CN102507482A - 一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG）的检测方法及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法及试剂。本发明所述检测方法的测定原理为：测定试剂中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶(MPT)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖，反应中生成的MPT在205nm、270nm、340nm处有最大吸收，通过测定37℃反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出样品中MPT-NAG的含量。本方法所涉及的化学品均无毒、易得，符合发展绿色检测方法的要求，检测灵敏度高，线性、精密度好，结果准确，且操作简便快速，可用于各种类型的分析仪，满足大规模测定样本的要求。
Description
技术领域
本发明属于生物化学试剂检测领域，具体涉及一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法和用于该方法的检测试剂。
背景技术
6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)是近年来合成的测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)的新底物。以MPT-NAG为主要原材料开发的液体型NAG测定试剂具有稳定、抗干扰能力好、能实现自动化分析等特点，在临床得以广泛应用。MPT-NAG含量的高低显著影响NAG测定试剂的灵敏度，是控制NAG测定试剂批间差不可忽视的实验因素之一。
目前实验室测定MPT-NAG含量时均采用高效液相色谱(HPLC)法，该法需要专用大型仪器，需要标准品做对照，检测费时且成本高，检测时还需要使用有毒溶剂甲醇，易造成环境污染。
因此，寻求一种操作简便、灵敏度高、结果准确的方法，对MPT-NAG进行定量检测就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术的不足，利用N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶对MPT-NAG的催化分解，通过测定反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出待测定样品中MPT-NAG浓度。依据该法构建的测定试剂绿色、环保，实现一步法直接测定，测定试剂置于2-8℃环境中可稳定保存12个月，用普通的紫外分光光度计就可以实现检测。
本发明测定原理为：测定试剂中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶(MPT)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖。反应中生成的MPT 205nm、270nm、340nm处有最大吸收，通过测定37℃反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出样品中MPT-NAG的含量。
本发明通过以下技术方案实现：
一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
1)配制含有MgCl2、EDTA·2Na、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶、聚乙二醇6000、乙二醇、蔗糖的pH4.0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液；
2)加入含MPT-NAG的待测样品，反应一段时间，试剂中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶(MPT)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖；
3)通过测定特定波长下溶液的吸光度值，计算出待测样品中MPT-NAG的含量。
步骤(1)中所述pH4.0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液的浓度为30-500mmol/L、MgCl2浓度为2-20mmol/L、EDTA·2Na浓度为0.5-10mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶浓度为5-20KU/L、聚乙二醇6000浓度为2-10g/L、乙二醇浓度为20-100ml/L、蔗糖浓度为5-50g/L。
步骤(2)中的反应条件为在37℃环境中反应5-10min。
步骤(2)中反应生成的6-甲基-2巯基吡啶(MPT)分别在205nm、270nm、340nm处有最大吸收，尤其是340nm。
样品中MPT-NAG的计算公式为：样品液MPT-NAG含量(mmol/L)＝(Au-A0)×V1×103/(ε×V2)，其中Au为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，ε为特定波长下MPT-NAG的摩尔吸光值。
本发明的另一个目的是提供一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测试剂，其特征在于：含有pH4.0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中柠檬酸-柠檬酸三钠浓度为30-500mmol/L，MgCl2浓度为2-20mmol/L、EDTA·2Na浓度为0.5-10mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶浓度为5-20KU/L、聚乙二醇6000浓度为2-10g/L、乙二醇浓度为20-100ml/L、蔗糖浓度为5-50g/L，待测样品的浓度为0.005-16.5g/L。
利用本发明所述定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的酶法检测方法，可以精确检测待测样品中含有的6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的范围为0.015-50mmol/L。
本发明所涉及的化学品均无毒、易得，符合发展绿色检测方法的要求。本检测方法与高效液相(HPLC)法相比较结果见表1。
表1
| 检测方法 | HPLC | 本法 |
| 检测时间 | 60min | 5～10min |
| 检测成本 | 200 | 很低 |
| 标准品 | 需要 | 不需要 |
| 检测步骤 | 多步 | 一步直接法 |
| 手工法/自动法 | 手工法 | 手工法或自动法均可 |
| 含有的有毒物质 | 甲醇 | 不含有毒物质 |
本发明所述方法灵敏度高，线性、精密度好，结果准确，且操作简便快速，并可用于各种类型的分析仪，达到大规模测定样本的要求。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明的原理和其应用，但本发明并不限于此。
样品液：精确称取0.1克左右样品，用去离子水定容至样品终浓 度为0.005-16.5g/L的样品液。
样品液中MPT-NAG的计算公式：样品液MPT含量(mmol/L)＝(Au-A0)×V1×103/(ε×V2)，其中Au为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，ε为特定波长下MPT-NAG的摩尔吸光值。
实施例1：
配制含MgCl220mmol/L、EDTA·2Na 10mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶20KU/L、聚乙二醇6000 10g/L、乙二醇100ml/L、蔗糖50g/L的500mmol/L pH5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液为测定试剂，将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为日立7080全自动生化分析仪，测定方法类型为终点法，温度为37℃，V样品为3μl，V试剂为300μl，测定主/副波长为340/800nm，试剂加入样本后在测定温度反应5分钟后读取吸光度。样品液中MPT-NAG的计算公式为：MPT-NAG含量(mmol/L)＝(Au-A0)×V1×103/(10063×V2)，其中Au为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，10063为340nm下MPT-NAG摩尔吸光值。用本法和HPLC法同时测定了25例样品液中MPT-NAG含量。
表2为本实施例所述方法测定的含MPT-NAG的样品液中MPT-NAG含量的测定值与HPLC法测定MPT-NAG含量的值对照表。
表2
从表2可知，本实施例所述方法与HPLC法的相关系数r为0.9999，两者显示了极好的相关性。
实施例2：
配制含MgCl210mmol/L、EDTA·2Na 5mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶12.5KU/L、聚乙二醇6000 6g/L、乙二醇60ml/L、蔗糖25g/L的250mmol/L PH4.5柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液为测定试剂，将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为岛津UV-2550紫外可见分光光度计，温度为37℃，V样品为30μl，V试剂为3000μl，测定波长为270nm，试剂加入样本后在测定温度反应7.5分钟后读取吸光度。样品液中MPT-NAG的计算公式为：MPT-NAG含量(mmol/L)＝(Au-A0)×V1×103/(9919×V2)，其中Au为样品管 反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，9919为270nm下MPT-NAG摩尔吸光值。
实施例3：
配制含MgCl22mmol/L、EDTA·2Na 0.5mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶5KU/L、聚乙二醇6000 2g/L、乙二醇20ml/L、蔗糖5g/L的30mmol/L pH4.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液为测定试剂，将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为岛津UV-2201紫外可见分光光度计，温度为37℃，V样品为25μl，V试剂为2500μl，测定波长为205nm，试剂加入样本后在测定温度反应10分钟后读取吸光度。样品液中MPT-NAG的计算公式为：MPT-NAG含量(mmol/L)＝(Au-A0)×V1×103/(8329×V2)，其中Au为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，8329为205nm下MPT-NAG摩尔吸光值。
本技术领域的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明的实质精神和范围的前提下，对发明的各种变化、变型和改进，都应落入权利要求书要求保护的范围内。
Claims (6)
1.一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
1)配制含有MgCl2、EDTA·2Na、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶、聚乙二醇6000、乙二醇、蔗糖的pH4.0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液；
2)加入含MPT-NAG的待测样品，反应一段时间，试剂中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶(MPT)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖；
3)通过测定特定波长下溶液的吸光度值，计算出待测样品中MPT-NAG的含量。
2.根据权利要求1所述的一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述pH4.0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液的浓度为30-500mmol/L、MgCl2浓度为2-20mmol/L、EDTA·2Na浓度为0.5-10mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶浓度为5-20KU/L、聚乙二醇6000浓度为2-10g/L、乙二醇浓度为20-100ml/L、蔗糖浓度为5-50g/L。
3.根据权利要求1所述的一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法，其特征在于：步骤(2)中的反应条件为在37℃环境中反应5-10min。
4.根据权利要求1所述的一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法，其特征在于：步骤(2)反应中生成的6-甲基-2巯基吡啶(MPT)分别在205nm、270nm、340nm处有最大吸收。
5.据权利要求1所述的一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法，其特征在于：样品中MPT-NAG的计算公式为：样品液MPT-NAG含量(mmol/L)＝(Au-A0)×V1×103/(ε×V2)，其中Au为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，ε为特定波长下MPT-NAG的摩尔吸光值。
6.一种用于权利要求1-5中任一项所述的检测方法的检测试剂，其特征在于：含有pH4.0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中柠檬酸-柠檬酸三钠浓度为30-500mmol/L，MgCl2浓度为2-20mmol/L、EDTA·2Na浓度为0.5-10mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶浓度为5-20KU/L、聚乙二醇6000浓度为2-10g/L、乙二醇浓度为20-100ml/L、蔗糖浓度为5-50g/L，待测样品的浓度为0.005-16.5g/L。
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| CN103739641A (zh) * | 2013-12-20 | 2014-04-23 | 宁波大学 | 一种N-乙酰-3,4,6-三乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷化合物及水解产物及其制备方法 |
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| CN104297179A (zh) * | 2014-10-10 | 2015-01-21 | 宁波医杰生物科技有限公司 | 用于检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的试剂 |
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