JPS62215397A

JPS62215397A - ヒアルロン酸の製造方法

Info

Publication number: JPS62215397A
Application number: JP61057123A
Authority: JP
Inventors: Toshinori Miyazaki; 宮崎　俊範; Hiroshi Ouchi; 大内　博志; Koichi Shintani; 新谷　康一; Kunio Ujita; 氏田　邦夫; Hideki Yoshioka; 秀樹吉岡
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1986-03-17
Filing date: 1986-03-17
Publication date: 1987-09-22

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は醗酵法によるヒアルロン酸の製造方法に関する
。

〔従来の技術〕

従来ヒアルロン酸は、ニワトリのトサカ、ＷＩ４帯やウ
シの眼球のガラス液などから単離され、化粧。

品や医療材料として利用されているが、極めて高価であ
る。

又、醗酵法によるヒアルロン酸の製造法は、ストレプト
コッカス属の細菌を利用したものであり。

ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）　。

ストレプトコッカスーｚキ（Ｓｔｒｅｐｅｏｃｏｃｃｕ
ｓ＋　ｅｑｗｉ）。

ストレプトコツカｘ−エキシミリス（８ｔｒｅｐｌ、ｏ
ｃｏｃｃｕｓ　　ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）ストレプト
コッカス・ズーエピデミカス（Ｓｅｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｅ　ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕａｌストレグトコツカ
ス、デイスガラクテイｚ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
　　ｄｙａｇａｌａｃｔｉａｅ）表どによりヒアルロン
酸の製造ができることが知られており、　（Ｂ、Ｈｏ１
ｍｓｔｒ５ｍ、　Ａｐｐｌ、ＭｉｃｒＯｂｉａｌ、　１
９６７）。

（、Ｔ、Ｂ　Ｗｏｏｌｃｏｃｋ、　８５．５７２〜３７
５．１．　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ。

１９７４）　、　（１！ｉ、　Ｋｊｅｍ、・Ａｃｔａ、
　Ｐａｔｈｏｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、　８ｃａｎａ
。

１９７６）らの報告がある。

又、糖成分３％以上の高瀝度で上記の微生物を通気撹拌
培養する方法も知られている（特開昭５ａ−ｓ６ｂｑｚ
）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかし前者の報告はいずれも大量生産を目的としたもの
ではなくグルコース１％、培養時間２４時間で収量０・
ｂｙ７を以下と低いものであった。

又、後者の方法では、糖質濃度を高くすると、不安定な
培養となり収量の低下を引きおこす問題があった。

本発明はかかる問題を解決したもので、高収量で、安定
して、しかも安価に醗酵法でヒアルロン酸を製造する方
法を提供することを目的としたものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明はヒアルロン酸を生成する能力を有する微生物を
、培養液中の糖質漉度が常時０．１〜３ｗ／ｖ％となる
ように糖質を複数回添加し、該培養液中で通気撹拌培養
して生成蓄積したヒアルロン酸を採取することを特徴と
するヒアルロン酸の製造方法に関する。

本発明に使用される微生物はヒアルロン酸を生成する能
力を有する微生物であり１例えばストレプトコッカス・
エキ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコ
ッカス−エキシミリス、ストレプトコッカス・ズーエピ
デミカス、ストレプトコッカス・ディスガラクチイエが
あげられ、具体的には１例えばストレプトコッカス−エ
キｍｘ−８５０２１４（微工研菌寄第８６８０号：以下
１’−ＮＫ−８５０２１４株」という）があげられる。

この菌株は群馬県高崎市南大類町の土壌より分離して得
られたもので、その菌学的諸性質は以下のとおりである
。

（ａ）　　　形　　態肉汁寒天斜面上で３０℃２日間培養後の観察では細胞は
直径０．６〜１．ｏｐｍ　　の球状で、長い連鎖状につ
ながっている。

運動性は認められない。又、砲子を形成しない。

ダラム染色は陽性で抗酸性を示さない。

（至）　各糧培地上での生育状態３０℃で培養し１ないし７日間にわたって観察した。

■　肉汁寒天培養；コａ＝−は正円、凸円状に隆起し１
周縁表面とも平滑乳白色やや透明幾分光沢を有する。生
育やや弱く、コロニーは微小である。色素は生成しない
。

■　肉汁寒天斜面培養：糸状から拡布状で光沢があり乳
白色、やや透明、扁平状となる。

■　肉汁液体培養：表面発育間められず、濁度弱く余剰
菌体は沈澱する。

■　肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンは液化しない。

■　リドマスミルク：酸性を示し、凝固しない。

（０）　　生理的性質 ■　硝酸塩の還元：　陰　性 ■　脱窒反応　　：　陰　性 ■　ＭＲテスト　：　陽　性 ■　ｖｐテスト　：　陰　性 ■　　インドールの生成：　　陰　性 ■　デンプンの加水分解：　陽　性 ■　クエン酸の利用：　陰　性 ■　ウレアーゼ　：　陰　性 ■　オキシダーゼ　：　陰　性Ｏカタラーゼ　：　陰　性Ｏ生育ｆ）範囲：　ｐＨ６〜、９．　温度　２０〜４０
℃Ｏ酸素に対する態度：嫌気性、好気性で発育■　Ｏ−
Ｆテスト　：発酵 ■　糖からの酸およびガスの生成酸　　　　　ガス（ペプトン水）　（ペプトン水）Ｌ−アラビノース　　　　−　　　　　　−Ｄ−キシロ
ース　　　　　−　　　　　　−Ｄ−グルコース　　　
　　＋　　　　　　−Ｄ−マンノース　　　　　＋　　
　　　　−Ｄ−７ラクトース　　　　十　　　　　　−
Ｄ−ガラクトース　　　　−　　　　　　−ショ糖　　
　　　　　　十　　　　　−乳糖　　　　−− トレハロース　　　　　　−　　　　　　　−Ｄ−ソル
ビット　　　　　−− Ｄ−マンニット　　　　　−　　　　　　−イノシット
　　　　　　　−− グリセリン　　　　　　−− イヌリン　　　　　　　−− （ｄ）　　その他 ■溶血性　　　　　　　：　β溶血 ■　乳酸の生成　　　　　　：　陽　性■　６・５％食
塩抵抗性　　　　　　：　陰　性■　０．１％メチレン
ブルーミルク　：　陰　性０６０℃熱抵抗性　　　　　
：　陰　性■馬尿酸加水分解　　　　：　陰　性 ■　エスクリン加水分解　　　　　：　陰　性０　アル
ギニン加水分解　　　　　；　陽　性以上の菌学的諸性
質をバーシーズ・マニュアル・オプ・デターミネイティ
ブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕ
ａｌ　ｏｆ　Ｄｅむｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ−ｏｇｙ）　　第８版に記載の檻と照合すると
、ストレプトコッカス・エキと一致する。このような観
察結果から、ＨＫ−８５０２１４株をストレプトコッカ
ス・エキＮＫ−８５０２１４と命名した。

次に本発明の製造方法について説明する。

本発明では、ヒアルロン酸を生産する微生物を培養液中
の糖質濃度が常時０．１〜５　ｗ／ｖ％、好ましくは０
・２〜２．５　ｗ／ｖ％、さらに好ましくは０．２〜２
　ｖ／ｖ％となるように糖質を複数回添加し１通気攪拌
培養をおこなう。ここで使用される糖質としてハ１例え
ばグルコース、シヨ糖、ガラクトース、ラクトース、フ
ラクトース、デングン分解物などの培養の際に糖類とし
て資化されるものならば特に制限ないが、グルコース、
ラクトースが好ましい。

糖質の添加量は総量で培養液１Ｌ当り２Ｑｆ以上、好ま
しくは３Ｇ−２００９，さらに好ましくは４Ｏ−１００
ｐ程度であり、又、その添加回数は５回以上が好ましい
。

本発明で用いる培地は上記の糖質の他窒素源。

無機塩類、生育因子および使用する微生物が要求する栄
養物質を含有する培地が良い。窒素源としてｉｔ、、　
ｍ母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンステイープリ
カー、硫安、尿素、硝酸ナトリウム。

クエン酸第ニアンモニウム、各種アミノ酸混合物等の一
般的原料がもちいられる。

無機塩としては塩化ナトリウム、マグネシウム。

カリウム、鉄、カルシウム等の硫酸塩、リン酸塩。

炭酸塩等が使用出来る。

又、微量のビタミン類、核酸類が必要に応じて添加され
る。又、使用菌の要求物質は単品として添加しなくても
それを含有する天然系物質を用いてもよい。

培養の条件は通気攪拌した方が良く、培養温度は２７〜
４０℃、培養日数は通常１〜４日である。

培養開始時および培養中のｐＨは５．５〜８．５がよく
ｐＨの調整には無機あるいは有機のアルカリ性物質を使
用することが出来る。

培養液中に生成蓄積されたヒアルロン酸を分離採取する
には、従来から行なわれている多糖類の分離採取法で出
来る。例えば、培養液中の菌体、その他不溶成分は一過
又は遠心分離により分離除去する。溶液中に混在する蛋
白質は、トリクロル酢酸又ハ、　クロロホルムーイソグ
ロビルアルコール混液、あるいは、活性炭などで除去で
きる。また混在する低分子物質は限外−過、透析あるい
は。

メタノール、エタノールなどの有機溶媒再沈澱法などに
より分離除去できる。

その後有機溶媒による沈澱法、カチオン活性剤による吸
着沈澱法、イオン交換樹脂による吸着法で精製し、凍結
乾燥あるいは噴霧乾燥、溶媒沈澱法等の方法でヒアルロ
ン酸を単離する事が出来る。

〔効　果〕

後記実施例及び参考例１〜５に示すごとく、グルコース
の譲度および添加方法を変えて培養した結果を表−１に
示した。

グルコースを低濃度にコントロールして培養する方法が
優れていることがわかる。

表−１従って１本発明により、ヒアルロン酸が従来の方法より
安価に製造出来るので１本発明方法は、ヒアルロン酸の
工業的製法として１期待される。

〔実施例〕

実施例１グルコース１．５％、酵母エキス１．２％、ペット７０
．２５％、ＮａＣ１Ｇ、５％、消泡剤０．０１％の組成
の培地ｔｓｏｔジャーファーメンタ−に２０を入れ１２
０℃１５分間加熱殺菌後、前培養したＨＫ−８５０２１
４株（微工研寄第８６８０号）を接種し、５６℃ｐＨ６
，５〜７．５１ｃ　ＩＩａＯＨ水溶液テ水溶液口コント
ロールコース残存量が０．５〜０．２％になった時、１
．５％になるようにグルコースを添加し、培養中グルコ
ース濃度をコントロールしつづけ、２日間通気撹拌（通
気量２０ｔ／分１回転数４．０　Ｏｒｐｍ　）培養した
。グルコースの添加回数は５回で、使用したグルコース
の総量は培養液１を当り６０２であった。

又、プロス１を当りのヒアルロン酸含量は５・５２であ
った。

培養終了後遠心分離により菌体および夾雑物を除去し、
上澄１ｆＬ１Ｌにセチルピリジウムクロライドを加え、
生じた沈澱をデ取する。

この沈澱を２ＭＮａＣ１水溶液に溶解後活性炭５５ｆを
加えよく撹拌し活性炭を遠心除去する。この上澄液２ｔ
をエタノール４ｔＶｃ攪拌しながら添加し。

沈澱を採取する。

この沈澱を水２ｔに溶解し透析法にて脱塩後、溶液を凍
結乾燥してヒアルロン酸を得た。

′　　本品は電気泳動にて標品のヒアルロン酸と同じ位
置に泳動され、赤外線吸収スペクトルも標品と一致した
。

参考例１実施例１において使用した培地中のグルコースの濃度を
８％におきかえた培地を用い、その後はグルコースを全
く添加せず、他の条件は実施例１と同様の方法で培養し
た。

ヒアルロン酸の含量はプロス１を当り２．５２であった
。

参考例２実施例１において使用した培地中のグルコースの量を０
．５チにお色かえた培地を用いて培養を開始し、グルコ
ースが消費つくされる直前にグルコース１！：６％添加
し他は何様の方法で培養した。

ヒアルらン酸の含量はプロス１を当りｓ、ａｙであった
。

Claims

【特許請求の範囲】

ヒアルロン酸を生成する能力を有する微生物を、培養液
中の糖質濃度が常時０．１〜３Ｗ／Ｖ％となるように糖
質を複数回添加し、該培養液中で通気攪拌培養して生成
蓄積したヒアルロン酸を採取することを特徴とするヒア
ルロン酸の製造方法。