JP2002065292A - 多糖類の製造法 - Google Patents
多糖類の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類の選択的かつ
効率的生産。 【解決手段】 酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類の2種の
多糖類を同時に生産蓄積するシュードモナス属細菌を液
体静置培養することによって酸性ムコ多糖類を、振盪培
養することによって硫酸多糖類をそれぞれ個別に得る。
効率的生産。 【解決手段】 酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類の2種の
多糖類を同時に生産蓄積するシュードモナス属細菌を液
体静置培養することによって酸性ムコ多糖類を、振盪培
養することによって硫酸多糖類をそれぞれ個別に得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、医薬品や機能性食
品として有用な酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類をそれぞ
れ選択的かつ高収率で製造する方法に関する。
品として有用な酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類をそれぞ
れ選択的かつ高収率で製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】シュードモナス・エスピー WAK-1（Pse
udomonas sp. WAK-1）菌は海洋に生息するワカメ藻体の
表面より分離された海洋細菌であり、これを寒天平板培
地で培養することにより、新規な構造を有する２種の多
糖類すなわち酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類が同時に生
産されることが知られている〔マツダ(M.Matsuda)ら：N
ippon Suisan Gakkaishi, 58, 1735-1741(1992)〕。こ
こで得られる酸性ムコ多糖類はコンドロイチン様構造を
有し、強い粘稠性があり、また硫酸多糖類には、抗ウイ
ルス作用のあることが分かっており〔マツダ(M.Matsud
a)ら：Marine Biotechnology, 1, 68-73(1999)〕、両多
糖類は共に医薬品や機能性食品等として有用である。
udomonas sp. WAK-1）菌は海洋に生息するワカメ藻体の
表面より分離された海洋細菌であり、これを寒天平板培
地で培養することにより、新規な構造を有する２種の多
糖類すなわち酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類が同時に生
産されることが知られている〔マツダ(M.Matsuda)ら：N
ippon Suisan Gakkaishi, 58, 1735-1741(1992)〕。こ
こで得られる酸性ムコ多糖類はコンドロイチン様構造を
有し、強い粘稠性があり、また硫酸多糖類には、抗ウイ
ルス作用のあることが分かっており〔マツダ(M.Matsud
a)ら：Marine Biotechnology, 1, 68-73(1999)〕、両多
糖類は共に医薬品や機能性食品等として有用である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、この菌を寒天
平板培地で培養して酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類を生
産させる場合の生産量は培地１リットルで調製した平板
培地に換算して、それぞれ５５mg及び１６５mg程度であ
り、一般的に行われている微生物による物質生産の生産
効率と比較すると必ずしも満足できる値とはいえない。
また、本菌を培養して多糖類を生産させた粘質物の１％
フェノール懸濁液から多糖類を回収する方法としては、
遠心分離により菌体を除去し、上澄みにアルコールを添
加して多糖類を沈澱させて回収する方法などがあるが、
この画分には酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類が混合して
含まれているため、それぞれの多糖類を個別に採取する
ためには、煩雑な方法によるさらなる分画と精製を必要
とする等の問題があった。
平板培地で培養して酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類を生
産させる場合の生産量は培地１リットルで調製した平板
培地に換算して、それぞれ５５mg及び１６５mg程度であ
り、一般的に行われている微生物による物質生産の生産
効率と比較すると必ずしも満足できる値とはいえない。
また、本菌を培養して多糖類を生産させた粘質物の１％
フェノール懸濁液から多糖類を回収する方法としては、
遠心分離により菌体を除去し、上澄みにアルコールを添
加して多糖類を沈澱させて回収する方法などがあるが、
この画分には酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類が混合して
含まれているため、それぞれの多糖類を個別に採取する
ためには、煩雑な方法によるさらなる分画と精製を必要
とする等の問題があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは酸性
ムコ多糖類と硫酸多糖類とをそれぞれ選択的、かつ高収
率で生産させるべく検討したところ、前記シュードモナ
ス属の細菌を液体培地中静置条件とすることにより酸性
ムコ多糖類が、液体培地中振盪条件とすることにより硫
酸多糖類が、それぞれ選択的に生産でき、かつ収率も向
上することを見出した。
ムコ多糖類と硫酸多糖類とをそれぞれ選択的、かつ高収
率で生産させるべく検討したところ、前記シュードモナ
ス属の細菌を液体培地中静置条件とすることにより酸性
ムコ多糖類が、液体培地中振盪条件とすることにより硫
酸多糖類が、それぞれ選択的に生産でき、かつ収率も向
上することを見出した。
【０００５】すなわち、本発明は、シュードモナス属に
属し、酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類の両者を生産する
能力のある細菌を液体培地中実質的に静置の条件で培養
し、該培養物中に酸性ムコ多糖類を生成蓄積させ、これ
を採取する酸性ムコ多糖類の製造法を提供するものであ
る。
属し、酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類の両者を生産する
能力のある細菌を液体培地中実質的に静置の条件で培養
し、該培養物中に酸性ムコ多糖類を生成蓄積させ、これ
を採取する酸性ムコ多糖類の製造法を提供するものであ
る。
【０００６】また、本発明は、シュードモナス属に属
し、酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類の両者を生産する能
力のある細菌を液体培地中実質的に振盪の条件で培養
し、該培養物中に硫酸多糖類を生成蓄積させ、これを採
取する硫酸多糖類の製造法を提供するものである。
し、酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類の両者を生産する能
力のある細菌を液体培地中実質的に振盪の条件で培養
し、該培養物中に硫酸多糖類を生成蓄積させ、これを採
取する硫酸多糖類の製造法を提供するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】本発明方法に用いるシュードモナ
ス属に属し、酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類の両者を生
産する能力のある細菌としては、海洋性シュードモナス
属細菌が挙げられ、より具体的にはシュードモナス・エ
スピー(Pseudomonas sp.)WAK-1株が挙げられる。本菌株
は本発明者らが瀬戸内海に於いてワカメの表面より分離
した海洋性細菌であり、その分類学的特性はNippon Sui
san Gakkaishi, 58, 1735-1741(1992)に記載されてい
る。また、本菌株は香川大学農学部生物資源食糧化学科
松田研究室に保存されている。
ス属に属し、酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類の両者を生
産する能力のある細菌としては、海洋性シュードモナス
属細菌が挙げられ、より具体的にはシュードモナス・エ
スピー(Pseudomonas sp.)WAK-1株が挙げられる。本菌株
は本発明者らが瀬戸内海に於いてワカメの表面より分離
した海洋性細菌であり、その分類学的特性はNippon Sui
san Gakkaishi, 58, 1735-1741(1992)に記載されてい
る。また、本菌株は香川大学農学部生物資源食糧化学科
松田研究室に保存されている。
【０００８】本発明に用いる培地は液体培地であればよ
いが、前記微生物が資化できる炭素源、窒素源、生育に
必要な各種無機塩等の栄養源を含む液体培地が好まし
い。具体的には、炭素源としてはブドウ糖、蔗糖等が挙
げられ、窒素源としては肉エキス、酵母エキス、ペプト
ン、硫酸アンモニウムその他の有機物あるいは無機物が
挙げられる。また、海水で調製した培地が好ましいが、
人工海水や２〜３重量％の食塩水でも良い。
いが、前記微生物が資化できる炭素源、窒素源、生育に
必要な各種無機塩等の栄養源を含む液体培地が好まし
い。具体的には、炭素源としてはブドウ糖、蔗糖等が挙
げられ、窒素源としては肉エキス、酵母エキス、ペプト
ン、硫酸アンモニウムその他の有機物あるいは無機物が
挙げられる。また、海水で調製した培地が好ましいが、
人工海水や２〜３重量％の食塩水でも良い。
【０００９】本発明においては、実質的に静置の条件で
培養すれば、培養物中に酸性ムコ多糖類が選択的に生成
蓄積する。ここで、実質的に静置の条件には、通常の静
置培養だけでなく、通常の通気攪拌型の発酵装置で通気
量を低下させるか、攪拌回転数を充分低下させた条件が
含まれる。
培養すれば、培養物中に酸性ムコ多糖類が選択的に生成
蓄積する。ここで、実質的に静置の条件には、通常の静
置培養だけでなく、通常の通気攪拌型の発酵装置で通気
量を低下させるか、攪拌回転数を充分低下させた条件が
含まれる。
【００１０】一方、実質的に振盪の条件で培養すれば、
培養物中に硫酸多糖類が選択的に生成蓄積する。ここ
で、実質的に振盪の条件には、通常の振盪培養だけでな
く、通常の通気攪拌型の発酵装置で通気量を高めるか、
通常以上に攪拌する条件が含まれる。
培養物中に硫酸多糖類が選択的に生成蓄積する。ここ
で、実質的に振盪の条件には、通常の振盪培養だけでな
く、通常の通気攪拌型の発酵装置で通気量を高めるか、
通常以上に攪拌する条件が含まれる。
【００１１】培養は、上記いずれの場合にも、通常pH６
〜８．５、好ましくは６．５〜７．５、温度１５〜４０
℃、好ましくは２５〜３５℃で行われる。
〜８．５、好ましくは６．５〜７．５、温度１５〜４０
℃、好ましくは２５〜３５℃で行われる。
【００１２】このようにして得られた培養物中には、目
的とする酸性ムコ多糖類または硫酸多糖類が含まれてい
る。該多糖類の採取に当たっては、予め培養物中の菌体
や他の固形成分を除去した後、回収することが好まし
い。
的とする酸性ムコ多糖類または硫酸多糖類が含まれてい
る。該多糖類の採取に当たっては、予め培養物中の菌体
や他の固形成分を除去した後、回収することが好まし
い。
【００１３】該多糖類の採取には、遠心分離、沈殿、洗
浄、透析、乾燥等多糖類を不純物から回収するために通
常使用されている手段を単独にあるいは適宜組み合わせ
ることによって実施すれば良い。そのー例を示すと、上
記固形分を除去して得られた溶液にエタノール等の溶剤
を添加して該多糖類を析出せしめる。得られた該多糖類
を水に溶解させ、これに第四級アンモニウム塩たとえば
セチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液を加えて
セチルトリメチルアンモニウムブロマイドとの複合体と
して多糖類を沈殿させる。この沈殿物を塩化ナトリウム
を含む水に溶解させた後、エタノールによる沈殿を行
い、沈殿物を水に溶解させた後、透析、凍結乾燥するこ
とにより該多糖類を得ることができる。
浄、透析、乾燥等多糖類を不純物から回収するために通
常使用されている手段を単独にあるいは適宜組み合わせ
ることによって実施すれば良い。そのー例を示すと、上
記固形分を除去して得られた溶液にエタノール等の溶剤
を添加して該多糖類を析出せしめる。得られた該多糖類
を水に溶解させ、これに第四級アンモニウム塩たとえば
セチルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液を加えて
セチルトリメチルアンモニウムブロマイドとの複合体と
して多糖類を沈殿させる。この沈殿物を塩化ナトリウム
を含む水に溶解させた後、エタノールによる沈殿を行
い、沈殿物を水に溶解させた後、透析、凍結乾燥するこ
とにより該多糖類を得ることができる。
【００１４】このようにして得られた多糖類について
は、DEAE-セルロースカラムクロマトグラフィー、電気
泳動法による均一性分析、糖組成分析、ピルビン酸含量
分析、硫酸基分析、及び核磁気共鳴分析等により、目的
とする酸性ムコ多糖類または硫酸多糖類であることが確
認できる[マツダ(M.Matsuda)ら：Nippon Suisan Gakkai
shi, 59, 535-538(1993)及びマツダ(M.Matsuda)ら：Fis
heries Science, 63, 983〜988(1997)]。
は、DEAE-セルロースカラムクロマトグラフィー、電気
泳動法による均一性分析、糖組成分析、ピルビン酸含量
分析、硫酸基分析、及び核磁気共鳴分析等により、目的
とする酸性ムコ多糖類または硫酸多糖類であることが確
認できる[マツダ(M.Matsuda)ら：Nippon Suisan Gakkai
shi, 59, 535-538(1993)及びマツダ(M.Matsuda)ら：Fis
heries Science, 63, 983〜988(1997)]。
【００１５】本発明方法により得られる酸性ムコ多糖類
は、下記構造単位を有するものである。
は、下記構造単位を有するものである。
【００１６】
【化１】
【００１７】また、本発明方法により得られる硫酸多糖
類は、下記構造単位を有するものである。
類は、下記構造単位を有するものである。
【００１８】
【化２】
【００１９】
【実施例】実施例１ マツダ(M.Matsuda)[Nippon Suisan Gakkaishi, 58, 173
5-1741(1992)]らの記載に従い、ペプトン０．５％、酵
母エキス０．１％、の組成を有する海水から調製した培
地を、１２１℃にて２０分間オートクレーブで滅菌し
た。シュードモナス・エスピーWAK-1(Pseudomonas sp.W
AK-1, 香川大学農学部生物資源食糧化学科松田研究室保
存菌株No.WAK-1)の保存用斜面培養から1白金耳を試験管
中の上記滅菌培地(１０mL)に接種し、２８℃にて72時間
振盪培養を行った。ついで、この前培養液を５００mL容
の三角フラスコ中の上記滅菌培地(３％ショ糖加、２０
０mL)２つに接種し、２８℃にて７２時間、一つは静置
培養、一つは振盪培養を行った。培養後、培養終了液を
それぞれ遠心分離して菌体を除いた上澄液に２倍量のエ
タノールを加え、白色沈殿物を得た。この沈殿物を濾過
により採取し、水(２００mL)中に溶解し、沈殿が新たに
生じなくなるまで５％セチルトリメチルアンモニウムブ
ロマイド水溶液を徐々に加え、セチルトリメチルアンモ
ニウムブロマイドとの複合体として多糖類を沈殿させ
た。この複合体を水で洗浄して過剰のセチルトリメチル
アンモニウムブロマイドを除いた後、４Ｍ塩化ナトリウ
ム水溶液(２００mL)中に複合体を溶解した。この溶液
に、２倍量のエタノールを加えて多糖類を沈殿させた。
得られた沈殿物を水に溶解し、水に対して透析後、凍結
乾燥を行い静置培養からは酸性ムコ多糖類(１０８mg)
を、振盪培養からは硫酸多糖類(１０２mg)を得た。この
ようにして得られた酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類につ
いては、DEAE-セルロースカラムクロマトグラフィー、
セルロースアセテート膜電気泳動法を用いて均一性を確
認すると共に、糖組成分析、ピルビン酸含量分析、硫酸
基分析及び核磁気共鳴分析により、目的の酸性ムコ多糖
類及び硫酸多糖類であることを確認した[マツダ(M.Mats
uda)ら、1993及び1997]。回収した酸性ムコ多糖類を
０．０１Ｍリン酸塩緩衝液(pH７．０)１００mLに溶解
し、０．０１Ｍリン酸緩衝液(pH７．０)で平衡させたDE
AE-セルロースイオン交換カラムに充填した。０．０１
Ｍリン酸塩緩衝液(pH７．０)中の塩化ナトリウム濃度を
段階的に変化させて各溶出画分を集め、透析し、次いで
凍結乾燥して静置培養からは０．４Ｍ塩化ナトリウム溶
出画分に酸性ムコ多糖類(72mg)を、振盪培養からは0.8M
塩化ナトリウム溶出画分に硫酸多糖(５３mg)を得た。塩
化ナトリウム濃度と多糖類回収量との関係を表１に示
す。表１から、静置培養からは酸性ムコ多糖類が、振盪
培養からは硫酸多糖類がそれぞれ選択的に生産されてい
ることがわかる。
5-1741(1992)]らの記載に従い、ペプトン０．５％、酵
母エキス０．１％、の組成を有する海水から調製した培
地を、１２１℃にて２０分間オートクレーブで滅菌し
た。シュードモナス・エスピーWAK-1(Pseudomonas sp.W
AK-1, 香川大学農学部生物資源食糧化学科松田研究室保
存菌株No.WAK-1)の保存用斜面培養から1白金耳を試験管
中の上記滅菌培地(１０mL)に接種し、２８℃にて72時間
振盪培養を行った。ついで、この前培養液を５００mL容
の三角フラスコ中の上記滅菌培地(３％ショ糖加、２０
０mL)２つに接種し、２８℃にて７２時間、一つは静置
培養、一つは振盪培養を行った。培養後、培養終了液を
それぞれ遠心分離して菌体を除いた上澄液に２倍量のエ
タノールを加え、白色沈殿物を得た。この沈殿物を濾過
により採取し、水(２００mL)中に溶解し、沈殿が新たに
生じなくなるまで５％セチルトリメチルアンモニウムブ
ロマイド水溶液を徐々に加え、セチルトリメチルアンモ
ニウムブロマイドとの複合体として多糖類を沈殿させ
た。この複合体を水で洗浄して過剰のセチルトリメチル
アンモニウムブロマイドを除いた後、４Ｍ塩化ナトリウ
ム水溶液(２００mL)中に複合体を溶解した。この溶液
に、２倍量のエタノールを加えて多糖類を沈殿させた。
得られた沈殿物を水に溶解し、水に対して透析後、凍結
乾燥を行い静置培養からは酸性ムコ多糖類(１０８mg)
を、振盪培養からは硫酸多糖類(１０２mg)を得た。この
ようにして得られた酸性ムコ多糖類及び硫酸多糖類につ
いては、DEAE-セルロースカラムクロマトグラフィー、
セルロースアセテート膜電気泳動法を用いて均一性を確
認すると共に、糖組成分析、ピルビン酸含量分析、硫酸
基分析及び核磁気共鳴分析により、目的の酸性ムコ多糖
類及び硫酸多糖類であることを確認した[マツダ(M.Mats
uda)ら、1993及び1997]。回収した酸性ムコ多糖類を
０．０１Ｍリン酸塩緩衝液(pH７．０)１００mLに溶解
し、０．０１Ｍリン酸緩衝液(pH７．０)で平衡させたDE
AE-セルロースイオン交換カラムに充填した。０．０１
Ｍリン酸塩緩衝液(pH７．０)中の塩化ナトリウム濃度を
段階的に変化させて各溶出画分を集め、透析し、次いで
凍結乾燥して静置培養からは０．４Ｍ塩化ナトリウム溶
出画分に酸性ムコ多糖類(72mg)を、振盪培養からは0.8M
塩化ナトリウム溶出画分に硫酸多糖(５３mg)を得た。塩
化ナトリウム濃度と多糖類回収量との関係を表１に示
す。表１から、静置培養からは酸性ムコ多糖類が、振盪
培養からは硫酸多糖類がそれぞれ選択的に生産されてい
ることがわかる。
【００２０】
【表１】
【００２１】
【発明の効果】本発明の方法を用いることにより、従
来、培養中に同時に生産され混在している酸性ムコ多糖
類及び硫酸多糖類を個別に、かつそれぞれ従来法の６．
５倍及び１．６倍の量を回収することができる。従っ
て、本発明により、種々の生理機能を有する酸性ムコ多
糖類及び硫酸多糖類を工業的規模で製造することが可能
となる。
来、培養中に同時に生産され混在している酸性ムコ多糖
類及び硫酸多糖類を個別に、かつそれぞれ従来法の６．
５倍及び１．６倍の量を回収することができる。従っ
て、本発明により、種々の生理機能を有する酸性ムコ多
糖類及び硫酸多糖類を工業的規模で製造することが可能
となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 19/04 (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38）
Claims (3)
- 【請求項１】 シュードモナス属に属し、酸性ムコ多糖
類及び硫酸多糖類の両者を生産する能力のある細菌を液
体培地中実質的に静置の条件で培養し、該培養物中に酸
性ムコ多糖類を生成蓄積させ、これを採取する酸性ムコ
多糖類の製造法。 - 【請求項２】 シュードモナス属に属し、酸性ムコ多糖
類及び硫酸多糖類の両者を生産する能力のある細菌を液
体培地中実質的に振盪の条件で培養し、該培養物中に硫
酸多糖類を生成蓄積させ、これを採取する硫酸多糖類の
製造法。 - 【請求項３】 シュードモナス属に属し、酸性ムコ多糖
類及び硫酸多糖類の両者を生産する能力のある細菌が、
シュードモナス・エスピー WAK-1である請求項１又は
２記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000265079A JP2002065292A (ja) | 2000-09-01 | 2000-09-01 | 多糖類の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000265079A JP2002065292A (ja) | 2000-09-01 | 2000-09-01 | 多糖類の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002065292A true JP2002065292A (ja) | 2002-03-05 |
Family
ID=18752400
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000265079A Pending JP2002065292A (ja) | 2000-09-01 | 2000-09-01 | 多糖類の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002065292A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002262900A (ja) * | 2001-03-08 | 2002-09-17 | Koichi Okuya | グリコサミノグリカン二糖の製造方法。 |
| JP2005008523A (ja) * | 2003-06-16 | 2005-01-13 | Koichi Okuya | 美白剤 |
| JP2006016336A (ja) * | 2004-07-01 | 2006-01-19 | Shiibaion:Kk | Ｉｌ−１２産生誘導活性を有するマクロファージ活性化剤 |
| JP2008194026A (ja) * | 2007-01-16 | 2008-08-28 | Shiibaion:Kk | 酸性ムコ多糖産生微生物、酸性ムコ多糖の製造法、ならびに酸性ムコ多糖を有効成分として配合した美白剤 |
| JP2009034094A (ja) * | 2007-07-09 | 2009-02-19 | Shiibaion:Kk | 新規微生物およびその変異株並びにそれを用いた多糖類の製造方法 |
-
2000
- 2000-09-01 JP JP2000265079A patent/JP2002065292A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2005008523A (ja) * | 2003-06-16 | 2005-01-13 | Koichi Okuya | 美白剤 |
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