DE3332593A1

DE3332593A1 - Neues antibiotikum und verfahren zu dessen herstellung

Info

Publication number: DE3332593A1
Application number: DE19833332593
Authority: DE
Inventors: Masashi Awata; Mitsuo Shizuoka Hayashi; Naoki Mutoh; Hideo Sakakibara; Shuzo Mishima Shizuoka Satoi; Masaki Takada
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1982-09-09
Filing date: 1983-09-08
Publication date: 1984-05-03
Also published as: GB8324134D0; GB2127019B; JPS5945890A; US4517296A; FR2532950B1; GB2127019A; CH658861A5; FR2532950A1; JPH0133105B2

Description

Hamburg, den 06.09.1983 272583 (KP-5913)

Priorität: 9- Sept. 1982

Japan Patent-Appl. No. 57-157921

Anmelder;

Toyo Jozo Kabushiki Kaisha 632-1, Mifuku

Ühito-cho, Tagata-gun Shizuoka-ken

Japan

Neues Antibiotikum und Verfahren zu dessen Herstellung

Die Erfindung betrifft eine neue antibiotisch wirksame Verbindung, Acmimycin genannt, sowie deren Säureadditionssalze und ein Verfahren zu deren Herstellung.

Es wurde gefunden, daß der !Mikroorganismus der Art Actinomycetes, bezeichnet als AC 4559, der aus einer von einem Acker in Akiyoshi-machi, Miya-gun, Yamaguchi-ken, Japan, stammenden Bodenprobe isoliert worden war, eine

gegen grampositive und gramnegative Bakterien aktive Verbindung produziert. Diese Verbindung wurde ,aus der Kulturbrühe isoliert und gereinigt, und es wurde gefunden, daß es sich bei dieser Verbindung um eine neue antibiotisch wirksame Verbindung handelt.

Gegenstand der Erfindung ist diese in Anspruch 1 gekennzeichnete neue Verbindung, die Acmimycin genannt wurde, und die gegen grampositive und gramnegative Bakterien wirksam ist.

Die Erfindung umfaßt auch das in den Ansprüchen 2 und 3 gekennzeichnete Verfahren zur Herstellung dieses neuen Antibiotikums Acmimycin sowie dessen Säureadditionssalze.

Das Antibiotikum Acmimycin produzierende Mikroorganismen gehören zur Gattung Streptomyces; vorzugsweise wird dazu die Art Streptomyces AC 4559 verwendet.

Die taxonomischen Eigenschaften der Art AC 4559 sind die folgenden:

a. Morphologische Merkmale:

Die folgenden Merkmale wurden auf einem Stärke-anorganisches Salz-Agar-Medium (ISP Medium 4) (Int. J. System. Bacteriol., 16, 313 - 340 (1966)) beim Züchten während 10 bis 14 Tagen bei 27°C beobachtet. Annähernd die gleichen morphologischen Beobachtungen wurden auf Hafermahl-Agar-Medium (ISP Medium 3) und Benett ¹S Agar-Medium gemacht .

Das Substrat-Myzel ist gekrümmt und weist verzweigte Wuchsform auf; der Durchmesser beträgt 0,4 χ 0,5 ,u. Keine Teilung des Myzels bzw. Sporulation.

Das Luftmyzel, das auf dam Substrat-Myzel aufwachst, ist gekrümmt und mit einfacher Verzweigung ausgebildet; der Durchmesser beträgt 0,4 χ 0,6 ,u ; es werden zahlreiche kettenförmig aneinander gereihte Sporen gebildet. Die Sporenketten sind spiralförmig mit 2 bis 4 lockeren Windungen. Die Sporenoberfläche ist glatt; die Sporen sind ovalförmig oder haben die Form von kurzen Stäbchen; die Abmessungen betragen 0,4 bis 0,6 χ 0,6 bis 1,0 ,u.

Keine Bildung von begeißelten Sporen und Sporangien.

b. Wachstumsmerkmale auf verschiedenen Medien:

Die Beobachtungen, die an Kulturen bei 27 C über 14 Tage auf verschiedenen Medien gemacht wurden, sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Die Farbindikation erfolgte mittels Klassifikation gemäß "Color Harmony Manual, 4.Edition, 195 8 (Container Corp. of America) ".

c. Physiologische Merkmale:

1) Wachstumstemperatur: 16 bis 33°C;

2) Gelatine verflüssigung: positiv ;

3) Stärkehydrolyse: positiv ;

4) Magermilch-Koagulation: negativ, Magarmilch-Peptonisation: positiv;

5) Bildung von Melanin-artigern Pigment: negativ auf

Tyrosin-Agar-Medium und Pepton-Hefee xtrakt-Eise n-Agar-Me di um.

Tabelle

Me di mn

Wachstum

Substrat-Myze1

Luftmyzel Lösliches Pigment

Saccharose-Nitrat-Agar

gering bis farblos sehr gering gering bis sehr
gering: wassertrüb
(18 ge ~18 ig)

keines

Glucose-Asp ar agin-Ag ar

gering bis hell-elfenbein gering: wasserhell keines

sehr gering (2 ca) bis hell- (18 ec)

weizenfarben (2 ea)

Glyzerin-Asparagin-

gering bis farblos bis sehr gering hell-elfenbein (2 ca)

keines ke i ne s

Stärke-anorganisches SaIz Agar

gut

bambusfarben (2 fb) gut: wassertrüb
(18 ig)

keines

Tyrosin-Agar

massig

he 11- be r ns te i n-(3 ic) gering: weiss
(a)

keines

GO OJ to

cn co co

Tabelle 1 (Forts.)

Medium

Wachstum

Substrat-Myzel

Luftmyzel

Lösliches Pigment

Hafermehl-Agar

massig

hell-elfenbein (2 ca) bis hellweizenfarben (2 ea) massig: wassertrüb keines (18 ig - 18 ga)

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

gut

zimtfarbeη (3 le) bis hell-bernsteinfarben (3 ic)

gering: weiss
(a)

keines

Nähragar

sehr gering

hell-elfenbein (2 ca) bis he 11-weizenfarben (2 ea) keines

keines

Erne rson's-Agar

gut

maisfarbeη (2 hb) sehr gering: weiss keines (a)

Bennett¹s-Agar

gut

top as farbe η (3 ne) massig: wassertrüb keines (18 ig - 18 ge)

CO GJ CO KJ

d. Assimilation von Kohlenstoff-Quallen:

(+: positiv; -: negativ)

L-Arabinose: - D-Mannitol:

D-Fructosa: - Ra^lf finose:

D-Glucose: + L-Rhamnose:

Saccharose: - D-Xylose: + Inosit:

e. Komposition der Zellwände:

Mittels der Mathode von Becker und Mitarb. (Appl. Microbiol., 12, 421 bis 423 (1964)) wurde LL-Diaminopimelinsäure gefunde η.

Anhand der wie zuvor angegebenen taxonomischen Eigenschaften wurde die Art AC 4559 als zur Gattung Streptomycas gehörend bestimmt im Hinblick darauf, daß von echtem Substrat-Myzel Luftmyzel gebildet wurde, daß Ketten aus zahlreichen Sporen vorhanden waren, daß LL-Diaminopime linsäure enthalten war und daß keine Bildung von be geißelte η Sporen und Sporangium erfolgte .

Es wird aus diesen Gründen die Art AC 4559 als Streptomyces sp. AC 4559 bezeichnet. Dieser Mikroorganismus wurde hinterlegt beim Fermentation Institute, Agency of Industrial Science and Technology, MITI, Japan, und hat die Hinterlegungs-Nummer No. FERM P-6645 erhalten.

Da die taxonomischen Eigenschaften von Streptomyces ganz allgemein relativ leicht mutieren, sind für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens als Mikroorganismen auch solche Mutanten brauchbar, die durch natürliche oder künstliche Mutationen, beispielsweise durch UV-Strahlung oder sonstige energiere 1 ehe Strahlung oder

■2·

durch Behandlung mit Mutagenen, wie beispielsweise N-Methy1-N-nitrosoguanidin oder Ethylmethansulfonat, erhalten werden.

Das Verfahren zur Herstellung der neuen antibiotisch wirksamen Verbindung Acmimycin wird nachstehend beispielsweise veranschaulicht.

Eine das Antibiotikum Acmimycin produzierende Mikroorganismenart, die zur Gattung Streptomyces gehört, wurde in einem geeigneten Medium gezüchtet. Bevorzugt verwendet man ein für Streptomycas übliches Medium. In einem solchen Medium werden Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, assimilierbaren Stickstoff und gewünschtenfalls anorganische Salze verwendet. Beispiele für Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff sind Glucose, Fructose, Galactose, Mannose, Glyzerin, Melassen, Stärke, Dextrin oder eine organische Säure. Beispiele für Quellen für assimilierbaren Stickstoff sind organische Stickstoff enthaltende Verbindungen, wie beispielsweise Pharma-Medien, Pepton, Fleischextrakt, Hsfeaxtrakt, Trockenhefe, Sojabohnenpulver, Maisquellwasser, Baumwollsaatkuchen, Kasein, Sojabohnenprotein-Hydrolysat, Aminosäuren oder Harnstoff,sowie anorganische Stickstoff-Verbindungen, wie beispielsweise Nitrat oder Ammoniumverbindungen; die genannten Substanzen können auch in beliebiger Kombination benutzt werden. Gewünschtenfalls kann man anorganische Salze, wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Magnasiumsalze, zum Beispiel Phosphate, zugeben. Weiterhin können das Wachstum fördernde Substanzen und Spurannährstoffe beigegeben werden.

Die Fermentation wird gebräuchlicherweise unter Bewegung, Schütteln bzw. Rühren, und/oder Belüften durchgeführt. Bei der Produktion in industriellem Maßstab wird vorzugsweise nach dem Submersverfahren gearbeitet. Dar pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise neutral oder laicht sauer eingestellt. Die Zuchtungsteraperatur wird zweckmäßig bei 22 bis 32°C gehalten. Die Kultur kann gewöhnlich in 2 bis 5 Tagen zur Reife gebracht werden, und der Vermehrungsvorgang wird vorteilhaft dann unterbrochen, wenn die maximale Produktion an Antibiotikum erreicht ist. Die jeweiligen speziellen Bedingungen hinsichtlich der Zusammensetzung des Nährmediums, der Einstellung des pH-Wertes, dar Rühr- bzw. Bewegungsgeschwindigkeit und der Menge an zwecks Belüftung zugeführter Luft bzw. Sauerstoff werden selbstverständlich je nach Natur, Zustand und Kondition der benutzten Mikroorganismus-Art ausgewählt und geregelt.

Es können erforderlichenfalls Antischäumungsmittel, wie beispielsweise Siliconöl, pflanzliches öl, oder Tenside als oberflächenaktive Mittel beigegeben werden.

Das gebildete Antibiotikum sammelt sich vorwiegend in der Kulturbrühe und kann vorteilhafterweise aus dem Kulturfiltrat isoliert werden,das man durch Filtrieren der Kulturbrühe gewinnt unter Verwendung von Filterhilfen, wie beispielsweise Diatomeenerde, die als Handelsprodukt beispielsweise unter den Handelsnamen Gelite, Parlite, Hyflo-supercel erhältlich ist. Man kann die Kulturbrühe auch durch Abzentrifugieren von dem Myzel trennen und so das Kulturfiltrat erhalten.

Durch Anwendung des Aminoglycosid-Antibiotikum-Isolations Verfahreη kann man aus dem Kulturfiltrat das erfindungsge-

mäße Antibiotikum isolieren. Man kann beispielsweise chromatographisch unter Verwendung von Kationenaustauscherharz oder_oeinem sonstigen Adsorbens die Isolierung vornehmen. Zweckmäßig arbeitet man dabei so, daß man das Kulturfiltrat auf pH 7 einstellt und dieses an einem schwach sauren Kationenaustauscherharz, wie es beispielsweise unter den Haneisbezeichnungen Ambe rute IRC-50 oder CG-50 im Handel erhältlich ist, chromatographiert. Man verwendet besonders vorteilhaft ein Ammoniumgruppen aufweisendes Ionenaustauscherharz auf Basis von Cellulose, wie beispielsweise CM-Callulose, oder einen Ionenaustauscher auf Basis von Polysaccharid, beispielsweise ein Produkt, das unter der Bezeichnung Sephadex bekannt ist, wie beispielsweise das Produkt mit dem Handelsname η CM-Sephadex. Das adsorbierte Antibiotikum wird mittels eines schwach basischen Eluierungsmittels, wie beispielsweise verdünntem wässrigem Ammoniak eluiert, wobei man, sofern notwendig, mit veränderlichen Konzentrationen eines solchen Eluierungsmittels arbeitet.

Die gewonnenen eluierteii Fraktionen, die diese erfindungsgemäße Verbindung enthalten, werden kombiniert, konzentriert und lyophilisiert, und man gewinnt das antibiotisch wirks ame Acmimy ei η.

Eine weitere Reinigung kann durch Wiederholung der zuvor angegebenen chromatographischen Behandlungen erzielt werden.

Da es sich bei der antibiotisch wirksamen erfindungsgemäßen Verbindung, dem Acmimycin, um ein basisches Antibiotikum handelt, lassen sich dessen Säureadditionssalze herstellen. Beispiele für solche Salze sind die pharmazeutisch unbedenklichen, nicht-toxischen Salze, beispielsweise anorga-

nische Salze, wie Hydrochloric!, Sulfat oder Phosphat, oder organische Salze, wie Acetat, Propionat,-Malat, Succinat, Tartrat, Citrat, L-Glutamat oder L-Aspartat.

Phy si co-ehe mi s ehe Merkmale und biologische Eigenschaften werden nachfolgend veranschaulicht:
I. Physico-chemische Merkmale

(1) Elementar analyse ( C, _Η__βΝ_Ο_ * r H-O ) :

	C%	H%	N%
ge f unde η:	48,36	7,32	7,86
berechnet:	48,26	7,77	7,51

(2) Molekulargewicht: 346 (Molekülion-Spitze aus dem

Massenspektrum)

(3) Schmelzpunkt: 123°C (Zers.)

(4) Spezifische Drehung: /"öCj^⁴ = +44,2° (c=l; H₃O)

(5) UV-Spektrum: in H₃O, kein spezifisches Absorptions

maximum bei 220 - 360 nm, End-Absorption

(6) IR-Spektrum (KBr) : Dieses ist in Fig. 1 veranschau

licht. Es sind auf der Abszisse die

Wellenzahl in cm und auf der

Ordinate die Durchlässigkeit in %

abgetragen.

3400, 2900, 1675, 1455, 1350, 1235,

1060 cm"¹

(7) NMR-Spektrum (¹³C, in D₃O, 25 MHz, interner Standard:

Dioxan):

150,5 , 103,3 , 95,3 , 89,4 , 71,6 , 70,2 , 66,8 , 66,2 , 62,0 , 60,7 , 59,4 , 56,1 , 31,5 , 21,7 ppm

(8) NMR-Spektrum (¹H, in D₃O, 100 MHz, interner Standard:

DSS) :

Dieses NMR-Spektrum ist in Fig. 2 dargestellt. Die chemische Verschiebung ist in S , und zwar in ppm, angegeben.

(10) Farbreaktion:

(9) Löslichkeit: löslich in Wasser,

wenig löslich in niedrigem Alkohol, wie beispielsweise Methanol, unlöslich in Aceton, Benzol und Ethy-lacetat

positiv: Ninhy-drinreaktion und

Entfärbung von Kaliumpermanganat

negativ: Elson-Morgan-Reaktion und Sakaguchi-Reaktion

(11) Natur: basisch

(12) Farbe: fahlgelb

(13) Silikagel-Dünnschichtchromatographie (Merk,

Art.5735):

Rf = 0,73 /""Chloroform-Methanol-14% wassr.Ammoniak (1:2: I)J

Rf = 0,77 /""Chloroform-Methanol-2 8% wässr.Ammoniak (2 : 3 : 2) 7

Verglichen mit bekannten Antibiotika ist die erfindungsgem'iße Verbindung, das Acmimycin, ähnlich dem Actinospectacin (Spectinomycin) [_ Antibiot. & Chemoth., 11, 118 - 122 (1961), Japan. Pat.Publ. No. 39-2993, Ungaprüfte Japan. Pat.Publ. No. 48-18489_7· Man erkennt anhand der zuvor angegebenen physico-chemischen Eigenschaften, daß es sich bei dem Acmimycin um ein neues Antibiotikum handelt. Die planare chemische Struktur ist anscheinend die folgende

H₃CHN

OH NHCH. 0 C H₃

II. Biologische Eigenschaften:

(1) Antibakterielles Spektrum:

In Tabelle 2 ist die Minimum-Inhibierungskonzentration (MIC) ( ,ug/ml ) der erfindungsgem antibiotisch wirksamen Verbindung, genannt
Acmimycin, veranschaulicht, wie sie mit Hilfe der Agar-Verdünnungsmethode ermittelt wurde.

Eine beispielsweise Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Verbindung wird nachfolgend veranschaulicht.

Tabelle 2

Test-Organismus ' MIC

Staph.aureus ATCC 65 38 P

MS 27

0119

" epidermidis sp-al-1 Strept. pyoge-nes N.Y. 5 Bacillus subtilis ATCC 6633 E. coli NIHJ--JC2 E. coli W 3630 E. coli W 3630 R G N 14 Cit. freundii G N 346 Kleb, pneumoniae ATCC 10031 Salm, enteritidis Gaertner Shigella sonnei E 33 Proteus morganii 0239

rettgeri ACR Ente rob ac. aerogenes 0655

" cloacae G N

Se rrati a marcescens Pseudo, aeruginosa IAM 1095

	100
	100
>	100
	50
	3.1
	25
	50
	25
>	100
>	100
	12.5
	25
	25
^>	100
>	100
	50
	25
	100

Be i sp ie 1

Ein in 500 ml-Erlenmeyerkolben befindliches Medium ( pH 7, 100 ml χ 10 Kolben), das 1% Glucose, 1% Dextran, 0,5% Kaseinhydrolysat, 0,5% Hefaextrakt und 0,1% Calciumcarbonat enthielt, wurde 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert, In jeden Kolben wurden Sporen von Streptomyces sp. AC 4559 FERM P-6645 eingeimpft, und es wurde 72 Stunden lang bei 30 C unter Hin- und Herbewegen ge:
wurde die Saatkultur hergestellt.

30 C unter Hin- und Herbewegen gezüchtet. Auf diese Weise

Ein flüssiges Medium (pH 7,0, 20 Liter), das 5% Dextrin, 0,5% Glucose, 3% Sojabohnenpulver, 0,7% Calciumcarbonat und 1,3 ppm Kobaltchlorid enthielt, wurde in einem 30 Liter Fermenter mit Dampf sterilisiert.

Es wurde mit Saatkultur (1 Liter) beimpft, und dann wurde 96 Stunden lang bei 30°C unter Rühren mit 200 UpM und Belüften mit 15 Liter/Min, fermentiert; so wurde die Kultur lösung (19 Liter) gewonnen.

Das KulturfiItrat wurde auf eine Säule aus vernetztes Polystyrolgerüst mit Ammonium-Endgruppen aufweisendem Ionenaustauscherharz (Handelsprodukt der Firma Rohm & Haas Co., mit der Handelsbezeichnung Amberlite IRC-50) ( 1 Liter ) aufgegeben, mit Wasser gewaschen, und mit 2 η wässrigem Ammoniak ( 3 Liter ) eluiert. Das gesamte Eluat wurde im Vakuum bis auf 10 ml konzentriert, der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt, und dann wurde das Konzentrat auf eine aus vernetztes Polysacchari dge rüst vom Carboxymethyl-Typ mit Ammonium-Endgruppen aufweisendem Ionenaustauscher bestehende Säule (Handelsprodukt der Firma Pharmacia Fine Chemicals mit der Handelsbezeichnung CM-Sephadex) (200 ml) aufgegeben.

Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und mit einem aus linear abgestuftem wässrigem Ammoniak von O - 0,1 η Konzentration bestehenden Eluie rungsmitte 1 ( 2 Liter ) eluiert. Das Eluat wurde zu je 20 ml Portionen fraktioniert und auf Silikagel (Merck, Art. 5 735) mittels Dünnschicht Chromatographie unter Verwendung von Chloroform-Methanol-14% wässr. Ammoniak (1:2:1) als Laufmittel untersucht. Der Nachweis des Antibiotikums Acmimycin erfolgte mittels Ninhydrin-FArbreaktion. Die Fraktionen No; 35 bis 45, die das Acmimycin enthielten, wurden gesammelt, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, und auf diese Weise wurde die erfindungsgemäße antibiotisch wirksame Verbindung, das Acmimycin, gewonnen (100 mg) .

Leerseite

Claims

Pate ntansp rü ehe

1. Antibiotisch wirksame Verbindung der Formel

H₃CHN

NHCH:

OCH,

sowie deren Säureadditionssalze .

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der in Anspruch 1 angegebenen Formel sowie eines Salzes dieser Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß man einen diese Verbindung produzierenden Mikroorganismus der Gattung Streptomycss bis zur Antibiotikum-Bildung züchtet, aus der Kulturbrühe die antibiotisch wirksame Verbindung isoliert und diese gewünschtenfalls zu einem Säureadditionssalz umsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Streptomyces sp. AC 4559 FERM BP-426 verwendet.