CN108680569A - 血清中蔗糖测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血清中蔗糖测定方法，属于利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法。本发明的技术方案是：工具酶及指示酶同在试剂I中，试剂II仅有蔗糖酶有效成分；其测定方法为：血清中葡萄糖先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中葡萄糖与试剂Ⅰ反应生成醌亚胺，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，蔗糖在蔗糖酶的作用下水解生成α‑D‑葡萄糖和β‑D‑果糖，水解生成的α‑D‑葡萄糖与试剂Ⅰ反应产生醌亚胺。仪器在540nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的醌亚胺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的醌亚胺计算出蔗糖的含量。本发明检测时不受内源性葡萄糖影响，其方法经济方便易行，不需要特殊检测设备，是一种准确性更高的蔗糖检测方法。

Description

血清中蔗糖测定方法
技术领域
本发明属于一种包含酶的测定方法；或是利用可见光，通过测试反应的结果产生颜色变化来测试材料的方法，特别是涉及一种用生化分析仪快捷、准确检测血清中蔗糖的测定方法。
背景技术
蔗糖最主要的功效就是为人类身体补充能量，它进入人体以后很容易被吸收和利用，能很快转化成能量，从而也就减少了疲劳症状的发生，蔗糖味甜，对人类身体有多种好处，但是它在食用时却有一些禁忌，最重要的一点就是那些患有高血溏和糖尿病的人群不能食用，不然会让身体的血糖指数快速升高，对病情控制不利，会严重伤害人们的身体健康。蔗糖在人体消息化系统内经过消化液分解产生等量的α-D-葡萄糖和β-D-果糖。纯净的蔗糖是无色晶体易溶于水，比葡萄糖、麦芽糖甜，但不如果糖甜。蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖缩合失去一分子水而成，葡萄糖分子中的醛基和果糖分子中的酮基都被破坏，因此没有还原性，属非还原性二糖。蔗糖在酸或蔗糖酶的作用下，水解生成等量的葡萄糖和果糖。葡萄糖、果糖、蔗糖它们的区别在于：
1、葡萄糖(是一种六碳一元醛糖，水溶液中存在缩合平衡：大部分分子内醛基和5-羟基发生缩合形成吡喃糖，含苷羟基)分子中含有醛基(-CHO)或苷羟基，具有还原作用，是最典型的还原性糖。
2、果糖(是一种六碳一元酮糖，水溶液中存在缩合平衡：部分分子内酮基和4-羟基发生缩合形成呋喃糖，不含醛基或苷羟基)分子中虽然不含有上述基团，但在水溶液非酸性环境下存在平衡能部分转化为醛糖(甘露糖/葡萄糖)和醛(甲醛；副产物二羟基丙酮,是最简单的酮糖,非还原性糖)，转化产物中含醛基,所以果糖也是还原性糖。
3、一分子蔗糖(α-D-葡萄吡喃苷基-β-D-呋喃果糖苷)由一分子β-D-呋喃果糖和一分子α-D-吡喃葡萄糖缩合(脱1分子H2O)形成，其中不含醛基或苷羟基，因此不是还原糖。
蔗糖是由α-D-葡萄糖和β-D-果糖以α-1，2糖苷键构成，其水解方程式为：
葡萄糖与果糖互为同分异构体，葡萄糖是一种多羟基醛(醛糖)，果糖是一种多羟基酮(酮糖)，果糖分子中并无醛基存在，它们的结构式及反应产物如图1所示。
葡萄糖米氏常数为1.5×10-2M，分子量342.3。无色晶体，具有旋光性，但无变旋。蔗糖的分子式：C12H22O11。蔗糖容易被酸水解，水解后产生等量的α-D-葡萄糖和β-D-果糖。易溶于水较难溶于乙醇。
目前国内临床实验室尚无测定血清中蔗糖浓度方法，本发明测定方法包括以下几个基本反应步骤：人体血清中葡萄糖与试剂Ⅰ中在葡萄糖氧化酶和过氧化物酶(POD)的催化下生成H2O2，H2O2与4-氨基安替比林(4-AAP)和2，4-二氯酚(也可使用4-氯酚、苯酚衍生物、苯胺盐和苯磺酸盐，下面就以2，4-二氯酚为代表叙述，其他色原不再重复提起，)形成有色染料醌亚胺,加入试剂Ⅱ后于37℃温浴3～6分钟，蔗糖在试剂Ⅱ中蔗糖酶的作用下，水解为α-D-葡萄糖和β-D-果糖，α-D-葡萄糖在变旋酶的作用下转变为β-D-葡萄糖糖，β-D-葡萄糖糖再循环第一步反应也生成醌亚胺，仪器在505～550nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的红色醌亚胺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的红色醌亚胺计算出蔗糖的含量。第二步反应生成醌亚胺的量与样本中蔗糖的含量成正比。最后通过分光光度法计算出相应的蔗糖浓度，具体反应见化学反应式1～6。
本发明方法蔗糖测定反应公式：
第一步反应
第二步反应
发明内容：
生化分析仪检测血清中蔗糖采用酶法，人体血清中葡萄糖与试剂Ⅰ中在葡萄糖氧化酶和过氧化物酶(POD)的催化下生成H2O2，H2O2与4-氨基安替比林(4-AAP)和2，4-二氯酚(也可使用4-氯酚、苯酚衍生物、苯胺盐和苯磺酸盐，下面就以2，4-二氯酚为代表叙述，其他色原不再重复提起，)形成有色染料醌亚胺,加入试剂Ⅱ后于37℃温浴3～6分钟，蔗糖在试剂Ⅱ中蔗糖酶的作用下，水解为α-D-葡萄糖和β-D-果糖，α-D-葡萄糖在变旋酶的作用下转变为β-D-葡萄糖糖，β-D-葡萄糖糖再循环第一步反应也生成醌亚胺，仪器在505～550nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的红色醌亚胺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的红色醌亚胺计算出蔗糖的含量。第二步反应生成醌亚胺的量与样本中蔗糖的含量成正比。本发明方法测定蔗糖不受血清中葡萄糖含量的影响，通过内空白法消除了血清中的葡萄糖的干扰，为真正的蔗糖含量。
本发明的技术方案是：工具酶及指示酶同在试剂I中，试剂II仅有蔗糖酶有效成分；其测定方法为：血清中葡萄糖先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～6分钟，血清中葡萄糖与试剂Ⅰ反应生成红色醌亚胺，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴3～6分钟，在蔗糖酶水解作用下蔗糖分解为α-D-葡萄糖和β-D-果糖，α-D-葡萄糖在变旋酶的作用下转变为β-D-葡萄糖糖，β-D-葡萄糖糖再循环第一步反应也生成醌亚胺，仪器在505～550nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的红色醌亚胺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的红色醌亚胺计算出蔗糖的含量。
试剂I：0.1mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液中含有葡萄糖氧化酶(GOD)15KU/L，过氧化物酶(POD)15KU/L，2，4-二氯酚4.0mmol/L，4-氨基安替比林1.60mmol/L，抗坏血酸氧化酶30KU/L，变旋酶2KU/L，Proclin-300200μL/L。
试剂II：0.1mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液中含有蔗糖酶4.0KU/L，Proclin-300200μL/L。
上试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中磷酸盐缓冲液的pH值为7.5±0.2。
上述测定中反应物的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II＝1∶60～90∶20～30。
本发明方法采用内空白法测定血清中蔗糖浓度，血清中葡萄糖在葡萄糖过氧化物酶、过氧化物酶的作用下与2，4-二氯酚，4-氨基安替比林反应生成醌亚胺，当加入试剂II后，蔗糖水解生成葡萄糖，在葡萄糖过氧化物酶、过氧化物酶的作用下与2，4-二氯酚，4-氨基安替比林生成醌亚胺，仪器以第一步反应生成的醌亚胺为空白，以第二步反应生成的醌亚胺计算出蔗糖的含量。
本发明可以测得血液、乳汁、尿液及体液中的蔗糖含量，测定线性范围可达18.9mmol/L。不会增加实验人员的负担，不增加试剂成本，经济方便易行，是一种准确性更高的蔗糖检测方法。
附图说明
附图1是蔗糖水解生成α-D-葡萄糖和β-D-果糖反应的产物结构示意图。
附图2是本发明测定人体血清中蔗糖的实时反应曲线图。
具体实施方式：
下面通过实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1
试剂的组成：
a.试剂Ⅰ：
试剂I：0.1mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液中含有葡萄糖氧化酶(GOD)15KU/L，过氧化物酶(POD)15KU/L，2，4-二氯酚4.0mmol/L，4-氨基安替比林1.60mmol/L，抗坏血酸氧化酶30KU/L，变旋酶2KU/L，Proclin-300200μL/L。
b.试剂Ⅱ：
试剂II：0.1mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液中含有蔗糖酶4.0KU/L，Proclin-300200μL/L。
c.标准液：5.55mmol/L葡萄糖水溶液。
其中，Proclin-300为液体高效防腐剂。
实施例2.
试剂Ⅰ中将2，4-二氯酚改为4-氯酚，含量不变，其他成分都不变，试剂Ⅱ不变。
实施例3
测定程序
双试剂法：在日本OLYMPUSAU2700全自动化生化分析仪上，仪器自动将3μl样品加入到225μl试剂Ⅰ中混匀，37℃孵育3分钟，加入75μl试剂Ⅱ混匀，37℃孵育5.1分钟，全自动分析仪在540nm波长处检测，仪器自动计算出蔗糖结果，具体见表1。
表1.本发明自动化生化分析仪测试条件
反应OD蔗糖计算值＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]
蔗糖浓度＝F×OD蔗糖
其中OD蔗糖是蔗糖产生的吸光度。OD1是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度，OD2蔗糖是加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度，SV是样品的体积，R1V1是试剂Ⅰ的体积，R2V2是试剂Ⅱ的体积。F是校正因数。
加入试剂II后OD1的稀释倍数为[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]，加入试剂II后的吸光度即为OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]。所以，由蔗糖产生的醌亚胺的吸光度为：OD蔗糖＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]，即OD蔗糖＝OD2–(3+225)/(3+225+75)×OD1。只要测出OD1和OD2即可计算出蔗糖的浓度。
下面通过检测血清中的蔗糖的性能指标来进一步说明本发明的积极效果，蔗糖回收率是反应后测定的数值和加入前的蔗糖数值的差值与加入的蔗糖数值的差值比值的百分率。蔗糖测定回收率以95.0～105.0％为最好。
1.检测对象：待检者人群血清中蔗糖浓度。
2.试剂
a.试剂Ⅰ：0.1mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液中含有葡萄糖氧化酶(GOD)15KU/L，过氧化物酶(POD)15KU/L，2，4-二氯酚4.0mmol/L，4-氨基安替比林1.60mmol/L，抗坏血酸氧化酶30KU/L，变旋酶2KU/L，Proclin-300200μL/L。
b.试剂Ⅱ：0.1mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液中含有蔗糖酶4.0KU/L，Proclin-300200μL/L。
c.标准液：5.55mmol/L葡萄糖水溶液。
3.仪器：日本OlympusAU2700型全自动生化分析仪。4.
方法
4.1测定方法样品∶试剂I∶试剂II＝1∶75∶25。样品3μl与试剂I225μl37℃温浴3分钟，加入试剂II37℃反应5.1分钟，540nm波长处终点法测定。
本发明方法精密度：CV<3.2％，批间差<5.9％。线性范围0.2～21.2mmol，浓度为5.55mmol时，ΔA范围为0.17～0.22mmol，对溶血，脂血，黄疸血干扰同葡萄糖测定。仪器将第一步反应产生的醌亚胺为空白，以第二步反应产生的醌亚胺计算出蔗糖的含量，为真正蔗糖含量。本发明测定结果平均回收率为98.0％，说明本发明测定结果准确，实时反应曲线见附图2，横轴为反应过程各时间点(每点间隔36秒)，纵轴代表各测定点的吸光度。

Claims (5)

1.一种血清中蔗糖测定方法，其特征在于：工具酶及指示酶同在试剂I中，试剂II中仅有蔗糖酶有效成分；其测定方法为：血清中葡萄糖先与试剂Ⅰ于37℃温浴3～5分钟，血清中葡萄糖与试剂Ⅰ反应生成醌亚胺，加入试剂Ⅱ后于37℃温浴4～7分钟，蔗糖在蔗糖酶的作用下水解生成α-D-葡萄糖和β-D-果糖，水解生成的α-D-葡萄糖与试剂Ⅰ反应产生醌亚胺，仪器在540nm波长处检测，以试剂Ⅰ反应产生的醌亚胺为空白，由试剂Ⅱ反应产生的醌亚胺计算出蔗糖的含量。计算公式为：
反应OD蔗糖＝OD2—OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]
蔗糖浓度＝F×OD蔗糖
其中OD蔗糖是蔗糖产生的吸光度。OD1是样品加入试剂Ⅰ反应后测得的吸光度，OD2蔗糖是加入试剂Ⅱ反应后测得的吸光度，SV是样品的体积，R1V1是试剂Ⅰ的体积，R2V2是试剂Ⅱ的体积。F是校正因数。
加入试剂II后OD1的稀释倍数为[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]，加入试剂II后的吸光度即为OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]。所以，由蔗糖产生的醌亚胺的吸光度为：OD蔗糖＝OD2-OD1×[(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)]，即OD蔗糖＝OD2–(3+225)/(3+225+75)×OD1。只要测出OD1和OD2即可计算出蔗糖的浓度。
2.根据权利要求1所述的血清中蔗糖测定方法，其特征在于:试剂Ⅰ中含有葡萄糖氧化酶，过氧化物酶，2，4-二氯酚，4-氨基安替比林，抗坏血酸氧化酶，变旋酶，Proclin-300等有效成分；试剂Ⅱ中仅含有蔗糖酶有效成分。
3.根据权利要求1所述的血清中蔗糖测定方法，其特征在于试剂Ⅰ0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液中含有葡萄糖氧化酶(GOD)10～20KU/L，过氧化物酶(POD)10～20KU/L，2，4-二氯酚2.0～6.0mmol/L，4-氨基安替比林1.0～2.2mmol/L，抗坏血酸氧化酶20～40KU/L，变旋酶1.0～3.0KU/L，Proclin-300 100～300μL/L。试剂II：0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液中含有蔗糖酶2.0～6.0KU/L、Proclin-300 100～300μL/L。
4.根据权利要求1所述的血清中蔗糖测定方法，其特征在于试剂Ⅰ和试剂Ⅱ中0.1mol/L磷酸盐缓冲液pH值为7.5±0.2。
5.根据权利要求1所述的血清中蔗糖的测定方法，其特征在于测定的体积比为：样品∶试剂I∶试剂II＝1∶60～90∶20～30。
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