민 결합 단백질 및 효모 표면 발현 단백질을 코딩하는 유전자를 하나의 벡터에 도입하여 발현시킨 결과, 효모의 표면에서 히스타민 결합 단백질이 생산되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 히스타민 결합 단백질 (histamine binding protein; HBP), 효모 표면 발현 단백질 (Cwp2p2) 및 효모 표면 발현 단백질 (Cwp2p2)의 신호 펩타이드를 포함하는, 히스타민 결합 단백질을 생산하기 위한 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
본 발명은 진핵 미생물인 Saccharomyces cerevisiae에 히스타민 결합 단백질을 생산하기 위해, Gly-Ser 링커를 갖는 효모 표면 발현 단백질(Cwp2p) 유전자, 효모 표면 발현 단백질(Cwp2p)의 신호 펩타이드, HA tag 및 히스타민 결합 단백질 2(Histamine binding protein 2; HBP 2) 유전자를 포함하는 플라즈미드를 제조하였다 (도 1). 상기 플라즈미드를 S. cerevisiae 2805에 리튬 아세테이트법으로 형질 전환한 뒤, 갈락토즈 프로모터(galactose promoter)를 이용하여 재조합 단백질 발현을 유도하였고, 이를 영양 선택적 배지를 통해 MBTL-GWL-1이 형질전환된 효모를 선별하였다 (도 2). 상기MBTL-GWL-1의 Ha tag에 1차 항체를 붙인 후, Green signal인 FITC(Fluorescince isothiocynate)가 달린 2차 Antidody(항체)를 붙여 형광 현미경을 통해 형광을 확인하였다.
그 결과 MBTL-GWL-1 벡터가 S. cerevisiae 2805에 형질 전환되어 형질 전환된 효모된 것을 확인 하였습니다 (도 3). 상기 효모 균주의 표면에 발현된 히스타민 결합 단백질과 히스타민 수용액을 함께 반응시켜 히스타민의 농도 감소에 대한 효과를 확인한 결과, 세포 농도가 감소함에 따라 히스타민 농도가 저감되는 것을 확인하였다(도 4). 또한 상기 세포의 생존 여부에 따른 히스타민 저감 효과를 확인한 결과, 균주가 살았을 때와 죽었을 때 모두 효과가 있음을 확인하였다 (도 5).
상기 벡터는 pYES 2일 수 있다.
상기 히스타민 결합 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 효모 표면 발현 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 효모 표면 발현 단백질 (Cwp2p2)의 신호 펩타이드를 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 벡터가 형질전환된 효모를 제공할 수 있다.
본 발명은 상기 재조합 벡터가 형질 전환된 효모를 포함하는 히스타민 억제용 조성물을 제공할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 히스타민 결합 단백질 및 효모 표면 발현 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작
본 발명은 Rhipicephalus appendiculatus에서 발견한 Histamine binding protein 2 유전자를 효모 표면에서 발현시키기 위해, 효모 표면 발현 단백질(Cwp2p)와 이의 신호 펩타이드를 사용하였다. 먼저 HBP2 단백질의 유전자 합성을 요청하여 서열을 얻었다. HBP2 서열에 원래 존재하는 신호 펩타이드는 배제되었고, 정지 코돈도 배제되었다. 합성된 유전자는 항생제 내성 유전자를 함유하는 pBHA 벡터에 제공되었다. 이를 대장균에 형질 전환하여 유전자를 증폭한 후 항생제 함유 배지를 사용하여 선택적으로 배양하였다. 벡터의 증폭을 위해, 재조합 대장균을 항생제 포함한 배지에 배양시킨 후 재조합 벡터를 추출하였다. 재조합 플리스미드는 pYES2 벡터(Introgen, Califonia, USA)에 의해 구축되었다. 먼저, Gly-Ser 링커를 갖는 Cw2p2 유전자를 pYES2벡터에 삽입한 후, 대장균에 넣어 형질 전환시켰으며 배양시켜 상기 벡터를 증폭시켰다. 다음으로 Cwp2p 신호 펩타이드, HA tag를 갖는 HBP2 유전자를 상기 벡터에 삽입하여 벡터를 완성시켰다. 이를 MBTL-GWL-1이라 명명했다 (도 1). 또한 완성된 플라스미드를 HBP seq-F-552(5-TGA GTA CGC TGT AGG TAG GG-3’) 및 HBP2 seq R-658 (5-ATG GCG GCA GCG GAT TCA GA-3’)의 2개의 시퀀스 프라이머를 사용하여 염기 서열 분석을 수행하여 확인하였다. 상기 실험에 사용한 유전자의 염기서열은 하기 표 1과 같다.
| 염기 서열 | |
| 효모 표면 발현 단백질(Cwp2p ; 서열번호 2) | GAATCCGCTGCCGCCATTTCTCAAATCACTGACGGTCAAATCCAAGCTACTACCACTGCTACCACCGAAGCTACCACCACTGCTGCCCCATCTTCCACCGTTGAAACTGTTTCTCCATCCAGCACCGAAACTATCTCTCAACAAACTGAAAATGGTGCTGCTAAGGCCGCTGTCGGTATGGGTGCCGGTGCTCTAGCTGCTGCTGCTATGTTGTTATAA |
| 효모 표면 발현 단백질(Cwp2p)의 신호 펩타이드 (서열번호 3) |
ATGCAATTCTCTACTGTCGCTTCCGTTGCTTTCGTCGCTTTGGCTAACTTTGTTGCCGCT |
| 히스타민 결합 단백질 2(Histamine binding protein 2; 서열번호 1) | AATCAGCCAGATTGGGCCGATGAAGCGGCAAATGGTGCACACCAAGACGCCTGGAAGAGTCTGAAAGCGGACGTTGAAAACGTTTACTACATGGTGAAGGCCACCTATAAGAATGACCCAGTGTGGGGCAATGACTTCACTTGCGTGGGTGTTATGGCAAATGATGTCAACGAGGATGAGAAGAGCATTCAAGCAGAGTTTTTGTTTATGAATAATGCTGACACAAACATGCAATTCGCCACTGAAAAGGTGACTGCTGTTAAAATGTATGGTTACAATAGGGAAAACGCCTTCAGATACGAGACGGAGGATGGCCAAGTTTTCACAGACGTCATTGCATACTCTGATGACAACTGCGATGTCATCTACGTTCCTGGCACAGACGGAAATGAGGAAGGTTACGAACTATGGACTACGGATTACGACAACATTCCAGCCAATTGTTTAAATAAGTTTAATGAGTACGCTGTAGGTAGGGAGACAAGGGATGTATTCACAAGTGCTTGCCTAGAG |
| HA tag (서열번호 4) |
TACCCATACGACGTTCCAGACTACGCT |
실시예 2. 상기 제작한 벡터를 형질전환한 세포 표면에서 히스타민 결합 단백질의 발현 확인
본 실시예에서는 진핵 미생물인 S. cerevisiae 2805를 사용하였으며, 상기 실시예 1에서 제작한 MBTL-GWL-1 벡터를 S. cerevisiae 2805에 리튬 아세테이트법으로 형질 전환하여 재조합 단백질 발현을 유도하였다. 상기 S. cerevisiae 2805에서 MBTL-GWL-1를 벡터 내 갈락토즈 프로모터(galactose promoter)를 이용하여 재조합 단백질 발현을 유도하였고, 이를 영양 선택적 배지를 통해 MBTL-GWL-1이 형질전환된 효모를 선별하였다 (도 2). 상기 MBTL-GWL-1벡터가 들어간 재조합 효모의 발현을 확인하기 위해 HA tag를 이용하여 면역 형광법으로 확인하였다. 먼저, 재조합 효모를 갈락토즈를 넣어 배양하여 상기 벡터의 발현을 유도시킨 후, 1차 항체가 HA tag가 아닌 다른 부분에 부착하는 것을 방지하기 위해 3% Bovin Serum Albumin을 이용하고, 1차 항체를 재조합 효모에 부착시킨다. 다음으로 1차 항체에만 부착되는 형광이 달려있는 2차 항체를 부착시킨 후 형광 현미경을 통해 결과를 확인하였다 (도 3). 그 결과, MBTL-GWL-1 벡터가 S. cerevisiae 2805에 형질 전환되어, 형질전환 되지 않은 효모(Mock)에서는 관찰되지 않은 형광이 보이는 것을 확인하였다.
실시예 3. 상기 히스타민 결합 단백질이 발현된 미생물에 히스타민 수용액과 반응 및 히스타민의 농도의 확인
본 실시예에서는 효모 균주의 표면에 발현된 히스타민 결합 단백질과 히스타민 수용액을 함께 반응시켜 히스타민의 농도 감소에 대한 효과를 확인하였다. 상기 재조합 효모를 배양 후 갈락토즈를 넣어 단백질 발현을 유도하였다. 히스타민 결합 단백질이 발현된 GWL-1과 1000 ppm 히스타민 수용액을 단순 교반으로 반응시킨 후 LC/MS 분석을 통해 히스타민 농도를 측정하였다. 대조군으로 공벡터만 들어간 Mock, 표면 발현 단백질만 들어간 GWL-0를 사용하였다. 상기 반응은 증류수로 세척한 재조합 효모 균주와 히스타민 수용액을 상온에서 단순 교반에 의해 이루어지고, 효모 균주의 농도 (도 4)에 따른 히스타민 저감 효과를 확인하였다. 단백질 발현 유도한 배양액 10 ml (1X) 을 기준으로 5 ml (1/2X), 2.5 ml (1/4X)의 원심 분리하여 반응한 결과, 세포 농도가 감소함에 따라 히스타민 저감 능력 또한 저감됨을 확인하였다 (도 4). 또한 상기 세포의 생존 여부에 따른 히스타민 저감 효과를 확인하였다. 초음파 분쇄를 통해 재조합 효모 균주를 파쇄 시키고 1000 ppm 히스타민 수용액과 단순 교반으로 반응시킨 후 LC/MS 분석을 통해 히스타민 농도를 분석한 결과이다. 균주가 살았을 때와 죽었을 때 모두 효과가 있음을 확인하였다 (도 5).
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY
<120> Recombinant Yeast containing histamine-binding proteins and yeast
surface expression protein
<130> 1067284
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 513
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Histamine binding protein 2
<400> 1
aatcagccag attgggccga tgaagcggca aatggtgcac accaagacgc ctggaagagt 60
ctgaaagcgg acgttgaaaa cgtttactac atggtgaagg ccacctataa gaatgaccca 120
gtgtggggca atgacttcac ttgcgtgggt gttatggcaa atgatgtcaa cgaggatgag 180
aagagcattc aagcagagtt tttgtttatg aataatgctg acacaaacat gcaattcgcc 240
actgaaaagg tgactgctgt taaaatgtat ggttacaata gggaaaacgc cttcagatac 300
gagacggagg atggccaagt tttcacagac gtcattgcat actctgatga caactgcgat 360
gtcatctacg ttcctggcac agacggaaat gaggaaggtt acgaactatg gactacggat 420
tacgacaaca ttccagccaa ttgtttaaat aagtttaatg agtacgctgt aggtagggag 480
acaagggatg tattcacaag tgcttgccta gag 513
<210> 2
<211> 219
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cwp2p
<400> 2
gaatccgctg ccgccatttc tcaaatcact gacggtcaaa tccaagctac taccactgct 60
accaccgaag ctaccaccac tgctgcccca tcttccaccg ttgaaactgt ttctccatcc 120
agcaccgaaa ctatctctca acaaactgaa aatggtgctg ctaaggccgc tgtcggtatg 180
ggtgccggtg ctctagctgc tgctgctatg ttgttataa 219
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cwp2p signal peptide
<400> 3
atgcaattct ctactgtcgc ttccgttgct ttcgtcgctt tggctaactt tgttgccgct 60
60
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA tag
<400> 4
tacccatacg acgttccaga ctacgct 27
Claims (6)
- (a) 서열번호 1의 히스타민 결합 단백질 2 (HBP2)의 유전자를 pBHA 벡터에 도입하고, 제조된 벡터로 대장균을 형질전환시키고 배양하여 상기 pBHA 벡터를 증폭시키고 추출하는 단계;
(b) pYES2 벡터에 Gly-Ser 링커를 갖는 서열번호 2의 효모 표면 단백질 Cwp2p의 유전자를 삽입한 후, 제조된 벡터로 대장균을 형질전환시키고 배양하여 벡터를 증폭시키는 단계; 및
(c) 단계(b)에서 제조된 벡터에 서열번호 3의 Cwp2p 신호 펩타이드 서열, 서열번호 4의 HA tag를 갖는 HBP2 유전자를 삽입하는 단계를 포함하는, 히스타민 결합 단백질을 생산하기 위한 도 1에 도시된 재조합 벡터를 제조하는 방법. - 제1항의 방법에 의하여 제조된 재조합 벡터.
- 제2항의 재조합 벡터로 형질전환된 효모.
- 제3항의 형질전환된 효모를 배양하는 단계를 포함하는 항히스타민용 조성물을 제조하는 방법.
- 제3항의 형질전환된 효모를 배양하고, 초음파 분쇄를 통해 상기 효모를 파쇄하는 단계를 포함하는, 항히스타민용 조성물을 제조하는 방법.
- 제4항 또는 제5항의 방법으로 제조된 항히스타민용 조성물.
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- 2020-05-06 KR KR1020200054034A patent/KR102268749B1/ko active IP Right Grant
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