JP5765859B2 - 黄色色素生成欠陥スフィンゴリピドアエロモナス及びジェランゴム生産における使用 - Google Patents
黄色色素生成欠陥スフィンゴリピドアエロモナス及びジェランゴム生産における使用 Download PDFInfo
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Description
ZD001(CCTCC NO:M 209198)菌株は本申請発明者が分離しかつ選んで育ちしてから得られたもの。その16S rDNAに対し、シークエンシングと分子比較を行う時、ZD001がスフィンゴモナス・パウチモビリス(Sphingomonas paucimobilis)16S rDNAヌクレオチド配列との同族性が99%以上であるため、ZD001(CCTCC NO: M 209198)菌株が、既に報道されたジェランゴムの生産菌スフィンゴモナス・パウチモビリスの同種変異形であることが認められた。
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCATGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAGATCCTTCGGGGTCTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGGGAATCTGCCTTGGGGTTCGGAATAACTCCCCGAAAGGGGTGCTAATACCGGATGATGTCGAAAGACCAAAGATTTATCGCCCTGAGATGAGCCCGCGTAGGATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAAGGCGCACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGAAGATAATGACTGTACCGGGAGAATAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTTTGTAAGTCAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTCAACTCCAGAACTGCCTTTGAGACTGCATCGCTTGAATCCAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACTGGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGTGCTTGGCACTTGGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCGTTTGACATGGTAGGACGACTGGCAGAGATGCCTTTCTTCCCTTCGGGGACCTACACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGACTTTAGTTACCATCATTAAGTTGGGTACTTTAAAGTAACCGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGCGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCAAGTACAGTGGGCAGCAATCCCGCGAGGGTGAGCTAATCTCCAAAACTTGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTTCACCCGAAGGCGTTGCGCTAACTCGTAAGAGAGGCAGGCGACCACGGTGGGCTTAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTT
1、無菌で土壌サンプルを採集して、希釈してYM寒天培養基の平板に塗布するステップ、
2、該当平板を30℃の下で五日間培養するステップ、
3、違う形の細菌集まりを選んで、同じ培養基の平板に別々に線を劃して浄化分離して、30℃の下で五日間培養ステップを含むZD001(CCTCC NO: M 209198)菌株の分離。
注:本発明では、培養基の濃度はすべて質量体積百分率の濃度を指し、あるコンポーネントの濃度が1%であることは、100mL培養基に1gの該当物質を含むことを言う。
1、純菌種をYPG培養基の斜面に接種して、30℃で72h培養するステップと、
2、斜面種を50mL一級種の培養基(250mLフラスコにある)に接入して、30℃、200rpmで24hの振動培養をして、一級種の液が得られる一級種の培養と、
3、一級種の液を5%の体積比の量で100mLの二級種の培養基(500mLフラスコにある)にして、30℃、200rpmで12hの振動培養をして、二級種の液が得られる二級種の培養と、
4、二級種の液を5%の体積比の量で発酵培養基に接入して、30℃、pH6.8〜7.2の条件の下で、1.0vvm通風して、回転速度300rpmで48時間培養する缶上発酵と、
5、缶上発酵に48時間で培養されたジェランゴムを含む発酵液を収集する発酵産物収集を含むZD001(CCTCC NO: M 209198)の発酵工程。YPG斜面培養基の構成と最終濃度はとしては、ブドウ糖2.00%、ベブトン 0.50%、酵母抽出物0.30%、寒天1.50% 、溶剤は蒸留水、pH7.2。
1、発酵液100L、10%(v/v)のHClでpHを6.0に調整して、60℃に昇温して、1h保温する発酵液前処理ステップと、
2、40℃に温度を下げる時、10%(w/v)のNaOHをpHを7.0に調整して、50gのリゾチーム(20万U/g、厖博生物会社)及び100gのアルカリ・プロテアーゼ(2万U/g、厖博生物会社)を加入して、2h保温する蛋白不純物除去と、
3、前処理及び蛋白不純物の除去処理後の発酵液に5Lの20%(w/v)濃度のCaCl2溶液を加入して、30min撹拌してから、30Lイソプロパノールを加入して、1h撹拌し続けてから、プレート及びフレームを濾過加圧する凝集沈殿分離と、
4、圧濾してから得られた繊維料を0℃で2h乾燥した後に粉砕して、オパール色粉末、0.05〜0.30%窒素含有量の高次アシル基ジェランゴム製品が得られる乾燥、粉砕を含む高次アシル基ジェランゴムの生成工程。
1、条件がまとまった発酵液100Lを取って、20%(w/v)濃度のCaCl2溶液3Lに加入して、10min撹拌してから10%のNaOHでpHを11.0に調整して、3min撹拌してからプレートとフレーム圧濾して、繊維料が得られる発酵液前処理と、
2、前処理された後の繊維料を水と1:5の体積比で混ぜて、10%のHClでpHを3.0に調整して、30min撹拌してからプレートとフレーム圧濾して、繊維料が得られる洗濯と、
3、洗濯された後の繊維料を水と1:10の体積比で混ぜて、均一になるように混ぜて、90℃程度昇温して、繊維料を完全に溶解させて、85℃の温度を維持して、10% のNaOHの水溶液を加入して、pH値を9.5〜10.5に調整した、10min反応してから10%のHClでpHを6.0に調整する脱アシル基処理と、
4、質量が料液体積の2%の珪藻岩を入れて、80℃以上の温度を維持して、プレートとフレーム濾過した後に料液(濾過液)体積の5%のKCl溶液(質量濃度が10%である)を入れて、プレートとフレーム圧搾と、
5、圧搾して得られたジェランゴム繊維料を90℃で2h乾燥してから粉砕して、低次アシル基ジェランゴム製品が得られる。オパール色の粉末で強さ≧800 g/cm2、透明度≧80%低次アシル基ジェランゴムが得られる乾燥、粉砕を含む脱アシルジェランゴムの生成工程。
Claims (7)
- 中国典型培養物保存センターに保存されており、住所は中国 武漢 武漢大学(430072)であり、保存期日は2009年09月10日であり、保存番号はCCTCC No:M 209198である黄色色素生成欠陥スフィンゴリピドアエロモナス(Sphingomonas sp.)ZD001。
- 記載のスフィンゴリピドアエロモナスの16S rDNAが
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCATGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAGATCCTTCGGGGTCTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGGGAATCTGCCTTGGGGTTCGGAATAACTCCCCGAAAGGGGTGCTAATACCGGATGATGTCGAAAGACCAAAGATTTATCGCCCTGAGATGAGCCCGCGTAGGATTAGCTAGTTGGTGTGGTAAAGGCGCACCAAGGCGACGATCCTTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGAAGATAATGACTGTACCGGGAGAATAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTTTGTAAGTCAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTCAACTCCAGAACTGCCTTTGAGACTGCATCGCTTGAATCCAGGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGACTGGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGTGCTTGGCACTTGGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCGTTTGACATGGTAGGACGACTGGCAGAGATGCCTTTCTTCCCTTCGGGGACCTACACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGACTTTAGTTACCATCATTAAGTTGGGTACTTTAAAGTAACCGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGCGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCAAGTACAGTGGGCAGCAATCCCGCGAGGGTGAGCTAATCTCCAAAACTTGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTTCACCCGAAGGCGTTGCGCTAACTCGTAAGAGAGGCAGGCGACCACGGTGGGCTTAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTという配列を持つことを特徴とする請求項1に記載のスフィンゴリピドアエロモナスである。 - スフィンゴリピドアエロモナス菌株が以下の通り、グラム陰性桿菌であり、芽胞が無い、真っすぐな棒状で、栄養寒天平板の上に細菌集まりがオパール色であり、オキシダーゼ試験が陽性、カタラーゼ試験が陽性、偏性好気性、ブドウ糖と果糖とキシロースと蔗糖を分解でき、でんぷん加水分解試験が陽性、ゼラチンカプセル液化不可能、43℃で成長しない、菌糸体の大きさは1.5-5.0μm×0.8-1.0μm、黄色色素が出ないことを特徴とする請求項1に記載のスフィンゴリピドアエロモナス。
- 微生物の発酵生成ジェランゴムのため請求項1に記載のスフィンゴリピドアエロモナスの使用。
- スフィンゴリピドアエロモナス菌株を活性化し、種培養してから、スフィンゴリピドアエロモナスに適用できる発酵培養基に植菌して、28〜32℃、pH6.8〜7.2で、32〜60h揺動培養してから高次アシル基ジェランゴムを含むオパール色発酵液が得られることを特徴とする請求項4に記載の使用。
- 高次アシル基ジェランゴムを含む発酵液を分離かつ浄化し、高次アシル基ジェランゴムが得られることと、用いられた分離浄化方法は以下の通り、高次アシル基が含まれる発酵液のpH値を5.0〜6.0に調整し、0℃〜70℃に昇温して、30min〜2h保温した後、40℃〜50℃に温度を下げ、pH7.0に調整して、リゾチームとアルカリ・プロテアーゼを入れて、1h〜3h保温して蛋白質を除去して、蛋白質除去済み後の発酵液に凝集剤溶液を入れて、凝集沈殿を行ってから、さらに分離しかつ乾燥して、記載の高次アシル基ジェランゴムが得られることと、また用いられた凝集剤がCaCl2、MgCl2、NaCl、KClから選ばれた一種或いは二種以上の任意比率の組み合わせであることということを特徴とする請求項5に記載の使用。
- 高次アシル基ジェランゴムを含む発酵液が脱アシル基処理されてから、分離浄化して、低次アシルジェランゴムが得られることと、低次アシルジェランゴムの生成方法が以下の通に、高次アシル基ジェランゴムが含まれる発酵液にアルカリ金属或いはアルカリ土類塩化物溶液を入れて、pHを11.0に調整して、固体液体分離してから繊維料1が生成して、その繊維料1を水と1:4〜6体積比で混ぜて、pHを2.5〜4.0に調整し、15min〜1h洗濯して、濾過加圧した後繊維料2が得られて、その繊維料2を水と1:9〜12体積比で均一になるように混ぜて、80℃〜90℃まで昇温して、アルカリ性試薬を入れてpH9.5〜10.5に調整して、そのまま8min〜15min反応して、反応が終了した後、反応液のpHを中性に調整して、ろ過助剤を加入して、濾過して、ろ液に凝集剤を加入して凝集沈殿してからさらに分離かつ乾燥して、低次アシルジェランゴムが得られることと、用いられたアルカリ金属或いはアルカリ土類塩化物がCaCl2、MgCl2、NaCl、KClから選ばれた一種或いは二種以上の組み合わせ、用いられたアルカリ性試薬がNaOH、KOH、Na3PO4から選ばれた一種或いは二種以上の組み合わせ、用いられたろ過助剤が珪藻岩、真珠岩或いはその組み合わせ、用いられた凝集剤がCaCl2、MgCl2、NaCl、KClから選ばれた一種或いは二種以上の組み合わせであることということを特徴とする請求項5に記載の使用。
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