CH646996A5

CH646996A5 - Verfahren zur herstellung des antibiotikums cephamycin c.

Info

Publication number: CH646996A5
Application number: CH462880A
Authority: CH
Inventors: Takashi Kamogashira; Tsutomu Nishida; Michiharu Sugawara; Tomiyo Nihno; Setsuko Takegata
Original assignee: Otsuka Pharma Co Ltd
Priority date: 1979-06-15
Filing date: 1980-06-16
Publication date: 1984-12-28
Also published as: JPS561894A; FR2459289A1; IT8048978A0; GB2052502A; ES8104414A1; GB2052502B; SE438164B; IT1146229B; NL183898C; FR2459289B1; NL8003449A; JPS594120B2; CA1150167A; US4332891A; SE8004434L; NL183898B; AU527100B2; ES492443A0; DE3022250C2; DE3022250A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cephamycin C.

Cephamycin C ist ein bekanntes Antibiotikum, nämlich 7-(5-Amino-5-carboxyvalerylamino)-3-carbamoyloxymeth-yl-7-methoxy- 3-cephem-4-carbonsäure der folgenden planen Formel

H2N-CH(ai2)3-COOH

CHN-

0

OCNH-

0

COOH

CD

Eine Reihe von Verfahren ist bereits zur Herstellung von Cephamycin C unter Verwendung verschiedener Streptomy-ces-Stämme bekannt. Z.B. wird S. jumonjiensis, S. lactamge-nes, S. sp. P 6621, S. clavuligerus, S. lactamdulans in den US-Patentschriften 3 770 590,3 865 693 und 3 977 942, in der GB-PS 1 425 081, in den japanischen Patentschriften 69294/75 und 11097/76 und in der japanischen Offenlegungsschrift 49071/77 beschrieben.

Es besteht ein Bedürfnis, Cephamycin C unter Verwendung von Mikroorganismen in wesentlich besseren Ausbeuten und nach einfacheren Verfahren herzustellen.

Nach gründlichen Untersuchungen wurde nun ein neuer Stamm Streptomyces sp. OFR 1022 aus dem Boden in Kenia isoliert, der grosse Mengen Cephamycin C in einem Kulturmedium bildet und vorteilhaft die technische Herstellung von Cephamycin C ermöglicht. Auf dieser Forschung beruht die Erfindung.

Tabelle 1 Kulturmedium

Saccharose Nitrat-Agar

Wachstum mässig

Oberflächen-mycel mässig, pulverig, natürlich 2dc

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Cephamycin C und ist dadurch gekennzeichnet,

dass man einen Stamm Streptomyces sp. OFR 1022 in einem Kulturmedium kultiviert und darin Cephamycin C ansam-5 melt und daraus Cephamycin C gewinnt.

Fig. lAund 1B sind Ultraviolett-Absorptionsspektren von Cephamycin C, das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhalten wurde.

Fig. 2 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum des erwähn-io ten Cephamycin C, und

Fig. 3 ist ein protonen-kernmagnetisches Resonanzspektrum (NMR) von Cephamycin C.

Der erfindungsgemäss verwendete neue Stamm Streptomyces sp. OFR 1022 hat eine aussergewöhnliche Produktivität für Cephamycin C im Vergleich zu den bekannten Cephamycin C produzierenden Stämmen und hat eine hohe optimale Kultivierungstemperatur im Vergleich zu den bekannten Stämmen. Infolge dessen ist es mit dem erfindungsgemässen Verfahren möglich, Cephamycin C herzustellen, ohne dass 20 man irgendwelche Kühlverfahren anwenden muss, unter Anwendung von einfachen Verfahrensweisen und Vorrichtungen, wobei man das Produkt in grossen Mengen zu niedrigen Kosten und in guten Ausbeuten erhält.

Die Erfindung stellt somit einen ganz erheblichen Fort-25 schritt bei der Herstellung von Cephamycin C dar.

Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes Streptomyces sp. OFR 1022, der erfindungsgemäss verwendet wird, sind die folgenden:

30 (I) Morphologische Eigenschaften

Die Beobachtungen wurden gemacht nachdem man den Stamm bei 28 °C während 3 Wochen wie folgt kultiviert hat.

Das Oberflächenmycel besteht aus einer Hauptachse und einfachen Verzweigungen entlang der Hauptachse. Diese Ver-35 zweigungen bilden häufig Agglomerate. Auf dem Kulturmedium, auf dem die Sporenbildung stattfindet, hegt die Verzweigung nur etwas in Kreisform vor, und im allgemeinen bildet sie eine vollständige Spirale, in welcher sie mehrere Male aufgewunden ist. Die Sporen haben eine spinale Oberfläche 40 und sind kreisförmig oder elliptisch in Form und haben eine Grösse von 0,7 bis 1,0 um x 1,1-1,3 (im. 10 oder mehr Sporen bilden eine Kette.

(II) Kultureigenschaf ten auf verschiedenen Agarmedien

Die Beobachtungen wurden mit Stämmen gemacht, nach-45 dem diese drei Wochen bei 28 °C auf den in Tabelle 1 gezeigten Medien kultiviert worden waren. Die Farbtönung wird im Vergleich zu dem Color Harmony Manual, Container Corporation of America, Chicago, bestimmt.

50

Substrat-mycel hell elfen bein 2ca

Rückseite bambus, 2gc lösliches Pigment kein

Glucose-

Asparagin-

Agar

Glycerin-

Asparagin-

agar massig gut, etwas spärlich

(Kicisformig)

reichlich, samtähnlich, gelb-braun gefärbt, 2ge beige, 3ge reichlich, samtähnlich, silbergrau, 3fe, beigebraun, 3ig perlrosa 3ca senffarben, 21g perlrosa, 3ca kein ziegelbraun, 31g

Spur gelb

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Kultur- Wachstum medium

Oberflächen-mycel

646 996

Substrat-mycel

Rückseite lösliches Pigment

Stärke- gut reichlich,

anorgani- samtähnlich,

sehe Salze- silbergrau,

Agar 3fe

Tyorin- mässig reichlich, samt-

Agar ähnlich, natür lich, 2dc

Nähr- schlecht kein

Agar

Hefe-Malz- gut reichlich, samt-

Agar ähnlich, weiss

Hafermehl- gut, spär- samtähnlich,

Agar lieh (kreis- pulverig, beige-

* förmig) braun 3ig

Pepton- mässig kein

Hefe-Eisen- schlecht

Agar

(III) Physiologische Eigenschaften

(1) Wachstumstemperaturbereich

(2) Wachstums-pH-Bereich

(3) Verflüssigung von Gelatine (in einem Glu-cose-Pepton-Gelatine-Medium, 20 °C)

(4) Hydrolyse von Stärke (in einem Stärkeanorganisches Salz-Agar-Medium)

(5) Koagulierung und Peptonisierung von entrahmter Milch

(6) Produktion von Melanoidin-Pigment

(7) Reduktion von Nitraten

(8) Zersetzung von Cellulose

(9) NaCl-Toleranz

(IV) Verwendung von Kohlenstoff quellen ( in einem Pridham-

Gottlieb-Agar-Medium )

L-Arabinose

±

D-Xylose

+

D-Glucose

+ +

D-Fructose

+

Saccharose

+ +

Inosit

+ 4

L-Rhamnose

—

Raffinose

±

D-Mannit

+ +

Anmerkung: ++: gute Verwertung; +: Verwertung;

± : etwas Verwertung; —: keine Verwertung.

(V) Diaminopimelinsäure in der ZellwandLL-Diaminopime-linsäure

Der erfindungsgemässe Stamm OFR 1022 gehört zum Genus Streptomyces; aufgrund der internationalen Streptomyces Project-Methode (ISP), der Morphologie der sporen-Duaenden Mycele gehört er zu der Sektion Spiralis; die Obersenffarben ziegelbraun, kein

21g 31g ziegelbraun nelken- ziegelbraun,

31g braun, 3 ni 31g bambus, 2gc Elfenbein- kein tönung, 2cb camel, 3ie zimt, 3 le kein

Elfenbein- silbergrau, kein tönung, 2cb 3fe

Beige-braun gelb-braun tiefbraun

3ig 2ge 3pl

15 °C bis 46 °C (optimale Wachstumstemperatur etwa 37 °C)

pH 4,5 bis 8,5 (optimaler Wachstums pH etwa

6,5)

negativ positiv

Peptonisierung positiv (in Tyrosin-Agar, einem Pepton-Hefe-Ei-sen-Agar und einer Trypton-Hefeextraktbrühe)

negativ negativ wächst bei 3% und wächst nicht bei 5%.

flächen der Sporen ist spinal und die Farbe des ausgewachsenen Oberflächenmycels entspricht der Graufarbreihe und es so wird ein Melanoidpigment, aber sonst praktisch kein anderes Pigment gebildet. Berücksichtigt man fernerhin die Tatsache, dass das Substratmycel und die Rückseite schwach gelb-gelbbraun oder hellbraun sind und die verschiedenen vorher beschriebenen Daten, wie die physiologischen Eigenschaften 55 und die Verwendung von Kohlenstoffquellen, so ist die Einteilung des vorliegenden Stammes derart, dass dieser Stamm am ähnlichsten Streptomyces filipinensis und Streptomyces gannmycicus ist, entsprechend Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe (1974), S.A. Waksman, The 6o Actinomycetes, Band 2 (1961) und E.B. Shirling and D. Gottlieb, International Lournal of Systematic Bacteriology, Band

18, S. 69 bis 189 (1968), Band 18, S. 279 bis 392 (1968, Band

19, S. 391-512 (1969) und Band 22, S. 265 bis 394 (1972).

65 Deshalb wurde der vorliegende Stamm und die Art der Stämme, die diesem Stamm am meisten entsprechen, unter gleichen Bedingungen kultiviert und dann verglichen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

646 996

Tabelle 2

4

Streptomyces Streptomyces filipinensis gannmycicus

ISP 5112 ISP 5572

büschelig, enge Spiralkreise einfache Verzweigung. Das oder hakenähnlich am obe- obere Ende ist hautsächlich renEnde RF, liegt selten in einer offe nen Spirale oder einer engen Spirale vor

Form des Oberflä-chenmycels

Wachstum auf Saccharose-Nitrat-Agar

Oberflächenmycel

Rückseite lösliches Pigment

Glucose-Asparagin-Agar-Wachstum

Oberflächenmycel

Rückseite lösliches Pigment Nähr-Agar-Wachstum

Oberflächenmycel Rückseite lösliches Pigment

Pepton-Hefe-Eisen-Agar-Wachstum

Oberflächenmycel Rückseite lösliches Pigment

Streptomyces sp.

OFR 1022

einfache Verzweigungen werden entlang d. Hauptachse gebildet, Oberflächen-mycele, bilden oft Kreise und geschlossene Spirale, die sich mehrere Male in der Spitze winden, und die selten in geschlossener Form vorliegen mässig, hell-elfenbein 2ca mässig, pulverig, natürlich, 2dc bambus, 2gc nicht mässig, perlrosa, 3ca reichlich, samtähnlich, gelbbraun, 2ge bis beige, 3ge perlrosa, 3ca nicht schlecht bambus, 2gc nicht elfenbein, 2cb nicht mässig bis schlecht beigebraun, 3ig nicht gelbbraun, 2ge dunkelbraun, 3pl gut, pastellgelb, ldb mässig, pulverig, weiss bambus, 2gc nicht gut, senfbraun reichlich, pulverig, natürlich, 2dc bis oberflächengrau, 2fe beige-braun,3ig Spur gelb mässig, schlecht stroh, 2fb nicht elfenbein, 2db nicht mässig, hellsenffarbig 2ie nicht gelbbraun, 2ge gelb-ahorn, 3ng wächst bei 46 °C und wächst nicht bei 60 °C

4,5-10,5

negativ positiv positiv schlecht, farblos,

nicht farblos nicht gutsenf, 21e mässig, pulverig oberflächengrau, 2fe gelb-ahorn, 3ng Spur gelb mässig, bambus, 2gc schlecht, weiss creme, l'/2ca nicht gut, bambus, 2gc schlecht, weiss hell-aprikot, 2ea Spur braun wächst bei 42 °C und wächst nicht bei 46 °C 4,5-11,0 positiv positiv (stark)

positiv (stark)

Physiologische Eigenschaften

Obere Grenze der Wachs- wächst bei 26 °C und wächst tumstemperatur nicht bei 60 °C

Wachstums-pH-Bereich 4,5-8,5

Verflüssigung von Gelatine negativ

Hydrolyse von Stärke positiv

Peptonisierung von ent- positiv rahmter Milch

Melanoidpigment-Bildungsfahigkeit

Trypton-Hefe-Extraktbrühe + + ±

Pepton-Hefe-Eisen-Agar + + + + +

Tyrosin-Agar + + _l_ +

Reduktion von Nitraten negativ positiv positiv (schwach)

5 646 996

Fortsetzung Tabelle 2

Verwendung von Kohlenstoffquellen

L-Arabinose

±

+ +

D-Xylose

+

D-Glucose

+ +

D-Fructose

+

+ +

Saccharose

+ +

—

Inosit

+ +

L-Rhamnose

—

+ +

Raffinose

±

+ +

D-Mannit

+ +

Anmerkung: + + : gut ausgenutzt; + : ausgenutzt; ± wenig ausgenutzt; —: nicht ausgenutzt.

15

Tabelle 2 sagt folgendes aus: Baumwollsamenmehl, Hefe, Fischmehl, Maismaische, Pep-

(1) Der vorliegende Stamm OFR 1022 unterscheidet sich ton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Hafermehl, Kaseinhydroly-von Streptomyces filipinensis ISP 5112 darin, dass Strepto- sat, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und myces filipinensis ISP 5112 ein büscheliges Oberflächenmycel dergleichen ein. Anorganische Salze schliessen Magnesiumhat, und dass deren Enden enge Spiralen bilden oder kreis- 20 sulfat, Phosphorsäuresalze, Kalziumcarbonat und derglei-oder hakenförmig sind, und dass die Farbe des Substratmy- chen ein.

cels auf dem Glucose-Asparagin-Agar-Medium senfbraun Notwendigerweise oder gewünschtenfalls kann man zu

2pl und die Rückseite beige-braun 3ig ist, dass es die Fähig- dem Kulturmedium eine geringe Menge eines Metallsalzes keit hat, Nitrat zu reduzieren, und dass es L'Arabinose und und geeignete Mengen von Aminosäure, wie a-Aminoadipin-Raffinose gut verbraucht. 25 säure, Natriumthiosulfat, Natriumdithionit, Glycin, L-Phe-

(2) Der vorliegende Stamm OFR 1022 unterscheidet sich nylanilin, Arginin und Ornithin und Diamine, wie 1,3-Diami-von Streptomyces gannmycicus ISP 5572 darin, dass der nopropan, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan. Polyamine, wie Hauptteil des Oberflächenmycels von Streptomyces gannmy- Spermidin und dergleichen zugeben. Im Falle einer Flüssig-cicus ISP 5572 in Form der Sektion RF (Rectiflexibiles) vor- kultivierung kann man als Entschäumungsmittel Silikon,

liegt und kaum in der etwas offenen Spiral- oder in der engen 30 Pflanzenöl, oberflächenaktive Stoffe und dergleichen Spiralform, dass das Wachstum auf einem Saccharose-Nitra" zugeben.

Agar-Medium schlecht ist, und dass man keine Ausbildung Der pH des Kulturmediums liegt im Bereich von etwa 4,0

von Oberflächenmycelen feststellt, und dass man andererseits bis etwa 8,0 und vorzugsweise bei etwa 6,0 und die Kultivie-Entwicklung von Oberflächenmycelen auf Nähr-Agar-Medi- rungstemperatur liegt bei etwa 15 °C bis etwa 46 °C und vor-um und auf Pepton-Hefe-Eisen-Agar-Medium feststellt und 3s zugsweise etwa 3 7 °C. Die maximale Produktionsmenge an dass er ausserdem nicht bei 46 °C wachsen kann, dass er Gela- dem gewünschten Cephamycin C wird gewöhnlich in einem tine verflüssigt, und dass er die Fähigkeit hat, als Kohlen- Zeitraum von 72 bis 96 h erhalten. Z.B. kann man bei einer stoffquelle besonders gut L-Arabinose, L-Rhamnose und Kultivierung in einem 5-1 -Fermentator eine Menge von etwa

Raffinose zu verwenden, während er Saccharose nicht ver- 2 mg/ml Cephamycin C ansammeln. Das Cephamycin C liegt brauchen kann. 40 hauptsächlich in dem flüssigen Teil der Kulturlösung vor,

Somit wird ersichtlich, dass der vorliegende Stamm OFR weil es gut in Wasser löslich ist.

1022 ein neuer Stamm ist, der sich von Streptomyces filipi- Nach Beendigung der Kultivierung werden die Mycele nensis und Streptomyces gannmycicus, denen er am ähnlich- und andere Feststoffe durch Zentrifugieren oder Filtrieren sten ist, unterscheidet. entfernt, und das in dem Filtrat vorhandene Cephamycin C

Der vorliegende Stamm OFR 1022 wurde als Streptomy- 45 wird in einfacher und üblicher Weise isoliert unter Anwen-ces sp. OFR 1022 bezeichnet und wurde am 18. Mai 1979 bei dung üblicher physikalischer und chemischer Trennmetho-Fermentations Research Institute, the Agency of Industriai den. Zur Reinigung kann man eine Reihe von Adsorbentien, Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Yatabe-ma- wie Ionenaustauschharze, Kieselgel und Aktivkohle, verwen-chi Tsubuka-gun, Ibaraki-ken 305, Japan, unter der Mikroor- den. Beispiele für Ionenaustauschharze sind saure Kationenganismus-Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 4985 hinter- 50 austauschharze und basische Anionenaustauschharze. Stark legt. Später wurde der Mikroorganismus auch bei der Ameri- basische Anionenaustauschharze werden vorzugsweise ver-can Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rock- wendet. Typische Beispiele sind Diaion PA 406 (hergestellt ville, Maryland 20852, USA, unter der Hinterlegungsnummer von der Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), Dowex 50W x 4 ATCC Nr. 31666 hinterlegt. (hergestellt von der Dow Chemical Corp.), Dowex 1x2 (her-

Für die vorliegende Erfindung ist es wesentlich, Strepto- 55 gestellt von der Dow Chemical Corp.).

myces sp. OFR 1022 oder einen natürlichen oder künstlichen Das auf dem Adsorptionsmittel adsorbierte Cephamycin

Mutanten davon zu verwenden. Die Kultivierung des vorlie- C wird mit Wasser, Kochsalzlösung oder einer Methanolgenden Stammes oder eines Mutanten davon kann nach übli- Wasser-Mischung, einer n-Butanlo-Wasser-Mischung, einer chen Kultivierungsverfahren erfolgen, und zwar vorzugsweise Aceton-Wasser-Mischung oder dergleichen eluiert.

in einem flüssigen Kulturmedium mittels einer Schüttelkultur so Zur Reinigung von Cephamycin C kann man Chroma-oder einer belüfteten gerührten Kultur. tografie unter Verwendung von Kieselgel oder Avicel (herge-

Eine Reihe bekannter Nährmittel für Actinomycetes kann stellt von der Asahi Kasei Kogyo, K.K.) anwenden, zur Kultivierung des vorliegenden Stammes verwendet wer- Durch eine geeignete Kombination der vorerwähnten den. Nährmittel, die als Kohlenstoffquelle verwendet werden Reinigungsverfahren und durch Wiederholung derselben können, schliessen Glucose, Saccharose, Glycerin, Maltose, 65 kann man reines Cephamycin C erhalten.

Dextrin, Stärke, Sojabohnenöl, Baumwollsamenöl und der- Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des er gleichen ein. Nährmittel, die als Stickstoffquelle verwendet findungsgemäss hergestellten Cephamycins C sind die fol-werden können, schliessen Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, genden:

646 996

(1) Aussehen: weisses Pulver

(2) Spezifische Drehung:

[a]^° = 221° (C=0,4, H20)

(3) Löslichkeit: löslich in Wasser, kaum löslich in Äthanol und wenig löslich in Dimethylsulfoxid.

(4) Farbreaktion: positiv gegenüber Ninhydrin-Reaktion und Jod-Reaktion und negativ gegenüber Ferridchlorid-Re-aktion.

(5) Dünnschichtchromatografie (TLC): Die Entwicklung wurde unter Verwendung einer Lösung von n-Butanol:Essig-säure: Wasser=2:1:1 (V/V) auf einer dünnschichtchromato-grafischen Kieselgelplatte GF 254 (hergestellt von Merk & Co.) vorgenommen. Rf =0,2.

(6) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (UV):

In Fig. 1 wird das Spektrum in Kurve (a) (Lösungsmittel H20) und Kurve (b) (Lösungsmittel 0,1 N HCl) gezeigt. Die

1%

Maximalabsorption und der E ^ cm -Wert in jedem Lösungsmittel wird in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3 Lösungsmittel

H20

0,1 N HCl

Maximalabsorption (mp.m)

240

265 245

266

cl% m ^ E, -Wert 1 cm

127 105

(7) Infrarotabsorptionsspektrum (IR): Das IR-Spektrum (KBr-Tablette) wird in Fig. 2 gezeigt.

(8) Kernmagnetisches Resonanzspektrum (NMR): Das NMR-Spektrum wird in Fig. 3 gezeigt, wobei D20 als Lösungsmittel und DSS als interner Reagensstandard verwendet wurde und die Frequenz 60 MHz betrug.

(9) Aminosäureanalyse: Die Analyse nach einer Hydrolyse mit 4 N HCl bei 110 °C nach 4 h bestätigte, dass sich a-Aminoadipinsäure und Glycin gebildet hatten.

Das antimikrobielle Spektrum gegenüber verschiedenen Mikroorganismen von erfindungsgemäss hergestelltem Cephamycin C wird nachfolgend in Tabelle 4 anhand der minimalen Inhibierungskonzentrationen (MIC) gezeigt.

Tabelle 4

Versuch Nr.

1

2

3

4

5

6

7

8

Testorganismus

Bacillus subtilis Pel 219

MIC (jig/ml)

15,6

Staphylococcus aureus FDA 250 209P

Staphylococcus aureus Newman 250

Sarcina lutea PCI 1001 15,6

Salmonella typhi 0-901 3,9 NCT8393

Proteus vulgaris HD OX-19 7,8

Proteus mirabilis 1287 7,8

Esherichia coli NIH J 15,6

Diese physikalischen und chemischen Eigenschaften unter Antimikroben-Spektrum sind in guter Übereinstimmung mit dem bekannten Cephamycin C, z.B. mit dem, das in der JA-OS 3286/1971 beschrieben wird.

5 Nachfolgend wird die Erfindung ausführlich durch die Beispiele erläutert. Alle Prozente sind auf das Gewicht bezogen.

Beispiel 1

io Streptomyces sp. OFR 1022, das auf einem Hafermehl-Agar-Medium inkubiert worden war, wurde auf einem flüssigen Kulturmedium, enthaltend 3% Stärke, 0,5% Saccharose, 1 % Sojabohnenmehl und 0,3 % Trockenhefe, mit einem pH von 7 inokuliert und 48 h bei 37 °C geschüttelt unter Erhalt is einer Saatkulturlösung.

In einer 30-1-Fermentator wurden 201 eines Kulturmediums vorgelegt, das 3% Stärke, 1% Saccharose, 2% Baumwollsamenmehl, 1% Trockenhefe, 0,05% Magnesiumsulfat, 0,02% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05% Dinatriummono-2o hydrogenphosphat und 0,05% Silikon (hergestellt von der Shinetsu Chemical Co., Ltd.) als Entschäumungsmittel enthielt. Vorher war, bei einem pH von 6,0 sterlisiert worden. Dazu wurde die oben erwähnte Saatkulturlösung in einer Menge von 1 % gegeben und das Ganze wurde unter Belüf-25 tung bei 37 °C inkubiert. Die Menge der zugeführten Luft betrug 201/Min. und die Anzahl der Drehungen des Propeller-rührers 300 UpM.

Nach 90-stündiger Kultivierung erreichte die Menge an gebildetem Cephamycin C 2 mg/ml.Dies wurde durch Hoch-30 geschwindigkeits-Chromatografie unter den folgenden Messbedingungen festgestellt:

Pumpe: (Japan Waters Co., Ltd., 6000 A-Typ)

Injektor: (Japan Waters Co., Ltd., U6K-Typ)

Detektor: (Shimazu Seisakusho Ltd., SPD 1)

35 Säule: (Japan Waters: Mikro-Bandapack C-18, mmidx 30 cm)

Mobile Phase: 0,01 M-Essigsäure Fliessgeschwindigkeit 2 ml/Min.

Nachweis: UV 254 nm, 0,16 AUFS 40 Aufzeichnungsgeschwindigkeit: 0,5 cm/Min.

Nach Beendigung der Kultivierung wurde die Kulturlösung zentrifugiert und die Mycele vom Filtrat getrennt, wobei man 181 Filtrat erhielt, das auf pH 7 bis 8 eingestellt und auf 31 Diaion PA 406 adsorbiert wurde. Dann wurde es mit einer 45 wässrigen 0,6 M Natriumchloridlösung eluiert, wobei man 21 einer antimikrobiellen aktiven Fraktion erhielt. Diese Fraktion wurde unter vermindertem Druck bei etwa 30 °C konzentriert. 200 ml der konzentrierten Lösung wurden über 400 ml Kieselgel ODS (Hergestellt von Waters Co.) geleitet und dann so wieder konzentriert. Die so konzentrierte Lösung wurde einer Umkehrphasenchromatografie mit 0,01 M Essigsäure über einer 5,35 cm Durchmesser x 120 cm langen Kieselgel-ODS-

Säule unterworfen.

Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gefrier-55 getrocknet, wobei man 18 g eines weissen, pulvrigen Cephamycin C erhielt. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der erhaltenen Verbindung wurden untersucht und stimmten mit den vorher bestimmten überein.

60 Beispiel 2

Streptomyces sp. OFR 1022 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 kultiviert und die Kulturbrühe wurde filtriert, wobei man 201 Filtrat erhielt. Das Filtrat wurde über 1,51 Diaion PA 406 CpTyp (hergestellt von Mitsubishi Chemical 65 Co., Ltd.) adsorbiert. Dann wurde die Säule mit dem vierfachen Säulenvolumen an entionisiertem Wasser gewaschen und mit IM wässriger NaCl-Lösung eluiert, wobei man 2,51 einer antimikrobiellen aktiven Fraktion erhielt. Diese Frak

tion wurde mit 4N Chlorwasserstoffsäure auf pH 1 eingestellt und dann wurde NaCl bis zu einer Endkonzentration von 4M (Mol/1) zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Säule (21) Diaion HP 20 (hergestellt von Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) absorbiert und mit Wasser eluiert. Das gefundene Cephamycin C wurde dann eluiert, nachdem der pH des Eluats etwa 4 erreichte. Anschliessend wurde das Eluat gesammelt bis zu einer Gesamtmenge von 1,51 und gefriergetrocknet, wobei man 24 g eines weissen Pulvers von Cephamycin C erhielt.

7 646996

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der erhaltenen Verbindung wurden untersucht und stimmten gut mit der in Beispiel 1 gefundenen überein.

5 Die Produktivität des neuen Stammes OFR 1022 an Cephamycin C wurde mit den bekannten Stämmen, die in verschiedenen Berichten beschrieben werden, verglichen und in Tabelle 5 wird der Vergleich gezeigt.

10

Tabelle 5 Stamm

Ausbeute an Cephamycin C in der Brühe

Literatur

Streptomyces jumonjiensis

Streptomyces lactamgenes

Streptomyces sp. P 6621

Streptomyces clavuligerus

Streptomyces lactamgenes

Streptomyces sp. OFR 1022

40 mg/1 200 mg/1 350 mg/. 494 mg/1 1291 mg/1 530 mg/1 2000 mg/1

US-PS 3 865 693

Japanische Patentanmeldung 69294/75

Japanische Patentanmeldung 110097/76

US-PS 3 977 942

US-PS 3 770 590

Japanische Patentpublikation 49071/77

erfindungsgemäss

Aus Tabelle 5 wird ersichtlich, dass Streptomyces sp. 40 OFR 1022 im Vergleich zu den bekannten Stämmen Streptomyces eine sehr hohe Ausbeute an Cephamycin C liefert.

C

2 Blatt Zeichnungen

Claims

646 996 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von Cephamycin C, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces sp. OFR 1022 in einem Kulturmedium kultiviert und darin Cephamycin C ansammelt und daraus Cephamycin C gewinnt.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den genannten Mikroorganismus bei einer Temperatur von 15 °C bis 46 °C kultiviert.

3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man den Mikroorganismus bei einer Temperatur von 37 °C kultiviert.