CA1123768A - Polysaccharides de xanthomonas utilisables pour preparer des gels aqueux de filtrabilite amelioree - Google Patents

Abstract

: L'invention a trait à l'emploi de polysaccharides de Xanthomonas spécialement adaptés pour préparer, par addition d'eau, des gels doués de propriétés de filtrabilité nettement améliorées, caractérisé en ce que lesdits polysaccharides sont obtenus selon un procédé qui consiste à exécuter les opérations suivantes : a) préparation de l'inoculum à partir d'une culture de Xanthomonas; b) éventuellement suivie d'une étape intermédiaire de croissance du microorganisme; c) et production du polysaccharide par inoculation, à l'aide de la culture issue de l'étape a) ou le cas échéant de l'étape b), d'un milieu comprenant un glucide et une source d'azote appropriée et fermentation de ce milieu; ladite source d'azote comprenant au moins un produit azoté d'origine organique, la quantité dudit produit azoté organique, exprimée en gramme d'azote élémentaire par litre de milieu de fermentation, étant comprise entre 0,01 et 0,3 g/l.

Description

~, f,,f,~.37~;8 La présente invention a trait à l'emploi de polysaccharides produits par fermentation de glucides au moyen d'un microorganisme du genre Xanthomonas pour préparer, par addition d'eau, des gels ayant une bonne filtrabilité.
On sait que pour la production de polysaccharides extracellulaires par des microorganismes du genre Xanthomonas, le milieu à fermenter comprend ordinairement une source de glu-cides, une source de phosphore, une source de magnésium qui est un activateur d'enzymes et une source d'azote qui est habituel-lement constituée par des "solubles de distillerie" (brevetaméricain n 3 000 790), du son ou des farines de grains entiers tels que le sorgho, le soja ou le mais (brevet 3 271 267), ou encore du "corn steep" (brevet américain 3 355 447).
Cependant, ces produits qui apportent l'azote assimila-ble présentent l'inconvénient d'introduire des impuretés inso-lubles qui se retrouvent dans le polysaccharide extrait du môut fermenté. Ces impuretés, outre qu'elles confèrent au gel aqueux reconstitué ~ partir du produit extrait une certaine coloration, et un aspect trouble, font que ce gel est impropre à certaines utilisations telles que par exemple la récupération assistée du pétrole. En effet, la présence d'impuretés peu solubles diminue la filtrabilité des gels obtenus à partir de ces polysaccharides et rend plus difficile leur pénétration dans les intertices des roches.
On a proposé diverses techniques de purification con-sistant par exemple à soumettre le moût fermenté, ou bien le gel aqueux reconstitué à partir du polysaccharide extrait du moût, à des opérations de filtration sur terres à diatomées, à l'ac-tion des enzymes du type protéase (brevet français 2 264 077) ou de la soude (brevet américain 3 729 460). Ces techniques de purification se sont avérées coûteuses et assez peu satisfai-santes.

i8 On a proposé encore de faire appel, pour la production de polysaccharides par les bactéries de Xanthomonas, àlmilieu de fermentation contenant une source d'azote minéral entièrement soluble (brevet américain 3 391 060 et demande de brevet français publiee sous le no. 2,342,339. Là encore, les resultats sont assez peu satisfaisants. En effet, on a constaté lorsque la fermen-tation se déroule dans un milieu qui n'est pas parfaitement stérile, comme c'est le cas généralement lors des opérations industrielles à moyenne ou grande échelle, que l'emploi d'une nourriture à base essentiellement d'azote minéral favorise le développement de contaminants au détriment de celui des espèces Xanthomonas. Pareille contamination entraine dès lors une chute sensible de la teneur en polysaccharide du milieu de fermenta-tion.
Il a maintenant été trouv~, conformément à la présente invention, qu'il est possible d'obtenir des gels de polysaccha-rides doués de propriétés de filtrabilité nettement améliorées à condition de faire appel à des polysaccharides de Xanthomonas spécialement adaptés comme ceux produits par fermentation en présence d'une nourriture azotée organique dont la quantité est fixée dans un domaine bien précis.
Plus particulièrement, la présente invention a trait à
l~emploi des polysaccharides tels que ceux obtenus par mise en oeuvre d'un procédé qui consiste à exécuter les opérations suivantes :
a) préparation d'un inoculum à partir d'une culture de Xanthomonas;
b) éventuellement suivie d'une étape intermédiaire de croissance des microorganismes;

c) inoculation à l'aide de la culture issue de l'etape a) ou le cas échéant de l'étape b), d'un milieu comprenant un glucide et une source d'azote et fermentation du milieu inoculé, 37~i~

caractérise en ce que dans l'étape c) on utilise comme seule sour-ce d'azote un composé azoté organique en quantité comprise entre 0,01 et 0,3 g/litre, exprimé en gramme d'azote élémentaire par litre du milieu de fermentation;
d) précipitation des polysaccharides obtenus en l'étape c) et e) formation de gels par mélange d'eau et de polysac-charides.
L'expression milieu de fermentation désigne le milieu à fermenter avant inoculation.
Comme source d'azote organique, on fait appel aux pro-duits generalement utilises dans l'art antérieur, et rappelés ci-avant, pourconduire de pareilles fermentations. Gn peut citer encore les peptones, la gélatine, la caséine, l'extrait de viande et l'extrait de levure.
Les quantités préférées de produit azoté organique, exprimees en gramme d'azote elementaire par litre de milieu de ermentation, se situent entre 0,02 et 0,2 g/l.
On a constate qu'il peut être avantageux pour conduire l'étape de production c) d'ajouter en outre dans le milieu de fermentation une nourriture azotee d'origine minerale. Cette mesure permet d'accro~tre de fa~on sensible la vitesse de fermen-tation. Cc~me source d'azote mineralconvenant à l'invention, on cite-ra par exemple des sels d'ammonium comme: le chlorure d'ammonium, le nitrate d'ammonium, les carbonates mono- ou diammonique, les sulfates mono- ou diammonique, les phosphates mono- ou diammonique, des nitrates c~: le nitrate de sodium, le nitrate de potassium.
Le produit aæote d'origine minerale, quand on a choisi d'en utiliser un, est introduit dans le milieu de fermentation dans des proportions variables qui sont déterminées de manière à
ce que la quantité totale de produit azoté organique et de produit azote mineral, exprimee en gramme d'azote élémentaire par litre de milieu de fermentation, soit au plus égale à 0,5 g/l.

3~

La fermentation du glucide dans l'étape de production du polysaccharide se fait en général dans un milieu aqueux renfermant jusqu'à 60 g/l dudit glucide. Les quantités préf~-rées de glucide se situent entre 10 et 40 g/l. Les glucides qui peuvent convenir comprennent entre autres, le glucose, le saccharose, le cérélose, le fructose, le maltose, le lactose, le galactose, les amidons de blé ou de mais et leurs hydrolysats.
Le milieu de fermentation dans l'étape de production du polysaccharide peut contenir encore des ions magnésium. La quantité utilisée, exprimée en gramme de magnésium élémentaire par litre de milieu de fermentation, se situe par exemple entre 0,001 et 0,05 g/l. Comme source d'ions magnésium on peut citer le sulfate de magnésium heptahydraté, l'acétate de magnésium, le chlorure de magnésium.
Un autre ingrédient utile pour la conduite de la fer-mentation consiste dans une source de phosphore. La quantité
utilisée, exprimée en gramme de phosphore par litre de milieu de fermentation, peut être comprise par exemple entre 0,01 et 1,5 g/l. De manière avantageuse, le phosphore peut être intro-duit sous forme de phosphate disodique ou de phosphate dipotas-sique qui peuvent constituer en même temps, à condition d'être utilisés en excès par rapport aux quantités précitées, une subs-tance tampon tout à fait appropriée pour réguler le pH. A cet égard, la conduite de la fermentation, comme on le sait, exige que le pH soit maintenu dans le domaine de 6 à 7,5, de préfé-rence de 6,5 à 7,2. Si le milieu n'est pas tamponé, on peut utiliser un dispositif régulateur de pH introduisant dans le milieu les quantités nécessaires d'un réactif alcalin, tel que la soude, la potasse, la chaux.

A noter que le phosphore peut être ajouté encore dans le milieu de fermentation sous forme de phosphates mono- ou diammonique qui peuvent alors constituer en même temps, en tout 7~3 ou partie, la source d'azote d'origine minérale utilisable le cas échéant dant le cadre de la présente invention.
Un agent antimousse peut être introduit également dans le milieu de fermentation.
Après ach~vement de la fermentation mais avant de procéder à la récupération du polysaccharide à partir de son moût, on a constaté qu'il est intéressant de soumettre le moût fermenté à un chauffage dans un domaine de température de 80 à
130C pendant 1 à 40 minutes. De préférence, la température est d'environ 100 - 110C et la durée de chauffageest voisine de 10 à 15 mn.
On isole le polysaccharide du moût, éventuellement chauffé au préalable comme indiqué ci-avant, en faisant appel aux méthodes usuelles, par exemple en le précipitant par addi-tion à ce moût d'un alcool inférieur comme le méthanolJ
l'éthanol, l'isopropanol, le butanol tertiaire, ou d'acétone, ou d'un mélange de ces agents de précipitation. On peut avoir recours à la mise en oeuvre d'un sel minéral comme le chlorure de potassium, le chlorure de sodium, ou le sulfate de sodium pour opérer une précipitation économique du polysaccharide.
Une fois précité, le polysaccharide est séparé, lavé avec le liquide de précipitation, puis il est séché et broyé.
Le produit ainsi obtenu est utilisable pour préparer, par addition d'eau, des gels. Les concentrations utiles en polysaccharide sont habituellement comprises entre 0,005 et 2%
en poids. Les gels peuvent être soumis à un traitement ultérieur par filtration, par exemple sur des terres de diatomées, ou par centrifugation. Les solutions de polysaccharide, ainsi obtenues et éventuellement traitées, se sont révélées posséder d'excel-lentes propriétés de filtrabilité en ne provoquant pas de col-matage de milieu poreux. Dans les mêmes conditions d'expéri-mentation, les gels de polysaccharides, obtenus par fermentation 37i~

avec une source d'azote organique utilisée en quantité
supérieure à celle correspondant au domaine de concentrations de la présente invention, ne présentent par contre pas les mêmes avantages et en particulier ils s'écoulent difficilement dans les milieux poreux qu'ils finissent par colmater. Les espèces représentatives de bactéries du genre Xanthomonas dont on peut se servir pour la fabrication des polysaccharides con-formes à l'invention comprennent par exemple: le Xanthomonas begoniae, le Xanthomonas campestris, le Xanthomonas carotaen, le Xanthomonas hederae, le Xanthomonas incanae, le Xanthomonas malvacearum, le Xanthomonas phaseoli, le Xanthomonas pisi, le Xanthomonas vasculorum, le Xanthomonas vesicatoria, le Xantho-monas vitians, le Xanthomonas pelargonii. L'espèce qui est particulièrement adaptée à la présente invention est le Xantho-monas campestris.
Les exemples non-limitatifs qui suivent illustrent la présente invention.

Exemple de fabrication de polysaccharide qui rentre dans le cadre de l'invention.
a) Pr~paration de l'inoculum :
A partir d'une culture de Xanthomonascampestris main-tenue sur gélose en tube, on ensemence par suspension, dans un erlenmeyer de 1 litre, 100 cm3 de bouillon aux solubles de soja;
ce milieu de culture préparé au laboratoire à la composition suivante pour 1 litre :
. saccharose 20 g . solubles de soja 90 cm3 . Na2HP04 , 12H20 8 g . NaH2P04 1 g . MgS04 , 7H20 0,25 g . antimousse 0,25 cm3 ~L~P ~ 761~

. eau distillée quantité suffisante pour 1 litre.
L'ensemble possède un pH naturel de 7,3 et est stéri-lisé à l'autoclave pendant 1 h 30 mn à 1,3 bar. La durée d'in-cubation à 28C est de 72 heures ; l'opération se fait sous agitation constante.
b) Etape intermédiaire de croissance :
On utilise 0,15% en poids de cette culture pour ino-culer, dans un fermenteur de laboratoire de 20 litres, 15 litres d'un milieu stérile ayant la composition suivante pour 1 litre:
. saccharose 20 g . farine de soja 4 g . Na2HPO4 , 12H20 11,4 g . MgS04 , 7H2o0,25 g . antimousse 2 cm3 H2S04 (d = 1,84) 0,5 cm3 . eau distilléequantité suffisante pour 1 litre.
L'ensemble possède un pH de 7,2 et est sté~ilisé sur place par injection de vapeur d'eau 45 mn à 1 bar, le volume passant alors de 9 litres à 15 litres. Après 24 heures d'incu-bation à 28C sous agitation et aération, le milieu possède uneviscosité (mesurée au viscosimètre Brookfield LVT à 30 t/mn et avec aiguille n 4) de 600 centipoises et un pH de 7,10.
c) Production du polysaccharide:
On utilise 1,5 % du milieu intermédiaire de croissance pour inoculer un fermenteur pilote de 1,4 m3 de volume rempli d'une charge de 0,8 m3 d'un milieu stérile ayant la composition suivante pour 1 litre :
. cérélose (glucose monohydraté) 22 g . farine de soja 2 g (corre6pond à 0,16 g d'azote élémentaire) . Na2HPO4 , 12H2O 11,4 g ~ ~ ~37~3 MgSO4 ~ 7H2O 0,25 g antimousse 0,5 cm3 . H2SO4 (d = 1,84) 0,43 cm3 . eau quantité suffisante pour 1 litre.
La stérilisation du milieu se fait en deux temps:
ler temps : dans 350 litres d'eau, on dissout le cérélose et la stérilisation dans un autoclave pendant 30 mn à 1 bar; 2ème temps: dans 320 litres d'eau, on dissout le reste des ingré-dients et on stérilise par injection de vapeur d'eau pendant 1 heure 30 mn à 1,3 bar. Le mélange des deux milieux stérilisés possède un pH de 7,37 et un volume de 0,8 m3. La fermentation dure environ 75 h sous agitation et aération, le pH etant régu-lé entre 6,7 et 6,9 par addition dlune solution aqueuse de soude à 300 g de NaOH par litre. Au bout de ce temps, on ne trouv.e plus de cérélose et la viscosité Brookfield du milieu de fermentation est de 7400 centipoises.
On opère ensuite un traitement thermique du moût en faisant circuler ce dernier dans un système de tubes à double paroi dans laquelle circule un fluide de chauffage porté à une température appropriée: le moût est chauffé ainsi à 120C
pendant 30 mn.
Le mo~t refroidi est ensuite additionné d'isopropanol, de facon classique, pour précipiter, le polysaccharide qu'on lave, sèche et broie, La matière sèche précipitée par l'iso-propanol est de 15,7 g/kg, ce qui correspond à un rendement pondéral de 71,4 %.
EXEMPLE 2.

Exemple de fabrication de polysaccharide conforme à
l'invention.

En opérant comme à l'exemple 1, on inocule un fermen-teur pilote de 1,4 m3 de volume rempli de 0,8 m3 d'un milieu stérile ayant la composition suivante par litre:

Z ~7~il 3 . cérélose 22 g . farine de soja 2 g) ) correspond au total à 0,37g de N
NH4NO3 0,6 g Na2HP04, 12H20 11,4 g MgSO4 ~ 7H2O 0,25 g antimousse 0,5 cm3 H2SO4 (d = 1,84) 0,43 cm3 . eau quantité suffisante pour 1 litre.
La stérilisation du milieu se fait comme décrit à
l'exemple 1 en deux temps. L'ensemble des deux milieux stéri-lisés possède un pH de 7,24 et un volume de 0,8 m3. La fermen-tation dure environ 41 heures sous agitation et aération, le pH étant régulé entre 6,7 et 6,9 par addition de lessive de soude à 300 g de NaOH par litre. Au bout de ce temps, on ne trouve plus de cérélose et la viscosité Brookfield est de 5400 centipoises.
On opère ensuite un traitement thermique du moût en chauffant celui-ci à 110C pendant 15 mn. Après refroidissement, le polysaccharide est précipité comme indiqué à l'exemple 1:
on isole ~ ~,6 g/kg de polysaccharide sec, conduisant à un rendement pondéral de 66,4 %.
EXEMPLE 3.
Exemple de fabrication de polysaccharide par fermenta-tion en présence d'une source d'azote organique utilisée en quantité supérieure à celle conforme à l'invention.
En opérant comme dans l'exemple 1, on inocule un fer-menteur pilote de 1,4 m3 de volume rempli d'une charge de 1 m3 de milieu stérile ayant la composition suivante pour 1 litre:
saccharose 20 g . farine de soja 4 g (correspond à 0,32 g d'azote) . Na2~PO4, 12H2O 11,4 g _g_ ~ Z37~i~

. MgS04 , 7H20 0,25 g . antimousse 0,5 cm3 . H2SO4 (d = 1,84) 0,43 cm3 . eau quantité suffisante pour 1 litre Le milieu complet possède un pH de 7,3 et est stéri-lisé par injection de vapeur durant 1 h 30 mn à 1,3 bar, le volume passant de 0,74 m3 à 1 m3. La fermentation dure environ 52 heures sous agitation et aération, le pH étant régulé entre 6,7 et 6,9 par addition de la lessive de soude utilisée dans les exemples ci-avant. Au bout de ce temps, on ne trouve alors plus de saccharose et la viscosité mesurée dans les conditions précitées est de 6900 centipoises. Après un traitement ther-mique du moût et précipitation dans les conditions de l~exemple l, on isole 15,6 g/kg de matière sèche, donnant un rendement de 78 %.
EXEMPLE 4.
On utilise les poudres de polysaccharides obtenues aux exemples l à 3 pour faire des essais de filtrabilité. Ces essais de filtrabilité consistent dans les opérations suivantes:

. 3,2 g de poudre de polysaccharide sont dispersés selon la technique habituelle dans 2 litres d'eau salée contenant 5 g de NaCl par litre, ayant un pH
de 7 exactement, et préfiltrée sur un filtre Milli-pore de 0,22 ,u ;
. La concentration en polysaccharide de cette solution (ou gel) 0,16% en poids) est ramenée à 0,04% par dilution à l'aide de la même solution d'eau salée;
. on procède ensuite à un traitement de filtration sur terre de diatomées de la solution à 0,04 %, à raison de 0,05 g de terre pour 100 cm3 de ladite solution;

. on mesure ensuite le volume de solution clarifiée à
0,04% qui a filtré au travers d'un filtre Millipore, 37~3 .

de porosité 3 ,u et de 47 mm de diamètre, sous une pression provoquée par une différence de niveau d'eau de 10 cm entre l'entrée et la sortie de l~appareil de filtration.
Les résultats obtenus apparaissent dans la figure 1 annexée où figurent les courbes indiquant le volume, qui a fil-tré en fonction du temps :
- des solutions de polysaccharides préparés comme in-diqués aux exemples 1 (courbe A) et 2 (courbe B) ;
- de la solution de polysaccharide préparé à l'exemple 3 (courbe C) ;
- de la solution d'eau salée, à 5 g par litre de NaCl, qui a servi à la préparation du test de filtrabilité
(courbe D).
Comme on peut le voir, ces essais de filtrabilité met-tent en évidence un colmatage rapide du filtre Millipore de 3 ,u par une solution de polysaccharide obtenu par fermentation sur un milieu riche en azote organique, malgré une préclarification de la solution de polysaccharide (courbe C). Par contre, la solution de polysaccharide obtenu par fermentation sur un milieu conforme à la présente invention, c'est-à-dire pauvre en azote organique, ne provoque pas de colmatage des milieux poreux et s'écoule facilement (courbes A et B).

Claims (2)

Les réalisations de l'invention au sujet desquelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit.

1. Procédé pour améliorer la filtrabilité des gels de polysaccharides obtenus par mélange d'eau et de polysaccharides produits par fermentation à partir d'une culture de Xanthomonas comprenant les étapes suivantes:
a) préparation d'un inoculum à partir d'une culture de Xanthomonas;
b) éventuellement suivie d'une étape intermédiaire de croissance des microorganismes;
c) inoculation à l'aide de la culture issue de l'étape a) ou le cas échéant de l'étape b), d'un milieu comprenant un glucide et une source d'azote et fermentation du milieu inoculé, caractérisé en ce que dans l'étape c) on utilise comme seule source d'azote un composé azoté organique en quantité comprise entre 0,01 et 0,3 g/litre, exprimé en gramme d'azote élémentaire par litre du milieu de fermentation;
d) précipitation des polysaccharides obtenus en l'étape c) et e) formation de gels par mélange d'eau et de poly-saccharides.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le moût de fermentation issu de l'étape c) est soumis à un chauffage entre 80 et 130°C pendant 1 à 40 minutes.