JP7475007B2 - エルゴチオネインの生産方法 - Google Patents
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Description
本発明は、エルゴチオネインの生産方法に関する。
エルゴチオネインは含硫アミノ酸の一種である。エルゴチオネインは、ビタミンＥの抗酸化作用よりも優れた抗酸化作用を有し、健康および美容等の分野において、利用価値の高い化合物として注目されている。
非特許文献１には、シュードザイマ（Pseudozyma）属の酵母がエルゴチオネインを生産することが記載されている。
特許文献１には、硝酸塩を含む培地でシュードザイマ（Pseudozyma）属の酵母を培養すると、培養上清の抗酸化活性が上昇することが記載されている。
Y. Fujitani et al., J. Biosci. Bioeng., 126, 715-722 (2018)
エルゴチオネインは、ヒトの体内では生合成されず、一部の微生物で生合成されることが知られている。よって、上述の先行技術文献に記載されるように、エルゴチオネインを産生する微生物の探索、および、エルゴチオネインの生産を増強させるための培養方法等の研究開発が進められている。しかしながら、先行技術文献に記載される微生物の培養方法は、エルゴチオネインの生産量が低く、エルゴチオネインの生産量が増強する培養方法のさらなる開発が望まれる。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、エルゴチオネインの生産量が増強する微生物の培養方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、鋭意検討の結果、培地を特定の組成にすることによって、エルゴチオネインの生産量を増強できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明に係るエルゴチオネインの生産方法は、シュードザイマ（Pseudozyma）属の酵母を培地中に培養し、エルゴチオネインを含む培養物を得る工程を含み、前記培地が糖を炭素源として含み、前記糖の濃度が５ｇ／Ｌ以上５０ｇ／Ｌ未満である、生産方法である。
本発明の一態様によれば、エルゴチオネインの生産量が増強する微生物の培養方法を提供することができる。
本実施形態の生産方法は、シュードザイマ（Pseudozyma）属の酵母を培地中に培養し、エルゴチオネインを含む培養物を得る工程を含む。エルゴチオネインは、含硫アミノ酸の一種であり、優れた抗酸化作用を有する。
（シュードザイマ属の酵母）
シュードザイマ属の酵母は、エルゴチオネインを産生可能であるシュードザイマ属の酵母であれば特に限定されない。シュードザイマ属の酵母の例として、シュードザイマ・アンタクティカ、シュードザイマ・フベイエンシス、シュードザイマ・シアメンシス、シュードザイマ・シャンキシエンシス、シュードザイマ・ルグローサ、シュードザイマ・クラッサ、シュードザイマ・アルボアメニアカ、シュードザイマ・グラミニコーラ、シュードザイマ・フシフォルマタ、シュードザイマ・パラアンタクティカ、シュードザイマ・フロキュロッサ、および、シュードザイマ・チュラシマエンシス等が挙げられる。エルゴチオネインの生産量が高い点等で、シュードザイマ・シアメンシス（Pseudozyma siamensis）、シュードザイマ・クラッサまたはシュードザイマ・フロキュロッサを培養することが好ましい。１種類の酵母を培養してもよいし、複数種類の酵母を培養してもよい。また、シュードザイマ属の酵母は、遺伝子組換え技術等による改変が行われていてもよい。
シュードザイマ属の酵母は、エルゴチオネインを産生可能であるシュードザイマ属の酵母であれば特に限定されない。シュードザイマ属の酵母の例として、シュードザイマ・アンタクティカ、シュードザイマ・フベイエンシス、シュードザイマ・シアメンシス、シュードザイマ・シャンキシエンシス、シュードザイマ・ルグローサ、シュードザイマ・クラッサ、シュードザイマ・アルボアメニアカ、シュードザイマ・グラミニコーラ、シュードザイマ・フシフォルマタ、シュードザイマ・パラアンタクティカ、シュードザイマ・フロキュロッサ、および、シュードザイマ・チュラシマエンシス等が挙げられる。エルゴチオネインの生産量が高い点等で、シュードザイマ・シアメンシス（Pseudozyma siamensis）、シュードザイマ・クラッサまたはシュードザイマ・フロキュロッサを培養することが好ましい。１種類の酵母を培養してもよいし、複数種類の酵母を培養してもよい。また、シュードザイマ属の酵母は、遺伝子組換え技術等による改変が行われていてもよい。
（培地）
本実施形態の生産方法で使用する培地は、糖を炭素源として含む。糖を炭素源として含むことにより、シュードザイマ属の酵母によるエルゴチオネインの生産量が増強する。糖の例として、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、オリゴ糖、多糖、でんぶん等が挙げられる。エルゴチオネインの生産量が高まる点等で、本実施形態の生産方法で使用する培地は、グルコースを含むことが好ましい。培地に含まれる糖は１種類であってもよいし、複数種類であってもよい。
本実施形態の生産方法で使用する培地は、糖を炭素源として含む。糖を炭素源として含むことにより、シュードザイマ属の酵母によるエルゴチオネインの生産量が増強する。糖の例として、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、オリゴ糖、多糖、でんぶん等が挙げられる。エルゴチオネインの生産量が高まる点等で、本実施形態の生産方法で使用する培地は、グルコースを含むことが好ましい。培地に含まれる糖は１種類であってもよいし、複数種類であってもよい。
本実施形態の生産方法で使用する培地に含まれる糖の濃度は、５ｇ／Ｌ以上５０ｇ／Ｌ未満である。当該糖の濃度は、培地１Ｌ当たりに含まれる糖の量を示す。エルゴチオネインの生産量が高まる点等で、１０ｇ／Ｌ以上が好ましく、１５ｇ／Ｌ以上がより好ましい。また、菌体当たりのエルゴチオネインの生産量が高まる点等で、４５ｇ／Ｌ以下が好ましく、４０ｇ／Ｌ以下であることがより好ましい。
本実施形態の生産方法に適する培地はＹＭ培地である。また、所望の糖濃度に調整されたＹＭ培地も実施形態の生産方法に適する。
本実施形態の生産方法で使用する培地は、エルゴチオネインの生産量が高まる点等で、ヒスチジンまたはメチオニンを含むことが好ましい。ヒスチジンおよびメチオニンを両方含んでいてもよい。ヒスチジンまたはメチオニンの濃度（培地１Ｌ当たりに含まれるヒスチジンまたはメチオニンの量）は、エルゴチオネインの生産量が高まる点等で、０．０１ｇ／Ｌ以上が好ましく、０．１ｇ／Ｌ以上であることがより好ましい。また、５０ｇ／Ｌ以下が好ましく、５ｇ／Ｌ以下であることがより好ましい。
本実施形態の生産方法で使用する培地は、エルゴチオネインの生産量が高まる点等で、過酸化水素を含むことが好ましい。過酸化水素濃度が０．０１ｍＭ以上、５ｍＭ以下となるように添加された培地が好ましく、０．１ｍＭ以上、３ｍＭ以下となるように添加された培地がより好ましい。
本実施形態の生産方法で使用する培地は、エルゴチオネインの生産量が高まる点等で、ｐＨが弱酸性であることが好ましい。具体的には、培地のｐＨが４以上であることが好ましい。また、７以下であることが好ましく、６以下であることがより好ましい。
（その他の培養条件）
培養形態は液体培地を用いた回分培養であってもよく、または培養系に培地成分を連続添加する流加培養であってもよい。通気攪拌して培養することが望ましい。
培養形態は液体培地を用いた回分培養であってもよく、または培養系に培地成分を連続添加する流加培養であってもよい。通気攪拌して培養することが望ましい。
培養温度は、シュードザイマ属酵母が生育し得る温度範囲であればよく、２０℃以上が好ましく、２２℃以上がより好ましい。また、３０℃以下が好ましく、２８℃以下がより好ましい。
培養時間は、使用する培地の種類および炭素源の濃度等に応じて、適宜選択できる。２４時間以上が好ましく、７２時間以上がより好ましい。また、１０日以下が好ましく、７日以下がより好ましい。
（培養物からのエルゴチオネインの回収）
エルゴチオネインを含む培養物からのエルゴチオネインの回収は、例えば、通常の微生物培養物からエルゴチオネインを回収し精製する方法で行えばよい。培養物には、培養上清、培養菌体、培養菌体破砕物等が含まれる。例えば、培養物を遠心分離等して菌体を回収する。回収した菌体を熱水抽出に供する等により、エルゴチオネインを含む抽出液を得る。そして、当該抽出液を精製することによって、エルゴチオネインを回収することができる。微生物のエルゴチオネインの生産量は、例えば、得られた抽出液を、高速液体クロマトグラフィー装置およびＬＣＭＳ等の質量分析装置によって測定することによって、定量することができる。
エルゴチオネインを含む培養物からのエルゴチオネインの回収は、例えば、通常の微生物培養物からエルゴチオネインを回収し精製する方法で行えばよい。培養物には、培養上清、培養菌体、培養菌体破砕物等が含まれる。例えば、培養物を遠心分離等して菌体を回収する。回収した菌体を熱水抽出に供する等により、エルゴチオネインを含む抽出液を得る。そして、当該抽出液を精製することによって、エルゴチオネインを回収することができる。微生物のエルゴチオネインの生産量は、例えば、得られた抽出液を、高速液体クロマトグラフィー装置およびＬＣＭＳ等の質量分析装置によって測定することによって、定量することができる。
〔まとめ〕
本実施形態に係るエルゴチオネインの生産方法は、シュードザイマ（Pseudozyma）属の酵母を培地中に培養し、エルゴチオネインを含む培養物を得る工程を含み、前記培地が糖を炭素源として含み、前記糖の濃度が５ｇ／Ｌ以上５０ｇ／Ｌ未満である。
本実施形態に係るエルゴチオネインの生産方法は、シュードザイマ（Pseudozyma）属の酵母を培地中に培養し、エルゴチオネインを含む培養物を得る工程を含み、前記培地が糖を炭素源として含み、前記糖の濃度が５ｇ／Ｌ以上５０ｇ／Ｌ未満である。
また、本実施形態に係るエルゴチオネインの生産方法において、前記培地が、ヒスチジンおよびメチオニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物をさらに含んでいてもよい。
また、本実施形態に係るエルゴチオネインの生産方法において、前記培地が過酸化水素をさらに含んでいてもよい。
また、本実施形態に係るエルゴチオネインの生産方法において、前記培地のｐＨが４以上６以下であってもよい。
また、本実施形態に係るエルゴチオネインの生産方法において、前記酵母が、シュードザイマ・アンタクティカ、シュードザイマ・フベイエンシス、シュードザイマ・シアメンシス、シュードザイマ・シャンキシエンシス、シュードザイマ・ルグローサ、シュードザイマ・クラッサ、シュードザイマ・アルボアメニアカ、シュードザイマ・グラミニコーラ、シュードザイマ・フシフォルマタ、シュードザイマ・パラアンタクティカ、シュードザイマ・フロキュロッサ、または、シュードザイマ・チュラシマエンシスに属する微生物であってもよい。
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明の以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
以下の実施例中、特に記載がない限り、％は質量％を表す。
〔評価例１〕シュードザイマ属酵母のエルゴチオネイン生産量の測定
３ｍＬのＹＭ培地を含む試験管に、表１に示す酵母１６株をそれぞれ植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて３日間培養を行った。ＹＭ培地には、１０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌのペプトン、３ｇ／Ｌの酵母エキス、および、３ｇ／Ｌの麦芽エキスが含まれている。表１中、Ustilago maydisはシュードザイマ属と近縁種の酵母である。
３ｍＬのＹＭ培地を含む試験管に、表１に示す酵母１６株をそれぞれ植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて３日間培養を行った。ＹＭ培地には、１０ｇ／Ｌのグルコース、５ｇ／Ｌのペプトン、３ｇ／Ｌの酵母エキス、および、３ｇ／Ｌの麦芽エキスが含まれている。表１中、Ustilago maydisはシュードザイマ属と近縁種の酵母である。
３日間培養後、培養液を６０００ｒｐｍにて５分間遠心分離に供した。遠心分離により得られた菌体ペレットを純水で洗浄し、再度遠心分離に供した。遠心分離により得られた菌体ペレットに純水を加えて懸濁した。得られた懸濁液を９６℃において１０分間加熱して、菌体内成分を抽出した。そして、抽出した菌体内成分を遠心分離に供して菌体残渣を取り除き、抽出液が得られた。
抽出液０．１５ｍＬとアセトニトリル０．３５ｍＬとを混合した溶液を０．４５μｍのＰＶＤＦフィルターで濾過した。得られた濾液をＬＣＭＳ測定のサンプルとして使用した。
ＬＣＭＳ分析には、島津製作所社製ＬＣＭＳ－２０２０を用いた。また、ＬＣのカラムには、ＳＨＯＤＥＸ社製Asahipak NH2P-40 2D+ガードカラムを使用した。ＬＣの移動相として、１０ｍＭギ酸アンモニウムとアセトニトリルとの混合液（１０ｍＭギ酸アンモニウム／アセトニトリル＝３０／７０（ｖ／ｖ））を使用した。また、流速は０．１ｍＬ／ｍｉｎとし、２５℃において分析を行った。
ＭＳ検出においては、ＥＳＩイオン化とＡＰＣＩイオン化とを同時に行うＤＵＩＳモードでイオン化させた。また、エルゴチオネインを検出可能なｍ／ｚ＝２３０（＋）のＳＩＭモードで検出を行った。測定結果を図１に示す。
図１の縦軸は培養液１Ｌ当たりのエルゴチオネイン（以下、「ＥＧＴ」と略記する場合がある）の含有量（ｍｇ／Ｌ－培養液）を示す。図１に示すように、評価した１６の酵母株中、１４の酵母株においてエルゴチオネインが生産された。菌株番号CBS9960（Pseudozyma siamensis）のＥＧＴ生産量が最も高かった（４０．１ｍｇ／Ｌ、１３．４ｍｇ／Ｌ／ｄ）。
〔評価例２〕培養条件の検討
３種類の培地を用いて、ＥＧＴの生産量を測定した。表２には使用したＹＭ培地およびミネラル培地の組成を示す。表３には、使用したＭＭ培地の組成を示す。表２中の濃度は、培地１Ｌ当たりの濃度である。表３中の濃度は、培地中の最終濃度である。ＭＭ培地の組成は、Alamgir, K. M. et al, Front. Microbiol., 6, 4025 (2015)のTable S1に記載のＭＭ培地と同じ組成である。
３種類の培地を用いて、ＥＧＴの生産量を測定した。表２には使用したＹＭ培地およびミネラル培地の組成を示す。表３には、使用したＭＭ培地の組成を示す。表２中の濃度は、培地１Ｌ当たりの濃度である。表３中の濃度は、培地中の最終濃度である。ＭＭ培地の組成は、Alamgir, K. M. et al, Front. Microbiol., 6, 4025 (2015)のTable S1に記載のＭＭ培地と同じ組成である。
３ｍＬのＹＭ培地、ＭＭ培地またはミネラル培地を含む試験管に、表１に示す酵母１６株をそれぞれ植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて３日間培養を行った。ＭＭ培地は７日間でも培養を行った。ＹＭ培地とＭＭ培地でのＥＧＴ生産量を示すデータを図２、ＹＭ培地とミネラル培地でのＥＧＴ生産量を示すデータを図３に示す。
図２に示すように、シュードザイマ属の酵母によるＭＭ培地でのＥＧＴ生産量は培養日数に関わらず、ＹＭ培地でのＥＧＴ生産量よりも低かった。また、図３に示すように、シュードザイマ属の酵母によるＹＭ培地でのＥＧＴ生産量はミネラル培地でのＥＧＴ生産量よりも高かった。以上のことから、ＹＭ培地でシュードザイマ属の酵母を培養することによって、ＥＧＴ生産量が増加することが分かった。
〔評価例３〕培養条件の検討（基本条件におけるＥＧＴ生産量の測定）
次に、ＹＭ培地を基に培養条件を検討することにした。まず、３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコにシュードザイマ・アンタクティカ（以下、「ＰＡＮ」と略記する場合がある）、シュードザイマ・シアメンシス（以下、「ＰＳＩ」と略記する場合がある）、および、シュードザイマ・シャンキシエンシス（以下、「ＰＳＨ」と略記する場合がある）をそれぞれ植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１０）。測定結果を図４に示す。
次に、ＹＭ培地を基に培養条件を検討することにした。まず、３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコにシュードザイマ・アンタクティカ（以下、「ＰＡＮ」と略記する場合がある）、シュードザイマ・シアメンシス（以下、「ＰＳＩ」と略記する場合がある）、および、シュードザイマ・シャンキシエンシス（以下、「ＰＳＨ」と略記する場合がある）をそれぞれ植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１０）。測定結果を図４に示す。
図４に示すように、ＹＭ培地でのＥＧＴ生産量はＰＳＩが最も高かった。ＰＡＮによるＥＧＴ生産量は１３．０±３．５ｍｇ／Ｌ、ＰＳＩによるＥＧＴ生産量は４９．５±７．０ｍｇ／Ｌ、ＰＳＨによるＥＧＴ生産量は１９．８±２．９ｍｇ／Ｌであった。以下、評価例３の培養条件を基本条件として、培養条件の検討を行うことにした。
〔評価例４〕培養条件の検討（アミノ酸供給源の添加）
ＹＭ培地中の酵母エキス（ＹＥ）またはペプトン（ＰＥ）の濃度を上昇させることによって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。ＹＥおよびＰＥは、ＹＭ培地のアミノ酸供給源である。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコにＹＥまたはＰＥを添加して、酵母を植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図５に示す。
ＹＭ培地中の酵母エキス（ＹＥ）またはペプトン（ＰＥ）の濃度を上昇させることによって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。ＹＥおよびＰＥは、ＹＭ培地のアミノ酸供給源である。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコにＹＥまたはＰＥを添加して、酵母を植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図５に示す。
図５中、例えば、「ＹＥ ６ｇ／Ｌ」は、培地１Ｌ当たりに酵母エキス（ＹＥ）を６ｇ添加したときのＥＧＴ生産量を示す。図５に示すように、酵母エキスの培地への添加によって、ＥＧＴ生産量に顕著な増加は見られなかった。
〔評価例５〕培養条件の検討（エルゴチオネインの前駆体アミノ酸の添加）
次に、ＹＭ培地中のヒスチジン（Ｈｉｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）および／またはシステイン（Ｃｙｓ）の濃度を上昇させることによって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。Ｈｉｓ、ＭｅｔおよびＣｙｓは、ＥＧＴの前駆体アミノ酸である。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコにＨｉｓ、Ｍｅｔおよび／またはＣｙｓを添加して、酵母を植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図６に示す。
次に、ＹＭ培地中のヒスチジン（Ｈｉｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）および／またはシステイン（Ｃｙｓ）の濃度を上昇させることによって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。Ｈｉｓ、ＭｅｔおよびＣｙｓは、ＥＧＴの前駆体アミノ酸である。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコにＨｉｓ、Ｍｅｔおよび／またはＣｙｓを添加して、酵母を植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図６に示す。
図６中、例えば、「Ｈｉｓ １ｇ／Ｌ」は、培地１Ｌ当たりにヒスチジン（Ｈｉｓ）を１ｇ添加したときのＥＧＴ生産量を示す。図６に示すように、Ｈｉｓの培地への添加によって、ＰＳＩにおけるＥＧＴ生産量が顕著に増加した。また、Ｍｅｔの培地への添加によって、ＰＳＨにおけるＥＧＴ生産量が顕著に増加した。一方、ＰＡＮ、ＰＳＩおよびＰＳＨいずれにおいても、Ｃｙｓの培地への添加によりＥＧＴ生産量は基本条件（評価例３）よりも生産量が減少する傾向が見られた。
〔評価例６〕培養条件の検討（温度）
培養温度によって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコに、酵母を植菌した。そして、３０℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図７に示す。
培養温度によって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコに、酵母を植菌した。そして、３０℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図７に示す。
図７に示すように、培養温度を３０℃にしたことによって、ＥＧＴ生産量は増加しなかった。
〔評価例７〕培養条件の検討（振とう速度）
振とう速度によって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコに、酵母を植菌した。そして、２５℃において２５０ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図８に示す。
振とう速度によって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコに、酵母を植菌した。そして、２５℃において２５０ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図８に示す。
図８に示すように、振とう速度を２５０ｒｐｍにしたことによって、ＥＧＴ生産量は増加しなかった。
〔評価例８〕培養条件の検討（NaCl濃度）
ＹＭ培地中のNaCl濃度を上昇させることによって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコに0.5M NaClを添加して、酵母を植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図９に示す。
ＹＭ培地中のNaCl濃度を上昇させることによって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコに0.5M NaClを添加して、酵母を植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図９に示す。
図９に示すように、ＹＭ培地中のNaCl濃度を上昇させることによって、ＥＧＴ生産量は増加しなかった。
〔評価例９〕培養条件の検討（ｐＨ）
ＹＭ培地のｐＨによって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコに、酵母を植菌した。ＹＭ培地のｐＨは、１Ｍ塩酸または１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ４～８に調整した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図１０に示す。
ＹＭ培地のｐＨによって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコに、酵母を植菌した。ＹＭ培地のｐＨは、１Ｍ塩酸または１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ４～８に調整した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図１０に示す。
図１０に示すように、弱酸性（ｐＨ４～５）の条件下で、ＰＳＩおよびＰＳＨにおいてＥＧＴ生産量が増加する傾向が見られた。
〔評価例１０〕培養条件の検討（過酸化水素の添加）
ＹＭ培地中の過酸化水素の濃度を上昇させることによって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコに、過酸化水素（１、３、５または１０ｍＭ）を添加して、酵母を植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図１１に示す。
ＹＭ培地中の過酸化水素の濃度を上昇させることによって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコに、過酸化水素（１、３、５または１０ｍＭ）を添加して、酵母を植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図１１に示す。
図１１に示すように、ＹＭ培地中への低濃度（１～３ｍＭ）の過酸化水素の添加によって、ＰＡＮ、ＰＳＩおよびＰＳＨいずれの酵母においてＥＧＴ生産量が増加した。
〔評価例１１〕培養条件の検討（金属塩の添加）
ＹＭ培地中の金属塩の濃度を上昇させることによって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコに１ｍＭの金属塩（ＦｅＳＯ４、ＦｅＣｌ３、ＣｕＳＯ４またはＣｕＣｌ２）を添加して、酵母を植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図１２に示す。
ＹＭ培地中の金属塩の濃度を上昇させることによって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。３０ｍＬのＹＭ培地を含む３００ｍＬのフラスコに１ｍＭの金属塩（ＦｅＳＯ４、ＦｅＣｌ３、ＣｕＳＯ４またはＣｕＣｌ２）を添加して、酵母を植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図１２に示す。
図１２に示すように、ＹＭ培地中の金属塩の濃度を上昇させることによって、ＥＧＴ生産量は増加しなかった。
〔評価例１２〕培養条件の検討（グルコース濃度）
ＹＭ培地中のグルコース濃度によって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。糖濃度を１、５、１０、５０または１００ｇ／Ｌに調整したＹＭ培地３０ｍＬを含む３００ｍＬのフラスコに、酵母を植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図１３に示す。
ＹＭ培地中のグルコース濃度によって、ＥＧＴ生産量が増加するか否かを検証した。糖濃度を１、５、１０、５０または１００ｇ／Ｌに調整したＹＭ培地３０ｍＬを含む３００ｍＬのフラスコに、酵母を植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、ＥＧＴ生産量を測定した（ｎ＝１）。測定結果を図１３に示す。
図１３に示すように、ＰＡＮおよびＰＳＨにおいては、５ｇ／Ｌ以上の糖濃度のＹＭ培地においてＥＧＴが生産された。ＰＳＩにおいては、１ｇ／Ｌ以上の糖濃度のＹＭ培地においてＥＧＴが生産された。
次に、ＹＭ培地中のグルコース濃度によって、酵母の増殖に影響があるか否かを検証した。糖濃度を１、５、１０、５０または１００ｇ／Ｌに調整したＹＭ培地３０ｍＬを含む３００ｍＬのフラスコに、酵母を植菌した。そして、２５℃において２００ｒｐｍにて５日間培養を行い、１Ｌ培養液当たりの酵母数（乾燥菌体重量）を測定した。測定結果を図１４に示す。
図１４に示すように、５０ｇ／Ｌ以上の糖濃度のＹＭ培地において菌体重量が顕著に増加した。また、図１３および１４から、５０ｇ／Ｌ以上の糖濃度のＹＭ培地においては、菌体当たりのＥＧＴ生産量（＝ＥＧＴ濃度／乾燥菌体重量）が低くなることが分かった。
図１５は、乾燥菌体１ｇ当たりのＥＧＴ生産量（ｍｇ）を示すグラフである。図１５からも、５０ｇ／Ｌ以上の糖濃度のＹＭ培地においては、いずれの菌株でも菌体当たりのＥＧＴ生産量が大きく減少した。また、いずれの菌株でも、５ｇ／Ｌ以上の糖濃度のＹＭ培地において、菌体当たりのＥＧＴ生産量が増加した。
本発明の生産方法は、エルゴチオネインの生産量が高く、健康および美容等の分野において利用可能である。
Claims (4)
- エルゴチオネインの生産方法であって、
シュードザイマ（Pseudozyma）属の酵母を培地中に培養し、エルゴチオネインを含む培養物を得る工程を含み、
前記培地がグルコースを炭素源として含み、
前記グルコースの濃度が５ｇ／Ｌ以上５０ｇ／Ｌ未満であり、
前記培地が過酸化水素をさらに含む、
生産方法。 - 前記培地が、ヒスチジンおよびメチオニンからなる群から選択される少なくとも１つの化合物をさらに含む、請求項１に記載の生産方法。
- 前記培地のｐＨが４以上６以下である、請求項１または２に記載の生産方法。
- 前記酵母が、シュードザイマ・アンタクティカ、シュードザイマ・フベイエンシス、シュードザイマ・シアメンシス、シュードザイマ・シャンキシエンシス、シュードザイマ・ルグローサ、シュードザイマ・クラッサ、シュードザイマ・アルボアメニアカ、シュードザイマ・グラミニコーラ、シュードザイマ・フシフォルマタ、シュードザイマ・パラアンタクティカ、シュードザイマ・フロキュロッサ、および、シュードザイマ・チュラシマエンシスに属する微生物から選択される少なくとも１種の酵母である、請求項１～３のいずれか１項に記載の生産方法。
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