DE3022250C2

DE3022250C2 - Herstellung des Antibiotikums Cephamycin C

Info

Publication number: DE3022250C2
Application number: DE3022250A
Authority: DE
Inventors: Takeshi Kamogashira; Tomiyo Nihno; Tsutomu Nishida; Michiharu Sugawara; Setsuko Tokushima Takegata
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1979-06-15
Filing date: 1980-06-13
Publication date: 1982-07-08
Also published as: FR2459289A1; AU5929380A; GB2052502A; US4332891A; ES8104414A1; GB2052502B; SE438164B; IT1146229B; ES492443A0; NL8003449A; CH646996A5; JPS594120B2; JPS561894A; CA1150167A; DE3022250A1; AU527100B2; SE8004434L; NL183898B; IT8048978A0; FR2459289B1

Description

H₂N-CH(CH₂J₃-CHN

COOH

Eine Reihe von· Verfahren ist bereits zur Herstellung von Cephamycin C unter Verwendung verschiedener Streptomyces-Stämme bekannt. Zum Beispiel wird S. jumonjiensis, S. lactamgenes, S. sp. P 6621, S. clavuligerus, S. lactamdulans in den US-Patentschriften 37 70 590, 38 65 693 und 39 77 942, in der GB-PS 14 25 081, in den japanischen Patentschriften 69294/75 und Ii 097/76 und in der japanischen Offenlegungsschrift 49071/77 beschrieben.

Es besteht ein Bedürfnis, Cephamycin C unter Verwendung von Mikroorganismen in wesentlich besseren Ausbeuten und nach einfacheren Verfahren herzustellen.

Nach gründlichen Untersuchungen wurde nun ein neuer Stamm Streptomyces sp. AT'C 31666 aus dem Boden in Kenia isoliert, der große Mengen Cephamycin C in einem Kulturmedium bildet und vorteilhaft die technische Herstellung von Cephamycin C ermöglicht.

Die Erfindung betrifft somit das im Anspruch 1 angegebene Verfahren.

F i g . 1 ist ein Ultraviolett-Adsorptionsspektrum von Cephamycin C, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde,

Fig.2 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum des erwähnten Cephaymcin C, und

F i g. 3 ist ein protonen-kernmagnetisches Resonanzspektrum (NMR) von Cephamycin C.

Der erfindungsgemäß verwendete neue Stamm Streptomyces sp. ATCC 31666 hat eine außergewöhnliche Produktivität für Cephamycin C im Vergleich zu den bekannten Cephaymcin C produzierenden Stämmen und hat eine hohe optimale Kultivierungstemperatur im Vergleich zu den bekannten Stämmen. Infolge dessen ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich,

Tabelle 1

3, Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. ATCC 31666 bei 37° C kultiviert

Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Die Patentansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen der Erfindung. Cephamycin C ist ein bekanntes Antibiotikum, nämlich 7-(5-Amino-5-carboxyvalerylamino)-3-carbamoyIoxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure der folgenden planen Formel

OCH₃

COOH

Cephamycin C herzustellen, ohne daß man irgendwelche Kühlverfahren anwenden muß, unter Anwendung von einfachen Verfahrensweisen und Vorrichtungen, wobei man das Produkt in großen Mengen zu niedrigen Kosten und in guten Ausbeuten erhält.

Die Erfindung stellt somit einen ganz erheblichen

Fortschritt bei der Herstellung von Cephamycin C dar.

Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes Streptomyces sp. ATCC 31666 der erfindungsgemäß verwendet wird, sind die folgenden:

(I) Morphologische Eigenschaften

Die Beobachtungen wurden gemacht, nachdem man den Stamm bei 28⁰C während 3 Wochen kultiviert hat.

Das Oberflächenmycel besteht aus einer Hauptachse

und einfachen Verzweigungen entlang der Hauptachse.

Diese Verzweigungen bilden häufig Agglomerate. Auf dem Kulturmedium, auf dem die Sporenbildung stattfindet, liegt die Verzweigung nur etwas in Kreisform vor, und im allgemeinen bildet sie eine vollständige Spirale, in welcher sie mehrere Male aufgewunden ist. Die Sporen haben eine spinale Oberfläche und sind kreisförmig oder elliptisch in Form und haben eine Größe von 0,7 bis 1,0 μΐη χ 1,1 —1,3 μπι.

10 oder mehr Sporen bilden eine Kette.

(II) Kultureigenschaften auf verschiedenen Agarmedien

Die Beobachtungen wurden mit Stämmen gemacht, nachdem diese drei Wochen bei 28°C auf den in Tabelle 1 gezeigten Medien kultiviert worden waren. Die Farbtönung wird im Vergleich zu dem Color Harmony Manual, Container Corporation of America, Chicago, bestimmt.

Kulturmedium

Wachstum

Oberflächenmycel Substratmycel

Rückseite

lösliches Pigment

Saccharose
Nltrat-Agar

Glucose-

Asparagln-

mäßig
mäßig

mäßig, pulverig, natürlich, 2dc

reichlich, samtähnlich, gelbbraun gefärbt, 2ge, beige, 3ße hell-elfenbeln,
2ca

perlrosa, .'!ca

bambus, 2gc perlrosa, 3ca

kein kein

	(I)	30 22 3	250	4	Raffincse D-Mannit Anmerkung:+ + + : ±:	nächst nicht bei 5v	lösliches Pigment
Fortsetzung	(2)						Spur gelb
Kultur medium	ü)	Wachstum Oberflachen- mycel	Substrat- mycel	Rückseite		± + + . gute Verwertung; Verwertung; etwas Verwertung; lcpine Vprwprhino	kein
Glycerin- Asparagln- Agar	(4)	gut, etwas reichlich, spärlich samtähnlich, (kreisförmig) silbergrau, 3fe, beigebraun, 3lg	scnffarben, 21g	ziegelbraun, 31g		ziegel braun, 31g
Stärke anorganische Salze-Agar	(5)	gut reichlich, samtähnlich, sllbergrau, 3fe	senffarben, 21g	ziegelbraun, 3!g		kein
Tyorln-Agar	(6)	mäßig reichlich, samtähnlich, natürlich, 2dc	ziegelbraun, 31g	nelken braun, 3ni	kein
Nähr-Agar	(7)	schlecht kein	bambus, 2gc	Elfenbein tönung, 2cb	kein
Hefe-Malz- Agar	(8)	gut reichlich, samtähnlich, weiß	camel, 3)e	zimt, 31e	tiefbraup 3pl
Hafermehl - Agar	(9)	gut, spärlich samtärmlich, (kreisförmig) pulverig, beigebraun, 3ig	Elfenbein tönung, 2cb	silbergrau, 3fe
Pepton- Hefe-Elsen- Agar		mäßig kein schlecht	beigebraun, 31g	gelbbraun, 2ge
	L-Arabinose D-Xylose D-Glucose D-Fructose Saccharose Inosit L-Rhamnose	(III) Physiologische Eigenschaften
Wachstumstemperaturbereich	15" C bis 46" C (optimale Wachstums temperatur etwa 37"C)
Wachstums-pH-Bereich	pH 4,5 bis 8,5 (optimaler Wachstums-pH etwa 6,5)
Verflüssigung von Gelatine (In einem Glucose-Pepton-Gelatine- Medlum, 2O⁰C)	negativ
Hydrolyse von Stärke (In einem Stärke-anorganische Salze-Agar-Medlum)	positiv
Koagullerung und Peptonislerung von entrahmter Milch	Peptonisierung
Produktion von Melanoidln-Plgment
Reduktion von Nitraten
Zersetzung von Cellulose
NaCI-Toleranz	positiv (in Tyrosin-Agar. einem Pepton- Hefe-Eisen-Agar und einer Trypton-Hefe- Extraktbrühe)
negati\
negativ-
wachst bei 3% und
(IV Verwendung von Kohlenstoffquellen (in einem Pridham-Gottlieb-Agar-Mediuini
± + + + + 65 + + + +

(V) Diaminopimelinsäure in der /ellwand
Ll.-Diaminopimelinsäure

Der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm gehört zum Genus Slreplomyces; aufgrund der internationalen Streptomyces Project-Methode (ISP). der Morpholgy der sporenbildenden Mycele gehört er zu der Sektion Spiralis; die Oberflächen der Sporen ist spinal und die Farbe des ausgewachsenen Oberflächenmycels entspricht der Graufarbreihe und es wird ein Melanoidptgment. aber sonst praktisch kein anderes Pigment gebildet. Berücksichtigt man fernerhin die Tatsache, daß das Substratmycel und die Rückseite schwach gelb-gelbbraun oder hellbraun sind und die verschiedenen vorher beschriebenen Daten, wie die physiologischen Eigenschaften und die Verwendung von Kohlenstoffqucllen.

so ist die Einteilung des vorliegenden Stammes derart, daß dieser Stamm am ähnlichsten Streptomyces filipinensis und Streptomyces gannmycicus ist, entsprechend Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe (1974), S. A. Waksman, The Actinomycetes, Band 2 (1961) und F.. B. Shirling and D. Gottlieb, International Journal of Systematic Bacteriology, Band 18, S. 69 bis 189 (1968), Band 18, S. 279 bis 392 (1968, Band 19, S. 391 - 512 (1969) und Band 22, S. 265 bis 394 (1972).

Deshalb wurde der erfindungsgemäß verwendete Stamm und die Stamme, die diesem Stamm am meisten entsprechen, unter gleichen Redingungen kultiviert und dann verglichen.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2 sagt folgendes aus:

Tabelle 2

EnrtV lies

' lherl'lächennnce¹

W iidMuiii auf

At: ·γ

nheril.icher

Nlrc-ploi-mces
\ 1 ( ( y\666 Streptomyccs
filipinensis
ISI' 5112

Sirepimmces Biinnnncii'us

isp "":

eintache Verzweigungen werden entlang der Hauptachse gebildet. nhcrflächennuecle bilden oft Kreise unil geschlossene Spirale. die sich mehrere Male in der Spitze winden und die selten in geschlossener Tonn vorliegen

mäHlg. hell-elfcnbcin. 2ca

m.iHi!'. puKerie. natürlich. 2dc

nicht

büschelig, enge Spiral kreise oder hakeniihnllch
am oberen Ende

gut. pastellgelb, UIb

mäßig, pulverig, weiß

bambus. 2gc

nicht

einfache Verzweigung; das obere Ende Ist hauptsächlich RE. liegt selten in einer offenen Spirale oder einer engen Spirale vor

schlecht, farblos

nicht

farblos

nicht

Eigenschaften

^e-; Grenze
d-;-r Wachstun
'.emperaiur

wächst bei 2f> C und wächst nicht bei 60 C wächst bei 46 C und
wächsi nicht bei 60" C

4.5-10.5 wächst bei 42" C und wächst nicht bei 46° C

4.5-11.0

■ ■- Gelatine

H-. .-JnI;. se ν ■- Stärke	positiv	."ca
Pep:.inisierung von entrahmter Milch	pin Ki'.
Meisnnidpierrent Biid^ngsfähigf.eit
T-ypton-Hefe- Extnktbrühe	-
Perton-Hefe-Eiscr - Agar
T>r.-!s;r:-Agar	--
Reduktion %^n	negativ
	mäßig. perirosa.

negativ positiv

positiv

gut.
senfbraun

positivpositiv (stark) positiv (stark)

positiv (schwach) gut. senf. 21e

Streptomyces sp. ATCC 31666

Streptomyces flllplnensls ISP 5112

Streptomyces gannmycicus ISP 5572

Oberrlachenmycel	reichlich, samtähnlich, gelbbraun. 2ge bis beige, 3ge
Rückseite	perlrnsii. ica
lösliches Pigment	nicht
Nahr-Agar- Waehsluni	schlecht, bambus. 2gc
Obcrnilchenmycel	nicht
Rückseite	elfcnbcln. 2cb
iosiiches Pigment	nicht
Pepton-llcfe-F.lsen- Agar-Wachstum	maßig bis schiecht belgchraun, 3lt>
Oberfl «lchenmycel	nicht
Rückseite	gelbbraun. 2gc
lösliches Pigment	dunkelbraun. 3pl
Verwendung von Kohlenstoffquellen
I.-Arablnose	t
D-Xylose
D-Cilucose
D-Fructose
Saccharose
Inosit
I.-Rhamnose	-
Rafflnose	t
D-Mannlt
Anmerkung: ": gut aussenutzr. *:	ausgenutzt; +: wenle ausgei

reichlich, pulverig, natürlich. 2dc bis oberflächengrau. 2fe	maßig, pulverig, oberflächegrau. 2ie
helpehraun. 3lg	gelb-ahorn. 3ng
Spur gelb	Spur yclb
müßig, schlecht, stroh. 21h	müßig, bambus. 2gc
nicht	schlecht, weiß
ellenbeln. 2db	creme. I'/? ca
nicht	nicht
mäßig, hell- senlfarbig. 2ie	gut. bambus. 2gc
nicht	schlecht, weiß
gelbbraun. 2gc	hcll-aprikot. 2ca
gelb-ahorn. 3ng	Spur braun

-: nicht ausgenutzt

(1) Der Stamm ATCC 31666 unterscheidet sich von Streptomyces filipinensis ISP 5112 darin, daß Streptomyces filipinensis ISP 5112 ein büscheliges Oberflächenmycel hat. und daß deren Enden enge Spiralen bilden oder kreis- oder hakenförmig sind, und daß die Farbe des Substratmycels auf dem Glucose-Asparagin-Agar-Medium senfbraun 2pl und die Rückseite beige-braun 3ig ist, daß es die Fähigkeit hat, Nitrat zu reduzieren, und daß es L-Arabinose und Raffinose gut verbraucht.

(2) Der Stamm ATCC 31666 unterscheidet sich von Streptomyces gannmycicus ISP 5572 darin, daß der Hauptteil des Oberflächenmycels von Streptomyces gannmycicus ISP 5572 in Form der Sektion RF (Rectiflexibiles) vorliegt und kaum in der etwas offenen Spiral- oder in der engen Spiralform, daß das Wachstum auf einem Saccharose-Nitrat-Agar-Medium schlecht ist und daß. man keine Ausbildung von Oberflächenmycelen feststellt und daß man andererseits Entwicklung von Oberflächenmycelen auf Nähr-Agar-Medium und auf Pepton-Hefe-Eisen-Agar-Medium feststellt und daß er außerdem nicht bei 46⁼C wachsen kann, daß er Gelatine verflüssigt, und daß er die Fähigkeit hat. als Kohienstoffquelle besonders gut L-Arabinose. L-Rhamnose und Raffinose zu verwenden, während er Saccharose nicht verbrauchen kann.

Somit wird ersichtlich, daß der Stamm ATCC 31666 ein neuer Stamm ist. der sich von Streptomyces filipinensis und Streptomyces gannmycicus, denen er am ähnlichsten ist, unterscheidet

Der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm wurde als Streptomyces sp. OFR 1022 bezeichnet und bei der American Typ Culture Cellection. 12301 Parlawn Drive. Rockville, Maryland 20852. USA, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31666 hinterlegt

Für die vorliegende Erfindung ist es also wesentlich. Streptomaces sp. ATCC 31666 zu verwenden. Die Kultivierung dieses Stammes kann nach üblichen Kultrvierungsverfahren erfolgen, und zwar am besten in einem flüssigen Kulturmedium mittels einer Schüttelkul-

tür oder einer belüfteten gerührten Kultur.

Eine Reihe bekannter Nährmittel für Actinomycetes kann zur Kultivierung dieses Stammes verwendet werden. Nährmittel, die als Kohlenstoffquelle verwendet werden können, schließen Glucose, Saccharose, Glycerin, Maltose, Dextrin, Stärke, Sojabohnenöl. Bauinwollsamer.öl und dergleichen ein. Nährmittel, die als Stickstoffquelle verwendet werden können, schließen Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Baumwollsamenmehl, Hefe, Fischmehl, Maismaische, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Hafermehl, Kaseinhydrolysat, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergleichen ein. Anorganische Salze schließen Magnesiumsulfat, Phosphorsäuresalze, Kaliumcarbonat und dergleichen ein.

Notwendigerweise oder gewünschtenfalls kann man zu dem Kulturmedium eine geringe Menge eines Metallsalzes und geeignete Mengen an Aminosäure, wie rt-Aminoadipinsäure, Natriumthiosulfat, Natriumdithio-

'* p|.,_n;_n I Ol,„„..l„ |_n;_n Α «.»!»Im ,,».4 ΛΊ·-η,*1*>η iirtA Mil, UIJVIII, !_.-I IIV.IIJT ICIf Hill, /-1IgMIIII UIIU Ulllltlllll UItU Diamine, wie 1,3-Diaminopropan, 1,3-Diamino-2-hydroxypropan. Polyamine, wie Spermidin und dergleichen zugeben. Im Falle einer Flüssigkultivierung kann man als Entschäumungsmittel Silikon, Pflanzenöl, oberflächenaktive Stoffe und dergleichen zugeben.

Der pH des Kulturmediums liegt im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 8,0 und am besten bei etwa 6,0 und die Kultivieningsteniperatur liegt bei etwa I5"C bis etwa 46°C und vorzugsweise etwa 37°C. Die maximale Produktionsmenge an dem gewünschten Cephamycin C wird gewöhnlich in einem Zeitraum von 72 bis 96 h erhalten. Zum Beispiel kann man bei einer Kultivierung in einem 5-l-Fermentator eine Menge von etwa 2 mg/ml Cephamycin C ansammeln. Das Cephamycin C liegt hauptsächlich in dem flüssigen Teil der Kulturlösung vor, weil es gut in Wasser löslich ist.

Nach Beendigung der Kultivierung werden die Mycele und andere Feststoffe durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt, und das in dem Filtrat vorhandene Cephamycin C wird in einfacher und üblicher Weise isoliert unter Anwendung üblicher physikalischer und chemischer Trennmethoden. Zur Reinigung kann man eine Reihe von Adsorbewfien, wie Ionenaustauschharze, Kieselgel und Aktivkohle, verwenden. Beispiele für Ionenaustauschharze sind saure Kationanaustauschharze und basische Anionenaustauschharze. Stark basische Anionenaustauschharze werden zweckmäßig verwendet. Typische Beispiele sind Diaion PA 406, Dowex 50W χ 4 oder Dowex 1 χ 2.

Das auf dem Adsorptionsmittel adorbierte Cephamycin C wird mit Wasser, Kochsalzlösung oder einer Methanol-Wasser-Mischung, einer n-Butanol-Wasser-Mischung, einer Aceton-Wasser-Mischung oder dergleichen eluiert

Zur Reinigung von Cephamycin C kann man Chromatografie unter Verwendung von Kieselgel oder Avicel anwenden.

Durch eine geeignete Kombination der vorerwähnten Reinigungsverfahren und durch Wiederholung derselben kann man reines Cephamycin C erhalten.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des erfindungsgemäß hergestellten Cephamycins C sind die folgenden:

(1) Aussehen: weißes Pulver

(2) Spezifische Drehung:

[«]? =221° (C=OAH₂O)

(3) Löslichkeit:

löslich in Wasser, kaum löslich in Äthanol und wenig löslich in Dimethylsulfoxid.

(4) Farbreaktion:

positiv gegenüber Ninhydrin-Reaktion und Jod-Reaktion und negativ gegenüber Ferridchlorid-Reaktion.

(5) Dünnschichtchromatografie (TLC):

Die Entwicklung wurde unter Verwendung einer Lösung von n-Butanol zu Essigsäure zu Wasser = 2:1:1 (V/V) auf einer dünnschichtchromatografischcn Kieselgelplatte GF 254 vorgenommen.
Rf = 0,2

(6) UltraviolettAbsorptionsspektrum (UV):

In Fig. 1 wird das Spektrum in Kurve (a) (Lösungsmittel HjO) und Kurve ^(Lösungsmi! el 0,1 N HCl) gezeigt. Die Maximalabsorption und tier l^ in jedem Lösungsmittel wird in Tabelle

Tabelle .1
lösungsmittel

Maxlmalübsorptlon (rruim)

-Wen

H₂O

0.1 N HCI

240
265
245
266

127

105

(7) Infrarotabsorptionsspektrum (IR):

Das IR-Spektrum (KBr-Tablette) wird in Fig. 2 gezeigt.

(8) Kernmagentisches Resonanzspektrum (NMR):

is Das NMR-Spektrum wird in F i g. 3 gezeigt, wobei

D2O als Lösungsmittel und DSS als interner Reagensstandard verwendet wurde und die Frequenz 60 MHz betrug.

(9) Aminosäureanalyse:

4(1 Die Analyse nach einer Hydrolyse mit 4 N HCl bei

11O⁰C nach 4 h bestätigte, daß sich Λ-Aminoadipinsäure und Glycin gebildet hatten.

Das antimikrobielle Spektrum gegenüber verschiedenen Mikroorganismen von erfindungsgemäß hergestelltem Cephamycin C wird nachfolgend in Tabelle 4 anhand der minimalen Inhibierungskonzentrationen (MIC) gezeigt.

50 Tabelle 4	Testorganismus	MIC(ug/ml)
Versuch
Nr.	Bacillus subtllis PCI 2Ί9	15,6
	Staphylococcus aureus
55 ₂	FDA 209P	250
	Staphylococcus aureus
3	Newman	250
	Sarclna lutea PCI 1001	15,6
4	Salmonella typhi 0-901
60 ₅	NCT 8393	3,9
	Proteus vulgaris HD OX-19	7,8
6	Proteus mlrabllis 1287	7,8
7	Escherichla coll NIHJ	15,6
8

Diese physikalischen und chemischen Eigenschaften unter Anümikroben-Spektrum sind in guter Übereinstimmung mit dem bekannten Cephamycin C, z. B. mit

Il

dem. «as in der JA-OS 3286/1971 beschrieben wird.

Nachfolgend wird die Erfindung beispielhaft be schrieben. Alle Prozente sind auf das Gewicht bezogen.

Beispiel I

Streptomyces sp. ATCC 31666 das auf einem Hafermehl-Agaf-Medium inkubiert worden war, wurde auf einem flüssigen Kulturmedium, enthaltend 3% Stärke, 0,5% Saccharose, 1% Sojabohnenmehl und 0,3% Trockenhefe, mit einem pH von 7 inokuliert und 48 h bei 37°C geschüttelt unter Erhalt einer Saatkiiltiirlösung.

In einer 30-l-Ferinentator wurden 20 1 eines Kultur mediums vorgelegt, das 3% Stärke, 1% Saccharose, 2% Baumwollsanienmehl, 1% Trockenhefe, 0.05% Magnesiumsulfat, 0,02% Kaliumdihydrogenphosphat. 0.05% Dinatriummonohydrogenphosphat und 0.05% Silikon als Entschäumungsmittel enthielt. Vorher war bei einem Nach Beendigung der Kultivierung wurde ^ie Kulturlösung zentrifugiert und die Mycele vom Filtrat getrennt, wobei man 18 I Filtrat erhielt, das auf pH 7 bis 8 eingestellt und auf 3 1 Diaion PA 406 adsorbiert wurde. Dann wurde es mit einer wäßrigen 0,6 M Natriumchloridlosung eiuiert, wobei man 2 I einer antimikrobiellen aktiven Fraktion erhielt. Diese Fraktion wurde unter vermindertem Druck bei etwa 3O⁰C konzentriert. 200 ml der konzentrierten Lösung wurden über 400 ml Kieselgel ODS geleitet und dann wieder konzentrier.. Die so konzentrierte Lösung wurde einer Umkehrphasenchriimatografie mit 0.01 M Essigsäure über einer 5,35 cm Durchmesser χ 120 cm langen Kieselgel-ODS-Säule unterworfen.

Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet, wobei man 18 g eines weißen, pulvrigen Cephamycon C erhielt. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der erhaltenen Verbindung wurden untersucht und stimmten mit den vorher

obenerwähn.e Saatkulturlösung in einer Menge von 1% gegeben unüdas Ganze wurde unter Belüftung bei 37'C inkubiert. Die Menge der zugeführten Luft betrug 20 l/Min, und die Anzahl der Drehungen des Propellerrührers 300 UpM.

Nach 90stündiger Kultivierung erreichte die Menge an gebildetem Cephamycin C 2 mg/ml. Dies wurde durch Hochgeschwindigkeits-Chromatographie unter den folgenden Meßbedingungen festgestellt:

Beispiel 2

Pumpe:

(Japan Waters Co., Ltd., 6000 A-Typ) Injektor:

(Japan Waters Co. Ltd. U6K-Typ) Detektor:

(Shimazu Seisakusho Ltd. SPD 1) Säule:

(Japan Waters: Mikro-Bandapack C-18,

4 mmid χ 30 cm)
Mobile Phase:

0,01 M-Essigsäure
Fließgeschwindigkeit 2 ml/Min. Nachweis:

UV 254 nm 0,16 AUFS
Aufzeichnungsgeschwindigkeit:

0,5 cm/Min.

Streptomyces sp. ATCC 31666 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel I kultiviert und die Kulturbrühe wurde filtriert, wobei man 20 1 Filtrat erhielt. Das Filtrat wurde über 1,5 1 Diaion PA 406 Ct-Typ adsorbiert. Dann wurde die Säule mit dem vierfachen Säulenvolumen an entionisiertem Wasser gewaschen und mit 1 M wäßriger NaCI-Lösung tluiert, wobei man 2,5 I tiner antimikrobiellen aktiven Fraktion erhielt. Diese Fraktion wurde mit 4 N Chlorwasserstoffsäure auf pH 1 eingestellt und dann wurde NaCI bis zu einer Endkonzentration von 4M (Mol/l) zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Säule (21) Diaion HP 20 absorbiert und mit Wasser eiuiert. Das gefundene Cephamycin C wurde dann eiuiert, nachdem der pH des Eluats etwa 4 erreichte. Anschließend wurde das Eluat gesammelt bis zu einer Gesamtmenge von 1.5 1 und gefriergetrocknet, wobei man 24 g eines weißen Pulvers von Cephamycin C erhiel'

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der erhaltenen Verbindung wurden untersucht und stimmten gut mit der in Beispiel 1 gefundenen überein.

Die Produktivität des neuen Stammes ATCC 31666 an Cephamycin C wurde mit den bekannten Stämmen, die in verschiedenen Berichten beschrieben werden, verglichen und in Tabelle 5 wird der Vergleich gezeigt.

Tabelle 5

Stamm

Ausbeule an	Literatur
Cephamycin C
in der Brühe
40 mg/1	US-PS 38 65 693
200 mg/1	Japanische Patentanmeldung
	96 294/75
350 mg/1	Japanische Patentanmeldung
	1 10 097/76
494 mg/1	US-PS 39 77 942
1291 mg/1	US-PS 37 70 590
530 mg/1	Japanische Patentanmeldung
	49 071/77
2000 mg/1	erfindungsgemäß

Streptom>ces jumonjlensis Streptomyces lactamgenes

Streptomyces sp. P 6621

Streptomyces clavuligerus Streptomyces lactamgenes Streptomyces lactamgenes

Streptomyces sp. OFR 1022

Aus Tabelle 5 wird ersichtlich, daß Streptomyces sp. ATCC 31666 im Vergleich zu den bekannten Streptomyces-Stämmen eine sehr hohe Ausbeute an Cephamycin C liefert.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

t. Verfahren zur Herstellung von Cephamycin C durch Kultivieren eines Streptomyces-Stammes in einem Kulturmedium, Ansammeln des Cephamycin C in diesem und Gewinnen des Cephamycin C aus diesem, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces-Stamm Streptomyces sp. ATCC 31666 kultiviert

Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. ATCC 31666 bei 15 bis 46° C kultiviert