JPH02234689A - ヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、醗酵法によるヒアルロン酸の製造法に関する
。さらに詳しくは、栄養要求性が部分的に解除されたス
トレゾトコッカス・エキを培養し、ヒアルロン酸を生成
蓄積せしめることを特徴とするヒアルロン酸の製造法に
関する。

〔従来の技術〕

従来ヒアルロン酸はニワトリのトサカ、牛の眼の硝子体
又は騰帯等よシ抽出によって得られていた。しかしなが
ら抽出法によるヒアルロン酸製造は、分離精製が非常に
繁雑等の課題を有してい亀その課題を改良するために、
ヒアルロン酸を生産する能力乞有する微生物を培養し、
その培養液から直接ヒアルロン酸を採取する方法が提案
されてきたが収量のバラッキがあり、生産性が不安定で
あった。

本発明者らも先にヒアルロン酸生産を工業的に実施すべ
く種々研究を行った結果、栄養要求性が部分的に解除さ
れたストレゾトコッヵス・エキの変異株ＦＭ・１００が
親株よりも高収量で、しかも収量のバラッキが少なく安
定的にヒアルロン酸を生成することを見い出した（特開
昭６３−１　２５３９２号公報）。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしストレグトコッカス・エキの変異株ＦＭ・１００
を用いてヒアルロン酸生産を行うに際し、長期間にわた
って伺回も培養を行なう場合、おるいは、培養液の一部
を残し、そこに新たな培地を添加し増養を継続する半連
続培養を行なう場合、ヒアルロン酸の収量が徐々に低下
し、バラッキも大きく、安定なヒアルロン酸の製造を行
うことが困難であった。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、かかる課題を解決すべく、種々研究を行
なった結果、ストレゾトコツカスエキの変異株ＦＭ・１
００から、更に栄養要求性が解除された株として誘導さ
れた変異株ＦＭ・６００（微工研条寄第２３１９号）が
ヒアルロン酸の生産安定性の面で大きく改善されている
ことを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、ストレゾトコツカス・エキ（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ）の変異株ＦＭ　−　
６０　０（微工研条寄第２３１９号）を培養し、ヒアル
ロン酸を生成蓄積せしめることを特徴とする該ヒアルロ
ン酸の製八である。

以下、本発明について具体的に説明する。

本発明の栄養要求性が部分的に解除されたストレゾトコ
ツカス・エキＦＭ・６００（微工研条寄第２３１９号）
は、ヒアルロン酸生成能を有するストレゾトコツカス・
エキＦＭ・１００の突然変異株の中から取得することが
出来る。

例えば、ストレプトコツカス・エキＦＭ・１００を用い
、ポリペデトン１．５％、酵母エキス０．５　％、グル
コース２チの培地にて、３６℃で培養し、対数増殖期の
菌を、低温で遠心分離により集菌し、生理食塩水を用い
て、無菌的に６回洗浄する。Ｎーメチル−Ｎ′一二トロ
ーＮ−ニトロソグア二ジン５０μ１１／αを含むｐＨ５
．０、０．０　５　Ｍリン酸緩衝液中、６０℃で１時間
振盪したのち、氷冷する。

ついで、生理食塩水を用いて、低温で菌体な６回洗浄し
た後、ポリペプトン１．５％、酵母エキス０．５％、グ
ルコース２％の培地で、６６℃、６時間培養し、また生
理食塩水を用いて、低温で菌体を６回洗浄する。表１に
示す人工合成培地で、６６℃、７日間液体培養し、増殖
してきた培養液をさらに、新しい同じ人工合成培地にう
えつぎ、この操作を６回くりかえす。

次に嘩天を含む同じ組成の培地上に塗布し、コロニーヲ
分離シ、ストレゾトコツカス・エキＩＦＭ６００を得る
。

本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研
条寄第２３１９号として受託されている。

ストレゾトコツカスＦＭ・３００はストレソトコツカス
・エキＦＭ・１００から更にスレオニン及びフエニルア
ラニンの栄養要求性が解除され、ストレプトコツカス・
エキＦＭ・１００が生肯できない表１に示す培地成分だ
けからなる人工合成培地によく生育することができる。

本発明に用いる培地は通常の微生物の培養に用いるもの
で良く、グルコース、フラクトース、ガラクトース、シ
ュークロース、等の炭素源、リン酸第１カリウム、リン
酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、亜硫酸ソーダ、チ
オ硫酸ソーダ、リン酸アンモニウム等の無機塩類、ポリ
ペゾトン、カデミノ酸、酵母エキス、コーンステイープ
リカー大豆加水分解液等の有機栄養源の他、必要に応じ
て各種アミノ酸、ビタミン類等が好適に用いられる。

これらの培地成分は一括仕込又は分割添加いずれでも採
用可能である。

本発明の培養は、通気・攪拌培養等の公知の方法でよく
、培養温度は６０〜３５℃が好ましい。

培養液の絹は、菌の生育と共に低下するため、カ性ソー
ダ、カ性カリ、アンモニア等の声調整剤を添加し、ＰＪ
｛６．５〜９。ＯＫコントロールする。

また、培養終了後、培養液の一部を残し、そこに新九女
培地を添加し培養を継続する半連続培養を行うことも可
能である。

このようにして培養すると、ヒアルロン酸の生成と共に
、培養液の粘度が次第に上昇してくる。

使用炭素源が培養液中で消費された時点で培養を停止し
、遠心分離による除菌後、アルコール等の有機溶媒によ
る析出、限外ろ過による脱塩等の簡単な公知精製法によ
シ、高収率でヒアルロン酸が得られる。

〔実施例〕

次に実施例によシ、本発明を詳しく説明するが、本発明
はこれに限定されるものではない。

実施例１ グルコース２チ、リン酸第１カリウム０．２チ、硫酸マ
グネシウム７水塩０．０５％、チオ硫酸ンーダ０．１％
、ポリペプトン１．０％酵母エキス０．５％からなるｐ
Ｈ　８．５の培地　１ｌに同一培地からなるストレゾト
コツカス・エキＦＭ・３００の前培養液１０ｍＡ’を接
種し、通気量ｉ．５　ｖｖｍ　（　ｖｏｌｕｍｅｖｏｌ
ｕｍｅ　ｍｊ−ｎｕｔｅ　）　．，攪拌２００回転／分
、温度３６℃でカ性ソーダで一を８．５にコントロール
しながら培養し、１５時間後に、グルコース２％を分添
し、グルコースが全部消費された時点で培養液９００ｄ
を抜き出した。さらにグルコース２チ、リン酸第１カリ
ウム０．２％、硫酸マグネシウム７水塩０．０５チ、チ
オ硫酸ソーダ０．１チ、ポリペプトン１．０チ酵母エキ
ス０．５％からなるｐＨ８．５の培地９００ｍ／を添加
し、通気量１．５ｖｖｍ，攪拌２００回転／分、温度３
３°Ｃでカ性ソーダで一を８．５にコントロールしなが
ら培養し、５時間後に、グルコース２％を分添し、グル
コースが全部消費された時点で培養液９００Ｉ＋！７！
を抜き出した。

上記の半連続操作をちと４回くシかえし、計６バッチ行
った結果を表２に示す。

培養液は塩酸でｐＨ４に調整後、蒸留水で２倍希釈し、
遠心分離によシ除菌した。得られた除菌液をエチルアル
コールヲ加エ、ヒアルロン酸ソーダを析出せしめる。こ
れをろ別した後、水に溶解し、セチルビリジニウムクロ
ライドを加え、生じた沈殿をろ取し、２チ食塩水に再溶
解後、再びエチルアルコールによる析出をくシ返す。得
られたヒアルロン酸ソーダを室温で減圧乾燥して、白色
のヒアルロン酸ソーダヲ得タ。

得られたヒアルロン酸ソーダは、赤外線吸収スペクトル
、Ｃ−１３核磁気共鳴スペクトル、ストレゾトミセスの
ヒアルロニダーゼによる分解実験でヒアルロン酸ソーダ
であることが確認された。

表　　　２ 比較例１ ストレプトコツカス・エキ　ＦＭ・１［］０を実施例１
と同様にして６回半連続培養したが、得られたヒアルロ
ン酸ソーダはそれぞれ、７．１　．！；Ｉ，　　ｓ．ｏ
　ｇ，４．５Ｌ　　４．０．９，２．５Ｌ　　２．０．
９であシ収量は実施例１に比較して、低く、まだばらつ
いていた。

実施例２ グルコース２チ、リン酸第１カリウム０．２チ、硫酸マ
グネシウム７水塩０．０　５　％　、チオ硫酸ソーダ０
．１優、ポリＫノトン１．０％酵母エキス０．５％から
なるｐ｝１　８．５の培地　１ノに同一培地からなるス
トレゾトコツカス・エキＦＭ・６００の前培賽液１０−
を接種し、通気量１．５ｖｖｍ，攪拌２００回転／分、
温度３３℃でカ性ソーダでーを８．５にコントロールし
ながら培養し、１５時間後に、グルコース２チを分添し
、グルコースが全部消費された時点で培養を停止した。

培養液を塩酸でｐＨ４に調整後、蒸留水で２倍希釈し、
遠心分離によシ除菌した。得られた除菌液をエチルアル
コールを加エ、ヒアルロン酸ノーダを析出せしめる。こ
れをろ別しだ後、水に溶解し、セチルぎリジニウムクｄ
ライドを加え、生じた沈殿をろ取し、２チ食塩水に再溶
解後、再びエチルアルコールによる析出をくシ返す。得
られたヒアル目ン酸ソーダを室温で減圧乾燥して、培養
液１ｌあだ！９　７．７　ｇの白色ヒアルロン酸ソーダ
を得た。

得られたヒアルロン酸ソーダは、赤外線吸収スペクトル
、Ｃ−１３核磁気共鳴スペクトル、ストレゾトミセスの
ヒアルロニダーゼによる分解実験でヒアルロン酸ソーダ
であることが確認された。

上記と同様の培養を１４回くシかえし、全部で１５バッ
チ行なった結果を表３に示す。

表　　６ さらに長期的Ｋ培養を行なったが、ヒアルロン酸収量は
常に安定していた。

比較例２ ストレゾトコツカス・エキＦＭ・１００を実施例２と同
様にして、１５回くシかえしたが、得られたヒアルロン
酸ソーダは第１，４，８，１２．１５パッチの収量がそ
れぞれ、７．ＯＦ，７．３ｇ、３．９　．９　，　６．
３　＃、４．０ｇであシ、収量は実施例１Ｋ比較して、
低く、またばらついていた。

〔発明の効果〕

本発明Ｋよれば、ヒアルロン酸生産のためＫ数多く繰シ
返し培養を行ったシ、半連続培養を行っても、ヒアルロ
ン酸を高収率で、しかも収量ｋほとんどばらつきなく、
安定Ｋ生産することができる。また菌株管理も容易であ
る。

本発明によって製造されたヒアルロン酸は、化粧品、医
薬品に配合して使用できる。

特許出願人　電気化学工業株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ストレプトコツカス・エキ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
   ｓｅｑｕｉ）の変異株ＦＭ・３００（微工研条寄第２３
   １９号）を培養し、ヒアルロン酸を生成蓄積せしめるこ
   とを特徴とする該ヒアルロン酸の製造方法。