JPH02218701A - 微生物による炭素源の発酵によって多糖類を製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物による炭素源の発酵によって多糖類を
製造する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、向
上した濾過適性を示す多糖類の水溶液又はゲルの取得を
可能にする発酵方法並びにこの多糖類を石油の促進的回
収に使用する方法に関する。

［従来の技術とその問題点］ キサントモナス属若しくはアルスロバクタ−属の細菌、
スクレロチウム属に属する菌類又はこの部類の他の微生
物の作用の下で炭素源を発酵させることによって得られ
る多糖類、即ちバイオポリマーは、その増稠性及び増粘
性の故に多くの工業的用途が見出されている。

特に、キサンタンゴム型のへテロ多糖類は、石油の二次
及び三次的回収方法において有益な用途が見出された。

この用途においては、部分的に枯渇した埋蔵所から石油
を置換するため、約３００〜３０００　ｐｐｍの濃度に
希釈された水溶液が使用される。キサンタンゴムは、事
実、低濃度での高い粘度、塩分及び塩の性状に対する大
きな不感受性並びに機械的束縛に対する大きな安定性に
よって特徴づけられる。しかしながら、発酵液から又は
この発酵液より沈殿回収された粉末の希釈により工業的
な量で製造された溶液は、それが注入された岩石組織の
細孔を迅速に目詰りさせ、これによって望ましくない圧
力の増大を招きかつ石油のそれ以上の回収を迅速に制止
させるという重大な欠点を示す、この目詰りの原因は、
一方では、発酵に由来する細胞の残骸や生きていない細
菌のためであり、他方では、特に溶液が発酵液から沈殿
させたバイオポリマーで製造された場合には、確実な数
の半透明の凝集体又はミクロゲルの存在のためであるこ
とがわかる。

また、発酵培地の組成、特に使用する窒素源に左右され
るキサンタンゴムの水溶液の流動学的挙動に著しい差異
が観察され得ることが認められた。米国特許節３．　Ｏ
Ｏ０，７９０号、同３．０２０゜２０６号、同３．３２
８．２６２号及び同３．４９５゜７１９号に記載のよう
に、蒸留所の可溶物の使用は発酵培地中に多量の不溶物
をもたらすことが知られている。この問題点を防止する
ため、他の知られた方法によって、最終発酵培地に少量
の無機窒素源及び（又は）有機窒素源が使用される。例
えば、米国特許節３，３９１，０６０号及び同３．４３
３．７０８号、仏国特許第２，４１４，５５５号を参照
されたい。

これにより濾過適性は改善されるけれども、これらの培
地は生産性及び（又は）濾過適性の観点から完全に満足
できるものとならない。使用できる各種の有機窒素源が
これらの特許にあげられているが、既知の化合物のうち
のある種の化合物の選択が特別の効果を生じるとは思わ
れない。さらに、無機窒素の使用は培地を汚染しやすく
し、また培地が完全に殺菌されていない場合には工業的
製造では二次的な発酵を生じさせる可能性がある。

さらに、石油の促進的回収の分野で使用できる多糖類の
製造のために変性された発酵培地が米国特許節４．１１
９，５４６号、同４，２９６，２０３号。

同４．３７７．６３７号、ヨーロッパ特許第００６６９
６１号において提案された。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、良好な粘度及び濾過適性を有する水性ゾルを
導くキサンタンゴム型の多糖類を高い生産性でもって製
造する方法を提供することを目的とする。さらに、本発
明の特別の目的は、部分的に枯渇した埋蔵所からの石油
の置換に使用するのに特に適した、キサントモナス属（
Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）により生じる多糖類を含有す
る発酵液を得ることである。

〔課題を解決するための手段〕

したがって、本発明は、１０〜１２０ｇ／ｌの炭素源並
びに窒素源を含有する水性栄養培地を微生物により発酵
させることによって多糖類を製造するにあたり、前記窒
素源がカゼイン又はカゼイン誘導体を他の有機及び（又
は）無機窒素源との混合物状で含むことを特徴とする多
糖類の製造方法に係る。

カゼイン誘導体は、カゼインナトリウム、カゼインカリ
ウム、カゼインアンモニウム、カゼインカルシウムのよ
うなカゼイン塩やカゼインの加水分解物のうちから選ぶ
ことができる。

カゼイン塩は、カゼインの中和又は発酵培地中で得るこ
とができる。カゼイン又はその誘導体は、発酵培地１β
当りの元素状窒素のｇ当量数で表わして、０゜００７〜
０．５ｇ／ρ、好ましくは０．０１４〜０．３５ｇ／ｌ
の濃度で有利に使用される。

発酵培地は、カゼインの他に、他の有機及び（又は）無
機窒素源を含有する。有機窒素源のうちでは、ペプトン
、ゼラチン、酵母抽出物、とうもろこしの可溶性抽出物
、大豆粉があげられる。

無機窒素源のうちでは、硝酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、炭酸モノ又はジアンモニウム、硫酸モノ又はジ
アンモニウム、りん酸モノ又はジアンモニウム及び硝酸
アルカリがあげられる。

カゼイン又はその誘導体の補充として、好ましくは有機
窒素源があげられる。特に、とうもろこしの可溶性抽出
物（ＣＳＬ）を使用するのが好ましい。なぜならば、そ
れは有機窒素源のうちで最良の収率を得させるものであ
るからである。生産性を高めるため、有機窒素源に要す
れば少量の無機窒素源を追加することができる。

窒素の全量は、発酵培地１β当りの元素状窒素のｇ当量
数で表わして、有利には０．２〜０．６ｇ／ｌ、好まし
くは０．３〜０．４ｇ／ｌである。

炭素源は糖であってよい。好ましくは、グルコース、サ
ッカロース、フラクトース、マルトース、ラクトース、
ガラクトースが１０ｇ〜４０ｇ／ρの好適濃度で使用さ
れる。

グルコース及びサッカロースが特に好ましい。

炭素源及び窒素源の他に、発酵培地は、それ自体知られ
た態様で、微量の元素及び必須生長要素を含有する。

しかして、発酵培地は、例えば、硫酸マグネシウム、酢
酸マグネシウム、塩化マグネシウム又は硝酸マグネシウ
ムによりもたらされるマグネシウムイオンを含有できる
。元素状マグネシウムの濃度は好ましくは０．００１〜
０．０５ｇ／ｌである。

また、発酵培地は、りん源を含有することができる。こ
れは出発時から使用でき又は有利には、例えば、りん酸
カリウム、ナトリウム又はアンモニウムによるｐＨ調節
時に導入することができる。

元素状りんの濃度は、好ましくは０．０５〜１．３ｇ／
ｌである。　ｐＨは有利には６〜７．５の間に保持され
る。

また、発酵時に消泡剤を導入することができる。

発酵用の微生物は、炭化水素を発酵させる細菌、例えば
ｒＢＥＲＧＥＹ’　Ｓ　　ＭＡＮＵＡＬ　ＯＦ　ＤＥＴ
ＥＲＭＩＮＡ−ＴＩＶＥ　ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ、
　（８版−１９７４年Ｎ、ウィリアムズ、ウイルキンズ
社発行、バルチモア市）に記載の細菌、例えば、キサン
トモナス・ベフニアエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｂｅ
ｇｏｎｉａｅ）、キサントモナス・カンペストリス（Ｘ
ａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、キサ
ントモナス・力ロタエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａ
ｒｏｔａｅ）、キサントモナス・ヘデラエ（Ｘａｎｔｈ
ｏｍｏｎａｓ　ｈｅｄｅｒａｅ）、キサントモナス・イ
ンカナエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｊｎｃａｎａｅ）、
キサントモナス・マルバセアリューム（Ｘａｎｔｈｏｍ
ｏｎａｓ　ｍａｌｖａｃｅａｒｕｍ）、キサントモナス
・パバベリ・コーラ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｐａｐ
ａｖｅｒｉ　ｃｏｌａ）、キサントモナス・ファセオリ
（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｐｈａｓｅｏｌｉ）　、キサ
ントモナス・ビシ　（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｐｉｓｉ
　）、キサントモナス・パスキュロリューム（Ｘａｎｔ
ｈｏｍｏｎａｓ　ｖａｓｃｕｌｏｒｕｍ）、キサントモ
ナス争ベシカトリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｖｅｓ
ｉｃａｔｏｒｌａ）、キサントモナス・ビチアンス（Ｘ
ａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｖｉｔｉａｎｓ）、キサントモ
ナス・ベラルゴニイ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｐｅｌａ
ｒｇｏｎｉｉ）　：アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏ
ｂａｃｔｅｒ）の細菌、特に、アルスロバクタ−・スタ
ビリス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　５ｔａｂｉｌｉｓ
　）　、アルスロバクタ−・ビスコサス（Ａｒｔｈｒｏ
ｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ　）　　；エルウィニ
ア属（Ｅｒｗｉｎｉａ　）　　；アゾトバクタ−属（Ａ
ｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）　、特にアゾトバクタ−・イン
デイカス（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　１ｎｄｉｃｕｓ）
　　；アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）　、特にアグロバクテリウム・ラジオバクター（
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ
）　、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）　、アルボバク
テリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のうちから選ばれる。

また、スクレロチウムｆ４　（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）
に属する菌類も使用することができる。

これらの微生物のうちでも、キサントモナス・カンペス
トリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉ
ｓ）を使用するのが好ましい。

微生物は、発酵培地にそれ自体知られた態様で、例えば
２０Ｉ２の実験室用発酵器において得られた中間培養物
（これ自体は例えば１２の三角フラスコで実施された接
種物より得られたものである）により導入される。

当業者に知られた接種物、即ち中間培養物の製造は、例
λば仏国特許第２．４１４，５５５号に記載されている
。

次いで、発酵が本発明の方法によって−又は二辺上の発
育及び生産段階で数日間行われる。発育用培地及び生産
用培地は同一の組成又は異なる組成を有していてよい。

発酵が終った後、液は約１５〜５０ｇ／ｌの濃度の多糖
類、細胞の残骸、炭素又は窒素源不純物、残留たん白質
及び無機イオンを含有する。発酵が完了した後であって
かつ多糖類の単離を行う前に（多糖類を粉末として得よ
うとする場合）、好ましくは発酵液の加熱が６０〜１２
０℃、好ましくは８０〜１１０℃の温度で１〜６０分間
実施される。重合体、即ち多糖類はそのままで使用する
ことができ、成るいは発酵液から当業者に知られた任意
の方法、例えばメタノール、エタノール、インプロパツ
ール、ブタノールのような低級アルコールによる沈殿に
より、又は例えば塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸
ナトリウム若しくはりん酸ナトリウムのような無機塩に
よる沈殿によって回収することができる。

沈殿した多糖類は分離され、洗浄され、次いで乾燥され
、粉砕される。このようにして直ちに使用できる粉末が
得られる。

本発明の範囲では多糖類は発酵液中のものを直接的に又
は粉末から出発して使用することができるが、粉末を懸
濁させて得られるゲルは一般に発酵液よりも濾過するの
が困難である。もちろん、所望ならば、発酵液（要すれ
ば熱処理前に）又は沈殿した粉末にバイオサイド又は酵
素を添加することができる。さらに、ある場合には、任
意の周知の手段によって実施することができる発酵液の
ｍ縮を行うのが有益である。

本発明方法によれば、高い粘度と良好な濾過適性を有す
るキサンタンゴムを高い生産性でもって得ることができ
る。

本発明方法による発酵液全体及び多糖類粉末は、キサン
タンゴムの知られた用途の全てに、特に良好な濾過適性
を要求する用途、具体的には石油の促進的回収に使用す
ることができる。

［実施例］ 本発明を下記の実施例により詳述するが、これらは本発
明を限定するものではない。

試験管中のグロース上に維持したキサントモナス・カン
ペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔ
ｒｉｓ　）ＡＴＣＣ１３９５１の培養物から１００＋ｙ
ｆのＭＹ−サッカロース培地（酵母抽出物３ｇ、麦芽抽
出物３ｇ、バクトペブトン５ｇ、サッカロース１０ｇ、
飲料水１１２とするに要する量）に播種する。

一定の攪拌下２８℃でのインキュベーション時間は２４
時間である。

この培養物の１００−により下記の組成サッカロース　
　　　　　２１　ｇ／ｇＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈｚ　Ｏ
Ｏ，２５ｇ／（１カゼインナトリウム　　　　Ｏ〜２ｇ
／ｌとうもろこしの可溶性抽出物８．５〜０．５ｇ／Ｊ
２菜種油　　　　　　　　　　０．５ｄ／Ｊ２水　　　
　　　　　　　１βとするに十分な量を有する無菌生産
用培地１５℃に接種する。

接種前のｐｏは７．２である０発酵は２８℃の温度で攪
拌しかつ曝気しながら行うとともに、その間ｐＨはか性
ソーダの添加により７．２に調節する０発酵は、もはや
微量の糖が存在しなくなったどきに停止する。

次いで、発酵液の熱処理を行い、それからイソプロパツ
ールを添加することにより多糖類を沈殿させ、洗浄し、
乾燥し、粉砕する。

窒素源の正確な組成及び発酵の結果を下記の表得られた
粉末から出発し、０．０７５ｇ／Ｊ２のＣａＣ１ｚを含
有する水溶液を希釈用に使用することにより、０．１重
量％濃度の希釈溶液を調製する。次いで、溶液の粘度及
び濾過適性を測定する。

粘度は、ブルックフィールド粘度計（モデルＬＶＴ、装
置ＵＬ、６ｒｐｍ、２５℃）によって測定する。

濾過適性は、溶液な細孔直径１２μの多孔質膜に０．０
６バールの一定圧力の下に通すことによって評価する。

３０分間で濾過された容積を測定する。

カゼインナトリウムを使用しない培地がそれはど粘稠で
なくかつ目詰まりさせるゾルを与えることが認められる
。

匠１ 発酵培地は下記の組成を有する。

サッカロース　　　　　　　２７ｇ／ｌカゼイン塩　　
　　　　　　　　１ｇ／４とうもろこしの可溶性抽出物
　２ｇ／ｌＫＮＯｓ　　　　　　　　　　　　Ｉｇ／Ω
菜種油　　　　　　　　　　　１ｇ／２Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ
ａ　・７ＨｚＯ０，２５ｇ／ｌ・水　　　　　　　　　
　１℃とするに十分な貴会窒素は０．３５ｇ当ｆｆｉ／
ｌの元素状窒素である。

発酵時間は６２時間であり、最終粘度は５，４００Ｃｐ
ｓである。サッカロースに対する収率は６７．６％であ
る。

発酵液の粘度を０．４ｇ／ｌの多糖類の溶液について測
定する。その粘度は６．３　ｍＰａ、　ｓであり、また
この液から回収された粉末で作った溶液の粘度は６．９
　ｍＰａ、　ｓである（ブルックフィールド、ＬＶＴ、
装置ＵＬ、３０ｒｐｍ、２５℃）。

濾過適性を ＮａＣ１７０，５ｇ／ｇ Ｃａ　　Ｃ１＊　　　　　　　　　　　　　　１７．５
ｇ／ｌよりなる塩水中の０．０４％の溶液について、３
μの細孔直径を有する膜上で１０ミリバールの圧力の下
で測定する０発酵液では１５０分間に１．９７８ｍｆｆ
１が濾過され、また粉末では１５０分間に４９５−が濾
過された。

［ 発酵培地は下記の組成を有する。

グルコース・ｌＨ２Ｏ・’　　　２０ｇ／ｌでんぷん　
　　　　　　　　　２ｇ／２ とうもろこしの可溶性抽出物　０．５ｇ／ｆｉカゼイン
ナトリウム　　　　　１．２５　又は２．５ｇ／ｌ Ｋ１ＨＰＯ４７，３ｇ／ｌ Ｍｇ　ＳＯ４０，２５ｇ／ｌ 菜種油　　　　　　　　　　　２．５ｍｆｆ／ｌ水　　
　　　　　　　　１ｌとするに十分な量ゾルの粘度は、
７５　ｐｐｍのＣａＣ１ｇを含む塩水中の０．１％溶液
について、３　ｒｐｍで回転するブルックフィールド粘
度計ＬＶＴにより例１におけるように測定する。

濾過適性は、０．０７５ｇ／ｆｌのＣａＣＬを含む塩水
中の０．１重量％溶液について、１２μの細孔匠Ａ 発酵用培地は下記の組成を有する。

カゼインナトリウム−０〜０．５ｇ／ｊ２ＮＨ４ＮＯｓ
　　　　　　　　　　１．２　ｇ／’２Ｋｚ　ＨＰ　０
４　　　　　　　　　７．３　ｇ／ｌＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４
・７Ｈ２００，２５ｇ／１２菜種油　　　　　　　　　
　　２．５ｒｄ＃２グルコース・ＩＨｚｏ　　　　２０
ｇ／１２でんぷん　　　　　　　　　　２ｇ／ｆ２水　
　　　　　　　　　１℃とするに十分な量抽出し、乾燥
した後の多糖類粉末の粘度を、蒸留水中０．１重量％の
多糖類を含有する溶液についてブルックフィールド粘度
計（ＬＶＴ、装置ＵＬ、３　　ｒｐｍ、２５℃）により
測定する。

多糖類粉末の濾過適性は、次の組成 ＮａＣｌ　　　　　　　　　　１６０　　ｇ／１２Ｃａ
　ＣＩ　ｚ　・２　Ｈ２０１６，５ｇ　／　ｉｌＭｇＣ
ｈ・６　Ｈ＊　０　　　　　７．５　ｇ／１２の塩水中
０．０４重量％の多糖類溶液について測定する。

この溶液を３μの細孔直径を持つ多孔質フィルターに０
．０６バールの一定圧の下で通す。３０分間に濾過され
た容積を測定する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）１０〜１２０ｇ／ｌの炭素源並びに窒素源を含有す
   る水性栄養培地を微生物により発酵させることによって
   多糖類を製造するにあたり、前記窒素源がカゼイン又は
   カゼイン誘導体を他の有機及び（又は）無機窒素源との
   混合物状で含むことを特徴とする良好な粘度とろ過適性
   を有する水溶液製造用の多糖類の製造方法。 ２）カゼインがカゼイン塩及びカゼイン加水分解物のう
   ちから選ばれることを特徴とする請求項１記載の方法。 ３）他の有機窒素源がとうもろこしの可溶性抽出物、ペ
   プトン、大豆粉、酵母抽出物及びゼラチンのうちから選
   ばれることを特徴とする請求項１記載の方法。 ４）他の窒素源が無機アンモニウム塩及び硝酸アルカリ
   のうちから選ばれることを特徴とする請求項１記載の方
   法。 ５）窒素源がカゼインナトリウム及びとうもろこしの可
   溶性抽出物よりなることを特徴とする請求項１又は２記
   載の方法。 ６）カゼイン又はカゼイン誘導体の量が、発酵培地１ｌ
   当りの元素状窒素のｇ当量数で表わして、０．００７〜
   ０．５ｇ／ｌ、好ましくは０．０１４〜０．３５ｇ／ｌ
   であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載
   の方法。 ７）窒素の全量が、発酵培地１ｌ当りの元素状窒素のｇ
   当量数で表わして、０．２〜０．６ｇ／ｌ、好ましくは
   ０．３〜０．４ｇ／ｌであることを特徴とする請求項１
   〜６のいずれかに記載の方法。 ８）炭素源が糖であることを特徴とする請求項１〜７の
   いずれかに記載の方法。 ９）糖がグルコース、サッカロース、フラクトース、マ
   ルトース、ラクトース又はガラクトースであることを特
   徴とする請求項８記載の方法。 １０）微生物がキサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎ
   ａｓ）に属することを特徴とする請求項１〜９のいずれ
   かに記載の方法。 １１）請求項１〜１０のいずれかに記載の方法によって
   得られる多糖類の発酵液及び粉末。 １２）請求項１〜１０のいずれかに記載の方法によって
   得られた多糖類を石油の促進的回収に使用する方法。