JPS63123392A - ヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、醗酵法によるヒアルロン酸の製造法に関する
。さらに詳しくは、栄養要求性が部分的に解除されたス
トレプトコッカス・エキを培養し、ヒアルロン酸を生成
蓄積せしめることを特徴とするヒアルロン酸の製造法に
関する。

〔従来の技術〕

従来ヒアルロン酸はニワ）　ＩＪのトサカ、牛の蝋の硝
子体又はＷｓ帝等よシ抽出によって得られてい之。しか
しながら抽出法によるヒアルロン酸製造は、分雌槽裂が
非常に困難等の欠点を有してい友。

その欠点を改良する之めに、ヒアルロンｒＲｔ−生産す
る能力をＭする微生Ｗを培養し、その培養液から直接ヒ
アルロン酸を採暇する方法が開示されている（特開昭５
８−５６６９２号公報、特開昭６１−６５２９４号公報
）。

さらに、微生物を培養し、ヒアルロン酸を採噴する方法
につ＾て、培養のロットごと生成量を安定化させる九め
、突然変異株を用いる方法が開示されている（？ｉＦ開
昭６１−２１９５９４号会報）。

本発明者らは、ヒアルロン酸産生能を有するストレプト
コツカス属の微生物を、培養液の−７，５〜９．０にコ
ントロールすることによシ、高分子歇のヒアルクン酸を
生成蓄積せしめる方法についてすでに提案し九（％願昭
６１−１７０９４！１号明細書）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

微生ｖＪを培養して、ヒアルロン酸の生産を行なうと、
ロットごとの生産瞳が不安定で、１）・工業的に実施す
る際に、大きな問題となる。

〔問題点を解決する之めの手段〕

本発明者らは、かかる問題を解決すべく、１々研究を行
なつ九結果、栄ｆＩ！要求性が部分的に解除されたスト
レプトコッカス・エキが意外にも親株よシも、高収瞼で
、しかも装置のバラツキが少なく安定にヒアルロン酸を
生成することを見い出し本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、栄養要求性が部分的に解除されたス
トレプトコッカス・エキを培養し、ヒアルロン酸を生成
蓄積せしめることを特徴とする醗酵法によるヒアルロン
酸の製造法である。

以下、本発明について具体的に説明する。

本発明の栄養要求性が部分的に解除されたストレットコ
ツカス・エキは、ヒアル筒ン酸生成ａｉ有するストレプ
トコッカス・エキの突然変異株の中から改得することが
出来る。

例えば、ストンシトコツカス・エキ　ＡＴＣＣ９５２７
を用い、ポリペプトン１．５％、酵母エキス肌５％、グ
ルコース２％の培地にて、３３℃で培養し、対数増Ｎ１
＠の菌ｔ１低温で遠心分離によシ集醒し、生理＊塩水を
用いて、無菌的に５＠洗浄する。Ｎ−メチル−シーニト
ロ−Ｎ−二トロンクアニゾン５０ａｊｉ／ｍｌｔ：！；
むｐ）Ｉ　５．０．０．０５　Ｍリン酸緩衝液中１３０
℃で１時間Ｓ盪し乏のち、水冷する。

つ＾で、生理食塩水を用ηて、低温で陶体を３回洗浄し
た後、ポリペプトン１．５％、酵母、エキス０．５％、
グルコース２％の培地で、５５’Ｑ、５時間培養し、ま
た生理食塩水を用いて、低温で菌体’に：３回洗浄する
。表２に示す人工合成培地で、３３’Ｃ，７日間液体培
養し、増殖してきた培養液をさらに、新し＾同じ人工合
成培地にうえつぎ、この操作を３回くシかえす＠ 久に寒天をきむ同じ組成の培地上に塗布し、コロニーｔ
″９離り、、ストレプトコッカス・エキＦ’Ｍ１００を
得る。

本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所忙、倣工研
菌寄第９０２７号として受託されている。

ストレプトコッカスＦＭ・１００は、部分的に栄養要求
性が解除され、親株でらるＡＴＣＣ９５２７が生育でき
ない表２に示す培地成分だけからなる人工合成培地によ
く生育することができる。

ストレプトコッカス・エキＦＭ・１００の栄養要求性は
表３に示すとおシである。

特定の栄養素の要求性が解除された菌株を吹得するとき
は、表２の培地から、その栄養素を除い之培地を作成し
、上述と同様の操作を行なう。

また栄ＩＩ要求性が部分的に解除された菌株は、とくに
人為的に変異処理を行なわなくても、上述のようなうえ
つぎ操作をくシかえずことによシ４得することもできる
。

本発明Ｉ／Ｃ用いる培地は通常の微生物の＠養に用いる
もので良く、グルコース、フラクトース、がラクトース
、シュークロース、等の炭素源、リン酸第１カリウム、
リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、亜硫酸ソーダ
、チオ硫酸ソーダ、リン醸アンモニウム等の無機１頌、
ポリペプトン、カブミノ酸、酵母エキス、コーンステイ
ープリカー、大豆加水分解液等のＭ機栄＃源の他、必要
に応じて各櫨アミノ酸、ビタぐン類等が好適に用いられ
る。

これらの培地成分は一括仕込又は分割添加いずれでも採
用ｏＴ１１！である。

本発明の培養は、通気・鷹件培＃専の公矧の方法でよく
、培養温度は５０〜５５　”Ｃ！が好ましい。

培養液の−は、菌の生育と共に低下する念め、力性ソー
ダ、力性カリ、アンモニア等のＦＪ’（調整剤を添加し
、ｐＨ６，５〜７．０にコントロールｆる。

このようにして培養すると、ヒアルロン酸の生成と共に
、培養液の粘度が次第に上、昇してくる。

使用炭素源が培養液中で消費された時点で培養を停止し
、遠心分離による除菌後、アルコール等の有機溶媒によ
る析出、限外ろ過による脱塩等の簡単な公刊槽製法によ
シ、高収率でヒアルロン酸が得られる。

〔実施例〕

次ｌＣ実施例により、本発明の詳細な説明するが、本発
明はこれに限定される本のではない。

実施例１ グルコース２％、リン酸第１カリウム０．２％、硫酸マ
グネシウム７水塩０．０５％、チオ＠改ソーダ０．１％
、ポリペプトン１．０％酵母エキス０．５％かうなる−
８．５の培養液１ｔに同一培地からなる八 ストレプトコツ力Ｗ・エキＦＭ−１００の前啼盪液１０
ゴを接種し、通気喰１，５ｖｖｍ、攪拌２００回転／分
、温度３３゛Ｃで力性ソーダで−を８．５にコントロー
ルしながら培養し、１５時間後に、グルコース２％を分
添し、グルコースが全部消費された時点で＠ｉｎｋ停止
した。

ｒ＠養液を塩酸で−４に調整後、蒸留水で２倍希択し、
遠心分＠により除菌した。得られた除菌液をエチルアル
コールを加え、ヒアルロン酸ソーダを析出せしめる。こ
れｔろ別し九後、水に痔解し、セチルピリジニウムクロ
ライドｔ−加え、生じた沈殿金ろ暇し、２％食塩水に再
俗解後、再びエチルアルコールによる析出をくり返す。

得られたヒアルロンはソーダを室温で減圧乾燥して、培
養液１ｔあた５　７．２　、Ｆの白色ヒアルロン酸ソー
ダを得た。

得られｔヒアルロン酸ソーダは、赤外線吸収スペクトル
、Ｃ−１３核磁気共鳴スペクトル、ストレプトミセスの
ヒアルロン酸−ぜによる分解実験でヒアルロン酸ソーダ
であることが確認された。

上記と同様の培養を４回くシかえし、全部で５バッチ行
なつｔ結果を表３に示す。

表　　５ さらに長期的に＠譬を行なり之が、ヒアルロン酸装置は
常に安定して＾た◎ 比較例１ 親株であるストレプトコッカス・エキＡＴＣＣ９５２７
を実施例１と同様にして、５回くりかえし次が、得られ
几ヒアルロン戚ンーダはそれぞれ−４，５ｇ、２．３ｇ
、６．５ｇ％　１−２Ｎ、５．９ｇであ夛−収皺は実施
列１に比較して、低く、またばらついていた〇 〔発明の効果〕 本発明によれば、ヒアルロン酸を高収率で１しかも収１
にばらつきなく、安定に生産することができる。また菌
株管理も容易である。

本発明によって製造されたヒアルロン酸は、化粧品、医
薬品に配合して使用できる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）栄養要求性が部分的に解除されたストレプトコッ
   カス・エキを培養し、ヒアルロン酸を生成蓄積せしめる
   ことを特徴とする醗酵法によるヒアルロン酸の製造法。
2. （２）親株の増殖しない表１に示す培地成分から成る人
   工合成培地に生育できる栄養要求性が部分的に解除され
   たストレプトコッカス・エキを培養し、ヒアルロン酸を
   生成蓄積せしめることを特徴とする醗酵法によるヒアル
   ロン酸の製造法。 表１ ▲数式、化学式、表等があります▼