CN106053450A - 一种优化的体外抗过敏作用检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及将透明质酸酶水解透明质酸产生N‑乙酰葡萄糖胺还原末端和Elson‑Morgan法相结合，优化了传统的透明质酸酶体外抑制率实验，对酶解条件进行了优化等，建立一个快速、低成本、重现性好的抗过敏作用的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种优化的体外抗过敏作用检测方法。
背景技术
透明质酸酶与血管透过性及炎症发生有关，参与组织炎症过程，还参与I型过敏反应。有研究表明，透明质酸酶活性和肥大细胞游离组胺抑制活性有强的相关性[Yoo,Effects of allergy-related drugs on hyaluronidase action and histamine by ratperitoneal mast cell,Taehan Saengri Hakboeehi 1988,22(2259-72).]。
有研究报道各种影响肥大细胞释放组胺的药物均能调节透明质酸酶的活性[Kakegawa H ,, Matsumoto H , Satoh T. Activation of Hyaluronidase by MetallicSalts and Compound 48/80,and Inhibitory Effect of Anti-allergic Agents onHyaluronidase[J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1985, 33(2):642-646.]。也有报道DSCG、BPS、Tranilast、traxano等抗过敏药物有强抑制透明酸酶活性的作用[Koda,AetalJAllergyClinl immunol,1976 V0157 396.]。
透明质酸酶是参与炎症反应的酶，抑制透明质酸酶活性的物质也具有抗过敏、抗炎作用[Asada M, Inoue M, Nakagomi K H S, et al. Inhibitory effect of alginicacids on hyaluronidase and on histamine release from mast cells.[J]. BiosciBiotechnol Biochem, 1997, 61(6):1030-1032.]。基于该机制，为能快速检测物质的抗过敏活性，Reissig J L et al.[ Reissig J L, Storminger J L, Leloir L F. Amodified colorimetric method for the estimation of N-acetylamino sugars.[J].Journal of Biological Chemistry, 1955, 217(2):959-966.]在Morgan W T, Elson LA[Morgan W T, Elson L A. A colorimetric method for the determination of N-acetylglucosamine and N-acetylchrondrosamine.[J]. Biochemical Journal, 1934,28(3):988-995.]提出方法的基础上进行改进，最终构建出了优化的透明质酸酶体外抑制率实验，以透明质酸酶抑制率作为抗过敏评价标准，透明质酸酶抑制率越高，抗过敏作用也就越强。
目前已报道的各种测定透明质酸酶活性的方法有：经典的浊度、粘度、比色法和较新的，如分光光度法、荧光、辐射、琼脂糖板、酶联免疫吸附法、高效液相色谱、明胶酶谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法等方法。浊度法是基于大分子量的透明质酸盐于酸化血清中发生沉降现象建立起来的，但这种方法需要大量的酶，且测量结果相对不准确。酶联免疫吸附试验、聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础的方法，明胶酶谱分析是半定量的、高度敏感，但需要专门的试剂并需要很长的时间，很难作为常规检测。而比色法是以摩根-埃尔森反应为基础，Reissig J L et al.改进后的方法[ Reissig J L, Storminger J L, Leloir L F. Amodified colorimetric method for the estimation of N-acetylamino sugars.[J].Journal of Biological Chemistry, 1955, 217(2):959-966.]，具有最真实可靠的化学计量，在这些方法中被广泛采用。因此，对比色法进行优化，改善有色产物是弱荧光等问题，提高方法的重现性和灵敏度，构建一个操作简便、快速、成本低的评价体系是十分有必要的。
透明质酸这种带负电荷的大分子量的多聚糖由β-D-葡萄糖醛酸-（1→3）-β-乙酰氨基葡萄糖双糖单位通过1→4键连接组成。透明质酸水解酶根据其水解机理通常分为三种：透明质酸－4－聚糖水解酶(睾丸、溶酶体和毒液透明质酸酶，EC 3.2.1.35)，透明质酸－3－聚糖水解酶(水蛭透明质酸酶，EC 3.2.1.36)，透明质酸裂解酶(细菌的透明质酸酶，EC4.2.2.1)。通过牛睾丸透明质酸酶的酶促降解透明质酸形成的一个带有N-乙酰-D-氨基葡萄糖还原端的四糖[Cramer J A, Bailey L C, Bailey C A, et al. Kinetic andmechanistic studies with bovine testicular hyaluronidase.[J]. Biochimica EtBiophysica Acta, 1994, 1200(3):315-21.]。
Beau et al.描述了摩根–埃尔森反应在碱性条件下产生了色原I（α-排列）和II（β-排列）[Beau J M, Rollin P ,, Sina? P ,. [Structure of chromogen I of theMorgan-Elson reaction].[J]. Carbohydrate Research, 1977, 53(2):187-95.]。在摩根–埃尔森反应中浓盐酸和浓硫酸的混合物的后续加入导致脱水，产生色原III。Kuhn andKru ¨ger 假设这种化合物是3-乙酰氨基-5 -（1,2-二羟-乙基）呋喃[Richard K, Gerd K.Das Chromogen III der Morgan‐Elson‐Reaktion[J]. Chemische Berichte, 1957, 90(2):264-277.]。
Benson证实了这一假设通过使用H-NMR技术和N-乙酰氨基葡萄糖结合到固相证明3-乙酰氨基的存在[Benson R L. Testing proposed reaction mechanisms withcompounds bound to solid supports[J]. J.org.chem, 1975, (11):1647-1649.]。在摩根–埃尔森反应的最后一步，色原III 与对二甲氨基苯甲醛（埃利希试剂）反应形成红色产物。Muckenschnabel I et al.采用紫外-质谱研究调查的结果与所提出的机制一致[Muckenschnabel I, Bernhardt G, Spruss T, et al. Quantitation ofhyaluronidases by the Morgan-Elson reaction: comparison of the enzymeactivities in the plasma of tumor patients and healthy volunteers.[J]. CancerLetters, 1998, 131(1):13–20.]。
在呋喃2位置的醛亲电进攻，其次是脱水，产生红色的产物(l = 586 nm)，它对光线敏感，化学性质很不稳定。具有潜在抗过敏作用的物质会对透明质酸酶产生抑制作用，使其活性降低，透明质酸酶水解透明质酸产生含N-乙酰氨基葡萄糖还原末端四糖的浓度也降低。根据对透明质酸酶的抑制率来评价物质的抗过敏能力。
技术问题:本发明要解决的技术问题是针对传统透明质酸酶抑制率实验对检测生物活性物质的抗过敏作用存在，如灵敏度低、有色产物是弱荧光等问题。基于一种以比色法为基础的透明质酸酶活性测定的实验原理和方法，通过优化透明质酸酶酶解透明质酸的酶解条件，如最适pH、酶解时间和酶的添加量来提高检测效率，以此建立一个快速、简便、成本低、灵敏、重现性好的检测活性物质抗过敏作用的体系。
发明内容
本发明涉及一种体外抗过敏作用检测方法，其特征在于:
Elson-Morgan法颜色反应的测定透明质酸酶活性，对透明质酸酶的酶解过程进行优化，构建一个优化检测活性物质抗过敏作用的体系，包括以下步骤：
（1）确定透明质酸酶酶解透明质酸的最适pH值；
（2）确定透明质酸酶酶解透明质酸的酶解时间；
（3）确定透明质酸酶酶解透明质酸的较适宜的酶添加量；
（4）将优化后的最适pH值、酶解时间和酶添加量应用到检测物质的抗过敏作用方法中。
其中：
步骤1的优化方法是：透明质酸酶的最大活性在弱酸性和中性pH值下，故设置不同pH梯度进行研究，即用盐酸调整缓冲剂pH值分别为1、2、3、4、5、6、7。
步骤2的优化方法是：设置不同的时间梯度进行研究，即控制酶解反应时间分别为：20min、40min、60min、80min、100min、120min。
步骤3的优化方法是：设置不同的酶添加量梯度进行研究，即酶的添加量分别为1mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml。
步骤1、2、3中测定透明质酸酶活性的方法为：5 mg/ml的透明质酸钾储存溶液用水制备并储存在4℃。一定浓度的透明质酸酶溶液用0.02M磷酸盐缓冲液、77mM氯化钠和1mg/ml 0.01% BSA配制成的缓冲液溶解，用盐酸调节PH。取两支10ml EP管，分别标记为A（酶活组），B（酶失活组），每管分别加入100μl透明质酸酶溶液，其中A管不作处理，B管沸水浴10min。之后每管分别加入200μl蒸馏水，轻轻混匀。再在试管中添加500μl的蒸馏水、200μl的缓冲液和100μl的透明质酸钾溶液，轻轻混匀。在37℃保温一定时间。酶促反应的终止通过加入220μl碱性硼酸盐溶液，将17.3g硼酸和7.8g氢氧化钾溶于100ml水中制备硼酸溶液，终止酶促反应前向硼酸溶液中添加10% 0.8g/ml碳酸钾溶液，即为碱性硼酸盐溶液。随后在沸水浴中加热5min。然后，试管放在冷水中20min，之后加入3ml对二甲氨基苯甲醛溶液即20g对二甲氨基苯甲醛溶解在25ml浓盐酸和75ml冰醋酸的混合液中；在使用前用4倍体积的冰乙酸立即将溶液稀释。为了使反应产物最大限度地显色，试管在37℃孵育20min。在酶标仪586 nm测定有色产物的吸光度。每组重复3次，求吸光度的平均值。
步骤4的检测生物活性成分抗过敏作用的方法即：5mg/ml的透明质酸钾储存溶液用水制备并储存在4°C。一定浓度的透明质酸酶溶液用0.02M磷酸盐缓冲液、77mM氯化钠和1mg/ml 0.01% BSA配制成的缓冲液溶解，用盐酸调节pH。取四支10ml EP管，分别标记为A（对照组）、B（对照空白组）、C（试样组）、D（试样空白对照组）, 每管分别加入100μl透明质酸酶溶液，其中A、C管不作处理，B、D管沸水浴10min。之后在A、B管加入200μl蒸馏水，而在C、D管中加入200μl样品37℃孵育10min。再在每支试管中添加500μl的蒸馏水、200μl的缓冲液和100μl的透明质酸钾溶液，轻轻混匀。在37℃保温一定时间。酶促反应的终止通过加入220μl碱性硼酸盐溶液，将17.3g硼酸和7.8g氢氧化钾溶于100ml水中制备硼酸溶液，终止酶促反应前向硼酸溶液中添加10% 0.8g/ml碳酸钾溶液，即为碱性硼酸盐溶液；随后在沸水浴中加热5min。然后，试管放在冰水中冷却20min，之后加入3ml对二甲氨基苯甲醛溶液即20g对二甲氨基苯甲醛溶解在25ml浓盐酸和75ml冰醋酸的混合液中；在使用前用4倍体积的冰乙酸立即将溶液稀释。为了使反应产物最大限度地显色，试管在37℃孵育20min。在酶标仪586nm测定有色产物的吸光度。每组重复3次，以吸光度的平均值代入公式。
抑制率(%)=[(A−B)−(C−D)]/(A−B)×100
A：对照吸光度（BHT+蒸馏水+HA）；
B：对照空白吸光度（BHT沸水钝化10min+蒸馏水+HA）；
C：试样吸光度（BHT+样品+HA）；
D：试样空白吸光度（BHT沸水钝化10min+样品+HA）
该方法目的还在于让酶解产生的N-乙酰葡萄糖胺调整到一个合适的浓度，当一定浓度的活性物质对透明质酸酶产生抑制作用时，既有显著的实验现象和实验结果，又能尽可能地节约透明质酸酶的用量。从而确定较适的透明质酸酶添加量。
附图说明
下面对附图进行简要说明。
图1:pH值对酶解的影响图。
图2 :酶解时间对酶解的影响图。
图3 :透明质酸酶的添加量对酶解的影响图。
图4 :样品浓度在 2-10 mg/ml范围内的环磷酸腺苷抗过敏活性检测抑制率图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，以确定透明质酸酶酶解透明质酸的最适pH值、酶解时间和酶添加量的实验为例，说明本发明技术的具体实施方式。
运用该技术包括如下三个步骤：
实施例1：确定最适pH值
5 mg/ml的透明质酸钾储存溶液用水制备并储存在4℃。10mg/ml的透明质酸酶溶液用0.02M磷酸盐缓冲剂、77mM氯化钠和1mg/ml 0.01% BSA配制成的缓冲液溶解，并用盐酸调pH分别为1、2、3、4、5、6、7。取两支10ml EP管，分别标记为A（酶活组），B（酶失活组），每管分别加入100μl透明质酸酶溶液，其中A管不作处理，B管沸水浴10min。之后每管分别加入200μl蒸馏水，轻轻混匀。再在试管中添加500μl的蒸馏水、200μl的缓冲液和100μl的透明质酸钾溶液，轻轻混匀。在37℃保温40min。酶促反应的终止通过加入220μl碱性硼酸盐溶液，将17.3g硼酸和7.8g氢氧化钾溶于100ml水中制备硼酸溶液，终止酶促反应前向硼酸溶液中添加10% 0.8g/ml碳酸钾溶液，即为碱性硼酸盐溶液。然后，试管放在冰水中冷却20min，之后加入3ml对二甲氨基苯甲醛溶液即20g对二甲氨基苯甲醛溶解在25ml浓盐酸和75ml冰醋酸的混合液中；在使用前用4倍体积的冰乙酸立即将溶液稀释。为了使反应产物最大限度地显色，试管在37℃孵育20min。在酶标仪586 nm测定有色产物的吸光度。每组重复3次，求吸光度的平均值，比较不同pH条件下吸光度的大小。确定最适pH值为3。
实施例2：确定最适酶解时间
5 mg/ml的透明质酸钾储存溶液用水制备并储存在4℃。10mg/ml的透明质酸酶溶液用0.02M磷酸盐缓冲剂、77mM氯化钠和1mg/ml 0.01% BSA配制成的缓冲液溶解，并用盐酸调pH至3。取两支10ml EP管，分别标记为A（酶活组），B（酶失活组），每管分别加入100μl透明质酸酶溶液，其中A管不作处理，B管沸水浴10min。之后每管分别加入200μl蒸馏水，轻轻混匀。再在试管中添加500μl的蒸馏水、200μl的缓冲液和100μl的透明质酸钾溶液，轻轻混匀。在37℃分别保温20min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min。酶促反应的终止通过加入220μl碱性硼酸盐溶液，将17.3g硼酸和7.8g氢氧化钾溶于100ml水中制备硼酸溶液，终止酶促反应前向硼酸溶液中添加10% 0.8g/ml碳酸钾溶液，即为碱性硼酸盐溶液。随后在沸水浴中加热5min。然后，试管放在冷水中20min，之后加入3ml对二甲氨基苯甲醛溶液即20g对二甲氨基苯甲醛溶解在25ml浓盐酸和75ml冰醋酸的混合液中；在使用前用4倍体积的冰乙酸立即将溶液稀释。为了使反应产物最大限度地显色，试管在37℃孵育20min。在酶标仪586nm测定有色产物的吸光度。每组重复3次，求吸光度的平均值，比较不同酶解时间下吸光度的大小。确定最佳酶解时间为60min。
实施例3：确定较适宜的酶添加量
5 mg/ml的透明质酸钾储存溶液用水制备并储存在4℃。不同浓度（1mg/ml、5 mg/ml、10mg/ml）的透明质酸酶溶液用0.02M磷酸盐缓冲剂、77mM氯化钠和1mg/ml 0.01% BSA配制成的缓冲液溶解，并用盐酸调pH至3。取两支10ml EP管，分别标记为A（酶活组），B（酶失活组），每管分别加入100μl透明质酸酶溶液，其中A管不作处理，B管沸水浴10min。之后每管分别加入200μl蒸馏水，轻轻混匀。再在试管中添加500μl的蒸馏水、200μl的缓冲液和100μl的透明质酸钾溶液，轻轻混匀。在37℃保温60 min。酶促反应的终止通过加入220μl碱性硼酸盐溶液，将17.3g硼酸和7.8g氢氧化钾溶于100ml水中制备硼酸溶液，终止酶促反应前向硼酸溶液中添加10% 0.8g/ml碳酸钾溶液，即为碱性硼酸盐溶液。随后在沸水浴中加热5min。然后，试管放在冷水中20min，之后加入3ml对二甲氨基苯甲醛溶液即20g对二甲氨基苯甲醛溶解在25ml浓盐酸和75ml冰醋酸的混合液中；在使用前用4倍体积的冰乙酸立即将溶液稀释。为了使反应产物最大限度地显色，试管在37℃孵育20min。在酶标仪586 nm测定有色产物的吸光度。每组重复3次，求吸光度的平均值，比较不同酶的添加量下吸光度的大小。确定较适酶的添加量为5mg/ml。
实施例4：体外检测环磷酸腺苷抗过敏作用
5mg/ml的透明质酸钾储存溶液用水制备并储存在4°C。5mg/ml的透明质酸酶溶液用0.02M磷酸盐缓冲剂、77mM氯化钠和1mg/ml 0.01% BSA配制成的缓冲液溶解，并用盐酸调pH至3。取四支10ml EP管，分别标记为A（对照组）、B（对照空白组）、C（试样组）、D（试样空白对照组）, 每管分别加入100μl透明质酸酶溶液，其中A、C管不作处理，B、D管沸水浴10min。之后在A、B管加入200μl蒸馏水，而在C、D管中加入200μl一定浓度的环磷酸腺苷溶液，37℃孵育10min。再在每支试管中添加500μl的蒸馏水、200μl的缓冲液和100μl的透明质酸钾溶液，轻轻混匀。在37℃保温60min。酶促反应的终止通过加入220μl碱性硼酸盐溶液，将17.3g硼酸和7.8g氢氧化钾溶于100ml水中制备硼酸溶液，终止酶促反应前向硼酸溶液中添加10%0.8g/ml碳酸钾溶液，即为碱性硼酸盐溶液。随后在沸水浴中加热5min。然后，试管放在冰水中20min，之后加入3ml对二甲氨基苯甲醛溶液即20g对二甲氨基苯甲醛溶解在25ml浓盐酸和75ml冰醋酸的混合液中；在使用前用4倍体积的冰乙酸立即将溶液稀释。为了使反应产物最大限度地显色，将试管在37℃孵育20min。在酶标仪586 nm测定有色产物的吸光度。每组重复3次，以吸光度的平均值代入公式。
抑制率(%)=[(A−B)−(C−D)]/(A−B)×100
[A：对照吸光度（BHT+蒸馏水+HA）；
B：对照空白吸光度（BHT沸水钝化10min+蒸馏水+HA）；
C：试样吸光度（BHT+样品+HA）；
D：试样空白吸光度（BHT沸水钝化10min+样品+HA）。]
得到半数抑制率IC50为：4.92mg/ml。
实施例5：体外检测红枣提取物的抗过敏作用
5mg/ml的透明质酸钾储存溶液用水制备并储存在4°C。5mg/ml的透明质酸酶溶液用0.02M磷酸盐缓冲剂、77mM氯化钠和1mg/ml 0.01% BSA配制成的缓冲液溶解，并用盐酸调pH至3。取四支10ml EP管，分别标记为A（对照组）、B（对照空白组）、C（试样组）、D（试样空白对照组）, 每管分别加入100μl透明质酸酶溶液，其中A、C管不作处理，B、D管沸水浴10min。之后在A、B管加入200μl蒸馏水，而在C、D管中加入500μl一定浓度的红枣提取物(购于上海娇源实业有限公司，450g/瓶)，37℃孵育10min。再在每支试管中添加500μl的蒸馏水、200μl的缓冲液和100μl的透明质酸钾溶液，轻轻混匀。在37℃保温60min。酶促反应的终止通过加入220μl碱性硼酸盐溶液，将17.3g硼酸和7.8g氢氧化钾溶于100ml水中制备硼酸溶液，终止酶促反应前向硼酸溶液中添加10% 0.8g/ml碳酸钾溶液，即为碱性硼酸盐溶液。随后在沸水浴中加热5min。然后，试管放在冰水中20min，之后加入3ml对二甲氨基苯甲醛溶液即20g对二甲氨基苯甲醛溶解在25ml浓盐酸和75ml冰醋酸的混合液中；在使用前用4倍体积的冰乙酸立即将溶液稀释。为了使反应产物最大限度地显色，将试管在37℃孵育20min。在酶标仪586nm测定有色产物的吸光度。每组重复3次，以吸光度的平均值代入公式。
抑制率(%)=[(A−B)−(C−D)]/(A−B)×100
[A：对照吸光度（BHT+蒸馏水+HA）；
B：对照空白吸光度（BHT沸水钝化10min+蒸馏水+HA）；
C：试样吸光度（BHT+样品+HA）；
D：试样空白吸光度（BHT沸水钝化10min+样品+HA）。
Claims (3)
1.一种体外抗过敏作用检测方法，其特征在于:
Elson-Morgan法颜色反应的测定透明质酸酶活性，对透明质酸酶的酶解过程进行优化，构建一个优化检测活性物质抗过敏作用的体系，包括以下步骤：
（1）对酶解最适pH值进行优化；
（2）对酶解时间进行优化；
（3）对酶的添加量进行优化；
（4）将优化后的最适pH值、酶解时间和酶的添加量应用到检测生物活性物质的抗过敏作用方法中，
所用的透明质酸酶为牛睾丸透明质酸酶400-1000 units/mg；
牛睾丸透明质酸酶是溶于0.02M磷酸盐缓冲剂，pH值7，77mM氯化钠和1mg/ml 0.01%BSA，后形成一个透明的溶液。
2.根据权利要求1所述的一种体外抗过敏作用检测方法，其特征在于：
测定透明质酸酶活性的方法为：5 mg/ml的透明质酸钾储存溶液用水制备并储存在4℃，一定浓度的透明质酸酶溶液用0.02M磷酸盐缓冲液、77mM氯化钠和1mg/ml 0.01% BSA配制成的缓冲液溶解，用盐酸调节pH；
取两支10ml EP管，分别标记为A酶活组，B酶失活组，每管分别加入100μl透明质酸酶溶液，其中A管不作处理，B管沸水浴10min，之后每管分别加入200μl蒸馏水，轻轻混匀，再向每管中添加500μl的蒸馏水、200μl的缓冲液和100μl的透明质酸钾溶液，轻轻混匀，在37℃保温一定时间，酶促反应的终止通过加入220μl碱性硼酸盐溶液，将17.3g硼酸和7.8g氢氧化钾溶于100ml水中制备硼酸溶液，终止酶促反应前向硼酸溶液中添加10% 0.8g/ml碳酸钾溶液，即为碱性硼酸盐溶液；随后在沸水浴中加热5min；然后，将两支试管放在冰水冷却20min，之后加入3ml对二甲氨基苯甲醛溶液即20g对二甲氨基苯甲醛溶解在25ml浓盐酸和75ml冰醋酸的混合液中；在使用前用4倍体积的冰乙酸立即将溶液稀释；为了使反应产物最大限度地显色，试管在37℃孵育20min；在酶标仪586 nm测定有色产物的吸光度，每组重复3次，求吸光度的平均值。
3.根据权利要求1所述的一种体外抗过敏作用检测方法，其特征在于：
检测生物活性成分抗过敏作用的方法即：5mg/ml的透明质酸钾储存溶液用水制备并储存在4°C， 一定浓度的透明质酸酶溶液用0.02M磷酸盐缓冲液、77mM氯化钠和1mg/ml 0.01%BSA配制成的缓冲液溶解，用盐酸调节pH；取四支10ml EP管，分别标记为A对照组、B对照空白组、C试样组、D试样空白对照组，每管分别加入100μl透明质酸酶溶液，其中A、C管不作处理，B、D管沸水浴10min，之后在A、B管加入200μl蒸馏水，而在C、D管中加入200μl样品37℃孵育10min；再在每支试管中添加500μl的蒸馏水、200μl的缓冲液和100μl的透明质酸钾溶液，轻轻混匀，在37℃保温一定时间，酶促反应的终止通过加入220μl碱性硼酸盐溶液，将17.3g硼酸和7.8g氢氧化钾溶于100ml水中制备硼酸溶液，终止酶促反应前向硼酸溶液中添加10%0.8g/ml碳酸钾溶液，即为碱性硼酸盐溶液；随后在沸水浴中加热5min，然后，试管放在冰水中20min，之后加入3ml对二甲氨基苯甲醛溶液即20g对二甲氨基苯甲醛溶解在25ml浓盐酸和75ml冰醋酸的混合液中；在使用前用4倍体积的冰乙酸立即将溶液稀释；为了使反应产物最大限度地显色，试管在37℃孵育20min，在酶标仪586 nm测定有色产物的吸光度。
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|---|---|---|---|---|
| CN108489920A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-09-04 | 想念食品股份有限公司 | 碎头面中虫卵含量的检测方法及应用 |
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- 2016-05-19 CN CN201610333003.6A patent/CN106053450A/zh active Pending
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