CN1225125A - 用于将木糖发酵为乙醇的稳定的重组酵母 - Google Patents

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Abstract

所述的为将木糖发酵为乙醇并且在非选择性培养基中培养数代时仍维持其这样做能力的重组酵母。优选的酵母含有多拷贝融合至不受葡萄糖抑制并且无需木糖来诱导启动子上且编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的整合的基因。同时描述的为通过以复制性/整合性载体转化细胞并且然后在选择压力下将该细胞复制多次以促进该载体在后代中保留而将多拷贝外源DNA整合入宿主细胞的优选方法。因此复制的载体用于将多拷贝外源DNA在整个复制/筛选期内整合至宿主细胞中。然后可去除选择压力以促进该载体在后代中的丢失,从而得到了外源DNA的稳定整合体。

Description

用于将木糖发酵为乙醇的稳定的重组酵母
                       背景
本发明广泛涉及遗传工程微生物且特别地涉及用于稳定掺入外源DNA至细胞，包括掺入多拷贝外源DNA至宿主中重复DNA序列处的独特方法。在优选的方面，本发明涉及能够将木糖(优选其发酵木糖与葡萄糖)至乙醇的酵母。更为特别的是，本发明的优选方面涉及含有编码木糖还原酶(XR)、木糖醇脱氢酶(XD)和木酮糖激酶(XK)克隆基因的酵母，该酵母甚至在非选择性培养基中培养很多代后仍基本上维持将木糖发酵至乙醇的效率。
作为进一步的背景，最近研究表明乙醇为理想的汽车液体燃料。其可作净燃料(100％乙醇)直接使用或以各种浓度与汽油混合使用。使用乙醇补充或替代汽油可降低许多国家对进口外来原油的依赖并且也提供用于运输的可再生燃料。此外，已证明乙醇较常规的汽油提供更为清洁的燃料，其向环境中释放少得多的污染物。例如，已经证实在汽油中使用氧物质可减少一氧化碳，一种有害的污染物释放入空气中。目前用于增加汽油中氧气含量的几种增氧剂(oxygenates)中，乙醇具有最高的氧气含量。美国环保署(EPA)已显示混合了10％乙醇的汽油降低一氧化碳排放约25％-30％。
到现在，用于通过发酵制备工业乙醇的原料为来自蔗糖或甜菜的糖和来自玉米或其它粮食作物的淀粉。然而，这些农作物目前被认为是太昂贵而不能用作大规模制备燃料乙醇的原料。植物生物体是用于通过发酵进行乙醇燃料制备的有吸吲力的原料因为其是可再生的并且可以低价和大量而得到。使用由微生物发酵糖而制备的乙醇的概念至少起源于二十年以前。来自纤维素材料的主要可发酵的糖为葡萄糖和木糖，其中的葡萄糖和木糖的比例大约为2或3到1。当然，纤维素材料最为理想的发酵将完全将葡萄糖和木糖转变为乙醇。不幸的是，甚至现在还没有一种已知既能够有效发酵葡萄糖又能够有效发酵木糖的天然微生物。
酵母，特别是糖酵母属酵母被传统用于将基于葡萄糖的原料发酵成为乙醇，并且仍然认为它们是用于该目的最好微生物。然而，已发现这些葡萄糖发酵酵母，包括糖酵母属不能够发酵木糖并且也不能够用此戊糖来生长。
近年来，N.Ho等开发出重组酵母，特别是能够有效地将木糖发酵成乙醇的重组糖酵母属酵母(Ho和Tsao,1995)。更为特别地是，优选的重组酵母能够将纤维素生物体的2种主要糖组分，葡萄糖和木糖共发酵成乙醇(Ho和Tsao,1995)。通过以高拷贝数含有编码木糖代谢三个关键酶的三个克隆基因XR、XD和XK的质粒转化酵母而开发出这些重组酵母(图1)。图2和图3显示了2种以前制备的称为1400(pLNH32)和1400(pLNH33)的重组糖酵母属酵母，它们能够将存在于相同培养基中的8％的葡萄糖和4％的木糖在2天中几乎完全共发酵成乙醇。另一方面，图4显示了母本酵母融合株1400(D′Amore等.，1989和D′Amore，等.，1990)仅可发酵葡萄糖至乙醇而不可发醇木糖至乙醇。通过以2个高拷贝数的显示于图1中的质粒pLNH32和pLNH33转化糖酵母属融合株1400(D′Amore等.，1989和D′Amore，等.，1990)而开发出1400(pLNH32)(简称LNH32)和1400(pLNH33)(简称LNH33)。到目前为止，已报导了4种这样的高拷贝数质粒，pLNH31、pLNH32、pLNH33和pLNH34(Ho和Tsao,1995)。这些质粒中的每一种可转化融合1400至重组酵母从而以相近的效率其转化葡萄糖和木糖。
其木糖代谢基因被克隆于基于2μ稳定高-拷贝-数质粒上的酵母1400(pLNH32)、1400(pLNH33)和有关的重组木糖-发酵的糖酵母属酵母十分适用于批量工艺发酵(process fermentation)。然而，在连续的工艺发酵中，在富含葡萄糖的培养基中长期培养后(大于20代)，1400(pLNH32)、1400(pLNH33)和类似的质粒介导的重组酵母丧失其发酵木糖的能力，如图5和图6中所示。
通常，外源DNA或基因可通过2种独立的方式克隆入酵母。一种方式是将外源DNA或基因克隆入含有可筛选遗传标记和使质粒能够在此新宿主中自主复制的有功能的酵母DNA复制起点或ARS(自主复制序列)的质粒载体中(Struhl等.，1979；Stinchcomb等.，1980；Chan和Tye,1980)，然后以含有所需克隆的DNA片段或基因的质粒转化所需的酵母宿主。得到酵母转化子能够在选择压力存在下稳定地维持该克隆的基因。然而，该克隆的基因在无选择的培养基(缺少选择压力)时长期培养后是不稳定的。
克隆外源DNA或基因进入酵母宿主的另一种方式是将该DNA或基因整合入酵母染色体中。在酵母中，整合转化几乎都是通过同源重组(Orr-Weaver,1981)。通过整合克隆所需基因至酵母染色体中的最简单方法首先是将该所需的基因克隆入不含复制起点或ARS(自主复制序列)但的确含有一段宿主DNA用于将此整合靶向至特异性位点的质粒中(Orr-Weaver,1981)。用这种完整的整合载体对新的酵母宿主的转化将产生含有所需的克隆入与选定靶向酵母DNA序列相邻位点的所需基因的整合转化子。然而，该整合转化的频率极低(每μg DNA1至10个转化子)。后来，证明在与宿主染色体DNA同源的DNA片段内线性化的整合性载体可以高得多的频率(高100至1000倍)转化酵母)(orr-Weaver,1981,Orr-Weaer和Szostak,1983)。表明由限制酶消化而导入的双断裂体是重组性的(recombinogenic)并且与同源染色体DNA是高度相互作用性的。这对于含有一个以上酵母基因的复合质粒特别有帮助从而人们可通过在质粒上相应区域内造成限制酶切口而将此整合定位于特定的位点。
另一种整合，也描述为置换或基因断裂利用两次同源重组以替代酵母染色体DNA(Rothstein,1981)。两次同源重组的载体含有待克隆的外源DNA或基因和选择标记，其侧翼为与待替代染色体DNA片段的5′和3′区域同源的酵母DNA序列。转化前，以限制酶消化该载体，该酶释放出含有与所需整合位点处的染色体DNA序列同源的5′和3′端的置换片段。如果需要稳定的单拷贝转化子，那么后者的策略便是用于酵母整合转化的首先方法。
已经用多种基于整合入强调染色体DNA中的策略产生稳定的多拷贝整合体。例如，酵母逆转录转座子Ty的Δ序列(Sakai等，1990；Sakar等.，1991)、高度保守的重复元件(Kudla和Nicolas,1992)和核糖体DNA的非转录序列(Lopes等1989；Lopes等.，1991；Rossolini等.，1992)均被用作多次整合外源基因至酵母中的靶向位点(Rothstein,1991；Romanos等.，1992)。
有关多重整合外源基因至酵母染色体中文献中报导的最近工作大部分包括使用适当线性化的非复制性载体或含有待克隆所需基因的DNA片段和用于筛选的遗传标记，其两侧为与酵母染色体DNA区域同源的DNA序列。很少用线性化的复制载体并且几乎不用完整的复制载体，如完整的ARS载体完成这样的重组转化，因而，自从开始开发酵母整合转化的早期工作(Szoatak和Wu(1979))，并且尽管观察到克隆于ARS载体上的DNA可整合入宿主染色体中(Cregg等.，1985；Kurtz等.，1986)，但为了整合的目的而对完整ARS载体的使用已被放弃较长一段时间(Struhl等.，1979；Stinchcomb等.，1980；Chan和Tye,1980)。自从发现由限制酶消化而导入的双链断裂体为重组性的(Orr-Weaver,1981；Orr-Weaver和Szostak,1983)，这特别地成为现实。
根据此背景，仍存在将木糖发酵为乙醇，优选将木糖和葡萄糖同时发酵为乙醇的更为稳定的酵母和用于制备高拷贝数整合体方便而有效方法的必要。本发明描述这些必要。
                   发明概述
因此，本发明提供甚至培养于非选择性培养基中多代(如，大于20代)时仍维持其完整的将木糖发酵成乙醇能力的含有多拷贝稳定克隆XR、XD和XK基因的酵母。更为优选地，XR、XD和XK基因均融合至不受葡萄糖存在所抑制并且也无需木糖存在用于其表达的启动子上。更为优选地，本发明的酵母可将纤维素性生物体的二种主要组分，葡萄糖和木糖发酵为乙醇。
本发明的另一实施方案涉及重复序列的使用，如与5S DNA相邻的非转录r-DNA序列(Valenzuela等.，1977)，其为通过同源重组用于靶向高拷贝数整合含有XR、XD和XK的DNA片段进入酵母基因组中的同源序列。例如，包括两侧为该同源序列的DNA片段的复制性质粒载体可用于定向整合该DNA片段。本发明的优选方法包括步骤(a)以具有外源DNA且包括筛选标记的复制/整合质粒转化细胞；和(b)反复扩增步骤(a)的细胞以制备许多代子化细胞同时筛选包括筛选标记的细胞(如，通过在选择平板上扩增)，从而促进复制和整合性质粒保留于随后的子代细胞中以及具有多个整合拷贝外源DNA的子代细胞的形成。在进一步的步骤中，可扩增步骤(b)的细胞从而在无筛选包括筛选标记细胞的压力下制备多代子细胞，从而促进该质粒在随后子细胞中的丢失(因而得到此稳定整合子的富集种群)。
本发明也提供用于筛选和保持所需转化子的优越的方式。众所周知，在基本培养基中，所有微生物需要碳源，如葡萄糖或木糖的存在用于生长。然而，在丰富培养基中大多数微生物无需碳源的存在用于生长。不过，本发明提供了使用碳源作为筛选压力用于甚至在丰富培养基如YEP(1％酵母提取物加上2％蛋白胨)中对转化子的筛选。许多种酵母，特别是糖酵母属酵母甚至在丰富培养基中的确需要碳源，如木糖或葡萄糖的存在用于生长，如图8中所示。该发现大大促进了稳定的转化子，如1400(LNH-ST)(图7)的开发，这些转化子在非选择培养基中基本上培养无限代后仍能够有效地发酵木糖。
在更广泛的方面，本发明也提供了用于整合多拷贝外源DNA至细胞中重复染色体DNA的方法。该方法包括(a)以具有外源DNA且包括筛选标记的复制和整合性质粒转化细胞。该方法也包括(b)扩增步骤(a)的细胞以制备多代的子代细胞同时筛选包括筛选标记的细胞，从而促进该复制和整合性质粒在随后的子代细胞中的保留并且产生具有多个整合拷贝的外源DNA的子代细胞。在具体应用中，该方法包括(ⅰ)以具有外源DNA且包括筛选标记的复制性质粒转化酵母细胞，该外源DNA的每端两侧为与宿主DNA的重复序列同源的DNA序列；(ⅱ)反复扩增步骤(ⅰ)的转化酵母细胞以制备多代的子代细胞同时筛选包括筛选标记的细胞，从而促进该复制性质粒在随后子代细胞中的保留并且得到每种含多拷贝整合外源DNA的子代细胞；和(ⅲ)扩增步骤(ⅱ)的子代细胞从而在缺乏筛选包括该筛选标记细胞的压力下制备多代子细胞，进而促进该质粒在随后子代细胞中的丢失并且回收每种含有多拷贝整合至其染色体DNA中外源DNA的酵母细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了将木糖发酵成乙醇的酵母，该酵母具有多拷贝整合到其染色体DNA中的外源DNA。该外源DNA包括编码融合至不受葡萄糖抑制启动子上木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的基因，其中的酵母能够同时将葡萄糖和木糖发酵为乙醇并且甚至在非选择条件下培养至少20代后基本上维持其将木糖发酵为乙醇的能力。
本发明的另一方面涉及将木糖发酵为乙醇的方法，其包括以本发明的酵母发酵含有木糖的培养基。
本发明的另一实施方案提供了用于将包括筛选标记的外源DNA序列整合入目标酵母细胞染色体DNA的质粒载体。该本发明的质粒载体含有有功能的酵母DNA复制起点和包括筛选标记的外源DNA，该DNA每个末端的两侧为与靶酵母细胞重复的核糖体DNA序列同源的DNA侧翼序列。该质粒在除了该DNA侧翼序列之间的位置进一步具有第二个筛选标记。
本发明的进一步实施方案提供了用于将外源DNA序列整合至酵母中以形成发酵木糖至乙醇稳定整合体的质粒载体。该载体含有有功能的酵母DNA复制起点和包括编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶基因的外源DNA，该DNA的每端为与靶酵母细胞的重复DNA序列同源的DNA侧翼序列。
本发明的进一步方面提供了用于形成具有多拷贝整合外源DNA片段的细胞的方法。此发明方法包括扩增具有重复基因组DNA并且含有具有外源DNA复制和整合性质粒的细胞以制备多代的子代细胞同时筛选包括筛选标记的细胞，从而促进复制和整合质粒在随后的子代细胞中的保留并且制备具有多拷贝整合外源DNA的子代细胞。
本发明提供了含有稳定克隆基因的酵母，该基因使酵母能够用于非选择条件(如连续发酵)以共发酵木糖和葡萄糖至乙醇，同时又不丧失其发酵木糖的能力。此外，本发明提供了用于形成稳定、多拷贝酵母整合体和其它易于操作并可被控制以调整整合外源DNA拷贝数的细胞的方法和物质。根据下面的描述和附属的权利要求，本发明的其它实施方案和特征及优势将显而易见。
                      附图简述
图1显示了质粒pLNH31、-32、-33和-34的限制图谱和克隆入其中的基因。
图2显示酵母转化子1400(pLNH32)(简称LNH32)可有效地共发酵葡萄糖和木糖。用于培养酵母和发酵糖的条件类似于实施例7中所述的条件。
图3显示酵母转化子1400(pLNH33)(简称LNH33)可有效地共发酵葡萄糖和木糖。用于培养酵母和发酵糖的条件类似于实施例7中所述的条件。
图4显示母本酵母融合株1400可发酵葡萄糖但不可发酵木糖。用于培养酵母和发酵糖的条件类似于实施例7中所述的条件。
图5显示具有克隆于复制性质粒pLNH32中木糖代谢基因的酵母转化子1400(pLNH32)(简称LNH32)在非选择培养基中是不稳定的。在非选择(例如，葡萄糖)培养基中培养20代后，1400(pLNH32)丧失其发酵木糖的能力。
图6显示其木糖代谢基因克隆于复制性质粒pLNH33中的酵母转化子1400(pLNH33)在非选择性培养基中是不稳定的。在非选择性培养基(例如，葡萄糖培养基)中培养20代以后，1400(pLNH33)丧失其发酵木糖的能力。
图7显示酵母转化子1400(LNH-ST)(简称LNH-ST)甚至在非选择性培养基中培养40多代后仍然维持其木糖发酵的能力。
图8显示甚至当丰富培养基如酵母提取物和蛋白胨存在于培养基中时，啤酒糖酵母和其它糖酵母属酵母仍然需要碳源用于生长。例如，这些实验显示啤酒糖酵母不能够在含有1％酵母提取物和2％蛋白胨的YEP培养基中生长，但是，当葡萄糖或木糖加入到YEP培养基中时能够生长。
图9A显示pLNH-ST的限制性图谱和克隆于其中的基因。
图9B显示克隆于pLNH-ST中基因(5S rDNA、KK、AR和KD)的遗传图谱(顺序和方向)。该基因图谱上游或下游的寡核苷酸(例如，Oligo25,Oligo26等)为用于通过PCR对克隆的基因的顺序和方向进行特征分析的引物。
图10为简要描述含有克隆的XR、XD、XK基因的pBluescript ⅡKS(-)的构建：构建4个这样的基因。选择克隆于pKS(-)-KK-AR-KD-3中的KK-AR-KD片段克隆于pUCKm-rDNA(5S)-ARS中用于也称为pLNH-ST的pUCKm-rDNA(5S)(KRD)-ARS的构建。
图11显示优于1400(pLNH32)和1400(pLNH33)的酵母转化子1400(LNH-ST)(简称LNH-ST)可有效地共发酵葡萄糖和木糖。用于培养酵母和发酵的条件类似于实施例7中所述的条件。
图12显示克隆于广谱宿主质中的基因以及该质粒的限制性图谱，该质粒用于分离含有来自啤酒糖酵母和其它酵母染色体DNA的DNA片段的ARS。
                     发明详述
为了促进对本发明原理的理解，现将列出与其一些优选实施方案有关的参考文献，并将用特定的语言描述此内容。不过将会明白其并不意在对本发明范围的限制，对这里所述本发明原理的这种修改、进一步修饰和应用对于本发明涉及领域的一位技术人员将是显而易见的。
如上所述，本发明一个优选的方面提供了稳定掺入有克隆的XR、XD和XK基因的重组酵母，其代表了较前面报导的重组酵母的改进。一般已报导了可有效共发酵存在于相同的培养基中葡萄糖和木糖的重组酵母(Ho和Tsao,1995)。本文中制备的酵母通过克隆适当修饰的XR、XD和XK基因于高拷贝质粒，pUCKm10中，然后用此得到的质粒，pLNH3X(X=1到4)(图1)转化适当的天然酵母而完成。例如，用质粒pLNH32和pLNH33转化分别融合到1400(pLNH32)和1400(pLNH33)上的融合酵母1400。这些重组的糖酵母属酵母可有效地共发酵存在于相同培养基中的葡萄糖和木糖至乙醇，如图2和3中所示，而母本未加工的1400酵母仅可发酵葡萄糖，不能既发酵葡萄糖又发酵木糖(图4)。
质粒介异的重组酵母可在选择压力存在下维持克隆的基因，但无选择压力时不能维持克隆的基因。如图5和6中所示，在无选择压力下1400(pLNH32)和1400(pLNH33)最终丢失其质粒和发酵木糖的能力。
重组的工业酵母，特别是用于制备大量工业产品如乙醇，无需选择压力存在而稳定的那些菌株是高度必要的。本发明中含有整合XR、XD和XK基因的重组酵母的开发提供了这种稳定性。此外，为了使得到的重组酵母具有与1400(pLNH32)和1400(pLNH33)类似或比其更高的效率的共发酵葡萄糖和木糖的能力，该重组酵母必需不仅含有整合的木糖代谢基因，而且含有高拷贝数的这种整合的基因。在本发明的优选方面，已经通过靶向非编码区，如5S核糖体DNA(rDNA)的非编码区作为多次整合的位点而开发出酵母的高拷贝数(hcn)整合体(即，具有至少约10个整合拷贝外源DNA的酵母)。
rDNA提供了用于整合优越的位置因为其是高度保守的，并且酵母一般含有多于100拷贝的rDNA重复序列。然而，将会明白为了达到本发明的酵母，在重复(repeated)或重复(reiterated)序列的每个位置(occurrence)完成所需基因的整合将是不必要的。根据本发明的广泛的方面，将足以在重复序列多个位点，即2个或2个以上的位点中的每个位点完成此整合。
为了在5S rDNA的位点处将hcn XR、XD和XK整合入酵母染色体，构建图9中所示的整合质粒，pLNH-ST。pLNH-ST为酵母-大肠杆菌的穿梭载体且为pUCKm6质粒的衍生物(Ho等.，1984)。将5S的rDNA序列插入pUCKm6的XhoⅠ限制位点。通过PCR技术从酵母染色体DNA中拷贝5S rDNA序列并且通过定点诱变技术对其加以修饰从而在其中间(大约)序列中加入XhoⅠ限制位点，如图9中所示。已将来自pKS(-)-KK-AR-KD的XhoⅠ片段(图10)(Ho和Tsao,1995)插入克隆于pLNH-ST中5S rDNA的XhoⅠ位点中。
pLNH-ST与其它传统的基于5S rDNA的hcn酵母整合载体的不同之处在于其也含有有功能的酵母ARS序列(Struhl等.，1979；Stinchcomb等.，1980；Chan和Tye,1980)，如图9中所示。这样，pLNH-ST既是复制性载体又是整合性载体。特别的是，在含有高拷贝整合XR、XD和XK重组酵母的开发中，pLNH-ST首先作为复制性载体而起作用然后作为整合性载体而起作用。将ARS片段插入pUCKm6的EcoR1位点中。此外，pLNH-ST也含有卡那霉素抗性基因(KmR)和氨苄青霉素抗性基因(ApR)。KmR在酵母中作为遗传霉素抗性基因而起作用并将赋予其酵母转化子对遗传霉素的抗性。KmR的XhoⅠ位点通过PCR技术加以去除而不影响其活性。KmR和ApR均为原始pUCKm6质粒的一部分。
如上所述，上述载体与目前技术中所用的载体在于含有ARS序列。此外，在前述用于制备hcn酵母整合体的方法中，克隆基因的整合在以外源基因转化酵母细胞的即刻便发生。相反，根据本发明优选的方式，在转化完成长时间后，该克隆基因的整合仍逐渐继续发生。特别地，转化首先通过复制性质粒，如pLNH-ST在转化酵母细胞中的存在而建立，并且整合仅仅通过在含有选择培养基的平板上反复扩增转化子而发生。
因此，本发明涉及开发含有hcn整合克隆基因的酵母或其它细胞转化子的下面方法的使用，以复制性/整合性质粒，如pLNH-ST转化含有重复DNA序列的宿主细胞，例如酵母或真核细胞，并且筛选含有高拷贝数复制性/整合性质粒的转化子。将得到筛选出的转化子于新鲜选择平板上反复扩增并且培养足够的次数至高细胞密度以整合所需拷贝数的外源DNA，然后在非选择培养基中对此转化子培养足够的代数从而从此转化子中去除复制性/整合性质粒。然后可将得到的转化子培养于选择培养基中，并且那些维持其在选择培养基中有效生长能力的转化子将是含有hcn整合至酵母或其它宿主细胞染色体中所需外源基因的那些转化子。例如，根据上述方法以pLNH-ST转化融合1400酵母，并且得到的稳定重组酵母，1400(LNH-ST)较1400(pLNH32)和1400(pLNH33)可更好地共发酵葡萄和木糖，如图11中所示。重要的是，新开发出的稳定重组酵母，1400(LNH-ST)在非选择性培养基中培养4、20和40代后仍以同样的效率同时发酵葡萄糖和木糖，如图7中所示，而1400(pLNH32)和1400(pLNH33)在非选择培养基中培养20代后将丢失其发酵木糖的活性(图5和6)，此外，1400(LNH-ST)随后培养于非选择培养基中几百代，并且仍保持其共发酵葡萄糖和木糖的完全活性。
在开发稳定hcn整合体的优选方法中，用常见的筛选标记在相同的选择培养基中选择和维持2种质粒介导的活性和由整合基因赋予的活性。在本工作中，常见的筛选标记为3个克隆的木糖代谢基因，XR、XD和XK、并且常见的选择培养基或者为含有木糖的丰富培养基或者为含有木糖的基本培养基(用于酵母)。此外，这些克隆的基因用作大多数糖酵母属在丰富培养基中的筛选标记，因为本申请者已显示大多数糖酵母属酵母甚至在丰富培养基中的确需要碳源，如木糖的存在用于生长(图8)。虽然在丰富培养基中需要碳源的存在用于生长对于选作宿主的酵母并非决定性的，不过，能够在含有具有木糖的丰富培养基的平板上筛选所需的整合体较在含有具有木糖的基本培养基的平板上要方便得多。在本发明中用于转化的优选宿主属于糖酵母属的种类，因为它们发酵葡萄糖通常特别有效。在发现所需的用作整合高拷贝数木糖代谢基因宿主的酵母种类在丰富培养基中无需碳源的存在用于生长时，可用常规的方法分离在丰富培养基中无需碳源的这些种类的合适突变体。
用于得到hcn整合的复制/整合性质粒，如pLNH-ST也按照需要含有用于复制质粒-介导转化子筛选的第二种筛选手段。对于pLNH-ST，第二种筛选机制既利用KmR又利用ApR作为可筛选的标记。尽管含有第二种筛选系统对复制/整合性载体并非是决定性的，但其将提供更为优选的载体，特别是当ARS载体甚至在选择压力存在下不足够稳定，并且该转化子在整合足够拷贝的所需基因之前具有丧失其大部分质粒的趋势时更是如此。当使用含有第二种筛选机制的载体时，该转化子可在第二种筛选试剂的存在下培养以增加其质粒的拷贝数，或以相同的载体但用第二种筛选机制重新转化该转化子以重新选择该转化子从而此整合过程可持续或重新起始。
使用KmR和ApR作为第二种筛选系统是本申请者优选酵母所需要的。虽然KmR可以是用于转化对遗传霉素具有抗性的酵母的显性筛选标记，但是有些酵母对遗传霉素是天然具有抗性而没有获得含有KmR的质粒。结果，仅仅KmR不是用于酵母转化子筛选的优选筛选标记。另一方面，虽然ApR可在大多数酵母中有效表达，但其一般不能够用作酵母转化的显性筛选标记因为大多数酵母天然对氨苄青霉素具有抗性。然而，KmR和ApR一起用作大多数酵母，特别是糖酵母属酵母的优良的显性筛选系统。为了使用这样的筛选系统，首先于含有YEPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)和适当浓度遗传霉素(20-80μg/ml，根据种类不同而变化)的平板上加以筛选。通过青霉素酶测试(Chevallier和Aigle,1979)筛选表达ApR的得到的转化子以鉴定真正的转化子。
ApR在pLNH-ST(图9)和相关复制/整合性质粒中的存在也用作另一种功能。由于ApR仅存在于复制性质粒中并且不存在于整合于酵母染色体中的片段中，故青霉素测试也用作鉴定那些含有hcn整合克隆基因而不含质粒载体的方便方法。
本发明提供含有hcn整合基因的稳定重组酵母方法的特征为待整合基因的拷贝数可容易地控制。例如，如果另一种筛选标记，如KmR插入到5S rDNA片段(或靶序列)中时，更多拷贝数的XR-XD-XK基因可插入到融合酵母1400染色体中。此外，用于开发hcn酵母整合体的本发明方法也较其它报导的方法更容易完成，其中的实验条件或许不得不调整和控制并且该转化方法在可获得稳定菌株之前或许不得不重复。
因此，本申请者提高了以前重组木糖发酵母，如1400(pLNH32)和1400(pLNH33)的稳定性，并且具有优势地开发出将无需选择压力存在以维持克隆基因并且共发酵葡萄糖和木糖较1400(pLNH32)和1400(pLNH33)同样有效或甚至更为有效的稳定重组酵母，例如1400(LNH-ST)。此外，本申请者也开发出提供容易hcn整合外源基因至细胞染色体中的方便方法，其中待整合基因的拷贝数也可容易控制。
与1400(pLNH32)和1400(pLNH33)类似，本发明优选稳定的遗传工程木糖发酵酵母也可有效地共发酵葡萄糖和木糖。这是因为插入到新酵母宿主染色体中的XR、XD和XK基因均融合至以下基因的完整5′非-编码序列，这些基因可有效地在酵母中表达，编码高水平酶的产生，并且也不受培养基中葡萄糖存在的抑制。例如，为了这些目的，含有用于有效表达糖酵解基因和制备高水平糖酵解酶所有遗传元件的完整5′非-编码DNA序列适于替代XR、XD和XK的完整5′非-编码序列。
克隆于pLNH-ST中的XR、XD和XK来自具柄毕赤酵母(Pichiastipitis)(XR和XD)和啤酒糖酵母(XK)。然而，只要它们在融合到含有有效启动子、核糖体结合位点等的适当5′非-编码序列上后可产生高水平的各自的酶，它们可以来自任何微生物。例如，这三种基因众所周知出现于多种微生物中并且已鉴定和分离出众多的XR、XD和XK基因。因此，这些基因的特定来源对本发明的广泛方面并非是决定性的，编码具有木糖还原酶活性(以NADPH和/或NADH作为辅因子将D-木糖转变为木糖醇的能力)、木糖醇脱氢酶活性(以NAD+和/或NADP+作为辅因子将木糖醇转变为D-木酮糖的能力)或木酮糖激酶活性(将D-木酮糖转变为D-木酮糖-5-磷酸的能力)蛋白(酶)的任何DNA将是合适的。这些基因可获得为天然基因，或者只要该编码的蛋白仍具有XR、XD和XK活性可以是通过，例如添加、替代或缺失碱基对天然基因加以修饰。同样，再一次只要该得到的DNA编码表现所需XR、XD和XK活性的蛋白，这些基因及其蛋白可通过已知的技术人工制备。
作为实例，XR和XD基因的适当来源包括利用木糖的酵母如休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)，具柄毕赤酵母，Pachysolentannophilus，适当的XK基因的来源包括上述利用木糖的酵母，以及不利用木糖的酵母如来自糖酵母属的酵母，如啤酒糖酵母，裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)属，如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)，和细菌如大肠杆菌、芽孢杆菌属种类、链霉菌属种类等。目的基因可利用常规的方法学从这些来源中回收。例如，杂交、互补或PCR技术可用于此目的。
多种启动子适用于本发明中。总的来说，将使用能够控制XR、XD或XK基因转录的可与酵母相容的启动子。这种启动子可获自众多已知的来源，包括酵母、细菌和其它细胞来源。优选地，用于本发明中的启动子将是无需木糖诱导的有效而且不受葡萄糖抑制的启动子。在这方面，这里使用的“有效”启动子指提供融合基因高水平表达的5′侧翼序列。具有这些特征的启动子也可广泛获得，并且这里所讲述的它们在本发明中的使用将在一般技术人员的视野范围内，如融合这些启动子至XR、XD和XK基因上，克隆启动子/基因融合产物至适当的载体中和用这些载体转化酵母。所有这些操作可用本领域和文献中众所周知的常规遗传工程技术加以完成。
只要DNA片段可作为有活性复制起点而起作用以支持质粒在选作用于hcn整合宿主中的自主复制，酵母DNA复制起点，如含有ARS的DNA片段可从酵母染色体DNA或其它生物的染色体DNA中获得。如文献中所报导的(Stinchcomb等.，1980；Ho等.，1984)；通过掺入随机消化的DNA片段至大肠杆菌质粒中，然后以得到的质粒库转化所需的宿主有机体，如啤酒糖酵母可容易地分离作为ARSs而起作用的DNA片段。
新方法已用于产生本发明稳定的菌株。然而，有数种迹象表明克隆的基因不位于复制质粒上并且已整合入宿主基因组中。例如，从1400(LNH-ST)分离的染色体DNA可用作模板用于通过聚合酶链式反应(PCR)分离包括既含有5S rDNA又含有克隆基因序列融合克隆基因的分离。同样，虽然很少质粒(pLNH-ST)能够在相同条件下通过大肠杆菌的转化而从1400(LNH-ST)中回收，但数百种pLNH32或pLNH33质粒可分别从1400(pLNH32)和1400(pLNH33)中回收。此外，含有高拷贝数复制pLNH-ST的起始1400融合酵母转化子是不稳定的(相对于其发酵木糖的能力)但为青霉素酶(由ApR编码的酶)测试阳性(Chevallier和Aigle,1979)。相反，发现在没有选择时仍维持其发酵木糖能力的最终稳定转化子，1400(LNH-ST)为青霉素酶测试阴性。如果该外源DNA在5S rDNA位点处整合，此结果是预期的因为ApR不是整合到宿主染色体中此DNA片段的一部分。有些稳定的酵母转化子可含有在酵母染色体ARS位点整合的外源基因也是可能的。
为了促进对本发明及其特征和优势的进一步理解，提供了下面的实施例。然而应该明白这些实施例是对本发明的说明而不是限制。
                     实施例1
             通过PCR合成5S rDNA片段
为了通过PCR合成5S rDNA片段(以用作定向高拷贝数整合入酵母染色体中的酵母DNA序列)，根据发表的5S rDNA序列(Valenzuela，等.，1977)合成下面的寡核苷酸并且用作PCR反应的引物。除了5S rDNA序列，将定义SalⅠ限制位点的其它核苷酸也添加至引物的5′末端以利于将PCR合成的5S rDNA克隆入大肠杆菌的质粒中。
寡核苷酸Ⅰ: TTAGTCGACGTCCCTCCAAATGTAAAATGG。
寡核苷酸Ⅱ: AATGTCGACGTAGAAGAGAGGGAAATGGAG
将从融合酵母1400分离的染色体DNA用作PCR反应的模板。首先将PCR合成的5S rDNA片段克隆入大肠杆菌pBluescriptⅡ KS(-)质粒(Stratagene克隆系统，LA Jolla,CA)的SalⅠ位点中。得到的质粒命名为pKS-rDNA(5S)。
                     实施例2
将XHOⅠ位点插入克隆的5S rDNA序列中
通过寡核苷酸介导的定点诱变(Kunkel,1985；Kunkel等.，1987)修饰5S rDNA序列(Valenzula等.，1977)-29与-56之间的核苷酸序列。结果，将XhoⅠ限制位点插入上述的特异性位点。除了用pKS质粒而不是用质粒pTZ18U或pTZ19U之外，根据伯乐实验室公司提供的用于寡核苷酸介导的定点诱变的方法完成此任务。得到的含有突变5S rDNA的质粒命名为pKS-5S rDNA(XhoⅠ)。用下面的寡核苷酸完成定点诱变：GAGGGCAGGCTCGAGACATGTTCAGTAGG
                   实施例3
      从啤酒糖酵母DNA或其它在酵母
      中作为ARS而起作用的DNA中分离DNA片段
以Sau3A限制酶消化啤酒糖酵母DNA(或来自其它酵母或其它生物的DNA)并且将其克隆入pUCKm6的BamHⅠ位点中(图12)(Ho，等.，1984)。用得到的质粒库转化啤酒糖酵母。筛选出那些能够于含有YEPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％葡萄糖)和50μg/ml遗传霉素的平板上生长并且也为青霉素酶测试(Chevallier和Algle,1979)阳性的转化子。通过类似于Ward(1990)所述的方法回收筛选出真转化子的质粒。
插入pUCKm6(图12)并且以酵母转化子中回收的酵母DNA片段都应含有可在啤酒糖酵母，可能也在其它酵母中作为ARS(自主复制序列)而起作用的DNA片段。将DNA插入子以各种限制酶消化并将得到的DNA片段重新插入pUCKm6中。用后者的质粒重新转化啤酒糖酵母。可使pUCKm6作为酵母质粒而有效发挥作用的任何适当大小的限制片段必需含有有效的“ARS”并且可用于构建复制/整合性载体如pLNH-ST用于高拷贝数整合外源基因至啤酒糖酵母的染色体中。这些限制片段也可能在其它酵母中作为ARS而起作用，并且适于构建其它酵母的复制/整合性质粒。
                  实施例4
从遗传霉素(卡那霉素)抗性基因，KmR中去除XHOⅠ限制位点
实施例1中所述的来自Tn903的遗传霉素(卡那霉素)抗性基因，kmR(A.Oka等.，1981)和5S rDNA片段为设计用于整合多拷贝外源基因至酵母染色体中质粒的一部分。然而，KmR在其编码序列中含有XhoⅠ位点。这与下面的事实相冲突，即XhoⅠ位点被加工入克隆的5SrDNA序列中心以用于插入外源基因如XR、XD和XK至用于整合的质粒中。因此，从KmR中去除XhoⅠ位点是必要的。这可通过多种不同的方法完成，本申请人选用定点诱变通过重叠延伸的PCR技术(S.N.Ho等.，1989)以去除KmR中的XhoⅠ位点而不改变其氨基酸编码序列且不影响由该基因所编码的酶的催化活性。按上述将克隆于pUCKm6中的KmR基因(图12)转变为KmR(-Xho)。
用于完成此任务的四种寡核苷酸列表如下。寡核苷酸Ⅰ: GGCCAGTGAATTCTCGAGCAGTTGGTG寡核苷酸Ⅱ: TGGAATTTAATCGCGGCCCCTAGCAAGACG寡核苷酸Ⅲ: TTACGCCAAGCTTGGCTGC寡核苷酸Ⅳ: TTCAACGGGAAACGTCTTGCTAGGGGCCGC
pUCKm6(图12)为pUC9的衍生物。寡核苷酸Ⅰ的一部分和整个寡核苷酸Ⅲ根据pUC9多接头区域的序列(Sambrook，等，1989)合成。
pUCKm6的上述的遗传操作不仅导致了KmR编码区XhoⅠ限制位点的缺失，而且在pUCKm6的KmR编码序列和EcoRⅠ位点之间插入XhoⅠ限制位点。将得到的质粒命名为pUCKm(-XhoⅠ)(+XhoⅠ)。添加XhoⅠ位点至KmR编码序列下游以利于插入实验例1中所述5S rDNA片段至新开发的质粒pUCKm(-Xho)(+Xho)中。
               实施例5
          质粒pLNH-ST的构建
实施例4中所述的质粒pUCKm(-XhoⅠ)(+XhoⅠ)用于构建pLNH-ST，如图9中所示。首先，从pKS-5S rDNA(XhoⅠ)中分离含有5S rDNA(XhoⅠ)的SalⅠ片段并且插入pUCKm(-XhoⅠ)(+XhoⅠ)的XhoⅠ位点。得到的质粒命名为pUCKm-rDNA(5S)。对于后者的质粒，将含有从啤酒糖酵母分离的有效ARS(根据实施例3中所述方法)的EcoRⅠ片段插入到pUCKm-5S rDNA的EcoRⅠ位点中，并将得到的质粒命名为pUCKm-5S rDNA-ARS。对于后者的质粒，将含有融合至酵母乙醇脱氢酶启动子(XR)和丙酮酸激酶启动子(用于XD和XK)克隆的XR、XD和XK来自pKS(-)-KK-AR-KD-3的XhoⅠ片段插入到位于克隆5S rDNA序列中心的XhoⅠ位点中。将得到的质粒，pUCKm-rDNA(5S)(KDR)-ARS也命名为pLNH-ST，显示于图9中。
               实施例6
用pLNH-ST转化融合酵母1400并且筛选稳定的
        转化子1400(LNH-ST)
在用于通过质粒pLNH32和pLNH33转化菌株1400的条件下(国际公开No.95/13362,1995年5月18日，公开国际申请No.PCT/US94/12861,1994年11月8日提交)通过电穿孔转化融合菌株1400。简言之，将培养至早对数期的50ml酵母细胞(Klett单位(KU)140-190)离心以去除培养基，以冷水洗2次，以冷的1M山梨糖醇洗1次。并且重悬于200μl 1M的山梨糖醇中。将60μl的细胞转移入4ml预先灭菌的塑料管(带盖)中并且向其中加入1μg质粒DNA。将50μl得到的细胞和质粒混合物转移至具有0.2cm电极间距的预冷的基因脉冲仪小池中并将小池中的内容物通过基因脉冲仪以脉冲控制器(伯乐)以2.0KV,25μF,200 ohms施以脉冲。
立即，将50ml YEPD加入到小池中。将小池的内容物转移至新的4ml的无菌塑料管中并于30℃孵育1小时。将100μl的此细胞铺板于含有YEPD和40μg/ml G418(遗传霉素)的琼脂板上。筛选快速生长的菌落并于含有相同培养基的另一平板上复制。筛选出的菌落进行氨苄青霉素测试(Chevallier和Aigle,1979)直至鉴定出阳性的菌落。上述的电穿孔方法是基于Becker和Guarenk报导的方法(1971)。
一旦通过青霉素霉测试鉴定转化子为阳性，将其维持于YEPX(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％木糖)的平板上。起初，这些转化子不稳定。如果培养于YEPD培养基中超过20代，则它们丧失其木糖发酵能力。然而，通过在YEPX平板上继续将这些转化子培养至稳定期，并且反复将它们转移至新鲜YEPD平板上，这些转化子相对于其发酵木糖能力逐渐变得稳定。一旦稳定，这些转化子可培养于非选择性培养基中几百代或更多并且仍能够共发酵葡萄糖和木糖。
            实施例7
以1400(LNH-ST)共发酵葡萄糖和木糖
葡萄糖和木糖的混合物(约10％葡萄糖和5％木糖)由菌株1400(LNH-ST)在下述的条件下加以发酵。将1400和1400(LNH-ST)的种子培养物有氧培养于液体YEPD培养基中直至中-对数期(400-500Klett单位(KU)之间)并且贮藏于4℃。通过转移2ml培养物至50ml新鲜YEPD中并按上述培养而每月1次制备新的种子培养物。将2ml的1400(LNH-ST)种子培养物接种至300ml具有侧臂的Erlenmeyer培养瓶中的100ml YEPD培养基中，这允许通过Klett比色计直接监测酵母培养物的生长。将培养物于30℃和200rpm有氧孵育于摇床中。
当细胞浓度达到中-对数期(400-450KU)时，将200ml(50％)葡萄糖和10ml(50％)木糖加入到培养瓶中。彻底混合后，从培养瓶中取出1ml培养混合物用作零样品。然后以Saran包裹膜密封培养瓶以使发酵在无氧下进行。以适当的间隔(每6小时)取出1ml发酵培养基样品以用作通过实施例9中所述的HPLC在发酵期间测定葡萄糖、木糖、木糖醇和甘油含量的样品。图11中所示的结果表明遗传工程的酵母1400(LNH-ST)可在30小时中共发酵10％葡萄糖和5％木糖中的大部分至乙醇。此发酵在正常的条件下完成，无需特殊的培养基或pH，并且也无需酵母生长至高的细胞浓度。因此，遗传工程的1400(LNH-ST)可有效地共发酵高浓度的葡萄糖和木糖至乙醇，产生很少量的木糖醇作为副产物，与显示于图2和3中的重组糖酵母1400(pLNH32)和1400(pLNH33)相比，1400(LNH-ST)较2种以前开发的酵母在一定速度上更好地同时共发酵葡萄糖和木糖。
                   实施例8
      培养于非选择性培养基中4、20或40代后
      在共发酵葡萄糖和木糖方面稳定的菌株1400
     (LNH-ST)与1400(LNH32)和1400
           (LNH33)的比较
如实施例7中所述，将2ml 1400(LNH-ST)、1400(LNH32)和1400(LNH33)的每种种子培养物接种至分别位于具有侧臂的250mlErlenmeyer培养瓶中的50ml YEPD中。细胞培养至400-500KU时，将每个培养瓶中的2ml新鲜培养物转入新的培养瓶中。该方法对于1400(LNH-ST)重复10次并且对于1400(LNH32)和1400(LNH33)重复5次。在非选择性培养基中培养4、20和40代的1400(LNH-ST)培养物(每次转移被看作为培养于非选择性培养基中培养的4代)用于在与实施例7中所述类似的条件下共发酵葡萄糖和木糖。与实施例7中所述的一致方式采集和分析发酵样品。类似地，在非选择性培养基中培养4和20代的1400(LNH32)和1400(LNH33)培养物用于共发酵葡萄糖和木糖。发酵开始后再次以适当的间隔采集样品用于通过HPLC的分析并且在图4至6中作比较。这些结果清楚地表明地非选择性培养基中培养大于40代后，1400(LNH-ST)在维持其木糖发酵能力方面要远较1400(LNH32)和1400(LNH33)稳定。
                    实施例9
               发酵样品的HPLC分析
将从培养物中取出的含有发酵培养基的样品(0.6ml至1.0ml)保存于1.5ml的Eppendort管中。通过在微离心管(microfuge)中(高速)离心10分钟而去除细胞和其它残余物。将上清稀释10倍。根据下面的条件用Hitachi系统通过高效液相色谱(HPLC)分析得到稀释样品的乙醇-葡萄糖、木糖、木糖醇和甘油含量。
柱：伯乐HPX-87H
移动相：0.005M H2SO4
流速：0.8ml/分钟
检测：RI检测器
温度：60℃
注射体积：20μl
                  实施例10
来自稳定转化子1400(LNH-ST)染色体DNA的遗传特征
根据限制和PCR分析，如图9B中所示，已测定存在于pLNH-ST中克隆基因KK、AR、KD和5S rDNA的遗传图谱(顺序和方向)。设计实验以测定是否这些基因(KK、AR和KD)已整合入5S rDNA的位点中。如果这些基因按预期已在5S rDNA的位点整合入酵母染色体中，含有部分或完整基因如5S rDNA-KK；5S rDNA-KD；KK-AR和AR-KD下面组合的DNA片段的正确大小应该通过用1400(LNH-ST)染色体DNA作为模板并且用显示于遗传图谱(图9B)上的寡核苷酸作为引物以通过PCR完成DNA合成而加以获得。如果这些基因没有整合入酵母染色体中，没有这些基因或基因片段的这种组合应通过上述的实验来获得。如果这些基因整合入酵母染色体中的别处而不是5S rDNA的位点，这些基因或基因片段的一些上述组合应该用上述的实验加以获得，但是含有5S rDNA片段的那些基因不应该用上述的实验加以获得；如5S rDNA-KK和5S rDNA-KD。为了完成上述的实验，用Qiagen,Chatsworth,CA提供的方法从1400(LNH-ST)中分离染色体DNA。用下面的引物对(见图9):Oligo25和Oligo369；Oligo26和Oligo369；Oligo370和Oligo96；Oligo97和Oligo99；Oligo982和Oligo27根据PCR合成获得阳性结果。因此，根据这些分析，含有KK-AR-KD的DNA片段似乎的确在其5S rDNA位点处整合入1400酵母染色体中。
                      参考文献
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Claims (30)

1．将木糖发酵为乙醇的酵母，包括：在酵母多个重复核糖体DNA位点的每个位点具有整合基因的酵母，所述的基因编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶。
2．权利要求1的酵母，也将葡萄糖发酵为乙醇。
3．权利要求2的酵母，为糖酵母属。
4．权利要求3的酵母，其中所述的位点为非转录DNA位点。
5．权利要求1的酵母，其中所述的基因融合到不受葡萄糖抑制的启动子上并且该酵母同时将葡萄糖和木糖发酵为乙醇。
6．权利要求5的酵母，其中的启动子无需木糖诱导。
7．权利要求3的酵母，其中的基因融合至不受葡萄糖抑制的启动子上并且该酵母同时将葡萄糖和木糖发酵为乙醇。
8．权利要求4的酵母，其中的基因融合至不受葡萄糖抑制的启动子上并且该酵母同时将葡萄糖和木糖发酵为乙醇，这些启动子也无需木糖用于诱导。
9．权利要求6的酵母，其中的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因来自将木糖发酵为乙醇的天然酵母。
10．权利要求9的酵母，其中的天然酵母为休哈塔假丝酵母、具柄毕赤酵母或Pachysolen tannophilus。
11．权利要求9的酵母，其中的木酮糖激酶基因来自酵母或细菌。
12．权利要求11的酵母，其中的木酮糖激酶基因来自休哈塔假丝酵母、具柄毕赤酵母、Pachysolen tannophilus、啤酒糖酵母、粟酒裂殖糖酵母或大肠杆菌。
13．具有在酵母的至少约10个核糖体DNA位点整合的所述基因的权利要求1的酵母。
14．用于整合多拷贝外源DNA至细胞重复染色体DNA中的方法，包括：
(a)以具有包括第一种筛选标记外源DNA的复制和整合性质粒转化细胞；和
(b)反复复制步骤(a)的细胞以制备许多代的子代细胞同时筛选包括此筛选标记的细胞，从而促进该复制和整合性质粒在随后子代细胞中的保留并且制备具有多拷贝整合外源DNA的子代细胞。
15．权利要求14的方法，其中的质粒DNA也包括用于筛选包括此质粒细胞的第二种筛选标记。
16．权利要求14的方法，其中的细胞为酵母或真核细胞，并且其中的方法进一步包括反复复制步骤(b)的子代细胞的步骤从而在对于包括此筛选标记的细胞无选择的条件下制备许多代的子代细胞，从而促进该质粒在随后子代细胞中的丢失并且回收每个含多拷贝整合到其染色体DNA中外源DNA的酵母细胞。
17．权利要求16的方法，其中的细胞为酵母细胞并且外源DNA包括编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的基因，它们同时用作第一种筛选标记。
18．权利要求14的方法，其包括：
(ⅰ)从具有包括筛选标记的外源DNA的复制性质粒转化酵母细胞，该外源DNA的每个侧翼端为与宿主DNA重复序列同源的DNA序列；
(ⅱ)反复复制步骤(ⅰ)的转化酵母细胞以制备许多代的子代细胞同时筛选包括该筛选标记的细胞，从而促进该复制性质粒在随后子代细胞中保留并得到每个含有多拷贝整合外源DNA的子代细胞；和
(ⅲ)复制步骤(ⅱ)的子代细胞以在对于包括该筛选标记的细胞缺乏选择的条件下制备许多代子细胞，从而促进该质粒在随后子代细胞中的丢失并且回收每个含多拷贝整合到其染色体DNA中外源DNA的酵母细胞。
19．由权利要求18的方法制备的酵母细胞。
20．权利要求19的酵母细胞，其中的外源DNA包括编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的基因，并且此酵母细胞发酵木糖至乙醇。
21．权利要求20的酵母细胞，其中所述的基因融合至无需木糖诱导并且不受葡萄糖抑制的启动子上，并且其中的酵母细胞同时发酵葡萄糖和木糖至乙醇。
22．根据权利要求21的酵母细胞，它们在非选择条件下培养至少20代时基本上维持其发酵木糖至乙醇的能力。
23．发酵木糖至乙醇的酵母，包括：
具有多拷贝整合入该酵母染色体DNA中外源DNA的酵母，该外源DNA包括编码融合至不受葡萄糖抑制启动子上的木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶的基因，该酵母同时发酵葡萄糖和木糖至乙醇并且当在非选择条件下培养至少20代时仍然基本上维持其发酵木糖至乙醇的能力。
24．权利要求23的酵母，其中所述的启动子无需木糖诱导。
25．发酵木糖至乙醇的酵母，包括：
具有多拷贝导入的含有编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶基因DNA的酵母，该酵母发酵木糖至乙醇并且当在非选择条件下培养至少20代时仍然基本上维持其发酵木糖至乙醇的能力。
26．权利要求25的酵母，其中的启动子无需木糖诱导。
27．用于发酵木糖至乙醇的方法，包括用权利要求1、22、23、24、25或26的酵母发酵含有木糖的培养基以制备乙醇。
28．用于整合包括第一种筛选标记的外源DNA序列至靶酵母细胞染色体DNA中的质粒载体，该质粒载体含有有功能的酵母DNA复制起点和外源DNA，后者的每个侧翼端为与靶酵母细胞的重复核糖体DNA序列同源的DNA侧翼序列，该质粒在此DNA侧翼序列之间以外的位置进一步包括第二种筛选标记。
29．用于整合外源DNA序列至酵母中以形成发酵木糖至乙醇的稳定整合体的质粒载体，该质粒载体含有有功能的酵母DNA复制起点和包括编码木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶基因的外源DNA，后者的每个侧翼端为与靶酵母细胞的重复DNA序列同源的DNA侧翼序列。
30．用于形成具有多拷贝整合外源DNA片段细胞的方法，包括：
复制具有重复基因组DNA并且含有具有外源DNA的复制和整合性质粒的细胞以制备多代的子代细胞同时筛选包括筛选标记的细胞，从而促进该复制和整合性质粒在随后子代细胞中的保留并且制备具有多拷贝整合外源DNA的子代细胞。
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