JP7473137B2 - シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株 - Google Patents
シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7473137B2 JP7473137B2 JP2022106237A JP2022106237A JP7473137B2 JP 7473137 B2 JP7473137 B2 JP 7473137B2 JP 2022106237 A JP2022106237 A JP 2022106237A JP 2022106237 A JP2022106237 A JP 2022106237A JP 7473137 B2 JP7473137 B2 JP 7473137B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- strain
- gene
- paura3
- medium
- pae
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241001661345 Moesziomyces antarcticus Species 0.000 title description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 326
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 208
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 82
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 42
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 33
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 28
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 23
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 claims description 23
- 241000556225 Pseudozyma sp. Species 0.000 claims description 14
- 101100352158 Arabidopsis thaliana PHYA gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101100120630 Candida albicans (strain SC5314 / ATCC MYA-2876) CFL1 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101100120631 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) FRE1 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101150075580 Xyn1 gene Proteins 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 101
- 241000519593 Pseudoalteromonas antarctica Species 0.000 description 74
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 74
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 71
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 70
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 62
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 46
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 42
- 241000893045 Pseudozyma Species 0.000 description 40
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 30
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 30
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 24
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 18
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 18
- SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 5-fluoroorotic acid Chemical compound OC(=O)C=1NC(=O)NC(=O)C=1F SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 15
- 101150024380 LYS12 gene Proteins 0.000 description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 14
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 13
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 12
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 239000007218 ym medium Substances 0.000 description 11
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 10
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 10
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 10
- 102100030981 Beta-alanine-activating enzyme Human genes 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 101000773364 Homo sapiens Beta-alanine-activating enzyme Proteins 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 8
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 229920009537 polybutylene succinate adipate Polymers 0.000 description 7
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 6
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 6
- 101150014580 LYS20 gene Proteins 0.000 description 5
- 241000222180 Pseudozyma tsukubaensis Species 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 5
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 5
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 101150072127 CTR1 gene Proteins 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100170937 Mus musculus Dnmt1 gene Proteins 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100455762 Aspergillus niger (strain CBS 513.88 / FGSC A1513) lysA gene Proteins 0.000 description 3
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 3
- 101150044775 LYS1 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150118523 LYS4 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150038802 LYS9 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 241001092921 Plocamaphis flocculosa Species 0.000 description 3
- 101100289883 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) lys2 gene Proteins 0.000 description 3
- 101150044776 URA5 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000002362 mulch Substances 0.000 description 3
- 229960000988 nystatin Drugs 0.000 description 3
- VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N nystatin A1 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/CC/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 3
- -1 /or Species 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 2
- 108091004554 Copper Transport Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037773 Copper transporters Human genes 0.000 description 2
- 108091006566 Copper transporters Proteins 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 241001661343 Moesziomyces aphidis Species 0.000 description 2
- 241001661347 Moesziomyces rugulosus Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 101150065672 FRE1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062427 GDP-mannose 4,6-dehydratase Proteins 0.000 description 1
- 102000002312 GDPmannose 4,6-dehydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 101710098556 Lipase A Proteins 0.000 description 1
- 101710098554 Lipase B Proteins 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 101710099648 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 102100026001 Lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase Human genes 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101100512075 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) LYS12 gene Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NRAUADCLPJTGSF-ZPGVOIKOSA-N [(2r,3s,4r,5r,6r)-6-[[(3as,7r,7as)-7-hydroxy-4-oxo-1,3a,5,6,7,7a-hexahydroimidazo[4,5-c]pyridin-2-yl]amino]-5-[[(3s)-3,6-diaminohexanoyl]amino]-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl] carbamate Chemical group NCCC[C@H](N)CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(N)=O)[C@@H](CO)O[C@H]1\N=C/1N[C@H](C(=O)NC[C@H]2O)[C@@H]2N\1 NRAUADCLPJTGSF-ZPGVOIKOSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N halothane Chemical compound FC(F)(F)C(Cl)Br BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 229920001748 polybutylene Polymers 0.000 description 1
- 229940050929 polyethylene glycol 3350 Drugs 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
- Y02W30/00—Technologies for solid waste management
- Y02W30/50—Reuse, recycling or recovery technologies
- Y02W30/62—Plastics recycling; Rubber recycling
Description
〔1〕シュードザイマ・アンタクティカ(Pseudozyma antarctica)GB-4(0)株(受託番号NITE P-02392)。
〔2〕シュードザイマ・アンタクティカGB-4(0)株(受託番号NITE P-02392)の栄養要求性変異株。
〔3〕リジン要求性又はウラシル要求性である、前記〔2〕に記載の栄養要求性変異株。
〔4〕シュードザイマ属菌の栄養要求性変異株であって、LYS2、LYS12、及び/又はLYS20の塩基配列の少なくとも一部に変異を有するか、又は、URA3及び/又はURA5の塩基配列の少なくとも一部に変異を有することを特徴とする、栄養要求性変異株。
〔5〕LYS12タンパク質のMet1~Glu195をコードする遺伝子の少なくとも一部の欠失を有するか、又は、URA3塩基配列の113番目のCの置換、867番目のCの置換、及び/又は614番目のTの欠失を有する、前記〔4〕に記載の栄養要求性変異株。
〔6〕前記シュードザイマ属菌が、偽菌糸を形成しないシュードザイマ属の菌株である、前記〔4〕又は〔5〕に記載の栄養要求性変異株。
〔7〕目的のタンパク質を発現するシュードザイマ属菌の形質転換体であって、
前記形質転換体が、栄養要求性変異株の形質転換体であり、
前記形質転換体が、遺伝子カセットを少なくとも1つ有し、
前記遺伝子カセットが、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子、シュードザイマ属菌のXYN1又はFRE1のプロモーター、及び、前記栄養要求性変異株の栄養要求性を相補する遺伝子を含み、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子が、前記プロモーターの下流に位置していることを特徴とする、形質転換体。
〔8〕前記目的のタンパク質が、シュードザイマ属菌のタンパク質、又は、シュードザイマ属菌以外の生物のタンパク質である、前記〔7〕に記載の形質転換体。
〔9〕前記目的のタンパク質をコードする遺伝子で使用されているコドンが、シュードザイマ属菌が使用するコドンに最適化されている、前記〔7〕又は〔8〕に記載の形質転換体。
〔10〕シュードザイマ・アンタクティカGB-4(0)L1-S12株(受託番号NITE P-02393)、GB-4(0)PGB480株(受託番号NITE P-02638)、GB-4(0)PGB469株(受託番号NITE P-02639)、及びGB-4(0)PGB474株(受託番号NITE P-02640)からなる群から選択される、シュードザイマ・アンタクティカの形質転換体。
〔11〕目的のタンパク質を生産する方法であって、
シュードザイマ属菌の栄養要求性変異株を用意する工程、
前記栄養要求性変異株に、遺伝子カセットを少なくとも1つ導入する工程、及び、
前記遺伝子カセットを導入した栄養要求性変異株を培養して、前記目的のタンパク質を生産する工程、
を含み、
前記遺伝子カセットが、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子、シュードザイマ属菌のXYN1又はFRE1のプロモーター、及び、前記栄養要求性変異株の栄養要求性を相補する遺伝子を含み、前記目的のタンパク質をコードする遺伝子が、前記プロモーターの下流に位置していることを特徴とする、方法。
〔12〕安定化された生分解性プラスチック分解酵素を取得する方法であって、
前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液を用意する工程、
前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液にエタノールを添加して、前記生分解性プラスチック分解酵素を安定化する又は沈殿させる工程、及び、
前記安定化した又は沈殿した生分解性プラスチック分解酵素を回収する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
〔13〕前記エタノール添加工程の前に、前記生分解性プラスチック分解酵素を濃縮する工程をさらに含む、前記〔12〕に記載の方法。
〔14〕前記生分解性プラスチック分解酵素を、前記〔11〕に記載の方法に従って生産する工程をさらに含む、前記〔12〕又は〔13〕に記載の方法。
本発明のシュードザイマ・アンタクティカ(P.アンタクティカ)の新規菌株は、GB-4(0)株であり、これは本件特許出願の直前に初めて独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されたものである(受託番号NITE P-02392)。本明細書に記載の「シュードザイマ・アンタクティカ」とは、イネやムギなどのイネ科植物の葉面に生息し得るシュードザイマ属菌(酵母)の一種であり、生分解性プラスチック分解酵素などを産生し得るものである。前記P.アンタクティカGB-4(0)株は、寄託されるまでは本発明者らの管理下で保管されており、たとえ譲渡の申出があったとしても本発明者らはその申出に応じる意志はなかったし、実際に他人に譲渡されたこともなかった。
前記栄養要求性変異株は、いずれの栄養に対する要求性が変化したものであってもよく、特に制限される必要はないが、例えば、リジン要求性又はウラシル要求性であってもよい。前記栄養要求性変異株がリジン要求性である場合には、当該変異株は、シュードザイマ属菌におけるリジンの生合成に関わる酵素をコードする遺伝子、例えば、LYS1、LYS2、LYS4、LYS9、LYS12、及び/又はLYS20の塩基配列の少なくとも一部に変異を有していてもよい。前記栄養要求性変異株がウラシル要求性である場合には、当該変異株は、シュードザイマ属菌におけるウラシルの生合成に関わる酵素をコードする遺伝子、例えば、URA3及び/又はURA5の塩基配列の少なくとも一部に変異を有していてもよい。P.アンタクティカのリジンの生合成に関わる酵素及びウラシルの生合成に関わる酵素をコードする遺伝子の塩基配列、並びにそれらの推定アミノ酸配列は、以下のとおりである。
ATGTCTGCCGCCGCCAACCGACAGCCCCTCTACCTCCGCTGCGAGATGAAGCCGGCCGAGCATCGTGCCGCGCTCACGCCCACCACCGCCAAGAAGCTCATCGAGGCCGGCTTCGACATCACCGTCGAGTCGGACCCGCAGCGCATCTTTGACGACAAGGAGTACGCCGACGTCGGCTGCACCATCGCCAAGCACAACACCTTCCACTCGCTCCCCAAGCACATCCCCATCATCGGCCTCAAGGAGCTCGAGGAGCCCGGTCCGGATCTGCCGCACACGCACATCCAGTTTGCGCACTGCTACAAGAAGCAGGCCGGCTGGGTCGACGTGCTCGGCCGCTTCAAGCGCGGCGGCGGAAAGCTCTACGATCTCGAGTTCCTCGAGGACAGCAACGGCCGTCGTGTCGCTGCGTTTGGCTGGCACGCCGGATTCGCCGGTGCGGCGCTCGGCCTGCTGGCGCTCGCCGAGCAGGTGCAGGGTGCCGAGCGCCGTCTGGGCCCGCAGAAGGCGTACCCGAACGAGCAGGCGCTCATCGCTCACGCCAAGCAGCAGATCGAGCACATCCGCAACTCGCGCGCCGACGGCAAGGTCAAGGCGCTCGTCGTGGGTGCGCTCGGCAGGTGCGGTCGGGGCGCCATCGACTTTTTCGAAAAGGCCGGCGTGGCGCCCGAAGACATTGTGCGCTGGGACATGAAGGAGACCTCGGCCAAGCACGGTCCGTACCAGGAGCTGCTCGACGTCGACATCTTTGTCAACTGCATCTACCTCACCTCCAAGATCCCGCCCTTCCTGGACGAGGCGACCATCCAAGCGGCGGGTGCCGAGCGCCGTCTCGGCGTGGTGGTGGACGTGTCGTGCGATACCACCAACCCCAACAACCCGCTGCCCATCTACAGCATCAACACCACCTTTGACAAGCCCACCGTCGACGTCGACACGGGTGCAGGCAACCCGGCGCTCAGCGTCATCTCGATCGACCACCTCCCCACGCTGCTCCCGCGCGAGAGCTCCGAGGGCTTCAGCAACGACCTCCTCCCCAGCCTGCTCCAGCTGCCCCTCGTGCTCGGCAAGGACACCACGCAGCTCGACACGCTCGAAGAGGGCAAGGGCGCCGTGTGGCAGCGCGCCGAAAAGCTCTTCCGACACCACCTCGCAGACGCAGAGAAGAACGGCGCCTGA(配列番号1)
・LYS1タンパク質の推定アミノ酸配列
MSAAANRQPLYLRCEMKPAEHRAALTPTTAKKLIEAGFDITVESDPQRIFDDKEYADVGCTIAKHNTFHSLPKHIPIIGLKELEEPGPDLPHTHIQFAHCYKKQAGWVDVLGRFKRGGGKLYDLEFLEDSNGRRVAAFGWHAGFAGAALGLLALAEQVQGAERRLGPQKAYPNEQALIAHAKQQIEHIRNSRADGKVKALVVGALGRCGRGAIDFFEKAGVAPEDIVRWDMKETSAKHGPYQELLDVDIFVNCIYLTSKIPPFLDEATIQAAGAERRLGVVVDVSCDTTNPNNPLPIYSINTTFDKPTVDVDTGAGNPALSVISIDHLPTLLPRESSEGFSNDLLPSLLQLPLVLGKDTTQLDTLEEGKGAVWQRAEKLFRHHLADAEKNGA(配列番号2)
ATGGCGTCTTCCTCAGCGTTGCAGGCGAGCTTGGATCGATGGTCGGCGCGGCTGACCTCGCTTCCAAGCATCGCACTGCCCACCGACTATCCACGACCTGCCACCTCGCAGCTCGTACAGGCACTCTCGTCGTCGACGCTCTCCTCGGCCACAAGAAAGGACCTCGTGCGTCTGGCTCTCCACCACGAGCTCGACCTGCATCCCGCCGAGCACGCTGATGATGACGAGGACAACGCGAGCCCGACGCCGTTCCACCTGCTCCTCGCCGCGTTCTGCGTGCTCCTTCACCGATACACAGGCGACACGGACCTCGTCATTGGCTCGTCCAACCCATACACGGGCGAGCCTCTCATCCTCAGGATCCCCATCGAGCCCAACGATCCCTTCTGGCAGATCGTCCGCCGCATACAGCAGGTCGAGAAGGAGGCGGCCGCCGATGCCGTGCCGTACGACGAGATCGTCAAGCGCGTCGAGGCCGAGCGTGCCGAGCGAGAGGGCCCGCTGCCCGAAGGCGTGCAGAGCGCACCCATCTTCCGCGTCCGCTTCTTCGACGAGACAGGCGGCAAGGCTCGCAACTTCATGCAGTCGACATCGCTCACCACCGACCTCACCGTCTTCCTCACCAAGCCCGGTGCCACACCCGGCGACGACTCGGCCAACGCGGCCACCCCTGCGGAATCGGCCACGCCTTCGTCCCACACGTTCCGCGACTCGTTGGTGCCCAACATCGCCGTGCACCTGTCGTACAACTCGCTGCTCTTCTCCTCGCAGCGCATGCAGCTCATCCTCGCCCAGCTCTCCCAGCTCATCTCCGTCGCTGCATCCAACCCAGCCGCCGCCGTCGGCAGCCTGCCCATCCGCACGCCGCAAGAGAACGCATTCCTGCCGGACCCCACCAAGGACCTCGAGTGGTGCGGATTCCGCGGCGCCATCACACAGATCTTTGAGCGCAACGCACGCGCGCACCCGGACCGCAGGTGCATCGTCGAGTCGCTTGCCGACGACTCGGGCTCGCTCGCCGAGCCCTCGGCTCCGGCAAGCCGCGTGCGCGAAATCACCTACGGCCAGCTCGACCGCGCCTCCAACGTGGTCGCTCACCATCTCCTCCAGGCAGGTGTCCAGCGCGAGGAGGTCGTTACGACCTACGCCCACCGTGGTGTCGACCTCGTCGTCGCTGTTCTCGGTACGCTCAAGGCCGGCGCGACATTCAGCGTGATCGACCCGGCGTACCCGCCTTCGCGCCAGAACATCTACCTCCAGGTCGCCAAGCCTCGCGCCCTGATCGTGCTGGCCAAGGCAGGCGTCCTGCAGCCCTCGGTGCGCAAGTGCATCCAGGACGAGCTCGAACTCCGCACCGAGGTCCCAGCGCTCGAGCTGCTCGATGACGGCTCCGTTCGGGGTGGCGCTGCGTCGCAAGGCGGTGCTGATGTGCTCGAACAGCAGCAGGCGCTGGCGGGCGAGAGCACCAACGTCGTGCTGGGTCCCGACAGCGTGGGTACGCTCTCGTTCACCTCCGGATCCACCGGCATTCCCAAGGGTGTCAAGGGACGCCACTTTTCGCTCACCCACTTCTTCCCCTGGATGGGCGAGCGCTTCGGCCTCGGAGCGCACGAGCGATTCACCATGCTTTCCGGTATCGCCCACGACCCCATCCAGCGCGACATCTTCACTCCGCTCTTCTTTGGCGCCGAGCTGCACATCCCCACATCCGAGGATATCGGTACGCCTGGCCGTCTCGCCGAGTGGATGGCGGCGACCAAGGCGACCGTCACGCACCTCACCCCCGCCATGGGTCAGCTGCTGAGTGCGCAGGCGACGGCGCTGATCCCTTCGCTTCGCAACGCCTTCTTTGTGGGTGACGTGCTCACCAAGCGCGACTGCACGCGTCTGCAGGCGCTTGCCGCCAACGTCTGCATCATCAACATGTACGGCACCACCGAGACGCAGCGTGCGGTGAGCTACTTTGCCATCCCTCCCGTCAGCACCTCGACCACCTTCCTGCAGACGCAGAAGGACATCATGCCCGCCGGACAAGGAATGATCAACGTCCAGCTGCTCGTCGTCAACCGCAACGAGCGCACCGCCACCTGCGCCGTGGGCGAAGTCGGAGAGATCTACGTCCGCAGCGGTGGCTTGGCCGAGGGTTACCTTGGACCCCCGGAGGTGACGGCTGAAAAGTTCATGCCCAACTTCCTCGCGCCCAACCTCAGCTTCCCCGATACCATCAAGGACAAGCCCGAGGGTCAGTTCTGGAAGGGTATCCGCGACCGCATGTACAAGACGGGTGACCTGGGTCGCTACCTCGCCGACGGCACCGTCGAGTGCACGGGCCGTGCCGACGACCAGATCAAGATCCGCGGCTTCCGCATCGAGCTCGGCGAGATCGACACGCACCTTTCGCGCCACCCGCACGTGCGCGAGAACGTGACGCTCGTACGTCGCGACAAGGACGAGGAGAAGGTGCTCGTTTCTTACTTTGTGCCCGGCGCCGGTGCTGCCGAGTTCGAGGAGCAGGTCACCGAGGACGACGAGGGCGCAGCGGCGGCAGGAGGCAAGGCCGCCCGCGACGCCATGCTCGTCAAGGGCATGCGCCGTTACCGCACGCTCATCAAGGACATCCGCGACCACCTCAAGCGGAAGCTGCCGGCCTACTCGGTGCCGACGCTGTTCGTTCCGCTGCACAAGATGCCGCTCAACCCCAACGGCAAGATCGACAAGCCTGCGCTGCCCTTCCCCGACACCGCCATGGTGGCCGCTGTGGGCTCGGGCAGCTCGTCCGGTGGCAAGAACGGTGCGGACGCTGCGGCTGCGCTGGCGGCTGCTTCGCCAACCGAGCGCTCCGTAACGGAGCTATGGTCGCGATTGCTGCCCAACGCACCCTCGCCGATCCCGCTCGACGAGAGCTTCTTCGACCTCGGAGGCCACTCGATCCTGGCCACGCGCCTGGTGTTCGAGATGCGCAAGCAGTTTGTCATCAACGTGCCTCTTGGAGTTGTCTTCGACGCTCCCACTGTTCGAGGTCTCGCCAAGGCTGTCGACCAGCTGCGCCAGGCCGATCTTGGCCTGGGTGCTTCGCAAGCCAACGGTTCGGCGGCCTCGGCCAAGCCGAGCGAGGAGGCGAACCTGGACGAGAACTACGGCGCCGACGTGGCAACGCTGACGCCGAGCCTGCCCGAGTCGTTTGCGGGTGACAAGGTCAAGACGGCTGCGGCAGGACCACGCACCGTGCTGGTGACGGGTGTCACTGGCTTCTTGGGCGCCTTTATCCTGTACGACTTGCTGACCAAGCGCGCGTCGAGCGTTGCCAAGGTGTACGCGCATGTGCGAGCCAAGGACGAGGCGAACGCGCTCGAGCGTCTGCGCGAGGGCTGCAAGGGCCGAGGCATCTGGGACGACAAGTGGGTGAGCGAGGGACGTCTCGAGGTGGTTCTGGGTGACCTGGCGGCACCGCAGCGCCTGGGCATGTCGGAGGCGGTGTACGCCAAGCTGGCGGACGAGGTGGACGACATCCTGCACAACGGTGCTCTCGTGCACTGGGTGTACCCCTACAGCAAGCTGCGTGCTGCCAATGTGGGCTCGACGATCTGTGCGATCAAGCTGTGCAACACGGGCAAGAAGGCCAAGACGCTCACGTTCGTGTCGAGTACCTCGGCGCTGGATACCGACCACTACATCCGACTGTCGGACTCGATCGTGCACGGTCAGGACCCTGCGCAGAATGGATCGGCGGAGCAGCTGCACGGTGTGCCCGAGACGGACGACATCGAGGCCAACAGCCGCGGCCTCACCACGGGCTACGGTCAGTCCAAGTGGGTGGCAGAGAAGCTCATCATGATCGCTGCGTCGCGCGGACTCAAGGCGTCGATCGTTCGACCGGGCTACGTCGTGGGTGACTCCACGACGGCGGTGACCAACACGGACGACTTCCTCTGGCGTCTCGTCAAGGGCTCGATCCAGCTGGGCTTGGTCCCCGATATGCACAACCCGATCAACATGGTGCCCGTCGACCATGTGGCGAGGATCGCCACGCTGGCTTGCCTCAACAATGCGCTGGAGCTCGACACGATCAACAAGACGCCTGGCACCAACGCCAAGGTGTTCCACGTGACCAACCACCCGAGCATCCGATTCAACGACATGCTCGGCCAGCTCAGCCGCTACGGCTGGAGGGTGGAAAAGACCGAGTACGTGCACTGGCGCGCGAGGCTCGAGGAGCACGTGCTCAGCACGGGCTCGGGCTCGGTCGAGGACAACGCGCTGTTCCCGCTGCTGCACTTTGTGCTGGACGACTTGCCGACGTCGACCAAGTCGCCTGAGCTGGACGACCGCCACACGCAGGCGATCCTCGACGCTGCCTCCGAGGGCAAAGCCCAAGGCACGGTCATGGGCGTCGACCGCTCGCTCGTTGGGACGTACCTCGCCTGGCTGCTGGCGGTTGGCTTCCTGCCTGCGCCGTCGCAGGCGGATGCGGAACCGCTGCAGCTTGCCAACATCGGCACAGAGATGAAGGCCATCGGCCGTGGATCCGCCAACTAG(配列番号3)
・LYS2タンパク質の推定アミノ酸配列
MASSSALQASLDRWSARLTSLPSIALPTDYPRPATSQLVQALSSSTLSSATRKDLVRLALHHELDLHPAEHADDDEDNASPTPFHLLLAAFCVLLHRYTGDTDLVIGSSNPYTGEPLILRIPIEPNDPFWQIVRRIQQVEKEAAADAVPYDEIVKRVEAERAEREGPLPEGVQSAPIFRVRFFDETGGKARNFMQSTSLTTDLTVFLTKPGATPGDDSANAATPAESATPSSHTFRDSLVPNIAVHLSYNSLLFSSQRMQLILAQLSQLISVAASNPAAAVGSLPIRTPQENAFLPDPTKDLEWCGFRGAITQIFERNARAHPDRRCIVESLADDSGSLAEPSAPASRVREITYGQLDRASNVVAHHLLQAGVQREEVVTTYAHRGVDLVVAVLGTLKAGATFSVIDPAYPPSRQNIYLQVAKPRALIVLAKAGVLQPSVRKCIQDELELRTEVPALELLDDGSVRGGAASQGGADVLEQQQALAGESTNVVLGPDSVGTLSFTSGSTGIPKGVKGRHFSLTHFFPWMGERFGLGAHERFTMLSGIAHDPIQRDIFTPLFFGAELHIPTSEDIGTPGRLAEWMAATKATVTHLTPAMGQLLSAQATALIPSLRNAFFVGDVLTKRDCTRLQALAANVCIINMYGTTETQRAVSYFAIPPVSTSTTFLQTQKDIMPAGQGMINVQLLVVNRNERTATCAVGEVGEIYVRSGGLAEGYLGPPEVTAEKFMPNFLAPNLSFPDTIKDKPEGQFWKGIRDRMYKTGDLGRYLADGTVECTGRADDQIKIRGFRIELGEIDTHLSRHPHVRENVTLVRRDKDEEKVLVSYFVPGAGAAEFEEQVTEDDEGAAAAGGKAARDAMLVKGMRRYRTLIKDIRDHLKRKLPAYSVPTLFVPLHKMPLNPNGKIDKPALPFPDTAMVAAVGSGSSSGGKNGADAAAALAAASPTERSVTELWSRLLPNAPSPIPLDESFFDLGGHSILATRLVFEMRKQFVINVPLGVVFDAPTVRGLAKAVDQLRQADLGLGASQANGSAASAKPSEEANLDENYGADVATLTPSLPESFAGDKVKTAAAGPRTVLVTGVTGFLGAFILYDLLTKRASSVAKVYAHVRAKDEANALERLREGCKGRGIWDDKWVSEGRLEVVLGDLAAPQRLGMSEAVYAKLADEVDDILHNGALVHWVYPYSKLRAANVGSTICAIKLCNTGKKAKTLTFVSSTSALDTDHYIRLSDSIVHGQDPAQNGSAEQLHGVPETDDIEANSRGLTTGYGQSKWVAEKLIMIAASRGLKASIVRPGYVVGDSTTAVTNTDDFLWRLVKGSIQLGLVPDMHNPINMVPVDHVARIATLACLNNALELDTINKTPGTNAKVFHVTNHPSIRFNDMLGQLSRYGWRVEKTEYVHWRARLEEHVLSTGSGSVEDNALFPLLHFVLDDLPTSTKSPELDDRHTQAILDAASEGKAQGTVMGVDRSLVGTYLAWLLAVGFLPAPSQADAEPLQLANIGTEMKAIGRGSAN(配列番号4)
ATGCGGCAGCAGCTGGCGGCTTCGGGGAAATGCCGAGATTGGGCTGCAGCCCACAACTCTCTTTTGAGCCACGTCCAAAGGCCCACTTTCAAATCGACACGAGAAGGCTTCTCCCTTCCTCCCATCCAAAGCACGACGCTTGCATTGCCGCTTCTCACCACTACCTCGCTCCGCATCGCCCAGCGTCGCATCATCATGAGGGCTGCAAACATGCTGCGCCTCGGCGCTTCCCGGCTCTCGACGCCGCTGCTTCGTCGCAGCCTCGCCACGCACGCTGCGGTCAACCCGGCTAGCGGCACGTACAACCTCGTCGAAAAGATCGTGCAGAAGTACGCCGTGGACCAAGCGCCAGGATCGCACGTCAAGTCGGGTGACTACGTCTCCATCCGCCCCGGCACCGTCATGACGCACGACAACACCGGGCCCGTCATCTCCAAGTTCGGCTCGATCGGCGCCACGTCGATCTACAACCCGGACCAGGTGGTGTTTGCGCTGGACCACGACGTGCAGAACAAGTCGGCCAAGAACCTGGAAAAGTACAGCAAGATCGAGAGCTTTGCGCGCAAGCATGGTATCGACTTTTACCCTGCCGGGCGCGGTATCGGCCACCAGGTGCTGGTCGAGGAGGGCTATGCTTTCCCGCAGACGCTGGCGGTGGCAAGTGACTCGCACTCCAACATGTACGGCGGTGTCGGCTGTCTCGGTACACCCATCGTGCGCACGGATGCGGCGGCGATCTGGGCGACCGGCCAGACATGGTGGCAGATCCCCGAGGTGGTCAAGGTCGAGCTCAAGGGTCAGCTGCCCAAGGGTGTCACTGGCAAGGATGTGATCGTGGCGCTCTGCGGCTACTTCAACCAAGACCAGGTGCTGAATGCTGCCATCGAGTTCCACGGCTCAGGTCTTTCTGCGCTCTCGATCGAGGAGAGGCTGGCGATTGCCAACATGACCACCGAATGGGGTGCGCTTGCTGGTCTCTTCCCCACGGACGACGTCACGCTCGGCTGGTACGAGAAGCAGATCCGCAAGCGCGACAAGCTCGAGTTCCAGATCGGCTCGTCGCCCTCGCCGTCCGGCTCACACCCGCGTCTGAACATGCACCGACTCGACGAGCTCTCGCGCACGCTCCTCCGCCCGGATGCCGACGCGCTCTACTCGAAGCACCTCACGCTCGACCTCGCCACGCTCGTCCCGCACGTGAGCGGGCCGAACTCGGTCAAGGTGTCGACGCCGCTCGACGAGCTGGCGCACCAGAACATCGCCATCAACAAGGCGTATCTCGTGTCGTGCGTCAACTCGCGCGCGTCCGATCTCAAGGCGGCCGCCGACGTCATCCGCGGCAAGAAGGTCGCCAAGGGCGTCGAGTTCTACGTGGCAGCCGCGAGCAGTGTGGTACAGCGCGAGGCAGAGGAGGCAGGTGACTGGGGCGCCCTGATGGCCGCAGGCGCCAAGCCGTTGCCTGCGGGATGCGGACCTTGCATCGGCCTCGGCGTGGGTCTGCTCGAGGACGGCGAGGTGGGCATCTCGGCGACCAACAGGAACTACAAGGGCAGGATGGGCAGTCCCAACGCCCAGGCGTACCTCGCCTCGCCCGCAGTGGTGGCGGCGTCGGCGATTGAGGGCAAGATCTGCGGTCCTTCGGATCTGGACCCTTCGTTGCTGCCTCCCTCGCGTGGCCTCAAGTACTCGATCTCGACCAGTGCCGATGCAGCCTCTGCGGCGTCATCCTCGGCCTCGACCGACGCAGCTGGTGTCGAAGTGCTTCCTTCGTTCCCCAAGTCTTTCTCGGGCCCCTTGATCTTTGCGCCGCAGGACAACCTCAACACCGACGGCATCTACCCGGGCAAGTACACGTACCAAGACGACATTACGCCCGACAAACAAGCCGAAGTGGTCATGGAGAACTACGACGCCACATTTGCCTCGACTGTTGCCTCGCTCCGCACCAGCAGCAGTGCAGGGGGTTCGGACGGCGTCAAGCTCGGACCTGTTTTGCTGGGTGGGTACAACTTTGGCACGGGCAGTTCGCGAGAGCAGGCAGCTACGGCTCTCAAGTACGCCGGTGTTCCACTCGTGCTCGCCGGTAGCTTCGGCGACATCTTCAAGCGCAACGCGATCAACAACGGTCTCATCTGCCTCGAGTCGCACGAGCTCGTCCAGGACCTCACCGCGCTCTACCTCGGATCCAGGGACGCCGTTCGAAACCAAAAGGCCATTCTGCTCGACCAGTCCAACGTGCAAATCAACTCGGCCACGGGCGAGATCAACCTCTCCTACACCGCTCCTGACGGATCCAAGGTCAACAAGAAGTACACCGCCAAGCCTGCAGGCATCGGCAAGAGCGTCCAGGAGATCTACACCGCTGGCGGCCTCGAAAAGTGGGTCAAGGAGCGCATCTGA(配列番号5)
・LYS4タンパク質の推定アミノ酸配列
MRQQLAASGKCRDWAAAHNSLLSHVQRPTFKSTREGFSLPPIQSTTLALPLLTTTSLRIAQRRIIMRAANMLRLGASRLSTPLLRRSLATHAAVNPASGTYNLVEKIVQKYAVDQAPGSHVKSGDYVSIRPGTVMTHDNTGPVISKFGSIGATSIYNPDQVVFALDHDVQNKSAKNLEKYSKIESFARKHGIDFYPAGRGIGHQVLVEEGYAFPQTLAVASDSHSNMYGGVGCLGTPIVRTDAAAIWATGQTWWQIPEVVKVELKGQLPKGVTGKDVIVALCGYFNQDQVLNAAIEFHGSGLSALSIEERLAIANMTTEWGALAGLFPTDDVTLGWYEKQIRKRDKLEFQIGSSPSPSGSHPRLNMHRLDELSRTLLRPDADALYSKHLTLDLATLVPHVSGPNSVKVSTPLDELAHQNIAINKAYLVSCVNSRASDLKAAADVIRGKKVAKGVEFYVAAASSVVQREAEEAGDWGALMAAGAKPLPAGCGPCIGLGVGLLEDGEVGISATNRNYKGRMGSPNAQAYLASPAVVAASAIEGKICGPSDLDPSLLPPSRGLKYSISTSADAASAASSSASTDAAGVEVLPSFPKSFSGPLIFAPQDNLNTDGIYPGKYTYQDDITPDKQAEVVMENYDATFASTVASLRTSSSAGGSDGVKLGPVLLGGYNFGTGSSREQAATALKYAGVPLVLAGSFGDIFKRNAINNGLICLESHELVQDLTALYLGSRDAVRNQKAILLDQSNVQINSATGEINLSYTAPDGSKVNKKYTAKPAGIGKSVQEIYTAGGLEKWVKERI(配列番号6)
ATGGGCGTCATCACTCACCCCAACATTCGCGATGGATGGTTTTACGAGACCAACTCGCAATGGCCCGGTCAGGCCATGAGCCTCCAGGTGCAGCGCATCCTCCACCACGAGAAGTCGCTCTTCCAGGATGTGCTCGTCTTCGAGTCCACCACCTTCGGCAACGTCCTCGTCCTTGACGGCGTTATCCAGTGCACCGAGCGTGACGAGTTCTCCTACCAGGAGATGATTGCCCACCTCCCCATCGCCTCGCACCCCAACCCCGAGCGCGTTCTCGTAATCGGCGGCGGTGACGGCGGTGTCCTCCGCGAGGTCGTCAAGCACGACTCGGTCAAGGAGGCCATTCTCTGCGACATTGACGAGGCTGTCCCCCGTGTCTCCCAGCAGTACCTTCCCAAGATGGCCGAGGGTCTCAACCACCCCAAGTCCAAGGTCATCATCGGCGACGGCTTCGCTTTCCTCAAGGACCCCAAGAACAAGGCCAGCTTCGACGTCATCATCACCGACTCCTCCGACCCGGTCGGCCCCGCAGAGGTGCTCTTCCAGCAGCCCTACTTCGCCCTGCTCAAGGAGGCCCTCAAGCCCGGAGGACACATCTCCACCCAGGCCGAGTGTGTCTGGATCCACCTCAACCTCATCGGCGAGCTCCGCCGCTCCACCAAGGAGCTCTTCCCCGTCGCCGACTACGCCTTCACCACCATCCCCACCTACCCCTCCGGTCAGATCGGCTTCGTCGTCTGCTCGCTCGACGCCAACCGCAACGTTCGCGAGCCCCTCCGCCAGGTGCCCGACTGCCGATACTACAACTCGGAGGTGCACAAGGCTTCCTTTATCGTCCCCGAGTTCGCTCGCAAGGTCATTGAGGAGGGTGCTCCCGCCCCTGGCCGTGTGATCCCCACTGGTGAGGGCAATGCCAAGGCTCAGCGTGCTCCCAAGAAGATCCTCCTCCTCGGCTCCGGCTACGTCGCCAAGCCCTTCGCCGAGTACGTCACCCGCTTCCCCGAGTACAGCCTCACCGTCGCCTCGGTCAAGATCGAGCACTCGCAGCGCCTCATCGAGGGCCTCCACAACGCCAACGCCACCTCGGTCGACGTCAACGACCCTGCCGCACTCTCGGCGCTGATCAAGGGCCACGACGTTGTCATCTCGCTCATCCCTTACATCTACCATGCCTCGGTCATCAAGGCCGCTTGCGAGCACAAGGTCAACGTAGTCACCACCTCGTACGTCTCGGACGCTATCCGCGAGCTCGAGCCCGAGATCAAGAAGGCCGGCATCACCGTCATGAACGAGATCGGTCTCGACCCCGGTCTCGACCACCTCTACGCCGTCAAGGCCATCGACGACGTGCACGCCGAGGGCGGAAAGATCAAGTCCTTCCTCTCCTACTGCGGTGGTCTGCCTGCCCCCGAGGCGGCCGACAACCCGCTCGGATACAAGTTCTCCTGGTCGTCGCGCGGTGTGCTTCTCGCACTCCGAAACACGGCCAAGTTCTGGCAGGACGGCAAGGAGCTCACTGTCTCGGGTCAGGAGCTCATGGCCGCTGCCCAGAGCTTCTACATCAACCCTGCCTTCGCCTTTGTCGCCTACCCCAACCGTGACTCGACTCCTTTCAAGCAGTGGTACAACATCCCCGAGGCCGAGACTGTGATCCGCGGTACGCTCCGATACCAGGGCTTCCCCGAGTTCATCCTCGCCCTCGTCAAGCTCGGCTTCCTCGACGAGGAGGCCAAGGACTTCCTTGCCTACGGTACCAAGGCCTCGTGGGCTGACGTCACCGCCAAGATGGTCGGTGCCGCCTCCGCTGCCGAGACCGACCTGATCGCTGCCATCAAGACCAAGGTCTCGTTCAAGTCGGCTCAGGAGGAGGAGACCATCATCCGCGGTCTGCGCTGGCTCGACCTCTTCTCCACCAAGGCCCACGTCACCGTGCGTGGCACCGCCCAGCAGGAGGCCGGCAAGGTGGCCGGCAACCCGCTCGACTCGCTCTGCGCTACCCTCGAGGAGAAGTGCGCCTACGCCCCCGGCGAGCGCGACATGGTCATGCTCCAGCACAAGTTCGAGATCGAGACTGCCAACGGCGAGCACAAGACCCTCACCTCGACGCTGCTCGACTACGGTATTCCCCACGGAACCTCGTCGATGGCTAAGCTCGTCGGTGTCCCTTGCGCCATTGCTACCCGCCTCATCCTCGAGGGCCACCCGGCTCTCACCAAGGTCGGTATCCTGGCTCCTTACACCAAGGACATCTGCGATCCCATCCGTCTCGAGCTCGAGAAGGAGGGCATTGCCCTCGAGGAGCGCTACGTCTAG(配列番号7)
・LYS9タンパク質の推定アミノ酸配列
MGVITHPNIRDGWFYETNSQWPGQAMSLQVQRILHHEKSLFQDVLVFESTTFGNVLVLDGVIQCTERDEFSYQEMIAHLPIASHPNPERVLVIGGGDGGVLREVVKHDSVKEAILCDIDEAVPRVSQQYLPKMAEGLNHPKSKVIIGDGFAFLKDPKNKASFDVIITDSSDPVGPAEVLFQQPYFALLKEALKPGGHISTQAECVWIHLNLIGELRRSTKELFPVADYAFTTIPTYPSGQIGFVVCSLDANRNVREPLRQVPDCRYYNSEVHKASFIVPEFARKVIEEGAPAPGRVIPTGEGNAKAQRAPKKILLLGSGYVAKPFAEYVTRFPEYSLTVASVKIEHSQRLIEGLHNANATSVDVNDPAALSALIKGHDVVISLIPYIYHASVIKAACEHKVNVVTTSYVSDAIRELEPEIKKAGITVMNEIGLDPGLDHLYAVKAIDDVHAEGGKIKSFLSYCGGLPAPEAADNPLGYKFSWSSRGVLLALRNTAKFWQDGKELTVSGQELMAAAQSFYINPAFAFVAYPNRDSTPFKQWYNIPEAETVIRGTLRYQGFPEFILALVKLGFLDEEAKDFLAYGTKASWADVTAKMVGAASAAETDLIAAIKTKVSFKSAQEEETIIRGLRWLDLFSTKAHVTVRGTAQQEAGKVAGNPLDSLCATLEEKCAYAPGERDMVMLQHKFEIETANGEHKTLTSTLLDYGIPHGTSSMAKLVGVPCAIATRLILEGHPALTKVGILAPYTKDICDPIRLELEKEGIALEERYV(配列番号8)
ATGACGTCGACCGCCGCCAAGATCCTCAAGAATGCCACTTCGGGCGTGCTGCGCCTGGGCATGATGCCCGCAGACGGCATTGGACGCGAGGTGCTCCCTTGCGCGCAGCGTGTGCTCCAGAACACGCCCGGCGCACCCAAGTTTGAGTTTGTGCACCTCGACGCTGGCTTCGAGCACTTCCAGAAGACCGGCTCGGCGCTTCCCGAGGAGACCGTGCGTGCACTCAAGGACGACTGCCACGGAGCCATGTTCGGCTCCGTCTCGAGCCCGTCGCACAAGGTCGAGGGCTACAGCTCGCCCATCGTCAAGCTCAGGAAGGAGCTCGACCTGTACGCCAACATTCGCCCCGTCATCGGCGTGCGCGGCACCAAGGACGACGACAAGTTCATCGACAGCGTCATCATTCGCGAGAACACCGAGTGCCTGGTAAGTAGCTGATCCGTCGTCGAGGAGAGCGAAAGATGAGATACTGACGCAGAACGGTCCCTCCCCAACTCGCTTCCACGCGAGCAGTACATCAAGTCCGAGACGAGCGAGAGCGGTCCGGACGGTCAGATTGCGCGCGCCATCCGCCAGATCACCGAGAAGGCTTCGACGCGCATCGGCAAGAAGGCGTTTGAAGTCGCGATTGCGCGCAAGGAGCTGCGCAAGGTGAACCAGCCGTCGTACGAGCCTACCGTGACGATCTGCCACAAGTCCAACGTGCTGAGCGTCACCGACGGTCTCTTCCGCACCTCGGTCCGCGGCGTGTACGAGAAGGACCAGAAGGCCAACGGAGGCGCCGGCCGATACGAGGGCGTCAAGCTCAACGAGCAGCTCGTCGACTCCATGGTCTACCGCCTCTTCCGCGAGCCCGAGGTGTTTGACGTGGTCGTGGCGCCCAACCTGTACGGTGACATTGTCTCGGATGCTGCCGCCGCCCTCGTGGGCTCCCTTGGCCTCGTCCCCTCCGTCAACGCCGGCGACAACTTCTTCATGGTAAGCCCCATCCTCCGTCTTCTCCTTCCTTCCAGCCCCGAGCGCCTACTTACATTTTGCCCCGCCTTGTTCTTCCCTTGTGCTGCGCATCGTAGGGCGAGCCGGTCCACGGTTCGGCGCCCGATATCGCGGGTCAGGGCAAGGCGAACCCGATCGCCTCGATCCGCTCCGCCGCCCTCATGCTCGAATACATGGGCTACACCGAGCCTGCGCTCAAGATCTACACGGCCGTCGACCAGGTCATCCGCGAGGGCAAGTACCTCACCCCAGACCTCGGCGGATCCGCCACCACCACCCAGTGCGAAGAGGCCATCCTCAAAAAGATCAACGCCTAG(配列番号9)
・LYS12タンパク質の推定アミノ酸配列
MTSTAAKILKNATSGVLRLGMMPADGIGREVLPCAQRVLQNTPGAPKFEFVHLDAGFEHFQKTGSALPEETVRALKDDCHGAMFGSVSSPSHKVEGYSSPIVKLRKELDLYANIRPVIGVRGTKDDDKFIDSVIIRENTECLYIKSETSESGPDGQIARAIRQITEKASTRIGKKAFEVAIARKELRKVNQPSYEPTVTICHKSNVLSVTDGLFRTSVRGVYEKDQKANGGAGRYEGVKLNEQLVDSMVYRLFREPEVFDVVVAPNLYGDIVSDAAAALVGSLGLVPSVNAGDNFFMGEPVHGSAPDIAGQGKANPIASIRSAALMLEYMGYTEPALKIYTAVDQVIREGKYLTPDLGGSATTTQCEEAILKKINA(配列番号10)
ATGTGTGATCACTCCGAACCCTCCGCTATCCAGCAGGTCAACGGCACCGCCCCCGACACCCATGTCGCCATCGACACCTCGGCCCCCAACACCAACGGCGCCGCCAACGGTGCCAACGGTGCCCTCGCCACGGCAGACAACGGAAACGTAGGCTCCGTACAGCCCTTCAACACGCGCTACTCGGACTTCCTCTCCAACGTATCCAACTTCAAGATCATCGAGTCCACCCTCCGCGAGGGCGAGCAGTTCGCCAACGCCTTCTTCGACACCGAGACCAAGATCAAGATCGCCAAGGCGCTCGACAAGTTCGGCGTCGACTGCATCGAGCTCACCTCCCCCGCCGCCTCCGAGCAGTCGCGCAAGGACTGCGAGGCCATCTGCAAGCTCGGCCTCAAGGCCAAAGTCATCACCCACATCCGCTGCCACATGGACGACGCCCGCATCGCCGTAGAGACGGGCGTCGACGGCGTCGACGTCGTCATGGGCACCTCCAAGTTCCTCCGCGAGTTCTCGCACGGCAAGGACATGACCTACATCACCAAGACCGCCATCGAGGTCATCCAGTTTGTCAAGTCCAAGGGCATCGAGATCCGCTTCTCCACCGAAGACTCCTTCCGCTCCGACCTCGTCGACCTGCTCAGCATCTACCAGGCCGTCGACAAGGTCGGCGTCAACCGCGTCGGCATCGCAGACACCGTCGGCGTCGCAAACCCAAGACAGGTCTACGACCTCGTCCGCACCCTCCGCGGCGTCGTCGGCTGCGACATCGAGTGCCACTTCCACAACGACACCGGCTGCGCCATCGCCAACGCCTACACCGCCCTCGAGGCCGGCGCCACCCACGTAGACACCTCGGTGCTCGGCATCGGCGAGCGCAACGGCATCCCCTCGCTCGGCGGCTTCATCGCACGCATGTACACCGCCGACCGCGAATACGTGATGAGCAAGTACAACCTCAAGGCGCTGCGCGAGGTCGAGAACCTCGTCGCCGAGGCGGTCCAGATCCAGGTGCCCTTCAACAACTACGTCACCGGCTACTGCGCCTTCACCCACAAGGCCGGCATCCACGCCAAGGCCATCCTCGCCAACCCGTCCACATACGAGATCATCCGCCCCGAGGACTTTGGCATGAGCCGCTACGTCTCCATCGGACACCGCCTCACCGGCTGGAACGCCGTCAAGTCGAGGTGCGAGCAGCTCGAGCTCAACCTCACCGAGGACCAGGTCAAGGAGGTCACCGCCAAGATCAAGCAGCTCGCAGACGTGCGCGAGCAGACCATGGAGGACGTCGACTCGATTCTCAGGAACTACGCGCGCGCCATCGAGAACGGCACCGCCTAA(配列番号11)
・LYS20タンパク質の推定アミノ酸配列
MCDHSEPSAIQQVNGTAPDTHVAIDTSAPNTNGAANGANGALATADNGNVGSVQPFNTRYSDFLSNVSNFKIIESTLREGEQFANAFFDTETKIKIAKALDKFGVDCIELTSPAASEQSRKDCEAICKLGLKAKVITHIRCHMDDARIAVETGVDGVDVVMGTSKFLREFSHGKDMTYITKTAIEVIQFVKSKGIEIRFSTEDSFRSDLVDLLSIYQAVDKVGVNRVGIADTVGVANPRQVYDLVRTLRGVVGCDIECHFHNDTGCAIANAYTALEAGATHVDTSVLGIGERNGIPSLGGFIARMYTADREYVMSKYNLKALREVENLVAEAVQIQVPFNNYVTGYCAFTHKAGIHAKAILANPSTYEIIRPEDFGMSRYVSIGHRLTGWNAVKSRCEQLELNLTEDQVKEVTAKIKQLADVREQTMEDVDSILRNYARAIENGTA(配列番号12)
ATGTCGAGCATCACCCTCCAGACGTACGCATCACGCGCGGCCAAGCAGCCCAACGCCGCCGCCAAGGCGCTGCTCGAGTGCATCGAGCGCAAGCAGTCCAACCTGTGCGTCTCGGTCGACGTGACCAACAAGCAGGACCTGCTCGACGTGTGCGATGCCGTCGGCCCAGACGTGTGCCTGGTCAAGACGCACATCGACATTGTCGAGGATTTTGACATCGACCTCGTCCAGCAGCTCACCGCGCTCAGCCAGAAGCACGACTTTCTCATCTTCGAGGACCGCAAGTTTGCCGACATTGGTAAGTCCATGCGATCGTCCACTCGAAGTGCCTGTGCACCCCGCTGACACGAGCTTACCCTGGCGCATTTGCATCTACAGGCAACACGGCAAGCCTGCAGTACTCGTCGGGCGTGCACAAGATTGCGTCGTGGTCGCACATCACCAACGCGCATCTGGTGCCTGGACCGGGCGTCATCAGCGGTCTCGCCAAGGTGGGCCAACCACTCGGACGCGGCCTTCTGCTGCTCGCCGAGATGAGCTCGGCAGGCGCGCTCACCAAGGGTTCCTACACGCAGGCGTGTGTCGACGAGGCCAAGAAGGACACCACCGGCTTTGTCTGTGGCTTCATCGCCATGTCGCGCGTCGACGAGCGCGAGGGCCCCAACACGGAGCGCGACCTGCTCATCCTCACACCGGGCGTCGGCCTCGACGTCAAGGGCGATGCCATGGGCCAACAGTACCGCACGCCCGACCAGGTCATCCGTGAAAGCGGCTGCGACGTCATCATCGTCGGTAGGGGTATCTACGGCGCTCTCATGACCGAAGAGGGCAAGGCCGACAAGAAGGCGGCGTTCGACAAGGTCAGGCAACAGGGTTCGCGGTACAAGAAGGCGGGTTGGGAGGCCTACCTCGCCCGTCTTGGTCAGAAGTAG(配列番号13)
・URA3タンパク質の推定アミノ酸配列
MSSITLQTYASRAAKQPNAAAKALLECIERKQSNLCVSVDVTNKQDLLDVCDAVGPDVCLVKTHIDIVEDFDIDLVQQLTALSQKHDFLIFEDRKFADIGNTASLQYSSGVHKIASWSHITNAHLVPGPGVISGLAKVGQPLGRGLLLLAEMSSAGALTKGSYTQACVDEAKKDTTGFVCGFIAMSRVDEREGPNTERDLLILTPGVGLDVKGDAMGQQYRTPDQVIRESGCDVIIVGRGIYGALMTEEGKADKKAAFDKVRQQGSRYKKAGWEAYLARLGQK(配列番号14)
(1)P.アンタクティカGB-4(0)株の低通気量条件下でのタンパク質生産能
日本国茨城県産のイネのもみ殻(農業生物資源ジーンバンク、JP番号203119)から、生分解性プラスチックであるポリブチルサクシネート(PBS)マルチフィルム及びポリブチレンサクシネート-コ-アジペート(PBSA)マルチフィルムを分解する活性を有する菌、すなわち生分解性プラスチック分解酵素であるPaEを産生する菌として、P.アンタクティカGB-4(0)株(受託番号NITE P-02392)及びP.アンタクティカGB-4(1)W株(受託番号FERM P-22155)を単離した。
P.アンタクティカGB-4(0)株及びP.アンタクティカT-34株に、ネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミド(pUXV1-neo)を導入して形質転換した。その形質転換効率(DNA1μgあたりの形質転換体数)を計算すると、P.アンタクティカT-34株では、1.4形質転換体/μgDNAであったのに対し、P.アンタクティカGB-4(0)株では、57.4形質転換体/μgDNAだった。したがって、P.アンタクティカGB-4(0)株は、形質転換効率が高いことがわかった。
(1)目的
P.アンタクティカの栄養素の合成遺伝子を破壊した栄養要求性変異株を作製する。この失われた栄養要求性を相補する遺伝子を遺伝子導入ベクターのマーカーとして利用することで、セルフクローニング株を選択することも可能となる。まずは、リジン要求性変異株を作製する。
本実施例で使用した培地の組成は以下のとおりだった。
・YM培地
酵母エキス(Difco Laboratories社製) 0.3質量%
モルトエキス(Difco Laboratories社製) 0.3質量%
ペプトン(Difco Laboratories社製) 0.5質量%
グルコース 1.0質量%
・SD培地
アミノ酸と(NH4)2SO4を含まないバクトイーストナイトロジェンべース(Difco Laboratories社製) 0.17質量%
グルコース 2.0質量%
(NH4)2SO4 0.5質量%
・SD w/o AA&AS培地
アミノ酸と(NH4)2SO4を含まないバクトイーストナイトロジェンべース(Difco Laboratories社製) 0.17質量%
グルコース 2.0質量%
・SD NaNO3培地
アミノ酸と(NH4)2SO4を含まないバクトイーストナイトロジェンべース(Difco Laboratories社製) 0.17質量%
NaNO3 0.2質量%
グルコース 2.0質量%
・Lys12-pro-618 F
5'-GACATATGAGTGGACAGGCGTGTTCCACAGACAG-3'(配列番号15)
・Lys12-ter+1782 R
5'-GAGAATTCCGAGAAGTTCACCTCCATGGACGAGC-3'(配列番号16)
・Lys20-21-618 F1
5'-TGTGGCAAAAAGCGGCCCAGCGCCA-3'(配列番号17)
・Lys20-21+1802 R4
5'-TCTGAAGCAGGTCAAGACTTTTGTT-3'(配列番号18)
・LYS2 pro F
5'-GATGTGGAGTCCATTGCTGTTGTCGAC-3'(配列番号19)
・LYS2 ter R
5'-CAAATCCCTTCTTTCGTCCCTCGGCT-3'(配列番号20)
P.アンタクティカGB-4(0)株を5mLのYM培地を含む試験管に接種し、30℃、160rpmで、24時間振とう培養した。この培養液1mLを30mLの冷滅菌水を含むシャーレに加え、スターラーで撹拌しながら、60秒間紫外線を照射した。遠心分離によって紫外線照射した菌体を全量回収し、5mLのYM培地に再懸濁した後、30℃、160rpmで、3時間の回復培養を行った。回復培養後の培養液1mLを回収し、菌体を滅菌水で2回洗浄した後、Wickerhamの合成培地に基づく最少培地(SD)から窒素源となる硫酸アンモニウムを除いた培地(SD w/o AA&AS培地)5mLを含む試験管に加え、30℃、160rpmで、4.5時間振とう培養し、窒素飢餓と細胞増殖の休止を促した。窒素飢餓処理した細胞を回収し、菌体を滅菌水で2回洗浄した後、SD培地の窒素源として硝酸ナトリウムを用いたSD NaNO3培地4mLで再懸濁した。これを30℃、160rpmで、3時間振とう培養し、栄養要求性ではない細胞の増殖を促した。この培養液に500μLのナイスタチン溶液(100μg/mL)を加え、さらに30℃、160rpmで、1時間振とう培養することで、栄養要求性ではない増殖中の細胞を死滅させた(ナイスタチン濃縮)。ナイスタチン濃縮処理液を冷滅菌水で103倍に希釈した後、50μLずつYM寒天培地(2質量%の寒天を含むYM培地)に塗布した。これを30℃で2日間静置培養すると、1枚のシャーレあたり約200個のコロニーが出現した。増殖してきた約3600個のコロニーについて、YM寒天培地上及びSD寒天培地(2質量%の寒天を含むSD培地)上にレプリカを作製した。その結果、YM寒天培地上では増殖できるがSD培地上では増殖できない3種の菌株を取得したので、これらを各種のアミノ酸を添加した最少培地へ移植した。そうすると、当該菌株は、いずれもリジンを加えた培地上でのみ生育を回復したことから、リジン要求性変異株であると考えられた。各菌株を、P.アンタクティカGB-4(0)-L1株、GB-4(0)-L8株、及びGB-4(0)-L14株と名付けた。
パン酵母S.セレヴィシエのリジン合成関連の遺伝子情報に基づき、P.アンタクティカGB-4(0)株のゲノム情報から、相同遺伝子PaLYS1、PaLYS2、PaLYS4、PaLYS9、PaLYS12、PaLYS20を見出した。P.アンタクティカGB-4(0)株のゲノムDNAからPCRで増幅させた各遺伝子を、取得した3種の菌株(L1株、L8株、及びL14株)に導入し、最小培地における増殖が回復するかどうか調べた。その結果、L1株は、PaLYS12遺伝子断片(Lys12-pro-618 F及びLys12-ter+1782 Rをプライマーとして使用)を導入した場合に増殖が回復したことから、PaLYS12変異株と同定された。L8株は、PaLYS20遺伝子断片(Lys20-21-618 F1及びLys20-21+1802 R4をプライマーとして使用)を導入した場合に増殖が回復したことから、PaLYS20変異株と同定された。L14株は、PaLYS2遺伝子断片(LYS2 pro F及びLYS2 ter Rをプライマーとして使用)を導入した場合に増殖が回復したことから、PaLYS2変異株と同定された。
MTSTAAKILKNATSGVLRLGMMPADGIGREVLPCAQRVLQNTPGAPKFEFVHLDAGFEHFQKTGSALPEETVRALKDDCHGAMFGSVSSPSHKVEGYSSPIVKLRKELDLYANIRPVIGVRGTKDDDKFIDSVIIRENTECLYIKSETSESGPDGQIARAIRQITEKASTRIGKKAFEVAIARKELRKVNQPSYE(配列番号22)
(1)目的
前述のL1株を宿主として選択し、PaLYS12を遺伝子導入マーカーとして用いて、同種の細胞の遺伝子のみで構成したタンパク質高生産用カセットを導入し、セルフクローニングによるタンパク質高生産システムを構築する。P.アンタクティカでは、キシロース存在下でPaXYN1プロモーター制御下の遺伝子が強力に発現誘導されることがわかっている(国際公開第2014/109360号)。そこで、PaXYN1プロモーターの制御下でPaEを生産させるセルフクローニング株を作製する。
本実施例で使用した培地の組成は以下のとおりだった。
・SDP寒天培地
アミノ酸と(NH4)2SO4を含まないバクトイーストナイトロジェンべース(Difco Laboratories社製) 0.17質量%
グルコース 2.0質量%
0.5M Na2HPO4溶液 5mL/L
寒天 2.0質量%
・XY培地
酵母エキス(Difco Laboratories社製) 1質量%
キシロース 6質量%
・3xFMM(Fungal minimum medium)8%キシロース培地
NaNO3 0.2質量%
KH2PO4 0.06質量%
MgSO4・7H2O 0.06質量%
酵母エキス(Difco Laboratories社製) 0.3質量%
キシロース 8.0質量%
・YPX培地
酵母エキス(Difco Laboratories社製) 1質量%
バクトペプトン(Difco Laboratories社製) 2質量%
キシロース 8質量%
・3xFMM(Fungal minimum medium)-0.5%PBSAエマルジョン・8%キシロース寒天培地
NaNO3 0.2質量%
KH2PO4 0.06質量%
MgSO4・7H2O 0.06質量%
酵母エキス(Difco Laboratories社製) 0.3質量%
PBSAエマルジョン* 0.5質量%
キシロース 8.0質量%
寒天 2質量%
*ビオノーレエマルジョンEM-301(PBSA)(昭和電工株式会社製)
・PLYS12 F-1
5'-ACGGCCAGTGAATTCGTACATATAGTTGGCCGCTGCATAT-3'(配列番号23)
・TLYS12-TXYN R
5'-AAAGAGAACGAGAAGTTCACCTCCATGGACGAGC-3'(配列番号24)
・PXYN F
5'-ACCGAGCTCGAATTCCACGCCACGTTCGATACCGAC-3'(配列番号25)
・PXYN-PaEG R
5'-AACTGCATCGTAAGGTTTGTTTGGCGTTTTGGG-3'(配列番号26)
・TXYN-PaEG F
5'-AGGGATAATCCGTCGTCACCGGCTTGCCTGTAT-3'(配列番号27)
・TXYN-TLYS12 R
5'-ACTTCTCGTTCTCTTTTTGCCAGGTGTTGGACT-3'(配列番号28)
・PaEG F
5'-ACCTTACGATGCAGTTCAAGTCGACCTTTGCCG-3'(配列番号29)
・PaEG R
5'-ACGACGGATTATCCCTGAAGAGCCTTGATACCG-3'(配列番号30)
・M13 F
5'-GTAAAACGACGGCCAG-3'(配列番号31)
・M13 R
5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'(配列番号32)
・LYS12 F-1000
5'-GTACATATAGTTGGCCGCTGCATAT-3'(配列番号33)
・PXYN-1513 F
5'-CACGCCACGTTCGATACCGAC-3'(配列番号34)
P.アンタクティカGB-4(0)株のゲノムDNAを鋳型とし、表1に示すプライマーを用いて、リジン合成遺伝子PaLYS12及びそのプロモーター及びターミネーター、PaXYN1のプロモーター(PXYN)、PaXYN1のターミネーター(TXYN)、並びにPaEをコードする遺伝子であるPaCLE1のセルフクローニング用の遺伝子断片を増幅した。
・PaLYS12(プロモーター及びターミネーターを含む)(2781bp(構造遺伝子領域1313bp、プロモーター領域999bp、及びターミネーター領域469bp);下線部はイントロン)
CGTACATATAGTTGGCCGCTGCATATACACAACCTTGTGGCAGTCTCCCTCGTCTTCAACACTTACTCCGTACGATCCATGCCCGCGCTCACGAAAGTCATCGTAGATGACCAATGACTGAGATTGTTCAAGTGTGGTTGAGCATTACGCAAACGGAATGAGACTCACACATGTACGCGTGCTTCCTTCAACCTGATCAGCCTCTGCACCGTCGTCGTCCATCCCGGACTCTTGTGTTGCTCCGTGCTGCTGCAGTCGTAAGGGCCCAAGATCGACAACGGTGCGGTGCAACACCAAAACAGTTCCTTCCTTGGGCATCATGCAATTCATCGGTCACACTGTCAATCCCCAATCCTCGAACCGTCCTGTCGGACTGTCTGCAGTGGACAGGCGTGTTCCACAGACAGAACCCACAGGTGGCTGCGCGATGCCGCGAGTCTTCCACAAAAATTGAGGCGCAGTGGATATCCACGTCTCCTCCCACACGAAGACCGTCTGCATTTCGGCCCGATCTATAGACTCGAGACAAGATGGCATTACGAGCCGCCGTGTGAAGACGCTCAAAGTGCAAAGATCTTGTCCAGAAAAAAAAAAGGAAGGATGCGGGAGAGCACCAAAAAAAGACAAAAAGGAATGACCAGCCTGGGGCTCGAACCCAGAATCTCCTGATTAGCGGCTGTTCACGAAGAACAGAACGTCGTAGTCAGACGCCTTACCATTGGGCCAACCGGCCTTTGTTGAAAGCAGGCTAGAACATTGCATACATATAGACGTAGACCAGATCCAAAGAGTCATTTCGATCCGACCACCTCCGACGAGCTGGAAGACCTGAAAACCAGCCGTGACTCGCTTGGCGCGGGTGCATCGGCAGGGCAGGGAAGGGTGGACAAGGCACAAGGCGAGCCCGGGAAAATGCCGAAGCTGTCCAACCGATTGCCCCTTCTTCTTCCACCCCCACCTAGACCTCTTGCTTTGCTCGTCCCACCCACACAGTCCAAGATGACGTCGACCGCCGCCAAGATCCTCAAGAATGCCACTTCGGGCGTGCTGCGCCTGGGCATGATGCCCGCAGACGGCATTGGACGCGAGGTGCTCCCTTGCGCGCAGCGTGTGCTCCAGAACACGCCCGGCGCACCCAAGTTTGAGTTTGTGCACCTCGACGCTGGCTTCGAGCACTTCCAGAAGACCGGCTCGGCGCTTCCCGAGGAGACCGTGCGTGCACTCAAGGACGACTGCCACGGAGCCATGTTCGGCTCCGTCTCGAGCCCGTCGCACAAGGTCGAGGGCTACAGCTCGCCCATCGTCAAGCTCAGGAAGGAGCTCGACCTGTACGCCAACATTCGCCCCGTCATCGGCGTGCGCGGCACCAAGGACGACGACAAGTTCATCGACAGCGTCATCATTCGCGAGAACACCGAGTGCCTGGTAAGTAGCTGATCCGTCGTCGAGGAGAGCGAAAGATGAGATACTGACGCAGAACGGTCCCTCCCCAACTCGCTTCCACGCGAGCAGTACATCAAGTCCGAGACGAGCGAGAGCGGTCCGGACGGTCAGATTGCGCGCGCCATCCGCCAGATCACCGAGAAGGCTTCGACGCGCATCGGCAAGAAGGCGTTTGAAGTCGCGATTGCGCGCAAGGAGCTGCGCAAGGTGAACCAGCCGTCGTACGAGCCTACCGTGACGATCTGCCACAAGTCCAACGTGCTGAGCGTCACCGACGGTCTCTTCCGCACCTCGGTCCGCGGCGTGTACGAGAAGGACCAGAAGGCCAACGGAGGCGCCGGCCGATACGAGGGCGTCAAGCTCAACGAGCAGCTCGTCGACTCCATGGTCTACCGCCTCTTCCGCGAGCCCGAGGTGTTTGACGTGGTCGTGGCGCCCAACCTGTACGGTGACATTGTCTCGGATGCTGCCGCCGCCCTCGTGGGCTCCCTTGGCCTCGTCCCCTCCGTCAACGCCGGCGACAACTTCTTCATGGTAAGCCCCATCCTCCGTCTTCTCCTTCCTTCCAGCCCCGAGCGCCTACTTACATTTTGCCCCGCCTTGTTCTTCCCTTGTGCTGCGCATCGTAGGGCGAGCCGGTCCACGGTTCGGCGCCCGATATCGCGGGTCAGGGCAAGGCGAACCCGATCGCCTCGATCCGCTCCGCCGCCCTCATGCTCGAATACATGGGCTACACCGAGCCTGCGCTCAAGATCTACACGGCCGTCGACCAGGTCATCCGCGAGGGCAAGTACCTCACCCCAGACCTCGGCGGATCCGCCACCACCACCCAGTGCGAAGAGGCCATCCTCAAAAAGATCAACGCCTAGATCGTCACTCAGCCCTGAGGCACCAAAAATCTTCTCTTCGCCTTGTCTCTTCCATTTGGGAAATCAATCGCATGCCCACCTCACTCTTCGCGCCTCTGGATTCCAATGTTCCGATGCGGCTTGGCAAGTGCTCAACTGAGGACTGAGTTTTGTGAACTGGAATCGGATGCAAAATGAATGTTGGGCATTGCAGAGAGGGGCGACACATGATGCGATGACTCTGCTCGCTTCAACGGGGAGCGAGGACGCTATTTTTATTTACAGGCCAAGTCGGGAGGAAAGCTGATCTTGGCGAAAGGGGAAGACCTACTTGCGGATGGCGTAAGCGGTCTGGCGATCGGAGCCGGCCTGGCCGCGCTCGGTCAAGCCGAGACCGTATCGGCGCAGCCTGATGGCCTGGACGGTGATGAAGCCGCTGGTGGCAGCCGAGTCGAAGCCACCCTGCTCGTCCATGGAGGTGAACTTCTCG(配列番号35)
GAATTCCACGCCACGTTCGATACCGACCAGCCACTCACAGCACACGCCAGCGTCGGTGGCAGCGACAATCTTGCGCGCGTCACCCGCCGAGGCGTTGAGCTCGACATCCACATCGACGTCTTTGCTGCGTCTTCTGGATCGAAGCTGGTGATGCGACAGATCATCACAATTCTCGCCCTCGGACCGTCTGCACCGCGGTCGAAAGCACCACCACCTGCAGAGTCACTCGATCGACCGCGCAAGGATGCGGACTACACGAGCACGGGCACGATCAAGATGCACTCGACCTCGCCGCGCGCATGGTGCCGCGTGTGCGGCGACTACAATCCGATCCACGTCTCGTCGCTGCTCGCGCGCCTGTTCGGCTTCCGCGGCAAGATCGCGCACGGCAACCATGTCGTAGCGCACCTGCTGCATCTGGTCTCGTCCGCTTCTGGGCCAGGTTCTGTGCGCGAGATTACCGACACTAGCAAGGGAAAGCGTTGGTGGATCGAGATGCACTTTAAGCGGCCTATGATTTTGCCACTTCAGCTCGAGGCACAGATCGCCGTCGACAATACAGGGGCGGAATGGAGGTGCAGCGGTGCTAAGGACGACAAGGTTTACGTTCAGGGTTCCATCGGCGCTCTGTAACATTGAGCTAAGGACGGTGCAGTGCATCGTGCAACCAAGCAGTGTTTCGTGTCGCAGTTCCGGAAGAATCACAGAACGGGACATGGCCCTCCGATTCTTCGCAGTGGTGTGACTGGTGAGTCCGACTGGATCTTGATCGCGGGAATCTATGGGGTGCAGTCGAGAAGCGAGCTTCGGCTGAGTGCTGTGCGGGGAGCCGATGCAGACCGGCGACGTTTCAGCCACGAGGCGTGTCACCTCGCGCTCATCTCGGCGTGGCGTCTTTGCGCATGGCTGAAGCTTTGGCTCTGACAACCAACCTAGTCGCTACAGCTTTGATGCGTGGTAACGAGGCAACCGCGAAGGATACCGAAGCATGACAGACAGCAGGGATGGCTCGGAGCCTAAGTTGATCGAAAAGGGTTGCAGTGCGAATCGCGTTTATGCACAACCCCGCTTCGCTTAGGCCATGCATCTGGAAGCGTAATGCTTGCACCGTGGCGCTCCAACGAACCGGTTTGGCGCTAACCATAATGGGCGTGTGGTTGTCAGGCAGCGCACGGACAGCCAGCGTGCGATACTGTGCACCAGGGTCGCCGGTGTCACATAGGTGCCTACTGCAGCATCGTGCCGCGATGGAAGCTCGGCGTGATTCAGCTGATCGTGGGCCAGGTCAGACTTGAACCCCAGCGGTTATCGCTGTAGCAGCACTACCGGCAGGTGGCCCTTGCAATGTACATGGTCCGGACACTACTTTGCCGGTCTCACTGTAATGCTGTACCCAGCATCAAGCTCTTGGAAGGTATAAAGGGACGACGTCGTCGTATCTGCTCGAGTACCTAGCCCAACGAACCCAAAGGAACCCATCGAACAGGACCCAAAACGCCAAACAAACCTTACG(配列番号36)
TCCGTCGTCACCGGCTTGCCTGTATGATGCATCGGGACCCGAGTCCACCATGCAATCCAGATACGAGTGTTGCTCTCTTCTTGGCTCACTTTACGCGTCTGTTTGAGTGGGGCGCGGGGAGGAAAAAAGGCTGAGTTCGCTGGGCCACGCGCGTGGAAGCAAGACTGCTGCTGAGCCCTTTTTCTCTTGCGCTGAGAGAGTCGCGGCGTGCGGCCCCTTTTTTTATTAATACTAATATTATAGACTCTGAAGGAAATCGCGCTCGTGGTCAGTCGAGTCCAACACCTGGCAAAAAGAGAA(配列番号37)
ATGCAGTTCAAGTCGACCTTTGCCGCCCTCGTCCTTGCCGCCGCTGGTCTCGTGCAGGCTGCTCCGCTCCAGGAGCGTGCTGGCTGTTCGTCGTACGTCATCATCAACACTCGCGGTACCAGCGAGCCTCAGGGTCCCTCGGTCGGCTTCCGGACCATGAACACCCGCATTCGCTCCGCCGTTTCGGGTGGCTCCGAATACGACACCGTCTACCCAGCCGGTATCGACCAGAACTCGGCCCAGGGTACTGCCAACATCGTGGCCCAGGTCAAGGCCGGTCTGGCCCGCAACCCCAACACGTGCTTCCTCCTCGAGGGCTACTCCCAGGGCGCCGCTGCCACCTGCAATGCCCTTCCTCAGCTTACTGGTGCGGCGTTCGACGCCGTCAAGGGTGTCATTCTTATCGGCAACCCCGAACACAAGCCCAACCTCGCTTGCAACGTCGATGGTAACGGTGGCAAGACCACCTTCAGCGCCAGAGGTATCTCGGCTGCTTTCACCCAGGGCGTCCCCTCCAACTGGGTCTCCAAGACGCTCGACATCTGCATCTACGGCGACGGAGTTTGCGACGTCAGCTCCGGATTCGGAATCACCCCCCAGCACCTTACCTACGGATACAACACCAACGTTCAGACCATGGGCGCCAACTTCGGTATCAAGGCTCTTCAGGGATAA(配列番号38)
上記プラスミドpPaLYS12X-PaEGを鋳型にし、M13 FとM13 Rをプライマーとして用いたPCRで遺伝子断片を増幅した。得られた遺伝子断片5μgを、GB-4(0)株のリジン要求性変異株であるL1株にエレクトロポーレーションにより導入し、リン酸2ナトリウムを含むSD(SDP)寒天培地上に塗布後、30℃で培養した。2日後に、プレート一枚当たり約20個の大きいコロニーが出現した(疑似陽性と思われる小コロニーは100個程度)。このうち80コロニーをランダムに新たなSDP寒天培地に釣菌した。釣菌した形質転換体についてそれぞれ、5mLのYX培地を含む試験管に1白金耳接種し、30℃、160rpmで、3日間振とう培養した。
ベクター由来の配列を一切含まず、P.アンタクティカGB-4(0)株由来の配列のみを含む遺伝子導入用の遺伝子断片を、次の2通りの方法で作製した。
(i)上記項目(3)で作製したプラスミドpPaLYS12X-PaEGを大腸菌DH5αで増幅し、増幅したプラスミドを抽出して制限酵素EcoRIで処理した。この遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、PaEの高発現用カセットを含む5268bpの遺伝子断片のみを回収及び精製した。
(ii)上記項目(3)で作製したプラスミドpPaLYS12X-PaEGを鋳型にし、LYS12 F-1000とPXYN-1513 Fをプライマーとして用いたPCRで遺伝子断片を増幅した。増幅した遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動で分離し、PaEの高発現用カセットを含む5262bpの遺伝子断片のみを回収及び精製した。
(1)目的
野生型のS.セレヴィシエは、ピリミジン生合成経路の中間代謝物のアナログである5-フルオロオロチン酸(5-FOA)とウラシルを添加したSD寒天培地では生育できず、ウラシル生合成関連遺伝子(URA3)に変異を有するウラシル要求性変異株のみが生育することができる。この性質を利用して、効率的にS.セレヴィシエのウラシル要求性変異株を取得する方法が報告されている(Boeke JDら,Mol.Gen.Genet.(1984),197,345)。また、S.セレヴィシエのウラシル要求性株を宿主とし、ウラシル生合成遺伝子を遺伝子導入用のマーカー遺伝子として用いて形質転換した場合、当該マーカー遺伝子を形質転換体から除去することが可能である(Christine Guthrie編,Methods in enzymology,vol.194,Guide to yeast genetics and molecular biology,p.293-298)。そのため、形質転換及びマーカー遺伝子の除去を繰り返して、複数の遺伝子を同一個体の染色体上に導入することができる。一方、P.アンタクティカについては、ウラシル要求性変異株は未だ報告されていない。したがって、本実施例では、P.アンタクティカのウラシル要求性変異株の取得を試みた。このような変異株は、セルフクローニングなど有用な育種へ利用できる可能性がある。
本実施例で使用した培地の組成は以下のとおりだった。
・YPD培地
酵母エキス(Difco Laboratories社製) 1質量%
バクトペプトン(Difco Laboratories社製) 2質量%
グルコース 2質量%
・YM寒天培地
2.0質量%の寒天を含むYM培地
・SD寒天培地
2.0質量%の寒天を含むSD培地
・SD+U+FOA培地
アミノ酸と(NH4)2SO4を含まないバクトイーストナイトロジェンべース(BD bioscience社製) 0.17質量%
(NH4)2SO4 0.5質量%
グルコース 2質量%
ウラシル(Sigma-Aldrich社製) 1000mg/L
5’-フルオロオロチン酸(Wako社製) 1000mg/L
寒天 2質量%
・PaURA3-651
5'-CGAGCTGCGACACCTCGACGTAGCG-3'(配列番号39)
・PaURA3+1449c
5'-GTGGCCATTGGCCGTGACAACAGTA-3'(配列番号40)
・PaURA3-300
5'-GCTGCAGCTGCAGCTCTCCAAGCTG-3'(配列番号41)
・PaURA3+150
5'-GTGCGATGCCGTCGGCCCAGAC-3'(配列番号42)
P.アンタクティカGB-4(0)株のゲノム配列から、S.セレヴィシエ由来のUra3タンパク質と82%の相同性があるタンパク質をコードする遺伝子配列を抽出した。これをPaURA3と名付けた。PaURA3の塩基配列は前述のとおり(配列番号13)である。
1)PaURA3変異候補株の取得
P.アンタクティカGB-4(0)株を、2mLのYPD液体培地を含む試験管中で、30℃、150rpmで、一晩振とう培養した。菌体を遠心分離し、濁度(600nm)が1.0になるように液体の最小培地に懸濁し、この懸濁液のうち200μLをSD+U+FOA培地に塗布した。これにUVランプの光を3分間照射した後、30℃で5日間培養した。その結果、12個のコロニーが得られた。
上記1)で取得した12個のコロニーの増殖を、YM寒天培地又はSD寒天培地で観察した。これらの内1株(No.8)はどの培地でも増殖し、また別の1株(No.9)はどの培地でも増殖しなかったため、これら2株は目的の栄養要求性変異株では無いと判断した。他の株は、SD寒天培地上では増殖しない一方でYM寒天培地では増殖し、かつSD+U+FOA培地でも増殖したため、ウラシル要求性であることが期待された。
紫外線照射による変異株の作製においては、目的遺伝子以外の染色体部位にも変異が生じる可能性があり、その結果、酵素生産や増殖、ストレス耐性に悪影響を与える場合がある。一方、変異頻度が低い天然の環境から得たPaURA3変異株であれば、染色体上のPaURA3以外の部位は健全である可能性が高い。しかし、野生型のGB-4(0)株をSD+U+FOA培地上に塗布しただけでは、増殖するコロニーはなく、天然のPaURA3変異株は取得できない。そこで、自然変異株の選抜効率が高くなるように、培地の組成を調製した。
P.アンタクティカGB-4(0)株以外のシュードザイマ属菌についても、ウラシル要求性変異株の取得を試みた。まず、各種菌を5mLのYM培地中で30℃、160rpmで、24時間振とう培養し、YM培地で生育したときの形態を微分干渉装置が付いた光学顕微鏡で観察した。P.アンタクティカGB-4(0)株(図2A)、P.アンタクティカOMM62-2株(受託番号NITE P-02239)(図2B)、P.フロキュローサJCM10321株(図2C)、及びP.ツクバエンシスJCM10324株(図2I)は、偽菌糸を形成していなかったのに対して、P.アンタクティカJCM3941株(図2D)、P.アンタクティカGB-4(1)W株(図2E)、P.アンタクティカT-34株(図2F)、P.ルグローサJCM10323株(図2G)、及びP.アフィディスJCM10318株(図2H)は、偽菌糸を形成していた。
(1)目的
P.アンタクティカGB-4(0)株のウラシル要求性変異株は、異種生物由来の遺伝子を使わない遺伝子操作(セルフクローニング)に使用することができる。本実施例では、生分解性プラスチック分解酵素PaEを大量生産するセルフクローニング株を作製する。
本実施例で使用した培地の組成は以下のとおりだった。
・3xFMM-PBSAエマルジョン・8%キシロース平板培地(実施例3(2)に記載のとおり)
・PaCLE1-627
5'-GATTCGATACATGGCGTCTCTG-3'(配列番号43)
・PaURA3(+900-932)-PaCLE1+1426c
5'-GAGGCCTACCTCGCCCGTCTTGGTCAGAAGTAGCACTACCTGTTGCGTTCGTA-3'(配列番号44)
・PaURA3-300(実施例4(2)に記載のとおり)
・PaXYN1-609
5'-GGCTGAAGCTTTGGCTCTGACA-3'(配列番号45)
・PaCLE1+25c-PaXYN1-1c
5'-CGGCAAAGGTCGACTTGAACTGCATCGTAAGGTTTGTTTGGCGTTTTGGG-3'(配列番号46)
・PaCLE1+1
5'-ATGCAGTTCAAGTCGACCTTTGCCG-3'(配列番号47)
・PaURA3-200
5'-CCCATTTCTTCCGGTTCACGTGAGC-3'(配列番号48)
・PaURA3-100
5'-TTTGCCTTTGCATGACATTCGCACG-3'(配列番号49)
・SIu-PaCLE1-1575
5’-TCATCGATGAATTCGCGTACGATATGCAGCCAATC-3’(配列番号50)
・SIdc-PaCLE1+1426c
5’-CCAGTGTCGAAAACGCACTACCTGTTGCGTTCGTA-3'(配列番号51)
・HindIII-PaURA3-651
5’-CCGCCAGCTGAAGCTCGAGCTGCGACACCTCGA-3’(配列番号52)
・XbaI-PaURA3+1449c
5’-CGCCTTTTCGTCTAGGTGGCCATTGGCCGTGAC-3’(配列番号53)
・NdeIu-PaCLE1+176
5’-GACAATATGTCCATACCGCCGTTTCGGGTGGCTCC-3’(配列番号54)
・NdeIdc-PaCLE1+1426c
5’-TGAGAGTGCACCATACACTACCTGTTGCGTTCGTA-3’(配列番号55)
・PaCLE1-1574
5'-CGTACGATATGCAGCCAATCGC-3'(配列番号56)
・PaURA3-651(実施例4(2)に記載のとおり)
PaURA3を選抜マーカーに用いて、P.アンタクティカ由来の配列のみで構成されるPaE高発現用の遺伝子断片を導入するために、それぞれのプロモーター領域及びターミネーター領域を含んだPaURA3遺伝子とPaCLE1遺伝子とを、非相同末端結合(NHEJ)を利用した遺伝子導入法(Hoshidaら、Yeast(2014)、31、29-46)を応用して接続する。この方法に従えば、外部から導入した2種の遺伝子断片を生体内で接続させ、その接続された遺伝子断片を保有する菌株だけを培地上に生育させて回収することができる。
シュードザイマ属菌(酵母)では、キシロース存在下でPaXYN1プロモーター制御下の遺伝子が強力に発現誘導されることが知られている。そこで、ウラシル要求性を利用して、PaXYN1プロモーター制御下でPaEを生産するセルフクローニング株を作製することにした。このために、フュージョンPCRを行い、PaXYN1プロモーターとPaCLE1(PaEの構造遺伝子)を繋げた遺伝子カセットを作製する。
取得した形質転換体を、PBSAを含んだ平板培地(3xFMM-PBSAエマルジョン・8質量%キシロース)に塗布し、PBSAの分解を評価した。この平板培地は、従来用いていた2層の培地(3xFMM-PBSAエマルジョン・大豆油重層平板培地;要すれば後述の実施例7も参照)に比べて多くのPBSAエマルジョンを含むため、PBSAを分解して透明な領域(ハロ)を形成させるためには、より多くのPBSA分解酵素が必要となる。また、炭素源にキシロースを用いているので、PaXYN1プロモーター制御下の遺伝子を強力に発現誘導する。この培地上で上記形質転換体を30℃で培養すると、3日目には、ハロを形成する形質転換体が観察され、6日目にはハロがより明確に観察されるようになった。PaCLE1及びPaURA3の遺伝子配列を含むが、プロモーターの長さが異なる3種類の遺伝子断片のいずれかを導入した形質転換体について、コロニーを50個ずつ観察し、PBSAエマルジョンを分解して比較的明確なハロの形成が観察されたコロニーの数を数えた。PaURA3紫外線変異株であるPGB045株に遺伝子導入して取得した形質転換体についての結果を表5に示す。
(6-1)プラスミドの作製
EUROSCARFより提供されたpAG32プラスミド(図6左)を、SacIによって処理して線状化した。また、P.アンタクティカGB-4(0)株の染色体DNAから、SIu-PaCLE1-1575及びSIdc-PaCLE1+1426cをプライマーとして用いたPCRによって、PaCLE1の遺伝子断片を増幅した。この遺伝子断片を、上記線状化pAG32にクローニングして、プラスミドpYT026(図6中)を作製した。
PaCLE1とPaURA3が接続された遺伝子カセット(PaCLE1-PaURA3c)を効率よく利用できるようにするため、PaCLE1-PaURA3cのドナー株を作製した。
すなわち、制限酵素EcoRVによってpYT108を線状化し、PaCLE1-1574及びPaURA3-651をプライマーとしたPCRによって、PaCLE1-PaURA3cを作製した。この遺伝子断片を、アガロースゲル電気泳動によって分離及び抽出して、PGB045株(紫外線照射で取得したPaURA3変異株)に導入し、形質転換体PGB459株を作製した。このPGB459株をドナー株として使用する。
P.アンタクティカGB4-(0)株の染色体DNAより、PaXYN1-609及びPaCLE1+25c-PaXYN1-1cをプライマーとして用いて、PaXYN1プロモーター遺伝子を増幅した。次に、PGB459株の染色体DNAより、PaCLE1+1及びPaURA3-651をプライマーとして用いて、PaCLE1-PaURA3c遺伝子断片を増幅した。そして、これら2つの遺伝子断片を、PaXYN1-609及びPaURA3-100をプライマーとして用いたフュージョンPCRによって接続した。このようにして作製されたPaXYN1プロモーター及びPaCLE1-PaURA3cを含む遺伝子カセットを、PGB371株(PaURA3自然変異株)に導入し、形質転換体(セルフクローニング株)を取得した。
取得した形質転換体を、PBSAを含んだ平板培地(3xFMM-PBSAエマルジョン・8質量%キシロース)に塗布し、PBSAの分解を評価した。その結果、ハロを形成する複数の形質転換体が観察され、このうち特にPGB469株は、他の形質転換体よりも大きいハロを示した。
(1)目的
遺伝子組み換えやセルフクローニング等でP.アンタクティカからPaE等の酵素を含む培養液を得た後でも、培養ろ液の状態では、保存、流通過程で目的酵素が安定に保たれている必要がある。また、製造工程で酵素生産菌であるP.アンタクティカが、完全に除去ができていない場合や、雑菌が混入すれば、取得した培養ろ液が腐敗する恐れもある。そのため、本実施例では、PaEの活性を極力安全かつ簡便な方法によって長期間安定に保つ方法を確立することを目的とする。また、組換え生物による環境汚染防止の観点から、培養液を(PaEの活性を保ちつつ)無菌化または完全に殺菌する方法を確立することを目的とする。さらに、製品流通コスト低減のため、PaE溶液の濃縮・コンパクト化を検討する。
室温(約20℃)下で、PaEを含むP.アンタクティカの培養液とエタノールとを、体積比100:0(0%エタノール)、75:25(25%エタノール)、50:50(50%エタノール)、30:70(70%エタノール)、又は10:90(90%エタノール)で混合し、変性沈殿物が生じるかどうか調べた。上記培養液としては、L1-S12株の培養上清液をフィルターで濾過し、菌体を除去したろ液を用いた。すると、0%エタノール及び25%エタノールでは沈殿は生じなかったが、エタノール濃度50%以上では、エタノール濃度を上げるに従って多くの沈殿が生じた。この沈殿物を10,000×gで10分間遠心分離して回収し、エタノールと混合前の培養液の体積と同量の水で再溶解して、50%エタノール沈殿物再溶解液(試料A)、70%エタノール沈殿物再溶解液(試料B)、及び90%エタノール沈殿物再溶解液(試料C)を作製した。そして、上記培養ろ液及び試料A~CのPaE活性とタンパク質濃度を測定し、以下の式に従って、PaE活性の回収率(活性回収率)、タンパク質沈殿率、及び、比活性を計算した。
活性回収率=100×再溶解液の全PaE活性/培養液の全PaE活性
タンパク質沈殿率=100×再溶解液の総タンパク質量/培養ろ液の総タンパク質量 比活性=100×(再溶解液の全PaE活性/再溶解液の総タンパク質量)/(培養液の全PaE活性/培養ろ液の総タンパク質量)
=活性回収率×培養ろ液の総タンパク質量/再溶解液の総タンパク質量
なお、本実施例におけるPaE活性(U/mL)とは、30℃下で、25mMのTris/HClバッファー(pH9.0)中におけるPBSAエマルジョンの分解活性のことをいい、全PaE活性とは、前記PaE活性に試料の体積(mL)を乗じたものをいう。PaEのエタノールによる沈殿特性の試験結果を表7に示す。
室温(約20℃)下で、PaEを含むL1-S12株の培養ろ液とエタノールとを、体積比100:0(0%エタノール)、90:10(10%エタノール)、75:25(25%エタノール)、50:50(50%エタノール)、25:75(75%エタノール)、又は10:90(90%エタノール)で混合した。これらの混合液をそのまま室温に放置して、当該混合液中のPaE活性の経時的な変化を調べた。沈殿が生じたものについては、活性測定直前にタッチミキサーでよく撹拌して均質化した後にサンプリングした。その結果を表8に示す。
PaEを含むL1-S12株の培養ろ液に、硫酸アンモニウムを50%飽和に達するまで添加した。生じた沈殿(50%飽和硫安沈殿物)を回収し、硫酸アンモニウム添加前の培養上清の体積と同量の水で再溶解して、50%飽和硫安沈殿物の再溶解液(試料D)を作製した。PaEは、試料D中に95.0%回収された(表9)。また、上記50%飽和硫安沈殿物を70%エタノールで懸濁し、不溶物を遠心して除去した後、エタノールをさらに加えてその濃度を90%とした。生じた沈殿を回収し、硫酸アンモニウム添加前の培養上清の体積と同量の水で再溶解して、50%飽和硫安沈殿物/70%エタノール可溶性/90%エタノール沈殿物の再溶解液(試料E)を作製した。PaEは、試料E中に90%以上回収された(表9)。そして、比活性は3.5倍近くに上昇したので(表9)、本方法によってPaEの精製度を上げることができた。
(1)目的
シュードザイマ属酵母の遺伝子組換えを利用して、効率良いタンパク質の生産系を構築するためには、適切なプロモーター制御下で、目的のタンパク質の遺伝子を発現させる必要がある。本実施例では、シュードザイマ属酵母のプロモーター活性を評価する系を構築する。具体的には、PaEの遺伝子であるPaCLE1の上流に検討対象のプロモーター配列を挿入したレポーターアッセイ用の遺伝子カセットを作製する。一方で、P.アンタクティカGB-4(0)株のPaURA3変異株を親株に用いて、PaCLE1遺伝子を破壊した菌株を作製する。この菌株に、PaURA3をマーカーに用いて上記遺伝子カセットを導入し、PaEの生分解性プラスチック分解活性をプロモーター強度の指標とした評価系を構築する。
また、例えば、培地の成分や細胞の状態にかかわらず、安定して遺伝子を発現させるプロモーター制御下でタンパク質を生産させることができれば便利である。そのようなプロモーターを、P.アンタクティカGB-4(0)株で探索するため、複数の炭素源条件下でGB-4(0)株を培養し、その細胞を用いた網羅的遺伝子発現解析を行って、安定的に発現している遺伝子を選定する。そして、PaEをレポーターに用いた評価系を用いて、P.アンタクティカにおいて安定的に発現するプロモーターの選抜を試みる。
本実施例で使用したプライマーの塩基配列は以下のとおりだった。
・PvuII-PaCLE1+1968c
5'-GAACGCGGCCGCCAGTGTGTCTTGTCGTTGTACAC-3'(配列番号57)
・PvuII-PaCLE1+613
5'-TGAACGTTGGTGTTGTATCCCTGAAGCTTCGTACG-3'(配列番号58)
・EcoRV-PaCLE1+263c
5'-GAATTCATCGATGATGCCACGATGTTGGCAGTACCCT-3'(配列番号59)
・EcoRV-PaCLE1-1074
5'-ACTAGTGGATCTGATAACGTTGCCGATCCGCAGTCTC-3'(配列番号60)
・SalI-PaURA3-651
5'-TACGCTGCAGGTCGACGAGCTGCGACACCTCGACGTAGCG-3'(配列番号61)
・SacI-PaURA3+1449c
5'-TCATCGATGAATTCGGTGGCCATTGGCCGTGACAACAGTA-3'(配列番号62)
・EcoRI-PaCLE1-1574
5'-TATCATCGATGAATTCGTACGATATGCAGCCAATC-3'(配列番号63)
・EcoRI-PaCLE1+1426c
5'-AATGGCCACCGAATTCACTACCTGTTGCGTTCGTA-3'(配列番号64)
・PaCLE1-1574(実施例5(2)に記載のとおり)
・PaURA3-300(実施例4(2)に記載のとおり)
・PaFRE1-903
5'-GCCGGAGTGATTCATGATTCGA-3'(配列番号65)
・PaXYN1-609(実施例5(2)に記載のとおり)
・PaCLE1+25c-PaXYN1-1c(実施例5(2)に記載のとおり)
・PaCLE1+25c-PaFRE1-1c
5'-CGGCAAAGGTCGACTTGAACTGCATCTTGATCTATCGAGGCCCCGCACGA-3'(配列番号66)
・PaCLE1+25c-PaCTR1-1c
5'-CGGCAAAGGTCGACTTGAACTGCATGCCGGAGTGATTCATGATTCGAATC-3'(配列番号67)
・PaTDH3-1500
5'-CCATTGCAGGTCTCGACATCAC-3'(配列番号68)
・PaCLE1+25c-PaTDH3-1c
5'-CGGCAAAGGTCGACTTGAACTGCATTTTTGAGATGATGGATGGGGAGTGT-3'(配列番号69)
・PaCTR1-903
5'-CTTGATCTATCGAGGCCCCGCA-3'(配列番号70)
・3xFMM-PBSAエマルジョン・大豆油重層平板培地の組成
上層(炭素源及びPBSAエマルジョン)
PBSAエマルジョン* 1.0質量%
大豆油(和光純薬) 1.0質量%
寒天 1.5質量%
*ビオノーレエマルジョンEM-301(PBSA)(昭和電工株式会社製)
下層(3xFMM培地、炭素源を除いた組成)
NaNO3 0.2質量%
KH2PO4 0.06質量%
MgSO4・7H2O 0.06質量%
酵母エキス(Difco Laboratories社製) 0.3質量%
(作製方法)
上層の原料を、スターラーを入れた三角フラスコ内で溶解し、殺菌した。9cmシャーレに約15mLの下層平板培地を作り、固まった後に45℃のインキュベーター内に保存し、約5mLの上層を重層した。このとき、上層はスターラーで撹拌し、油が均一に混ざるようにした。
酵母エキス(Difco Laboratories社製) 1質量%
ペプトン(Difco Laboratories社製) 2質量%
グルコース 8質量%
(寒天 2質量%)
・レポーターアッセイ用YPX培地
酵母エキス(Difco Laboratories社製) 1質量%
ペプトン(Difco Laboratories社製) 2質量%
キシロース 8質量%
(寒天 2質量%)
P.アンタクティカ染色体上にある内在性のPaCLE1をnatMX4で破壊して(置き換えて)、PaE非産生株を作製する。このnatMX4は、S.セレヴィシエを用いた実験で最近使われるようになった、ノウルセオトリシン(clonNAT)耐性遺伝子である。PaCLE1破壊用のコンストラクトとして、PaCLE1の上流配列と下流配列の間にnatMX4を挟んだ遺伝子配列を作製するために、KOD FX酵素(東洋紡)を使ったPCRによって、GB-4(0)株の染色体DNAからPaCLE1周辺配列を増幅し、natMX4がクローニングされたプラスミド(pAG25:EUROSCARFから研究用に入手)に、In-Fusion HD cloning kitを使用してクローニングした。
まず、PaURA3を遺伝子導入のマーカーとして利用するために、pAG25のnatMX4をPaURA3と置換したプラスミドを用意する。クローニングするためのPaURA3断片は、SalI-PaURA3-651とSacI-PaURA3+1449cをプライマーとしたPCRで取得した。これを、SacI及びSalIで消化したpAG25にクローニングし、得られたプラスミドをpYT019と名付けた。
1)P.アンタクティカGB-4(0)株の培養物の発現解析による候補プロモーター配列の選定
GB-4(0)株を、8質量%のグルコース又はキシロースを含む50mLの液体培地(0.6質量%のNaNO3、0.06質量%のKH2PO4、0.06質量%のMgSO4・7H2O、0.3質量%の酵母エキス(Difco Laboratories社製))を含む500mL容三角フラスコに接種後、30℃、200rpmで24時間及び168時間培養した。この細胞からRNAを抽出し、GB-4(0)株のマイクロアレイ解析に供した。
GB-4(0)株のゲノムから、これらの着目した遺伝子断片を取得するために、KOD plusを用いたPCRを行った。具体的には、PaCLE1-1574とPaURA3-300をプライマーとして用いたPCRによって、pTY040からPaCLE1プロモーターを評価するための遺伝子断片を作製した(図7右上)。
・PaFRE1のプロモーター領域の配列
GCCGGAGTGATTCATGATTCGAATCTGTCGATCGGGGCGAAGTCCAAGTGATGAGATGAGGCCGCGAATCGAGCGGGCGAGACGTGACGAGTTTACGATGGTGGCAAGAGACGAAGCGCAAAAGTCTCGTGGTGTCGCTATTGGGTATATAGTTGCCTCTGTTTGGTTGCTCGACAACGACCGGCGAGTTTAGTGCAGCGAAACAAGCTTGATTGTAGCTTTCCGTTGGTGCACGCAGCATTCGCCACTTTTCGTTCCATGCACTCCCACTGTCCGTACCCGCGCTCAAGCCTTTCAACACCAAGGCACAGTCGAGGCTACGGAGGCGACCGGCGCCTTTCGGCCTGATGCCAAGAAGTCTGGCTCGTCCCGACTCGGAGCGTTTTCCCCTTCCTCGCGCACCTCAACCGCACTGTTCCATGGCGTGTTTCTGACAGCTCACGGACCCTGAGCTCTACTGCGCTACCGAATTTCTGGTTTGGGCCTCGTCTAGCAAGCGAGGCGGCCCTGGAGCTCCTCGACACCATCCCCTCGGAGCCTTTTTTTTTCCACGACGTCGCTCGTTTGGCAAAGGCTCCGAGTCTCACGCTCGGAACGTGGCGCGTTACAAGACGAGCTTTGCTGTCGGTCTCGGCAAGGGAACAATGGTGTGGGATAACGCTTGCACAGGAAGGATCCGAACGAATCATGTCGACTGCTCAGCATGGAACCGTCAGGCAAACGCTTCTTGGCGTTGCAAGTACCGCTACAACAAAGCTTCACAGATTCTGAGCCCTCTTACTTTGTTTGCCACCACCCAACGAAGCAAGAGTTAATAAAGCTGGAGCACGATAGCTGCTCTCAAGAGCCCCGTCCCTCCGCCGAAACACCAGCCTCCTTCGTGCGGGGCCTCGATAGATCAAG(配列番号71)
CTTGATCTATCGAGGCCCCGCACGAAGGAGGCTGGTGTTTCGGCGGAGGGACGGGGCTCTTGAGAGCAGCTATCGTGCTCCAGCTTTATTAACTCTTGCTTCGTTGGGTGGTGGCAAACAAAGTAAGAGGGCTCAGAATCTGTGAAGCTTTGTTGTAGCGGTACTTGCAACGCCAAGAAGCGTTTGCCTGACGGTTCCATGCTGAGCAGTCGACATGATTCGTTCGGATCCTTCCTGTGCAAGCGTTATCCCACACCATTGTTCCCTTGCCGAGACCGACAGCAAAGCTCGTCTTGTAACGCGCCACGTTCCGAGCGTGAGACTCGGAGCCTTTGCCAAACGAGCGACGTCGTGGAAAAAAAAAGGCTCCGAGGGGATGGTGTCGAGGAGCTCCAGGGCCGCCTCGCTTGCTAGACGAGGCCCAAACCAGAAATTCGGTAGCGCAGTAGAGCTCAGGGTCCGTGAGCTGTCAGAAACACGCCATGGAACAGTGCGGTTGAGGTGCGCGAGGAAGGGGAAAACGCTCCGAGTCGGGACGAGCCAGACTTCTTGGCATCAGGCCGAAAGGCGCCGGTCGCCTCCGTAGCCTCGACTGTGCCTTGGTGTTGAAAGGCTTGAGCGCGGGTACGGACAGTGGGAGTGCATGGAACGAAAAGTGGCGAATGCTGCGTGCACCAACGGAAAGCTACAATCAAGCTTGTTTCGCTGCACTAAACTCGCCGGTCGTTGTCGAGCAACCAAACAGAGGCAACTATATACCCAATAGCGACACCACGAGACTTTTGCGCTTCGTCTCTTGCCACCATCGTAAACTCGTCACGTCTCGCCCGCTCGATTCGCGGCCTCATCTCATCACTTGGACTTCGCCCCGATCGACAGATTCGAATCATGAATCACTCCGGC(配列番号72)
CCATTGCAGGTCTCGACATCACGGCTTGGCACGACAGTTACATTGCCGGTAAAGCGGTGGTGTGCTGCATCGCTTGTCGCCTAAAGTGTGGGGTAGCACGCCATCGCGAGGTCCTCGTGGGGGGAGCTGTCGAGGCTTCGGGCCAACCTGTCAAGCTGTCGATCGGGCATGATCTGATTGAGAGAAAGACAAGTGTAGGCCGATCAGATCGCAAGAGGCTGTAATATATTGTTAGACCGAAGCACAATTGGATCCAAAACCGCGACCACCAAAGCCGCTTTCCCCCGCGATGGGTGTAGAAGGCCTGCCCGTATGCCCCCGAAGCATTCAGTCCATTCGGGTGCAGGAGAACTTCACGACATCGGGCTGATCCGCGCGTGAACGATAGAAAGCGAGGCTGAAGCTCGACTTGAAGCCTGACTGTTCGGCATAAACGGACAGGTGGTGCAGTCGCAGTTTGCTGGTCAAGCTCCGTGAATGCCTTTGCCAGTCGCCTCGGAAAGATCCTTCTGGCTTTCCGGATCGAACGACACAGCGACGGCCCTCCGCTTGCACCCGCATCTCCACCCGCACCCCGCACTAGGCTCATGCGCTCCTGCCCCTCTCTCTTTCACCCGCCAAATCGGAAGCAAACACACCCGGAGTCCCTACCGGATGTATTGCATTGTGTCGAGAATCCAAGGCGGCGGCGGCAGTGAGCGGGCTGAAGCGTGGTGACGCCAGTCAGCCTCCCCCTGCCTGTCTGCCGCTTTGCACTGTGTAGCCTCCTCCTTTTGCGACTGCTGCTCGGCTTCTCGCCCGACTACGCTTCACTCGGCCGTTGCTTACTGTGCTCAGATCTGATCGACTAGCACACCGCAGCATACCCAACAAATCAGCGCTCGGTGATAAGAAGAAAGTGCAGCCAAAAAAGGAGAGAGAAAGTCTCACCGAGAGAGAGTCACTGTTGCGCCGAGGAGAGAGCGAGCAGGCAGGGTCTTGCGAGGCGCAGCGCAACTGCACTGATCTTCAAGTGATAACGTTGCTCAGAGGCTCCACATGACCCTTGGAGTTCAAGTGCTGCGCGGCTTTTTTTGAAATGGGGATTAGATGTCTTTTTCAAAGCTGGACGCTCGGATCAGCTTGATTGGGCAGTGGAGCCAAGAGCGATCAGCCCGTGCATTTCCAAGAGCTTCTGCGGTGGGAGAGCGCAGAGAGAGTGGGCATTATTCAGAAGATCGATTGTTCACAGTCGAGAGGAGCAGGCGGACCTGCGCGGTCACCGCGGTGCTCTCCGGGCCCGTCAGCAGTCATCCTTTGGCTCGGCTCGCTCCGCCACTGGCTTTGCGCAGAGGCCAGCCAGCAGCACCAGCAGCAGCAGCGAGCAGTGTTGGGCGACGCAGACCCGCACCCTCCTGCAGGCGCAAAGCGATCAAAAGTGCGTGTCCGCTTCGTCTCTTCTTCCTTCTGCTCCACCATCGAATCTTCTTCGTGTCACACTCCCCATCCATCATCTCAAAA(配列番号73)
Claims (3)
- 安定化された生分解性プラスチック分解酵素を取得する方法であって、
前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液を用意する工程、
前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液にエタノールを添加して、前記生分解性プラスチック分解酵素を安定化する又は沈殿させる工程、及び、
前記安定化した又は沈殿した生分解性プラスチック分解酵素を回収する工程、
を含み、
前記生分解性プラスチック分解酵素が、酵母又は糸状菌の生分解性プラスチック分解酵素である、方法。 - 前記エタノール添加工程の前に、前記生分解性プラスチック分解酵素を濃縮する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記生分解性プラスチック分解酵素を含む溶液を用意する工程の前に、
シュードザイマ属菌の栄養要求性変異株を用意する工程、
前記栄養要求性変異株に、遺伝子カセットを少なくとも1つ導入する工程、及び、
前記遺伝子カセットを導入した栄養要求性変異株を培養して、前記生分解性プラスチック分解酵素を生産する工程をさらに含み、
前記遺伝子カセットが、前記生分解性プラスチック分解酵素をコードする遺伝子、シュードザイマ属菌のXYN1又はFRE1のプロモーター、及び、前記栄養要求性変異株の栄養要求性を相補する遺伝子を含み、前記生分解性プラスチック分解酵素をコードする遺伝子が、前記プロモーターの下流に位置している、請求項1又は2に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017054264 | 2017-03-21 | ||
JP2017054264 | 2017-03-21 | ||
JP2018052952A JP7181542B2 (ja) | 2017-03-21 | 2018-03-20 | シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018052952A Division JP7181542B2 (ja) | 2017-03-21 | 2018-03-20 | シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022121640A JP2022121640A (ja) | 2022-08-19 |
JP7473137B2 true JP7473137B2 (ja) | 2024-04-23 |
Family
ID=63794849
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018052952A Active JP7181542B2 (ja) | 2017-03-21 | 2018-03-20 | シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株 |
JP2022106237A Active JP7473137B2 (ja) | 2017-03-21 | 2022-06-30 | シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株 |
JP2022106236A Pending JP2022126864A (ja) | 2017-03-21 | 2022-06-30 | シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018052952A Active JP7181542B2 (ja) | 2017-03-21 | 2018-03-20 | シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022106236A Pending JP2022126864A (ja) | 2017-03-21 | 2022-06-30 | シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (3) | JP7181542B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP7128514B2 (ja) * | 2018-10-16 | 2022-08-31 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 害虫を防除するための組成物及び害虫を防除する方法 |
JP7475007B2 (ja) | 2020-03-10 | 2024-04-26 | 株式会社クレハ | エルゴチオネインの生産方法 |
JP7299623B2 (ja) * | 2020-09-17 | 2023-06-28 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | キシロース誘導性プロモーター及びその使用 |
WO2023176835A1 (ja) * | 2022-03-16 | 2023-09-21 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | キシロース誘導性プロモーター及びその使用 |
JP2023150669A (ja) * | 2022-03-31 | 2023-10-16 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 担子菌酵母及び担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4915593B2 (ja) | 2007-02-28 | 2012-04-11 | 独立行政法人農業環境技術研究所 | 生分解性プラスチック分解菌およびその分解酵素製造方法 |
JP5849297B2 (ja) | 2011-08-30 | 2016-01-27 | 国立研究開発法人農業環境技術研究所 | 生分解性プラスチック分解酵素の製造方法及びこれに使用されるPseudozyma antarctica |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6413117B2 (ja) | 2013-01-09 | 2018-10-31 | 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 高効率な異種タンパク質の製造方法 |
-
2018
- 2018-03-20 JP JP2018052952A patent/JP7181542B2/ja active Active
-
2022
- 2022-06-30 JP JP2022106237A patent/JP7473137B2/ja active Active
- 2022-06-30 JP JP2022106236A patent/JP2022126864A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4915593B2 (ja) | 2007-02-28 | 2012-04-11 | 独立行政法人農業環境技術研究所 | 生分解性プラスチック分解菌およびその分解酵素製造方法 |
JP5849297B2 (ja) | 2011-08-30 | 2016-01-27 | 国立研究開発法人農業環境技術研究所 | 生分解性プラスチック分解酵素の製造方法及びこれに使用されるPseudozyma antarctica |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
AMB Express,2011年11月29日,vol. 1,article no. 44 (pp. 1-11) |
Appl Microbiol Biotechnol,2013年06月08日,vol. 97, no. 7,pp. 2951-2959 |
PLOS ONE,2021年06月04日,vol. 16, no. 6,article no. e0252811 (pp. 1-11) |
平成24年度研究成果情報,2013年,vol. 29,pp. 42-43 |
酵素の精製分離,分析化学,1959年,vol. 8, no. 6,pp. 398-403 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP7181542B2 (ja) | 2022-12-01 |
JP2022121640A (ja) | 2022-08-19 |
JP2022126864A (ja) | 2022-08-30 |
JP2018157814A (ja) | 2018-10-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7473137B2 (ja) | シュードザイマ・アンタクティカの新規菌株 | |
JPS62104585A (ja) | ピチア属酵母の部位選択的ゲノム修飾 | |
CN1225125A (zh) | 用于将木糖发酵为乙醇的稳定的重组酵母 | |
US20160289690A1 (en) | Mortierella alpina recombinant gene expression system and construction method and use thereof | |
CN1938426A (zh) | 在酿酒酵母中生成重组基因 | |
US8198089B2 (en) | Flocculent yeast and method for production thereof | |
US20110281362A1 (en) | Electrotransformation of Gram-Positive, Anaerobic, Thermophilic Bacteria | |
JP2005508191A (ja) | ワイン酵母の尿素分解の調節 | |
FI111552B (fi) | Menetelmä rekombinanttisen isäntäsolukannan tuottamiseksi ja näin saatu rekombinanttinen isäntäsolu | |
FR2559781A1 (fr) | Nouveau vecteur plasmidique hybride de e. coli conferant le pouvoir de faire fermenter le saccharose et son procede de preparation | |
JP2004524817A (ja) | 薬剤耐性マーカーを含有しない遺伝子組み換え細胞とその作製方法 | |
CN113122461A (zh) | 单细胞蛋白生产菌及其应用 | |
US20240034983A1 (en) | Asporogenous bacteria and uses thereof as a feed ingredient | |
US20210102161A1 (en) | Method of Improving Resistance to Substrate Analog of Nitric Acid in Microalga | |
KR101871978B1 (ko) | 지방산 생성능이 개선된 변이 대장균 및 이의 제조방법 | |
John et al. | Genome shuffling: A new trend in improved bacterial production of lactic acid | |
JP7452900B2 (ja) | 乳酸耐性の向上を有する酵母およびその使用 | |
WO2022186216A1 (ja) | 改変シアノバクテリア、改変シアノバクテリアの製造方法、及び、タンパク質の製造方法 | |
Papon et al. | Genetic manipulation of Meyerozyma guilliermondii | |
JP6620373B2 (ja) | 形質転換体およびその製造方法、ならびに炭素数4のジカルボン酸の製造方法 | |
JP2864285B2 (ja) | 乳酸桿菌―大腸菌用複合シャトルベクター及びそれで形質転換された宿主微生物 | |
Sharaf et al. | Impact of some genetic treatments on the probiotic activities of Saccharomyces boulardii | |
KR100814313B1 (ko) | 대장균의 염색체 재조합에 사용되는 플라스미드 | |
CN117070538A (zh) | ppt1基因作为筛选标记在营养缺陷筛选中的应用 | |
KR20220166605A (ko) | 갈락토스 이용에 관여하는 모든 유전자가 결손된 효모 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질 생산방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220705 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230824 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20231012 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231225 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20231225 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240304 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240403 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7473137 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |