CN103088108A

CN103088108A - 葡萄糖脱氢酶法检测葡萄糖的试剂盒及制备方法

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Publication number: CN103088108A
Application number: CN2012104599107A
Authority: CN
Inventors: 李立和
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-11-16
Filing date: 2012-11-16
Publication date: 2013-05-08

Abstract

本发明公开了一种葡萄糖脱氢酶法检测葡萄糖的试剂盒，属于一种含酶的葡萄糖检测试剂盒。本发明试剂盒包括有：4瓶葡萄糖脱氢酶法试剂及1支葡萄糖标准液，在本发明试剂中包括有：120.0mmol/L浓度的磷酸盐缓冲液中溶解草酸钠8.0mmol/L、葡萄糖脱氢酶6000U/L、变旋酶180U/L、NAD⁺4.0mmol/L、0.2％ProClin 300防腐剂。在测定中通过草酸钠抑制内源性乳酸脱氢酶、α-羟丁酸脱氢酶的活性来控制干扰反应，增加反应的特异性，提高检测结果的准确度。本发明的试剂盒检测时受样品/试剂体积比的设置影响小，线性范围可达35.0mmol/L。其使用方法与原有葡萄糖脱氢酶法相同，不会增加实验人员的负担，几乎不增加试剂成本，经济方便易行，是一种准确性更高的葡萄糖脱氢酶法测定葡萄糖的试剂盒。

Description

葡萄糖脱氢酶法检测葡萄糖的试剂盒及制备方法

技术领域

本发明属于一种含有酶的葡萄糖检测试剂盒，特别是涉及一种葡萄糖脱氢酶法检测葡萄糖的试剂盒及制备方法。

背景技术

葡萄糖的测定方法已知的就有12种之多，在这些方法中，有的方法易受反应液中还原性物质、其它糖类干扰而产生或高或低偏差而很少应用。目前，国内外临床实验室检测葡萄糖最常用的方法是酶法，以酶为试剂可以提高特异性，葡萄糖氧化酶法易受维生素C、尿酸、尿素、胆红素、肌酐的干扰，而以上各物质对葡萄糖脱氢酶法无干扰。目前各实验室使用的葡萄糖脱氢酶法试剂盒，虽生产厂家不同，但试剂盒的组成基本相似，缓冲液内含有葡萄糖脱氢酶、变旋酶、NAD⁺或NADP⁺、防腐剂。

下面是《全国临床检验操作规程》葡萄糖脱氢酶法试剂盒配方

《全国临床检验操作规程》第三版中配方：

使用方法：样品∶试剂＝1∶100，混匀后7分钟检测。

葡萄糖脱氢酶法(GDH)法检测葡萄糖的过程为：葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖脱氢，与NAD⁺氧化生成葡萄糖酸(D-葡萄糖糖酸-δ-内酯)和NADH。

反应液中加入变旋酶可缩短反应到达平衡的时间，在反应过程中，NADH的生成量与葡萄糖浓度呈正比关系。

在肝转移癌、恶性贫血、急性心肌梗塞患者中，血液中LDH、α-HBDH活性都升高，同时伴有丙酮酸、α-酮丁酸升高，用葡萄糖脱氢酶法测定其葡萄糖时，一旦有NADH生成，它将会产生如下干扰反应：在LDH催化下，NADH与丙酮酸反应，生成L-乳酸和NAD+，如反应方程式(1)；在α-HBDH催化下，NADH与α-酮丁酸反应生成α-羟丁酸和NAD+，如反应方程式(2)。干扰反应不同程度地消耗了NADH，有时甚至会耗尽生成的NADH，使反应曲线下降或变为平坦，使NADH的生成与葡萄糖不成等量关系，干扰反应的结果使葡萄糖测定结果偏低，LDH、α-HBDH活性越高，干扰反应速度越快，偏差越大。葡萄糖脱氢酶法测定心肌酶升高患者的葡萄糖，内源性干扰可通过与葡萄糖氧化酶法比较而被发现，葡萄糖脱氢酶法测定葡萄糖结果明显偏低，也可以通过在自动化分析仪上查看实时反应曲线获知，心肌酶活性越高，样品体积分数增加，内源性干扰越大，反应曲线下降越陡，葡萄糖结果偏差越大，准确度越低。

葡萄糖脱氢酶法测定原理及消除干扰如图6所示。

在测定肝转移癌、恶性贫血、急性心肌梗死病人血清时，随着样品体积分数(SVF，样品与试剂使用比例)的改变，反应液中LDH及丙酮酸、α-HBDH及酮丁酸浓度随着改变。SVF增大，准确度下降(内源性干扰反应)、精密度也下降(因反应尚未达到终点，反应持续进行)，特别是在测定血清中LDH、α-HBDH酶活性高的患者葡萄糖时，其结果偏低。SVF降低，对低葡萄糖标本，仪器分析中的信噪比(噪音/信号)增大，会导致结果重复性下降，精密度CV下降。

发明内容

本发明为了解决现有技术中葡萄糖脱氢酶法测定葡萄糖存在内源性干扰的问题，提供一种抗内源性干扰，提高临床实验室采用葡萄糖脱氢酶法测定葡萄糖准确性的试剂盒及制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明的葡萄糖脱氢酶法检测试剂盒包括：4瓶葡萄糖脱氢酶法试剂及1支葡萄糖标准液，其特征在于试剂中120.0mmol/L浓度的磷酸盐缓冲液溶解草酸盐8.0mmol/L、葡萄糖脱氢酶6000U/L、变旋酶180U/L、NAD⁺4.0mmol/L、适量的防腐剂。

所述的草酸盐为分析纯的草酸钠、草酸钾。

所述的葡萄糖标准液浓度为5.55mmol/L。

所述的防腐剂为ProClin300。

一种葡萄糖脱氢酶法检测葡萄糖的试剂盒制备方法：

a.磷酸盐缓冲液(PH7.5)120.0mmol/L浓度的磷酸盐缓冲液的制备方法：称取96g NaCl、2.4g KCl、17.3g Na₂HPO₄和2.88g KH₂PO₄，溶于800ml蒸馏水中，调节pH值，最后加蒸馏水定容至1L即可。

b.试剂的制备方法：将葡萄糖脱氢酶加入制备好的磷酸盐缓冲液中，依次溶解草酸钠、变旋酶、NAD⁺、ProClin 300，充分混匀，使各成分的浓度达到8.0mmol/L浓度的草酸钠、葡萄糖脱氢酶6000U/L、变旋酶180U/L，NAD+4.0mmol/L、0.2％ProClin 300。

c.葡萄糖标准液的制备方法：称取葡萄糖(分析纯，分子量为180.16)溶解在蒸馏水中，使其浓度为5.55mmol/L，混匀后静置30分钟，分装备用。

在本发明试剂盒的试剂中，草酸盐为干扰反应抑制剂，NAD⁺为指示酶，葡萄糖脱氢酶和变旋酶为工具酶。防腐剂为ProClin 300，成分主要为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MCI)和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(CMCI)，ProClin系列防腐剂具有广谱抗菌活性，当浓度达到0.2％条件下，能在比较长的时间内抑制细菌、真菌和酵母菌等微生物的生长，它又能保持体系中酶的活性。

本发明人在2007年第25卷第6期《临床检验杂志》报道：用草酸钠消除己糖激酶法测定葡萄糖内源性干扰物。本发明对葡萄糖脱氢酶法试剂盒进行了技术改良，草酸盐对乳酸脱氢酶、α-羟丁酸脱氢酶活性有明显抑制作用，却不影响葡萄糖脱氢酶的活性，采用将适宜浓度的草酸钠加入到葡萄糖脱氢酶法所用的试剂中，起到抑制干扰反应的效果，所用的草酸盐可以为草酸钠、草酸钾，均为分析纯产品，纯度在99.97％。

在本发明试剂盒的试剂中加入草酸盐，其对试剂中的其他成分的影响、对自动化仪器的检测的影响、其最佳浓度、其检测结果的精确性、准确性都需要进行验证，下面以草酸钠为代表通过对草酸钠浓度选择、有关检测数据的选择，已有的葡萄糖脱氢酶法试剂盒与本发明的试剂盒的检测结果等一些实验来进一步对本发明进行说明。

实验仪器：

试剂：

实验条件：

温度 37℃ 试剂用量 300μL

波长 340nm 样品用量 3.0μL

比色光径 0.5cm 反应时间 8.1min

样品试剂比为1∶100

在反应曲线图中，横轴为反应时间，纵轴为吸光度，测定时间每点间隔18秒，测定波长340nm，测定时间8.1分钟(第27点)。

实验内容及结果：

1.草酸钠浓度的选择：在试剂中分别加入浓度为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0mmol/L的草酸钠，分别测定标本1和标本2的葡萄糖值，每点各测10次，取其平均值，标本1：英国RANSDOX公司350UN/5定制血清，血糖值范围6.16±0.62mmol/L；标本2：葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖值范围为7.85±0.75mmol/L(LDH 3601U/L，HBDH 3044U/L)，结果见表1。

表1.不同浓度的草酸钠对葡萄糖检测结果的影响

草酸浓度	2.0	4.0	6.0	8.0	10.0	12.0	14.0
								标本1	6.18	6.17	6.17	6.17	6.15	6.12	6.08
标本2	6.81	6.98	7.44	7.83	7.51	7.32	7.22

从表1看出：标本1为定值血清，测定的血糖值在误差范围之内，但随着草酸钠浓度的增加，葡萄糖值呈下降的趋势。标本2为高LDH、HBDH酶活性的血清，草酸钠浓度低时不足以完全抑制干扰反应，测得的数值偏低，当草酸钠浓度过高时会抑制工具酶活性，也会析出结晶，葡萄糖测定数值呈下降趋势，为了使该试剂达到准确度要求，又能抑制LDH、HBDH的干扰，因此选择了8.0mmol/L的浓度，以使检测更完善。换为草酸钾都能达到草酸钠的同等功效。在葡萄糖氧化酶法，未使用草酸钠抑制剂和本发明方法测试心肌酶升高组与对照组的葡萄糖结果见表2。

表2.几种测试方法的比较

从表2可以看出，1.正常对照组：Y_本发明法＝1.002X_GOD-0.4659，R²＝0.9993，；Y_本发明法＝0.9985X_GDH+0.2182；R²＝0.9995，本发明与原有的葡萄糖脱氢酶法和葡萄糖氧化酶法相关性良好，三种方法无显著性差异。2.在心肌酶升高组：Y_本发明法＝0.9938X_GOD+0.3835，R²＝0.9994；本发明法与葡萄糖氧化酶法无显著性差异，本发明法与原有的葡萄糖脱氢酶法有显著性差异，t＝21.06，p＜0.05，准确性高于现有的葡萄糖脱氢酶法。

精密度实验：取心肌酶升高组及对照组的血样，用三种方法测定血糖，计算批内、批间精密度结果见表3。

表3.精密度实验比较

从表3中可以看出，在测定对照组中，三种方法批内、批间无显著性差异；在测定心肌酶升高组中，原有的葡萄糖脱氢酶法精密度较低。

4.体积分数的选择：采用本发明法测定急性心肌梗死患者患者不同样品体积分数测定葡萄糖，测定结果比较见表4

表4 本发明不同样品体积分数测定急性心肌梗死患者葡萄糖结果比较：

从表4中可看出，各种样品试剂比测定结果间无显著性的差异，t＝0.5879，p＞0.05，n＝22，为了能适应多种仪器，本发明选择样品试剂比为1∶100。

附图说明

图1是本发明试剂盒结构示意图。

图2是现有葡萄糖脱氢酶法试剂盒测定正常对照组血清葡萄糖实时反应曲线图。

图3是本发明葡萄糖脱氢酶法试剂盒测定正常对照组血清葡萄糖实时反应曲线图。

图4是本发明葡萄糖脱氢酶法试剂盒检测急性心肌梗塞患者血清葡萄糖反应曲线图。

图5现有葡萄糖脱氢酶法试剂盒检测急性心肌梗塞患者血清葡萄糖反应曲线图。

图6为葡萄糖脱氢酶法测定原理及消除干扰示意图。

具体实施方式

1.试剂盒的组成

4瓶葡萄糖脱氢酶法试剂(500ml/瓶)；葡萄糖标准液1支(浓度：5.55mmol/L，2ml)。

2.试剂的配制：

b.试剂的制备方法：将葡萄糖脱氢酶加入制备好的磷酸盐缓冲液中，依次溶解草酸钠、变旋酶、NAD⁺，充分混匀，使各成分的浓度达到8.0mmol/L浓度的草酸钠、葡萄糖脱氢酶6000U/L、变旋酶180U/L、NAD+4.0mmol/L、0.2％ProClin 300。

本发明的试剂盒在4-8℃冷藏、闭光保存，有效期：1年。

3.试剂盒的使用方法

仪器自动将样品3μl加入到300μl试剂中，混合均匀，37℃孵育8.1分钟，应用全自动分析仪在340nm波长处检测。

Claims

1.一种葡萄糖脱氢酶法检测葡萄糖的试剂盒，包括有：4瓶葡萄糖脱氢酶法试剂及1支葡萄糖标准液，其特征在于90～150.0mmol/L的磷酸盐缓冲液溶解4.0～12.0mmol/L浓度的草酸盐，葡萄糖脱氢酶5000～7000U/L，变旋酶140～220U/L，NAD⁺2.0～6.0mmol/L，0.1～0.3％ProClin300防腐剂。

2.根据权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶法检测葡萄糖的试剂盒，其特征在于试剂中草酸盐为分析纯的草酸钠、草酸钾，用于抑制葡萄糖脱氢酶法测定中的干扰反应。

3.根据权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶法检测葡萄糖的试剂盒，其特征在于葡萄糖标准液的浓度为5.55mmol/L。

4.根据权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶法检测葡萄糖的试剂盒，其特征在于防腐剂为ProClin 300。

5.一种葡萄糖脱氢酶法试剂盒的制备方法，其特征在于试剂制备方法如下：

a.磷酸盐缓冲液(PH7.5)120.0mmol/L浓度的磷酸盐缓冲液的制备方法：称取96g NaCl、2.4g KCl、17.3g Na₂HPO4和2.88g KH₂PO₄，溶于800ml蒸馏水中，调节pH值，最后加蒸馏水定容至1L即可。

b.试剂的制备方法：将葡萄糖脱氢酶加入制备好的磷酸盐缓冲液中，依次溶解草酸钠、变旋酶、NAD⁺、ProClin 300充分混匀，使各成分的浓度达到使用要求。

c.葡萄糖标准液的制备方法：称取分析纯葡萄糖溶解在蒸馏水中，使其浓度为5.55mmol/L，混匀后静置30分钟，分装备用。