JPS62289198A - ヒアルロン酸の新規製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物によるヒアルロン酸の製造方法に関する
。

〔従来の技術〕

従来ヒアルロン酸は、ニワトリのトサカ、調帯やランの
眼球のガラス体など嘩乳動物に広く分布している。しか
し、微量にしか存在せず、しかもタンパク質や他のムコ
多塘体と複合体を形成し。

精製上複雑な工程を要する。

又、醗酵法によるヒアルロン酸の製造法は、ストレグト
コツカス属の細菌を利用したものであり、Ｂし、ｐｙｏ
ｇａｎｅｓ、　　！Ｅｆｔ、　　ｅｑｕｉ、　　Ｓじ。

　ｅｑｕｌｓｉｍｉｌ土ｅ、　　Ｓｔ、４ｙｅ−ｇａｌ
ａｃｔｉａｅおよびＳｅ、　ｚｏｏｅｐｉａｅｍｉｃｕ
ｓ　　等の細菌により産生されることで知られている。

〔例えばホルムストｌ／　−ム（Ｂ、　ＨｏｌｍＦＪｔ
ｒｏｍ、　Ａｐｐｌ、　ＭｉＣｒＯｂｉＯｌ。

１９６７）　、ジエービー・クールコック（Ｊ、Ｂ、　
Ｗｏｏｌ−ＣＯＣｋ、　８５１３７２−３７５．　Ｊ、
　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｖｏ’ｂｉｏｌ、　１９７４）。

イー・キエム（Ｌ　Ｋｊｅｍ、　Ａｃｔａ、　Ｐａｔｈ
ｏｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

５ｃａｎｄ、　１９７６）ｌ　　ヒアルロン酸の製造方
法（特開昭５ａ−ｓ６ｂｑ２）） 〔発明が解決しようとする問題点〕 しかじ、いずれも工業化には収量面で低いか。

あるいは、培養が不安定で収量の低下を引きおこす問題
があった。

本発明は、かかる問題を解決すべく鋭意研究した結果、
培地に特定のアミノ酸を添加することにより、高収量で
しかも安定してヒアルロン酸が得ら扛ることを見い出し
１本発明を完成するに至った。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明はヒアルロン酸を生成する能力を有する微生物を
、アルギニン及び／又はグルタミン酸を添加した培地中
で培養し、培養液からヒアルロン酸を採取することを特
徴とするヒアルロン酸の製造方法に関する。

本発明に使用される微生物はヒアルロン酸を生成する能
力を有する微生物であり１例えばストレプトコッカス・
エキ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコ
ッカス・エキシミリス、ストレプトコッカス・ズーエピ
デミカス、ストレプトコッカス・ディスガラクチイエが
あげられ、具体的には例えば、ストレプトコッカス・エ
キＮＫ−８５０２１４（微工研菌寄第８６８０号：以下
「ＮＫ−８５０２１４株」という）、ストレプトコンカ
ス−エキＮＫ−８５０２１５（微工研菌寄第８７５６号
）以下ＩＮＫ−８５０２１５株」カアげラレル。

本発明で培地に添加するアルギニン又はグルタミン酸の
添加量は、４？に制限ないが、あまり多すぎても一定以
上の収量増加にはみもれないのでそれぞれ好ましくは０
．０１〜１％、さらに好ましくは０．０３−０．５％程
度である。

アルギニンとグルタミン酸を併用すると収量はさらに向
上するので好ましい。

本発明においては糖質を添加した液体培地を用いる方が
好ましい。ここで使用される糖質としては５例えばグル
コース、シヨ糖、ガラクトース、ラクトース、７ラクト
ース、デンプン分解物などの培養の際に糖類として資化
されるものならば特に制限ないが、グルコース、ラクト
ースが好ましい。

糖質の添加量は総量で培養液１を当９２０ｆ以上、好ま
しくは３０−２００７、さらに好ましくは４Ｑ−ＩＱ０
７程度である。又、その糖質は全量を１度に添加しても
よいが、培養液中の糖質濃度が常時０．１〜ｓ　ｗ／ｖ
％、好ましくは０．２−２．５Ｗ／ｖｓさらに好ましく
は０．２〜２　ｗ／ｖ　％となるように糖質を複数回、
好ましくは３回以上分割添加する。

本発明で用１八る培地は上記の糖質の他窒素源、無機塩
類、生育因子および使用する微生物が要求する栄養物質
を含有する培地が良い。窒素源としては、酵母エキス、
肉エキス、ペプトン、コーンステイープリカー、硫安、
尿素、硝酸ナトリウム。

クエン酸第ニアンモニウム、各種アミノ酸混合物等の一
般的原料がもちいられる。

無機塩としては塩化ナトリウム、マグネシウム、カリツ
ム、鉄、カルンウム等の硫酸塩、リン酸塩。

炭酸塩等が使用出来る。

又、微量のビタミン類、核酸類が必要に応じて添加され
る。又、使用菌の要求物質は単品として添加しなくても
それを含有する天然系物質を用いてもよい。

培養の条件は振盪培養、通気攪拌培養など特に制限はな
いが１通気攪拌培養した方が良く、糖質を分割添加する
場合は特に通気攪拌培養が好ましい。培養温度は２７〜
４０℃、培養日数は通常１〜４日である。培養開始時お
よび培養中のｐＨは用することが出来る。

培養液中に生成蓄積でれたヒアルロン酸を分離採取する
には、従来から行なわれている多糖類の分離採取法で出
来る。例えば、培養液中の歯体。

その他不溶成分はデ過又は遠心分離により分離除去する
。溶液中に混在する蛋白質は、トリクロル酢酸又は、ク
ロロホルム−インプロピルアルコール混液、あるいは、
活性炭などで除去できる。また混在する低分子物質は限
外−過、透析あるいは、メタノール、エタノールなどの
有機溶媒再沈澱法などにより分離除去できる。

その後有機溶媒による沈澱法、カチオン界面活性剤によ
る吸着沈澱法、イオン交換樹脂による吸着法で精製し、
凍結乾燥あるいは噴霧乾燥、溶媒沈澱法等の方法でヒア
ルロン酸を単離する事が出来る。

〔効　果〕

実験例１ グルコース５．０％、酵母エキス１．０％、　ＮａＣ１
０，５％、炭酸カルシウム３．０％の組成の培地にアル
ギニンを添加し殺菌後、前培養したＮＫ−８５０２５株
（微工研菌寄第８７５６号）を接種し。

５０℃、３日間レクブロ式振盪培養機で培養を行った。

結果を表−１に示した。

表−１フルギニン添加量とヒアルロン酸生産量培地にア
ルギニンを添加すると収量が著しく向上することが確認
された。

実験例２ 実験例１で、アルギニンの代わりにグルタミン酸を添加
し同様の実験を行なった結果ｔｌ？２に示した。

表−２グルタミン酸添加量とヒアルロン酸生産量培地に
アルギニンを添加すると収量が著しく向上することが確
認された。

実験例３ グ＃　：Ｉ　−ス５．０％、酵母エキス１．０％、　Ｎ
ａＣ１０，５％、炭酸カル／ラム３．０％の組成の培地
に。

アルギニン０．２％、グルタミン酸０．２％を単独であ
るいは同時に添加し、殺菌後、前培養したＮＩＣ−８５
０２＋５株を接種し、３０℃、３日間振盪培養を行なっ
た。、浩果を表−３に示した。

アルギニン及びグルタミン酸の同時添加で相乗効果がみ
られ、無添加の約６．８倍のヒアルロン酸を生産した。

以上から明らかなようにアルギニン及び／又はグルタミ
ン酸を添加した培地を用いる本発明の方法は、ヒアルロ
ン酸の生産性を大幅に向上させることができるので、ヒ
アルロン酸の工業的製法としてすぐｎたものである。

〔実施例〕

実施例１ グルコース５．０％、＃母エキス１．０％１食塩０．５
％、炭酸カルシウム３．０％、アルギニン０．２チ、グ
ルタミン酸０．２％の組成の培地を殺菌後。

前培葵したＮＫ−８５０２１５株を接種し、３０℃、５
日間振盪培養を行ない、ブロス１Ｌ当りのヒアルロン酸
含量４．１２の培養液を得た。

培養終了後遠心分離により菌体および夾雑物を除去し、
上澄１ｆｆ１１ＬＫセチルピリジウムクロライドを加え
、生じた沈裁を戸数する。

この沈ご夕を２ＭＮａＣ１水溶液に溶解後活性炭５５２
を加えよく撹拌し活性炭を遠心除去する。この上澄液２
ｔをエタノール４ｔに攪拌しながら添加し。

沈澱を採取する。

この沈澱を水２ｔに溶解し透析法にて脱塩後、溶液を凍
結乾燥してヒアルロン酸を得た。

実施例２ グルコース５．０％、酵母エキス１．０％１食塩０．５
％、炭酸ｆ）ルシ１７　Ａ　３．０　％　、　７＃ギニ
ンＱ、２多、グルタミン酸０．２％の組成の培地を殺菌
後。

前培養したストレプトコッカス・エキＮ　Ｋ　−８５０
２１４株（微工研菌寄第８６８０号）を接種し。

３０℃、３日間振盪培養を行ない、プロス１を当りヒア
ルロン酸含量的３，５７の培養液を得た。

次いで実施例１と同様にしてヒアルロン酸を得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. アルギニン及び／又はグルタミン酸を添加した培地中で
   ヒアルロン酸生産能を有する微生物を培養し、培養液か
   らヒアルロン酸を採取することを特徴とするヒアルロン
   酸の製造方法。