CN109632986B - 一种糖及糖醇类化合物的柱后衍生检测方法 - Google Patents

一种糖及糖醇类化合物的柱后衍生检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109632986B
CN109632986B CN201811527543.3A CN201811527543A CN109632986B CN 109632986 B CN109632986 B CN 109632986B CN 201811527543 A CN201811527543 A CN 201811527543A CN 109632986 B CN109632986 B CN 109632986B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sugar
alcohol compounds
detection
sugar alcohol
post
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811527543.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109632986A (zh
Inventor
周丽娟
吴晶
李新南
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Golden Sun Pharmaceutical China Co ltd
Original Assignee
Golden Sun Pharmaceutical China Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Golden Sun Pharmaceutical China Co ltd filed Critical Golden Sun Pharmaceutical China Co ltd
Priority to CN201811527543.3A priority Critical patent/CN109632986B/zh
Publication of CN109632986A publication Critical patent/CN109632986A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109632986B publication Critical patent/CN109632986B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明涉及一种糖及糖醇类化合物的柱后衍生检测方法，涉及葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇等糖及糖醇类化合物的检测技术领域。本发明将糖或糖醇类物质采用高效液相色谱‑十八烷基硅胶色谱柱分离技术，将糖类进行分离纯化，再通过强氧化剂将其分子上的羟基经氧化转化为羰基，并与荧光传感化合物在一定温度、时间条件下发生衍生反应，生成含荧光显色基团的衍生化合物，最后采用荧光检测器实现快速定量定性检测的一种检测方法。采用此法测定糖及糖醇类化合物，数据稳定可靠，检测限可提高至ppm级。

Description

一种糖及糖醇类化合物的柱后衍生检测方法
技术领域
本发明属于化学分析技术领域，具体涉及糖及糖醇类化合物高效液相色谱（HPLC）分离-化学衍生制备-荧光光谱检验的方法，本发明的方法可用于临床医学、药品与食品检测领域。
背景技术
糖类化合物是自然界中存在数量最多、分布最广且具有重要生物功能的有机化合物，从细菌到高等动物的机体都含有糖类化合物。糖是除蛋白质和核酸外的又一类非常重要的生命物质，糖化学在生命科学、药物研究中占有很重要的地位和广泛的用途，对糖类物质的检测方法研究，一直是糖化学的重要研究内容。
糖类物质由于极性较强，通常以乙腈-水为流动相，采用氨基键合色谱柱进行分离，同时由于糖类物质化学结构中缺乏紫外或荧光等显色基团，因而多采用示差检测器进行定性定量测定，如《GB/T 22221-2008 食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定 高效液相色谱法》中采用此方法进行检测，但实际应用存在许多缺陷，如灵敏度低，选择性差，受环境温度的干扰大，不适合应用梯度洗脱等。为了克服这些方法的缺点并实现高灵敏度检测和痕量分析，目前开发了很多衍生化测定法，通过将糖类物质进行衍生化反应，标记成荧光或紫外发光化合物，从而提高灵敏度，并根据高效液相色谱进行分离前后衍生顺序的不同，分为柱前衍生或柱后衍生，本发明即属于高效液相色谱-柱后衍生-荧光检测技术，但本发明与其他文献研究的方法相比有很多优势。
目前糖类衍生常选择1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、2-氨基吡啶(2-AP)、芴甲氧基羰基-肼(FMOC-肼)、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)以及2-氨基吖啶酮(2-AMAC)等试剂进行柱前衍生，采用最多为选择1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)为衍生试剂，如专利号为201210592158.3的《一种具有降血糖功能制剂的检测方法》，即采用此衍生方法，但此类方法只能对还原性的糖类进行衍生，如鼠李糖,阿拉伯糖,葡萄糖,半乳糖和葡萄糖醛酸等，但对非还原糖如蔗糖等，糖醇类如甘露醇等则无法进行测定。同时此类方法由于衍生反应时间长，只能进行柱前衍生，前处理较为复杂。
由于乙腈强毒性试剂，费用高，用量大，对环境十分不友好，同时键合氨基色谱柱价格贵、寿命短，使用成本高，本发明研究使用一种离子对试剂-磷酸盐缓冲液混合纯水相、非有机溶剂为流动相，选择十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为分析色谱柱对糖类化合物进行高效液相分离，不仅避免使用了强毒性的乙腈试剂，改善环境影响，还大大降低了检测成本。
有文献报道使用1-萘硼酸作为糖类的衍生试剂进行柱后衍生-荧光检测含量测定，如《赵鑫. 1-萘硼酸柱后衍生高效液相色谱荧光法测定单糖的研究[D]. 河北师范大学, 2013.》中的研究，但根据文献内容此方法只适用于单糖测定，对于双糖或多糖如乳糖、蔗糖，则无法测定，同时使用1-萘硼酸衍生反应对pH较为敏感，需在特定pH值下进行反应，限定了液相分离中流动相选择范围。
本发明申请的一种糖及糖醇类化合物的柱后衍生检测方法，可以很好的克服上述测定过程中的缺陷，可作为糖类及糖醇类物质的通用型快速测定方法。
发明内容
本发明主要提供一种糖类及糖醇类化合物的检测方法，该方法操作简单、重复性好、分析结果准确。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案包含三个步骤。
第一步，采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱对糖类及糖醇类化合物进行高效液相分离，其流动相为离子对试剂-磷酸盐缓冲液。
流动相所使用的离子对试剂包括戊烷磺酸钠、己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠，浓度为0.01~1%，磷酸盐缓冲液浓度为0.01~0.5moL/L，pH范围为2~8。
第二步，将糖类及糖醇类化合物进行氧化反应后键合荧光基团。
氧化反应通过氧化试剂将糖化合物中的邻二醇氧化为羰基后，再与荧光化合物键合。氧化试剂包括四醋酸铅、高碘酸或高碘酸盐（钠/钾）等。荧光化合物为胺类化合物，包括对氨基苯磺酸、氨基乙基磺酸、酚试剂(MBTH)、丹磺酰肼等。衍生反应的温度为50~100℃。
以高碘酸为氧化剂，对氨基苯磺酸为荧光试剂为例，其反应原理如下：
Figure 83553DEST_PATH_IMAGE001
。
第三步，采用荧光检测器进行进行荧光定量检测。
荧光检测的激发波长为200~400nm，发射波长为400~500nm。
附图说明
图1为本发明实施例一中葡萄糖与果糖标准衍生物色谱图，其中葡萄糖衍生物质出峰时间为18.548分钟，果糖衍生物质出峰时间为6.820分钟。
具体实施方式
实施例一 血糖浓度柱后衍生-高效液相分离-荧光色谱检测方法：
血糖监测是临床中最常做的监测项目，其检测方法通常有葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法，但此类检测方法干扰较多，如葡萄糖氧化酶法其原理是利用氧化酶将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并同时产生过氧化氢，再利用过氧化氢酶使其与4-氨基安替比林和酚类物质进行缩合为红色醌亚胺类化合物，这类物质在可见光波长下有吸收峰，采用比色法进行测定，得出葡萄糖浓度，但血液中的的血脂成分，如乳糜微粒和极低密度脂蛋白对葡萄糖检测有极大干扰，影响结果真实性。本实施例采用柱后衍生-高效液相分离-荧光色谱技术，提供了一种专属性强、精密度高、灵敏度高的血糖测定方法，特别适用于药物临床测试等准确度要求很高的研究场合。方法包括下述内容。
1色谱条件。
仪器：设备应具有2个泵分别控制流动相与衍生反应液，样品进样器，色谱柱，反应管，冷却管，检测器和记录设备，其中反应管与冷却管应放于恒温装置中。
检测器：荧光检测器，激发波长：368nm，发射波长：417nm，灵敏度为1。
反应管：不锈钢管，0.3mm×15m（内径×长度）。
冷却管：不锈钢管，0.3mm×1.5m（内径×长度）。
色谱柱：C18色谱柱，4.6mm×25cm粒径5mm。
流动相：以0.15%十二烷基磺酸钠的磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾3.02g与磷酸氢二钾6.2g，加水溶解成1000ml，pH值约为7.0）为流动相。
流速：调节流动相流速使得葡萄糖峰保留时间约为18分钟，并调节荧光反应试剂的流速与流动相的流速一致。
反应温度：85~90℃、冷却温度：5~10℃。
2.溶液配制。
对照品储备液：精密称取葡萄糖对照品25mg，用甲醇溶解，配制成0.25mg/ml的对照品储备液，低温避光保存。
内标溶液：精密称取果糖对照品25mg，用甲醇溶解，配制成25μg/ml的内标储备液，低温避光保存。
荧光反应试剂：取对氨基苯磺酸5g与高碘酸1.5g，加水溶解并稀释至1000ml，既得。
3.血清样品处理方法。
精密吸取血清样品200μl 置于1.5 ml离心管中，精密加入10 μl内标溶液，涡旋30s，精密加入150μl乙腈，涡旋3 min，14000 r/min 离心10 min，取上清液100 μl，取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按标准曲线计算浓度，即得。
4.标准曲线的制备。
取适量葡萄糖标准溶液，氮气吹干，加入100 μl空白血清配制成血清中含待测物葡萄糖浓度分别为：25，50，100，150，200 μg/100μl（同时做空白对照），按“3”项下操作，进样分析。以待测物浓度（Y，μg/100μl）为纵坐标，待测物峰面积减去空白本底药物峰面积（As）与内标峰面积（Ai）的比值（X）为横坐标，用最小二乘法进行线性回归，回归方程：Y=8.541X＋0.412(r=0.999 9)。葡萄糖在25~200 μg/100μl范围内线性良好，定量下限为1.875 μg/100μl。

Claims (1)

1.一种糖及糖醇类化合物的柱后衍生检测方法，其特征在于其包括如下步骤：将葡萄糖和果糖经过高效液相色谱-十八烷基硅胶色谱柱分离后，在以0.15%十二烷基苯磺酸钠的磷酸盐缓冲液为流动相条件下分离后，以高碘酸为氧化剂，对氨基苯磺酸为荧光试剂，在85-90℃下衍生后，进行荧光检测，定量测定糖类化合物质，荧光检测的激发波长为200-400nm，发射波长为400-500nm；所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾3.02g与磷酸氢二钾6.2g，加水溶解成1000ml,pH值为7.0。
CN201811527543.3A 2018-12-13 2018-12-13 一种糖及糖醇类化合物的柱后衍生检测方法 Active CN109632986B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811527543.3A CN109632986B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种糖及糖醇类化合物的柱后衍生检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811527543.3A CN109632986B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种糖及糖醇类化合物的柱后衍生检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109632986A CN109632986A (zh) 2019-04-16
CN109632986B true CN109632986B (zh) 2022-07-01

Family

ID=66073690

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811527543.3A Active CN109632986B (zh) 2018-12-13 2018-12-13 一种糖及糖醇类化合物的柱后衍生检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109632986B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113219103A (zh) * 2021-05-26 2021-08-06 国家粮食和物资储备局科学研究院 一种多糖纯化制备装置

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101839898A (zh) * 2009-03-13 2010-09-22 日本化学研究株式会社 糖类的分析方法
CN102859352A (zh) * 2010-04-28 2013-01-02 日本化学研究株式会社 糖类的分析装置及分析方法
CN104280490A (zh) * 2013-07-02 2015-01-14 南通中国科学院海洋研究所海洋科学与技术研究发展中心 一种褐藻多糖硫酸酯的质量分析方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101839898A (zh) * 2009-03-13 2010-09-22 日本化学研究株式会社 糖类的分析方法
CN102859352A (zh) * 2010-04-28 2013-01-02 日本化学研究株式会社 糖类的分析装置及分析方法
CN104280490A (zh) * 2013-07-02 2015-01-14 南通中国科学院海洋研究所海洋科学与技术研究发展中心 一种褐藻多糖硫酸酯的质量分析方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Sugar and Cyclitol Determination in Vegetables by HPLC Using Postcolumn Fluorescent Derivatization;RYOICHI MASUDA et al.;《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》;19961231;摘要、第1187页 *
糖类物质的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）衍生化及HPLC和MALDI-TOF分析;林雪;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20060915;第1.3.1.3、1.3.3.2部分 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109632986A (zh) 2019-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Du et al. Flow injection chemiluminescence determination of epinephrine using epinephrine-imprinted polymer as recognition material
Cai et al. Determination of several sugars in serum by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection
Hou et al. Bioresponsive controlled release from mesoporous silica nanocontainers with glucometer readout
Chen et al. Determination of bisphenol‐A levels in human amniotic fluid samples by liquid chromatography coupled with mass spectrometry
CN109030658B (zh) 一种婴幼儿乳粉中低聚果糖和棉子糖的检测方法
CN105548407B (zh) 尿液中修饰核苷的检测方法
Gil et al. Potentiometric detection in liquid chromatographic systems: An overview
Zhang et al. A chemiluminescence method to detect malondialdehyde in plasma and urine
CN110514778B (zh) 一种果汁中22种糖、糖醇及醇类同时检测的方法
CN109632986B (zh) 一种糖及糖醇类化合物的柱后衍生检测方法
CN104483295B (zh) 基于硼酸荧光探针的分子印迹微球检测糖蛋白的方法
Kong et al. Sensitive determination of bromhexine hydrochloride based on its quenching effect on luminol/H2O2 electrochemiluminescence system
Wang et al. Determination of major sialic acids in dairy products by electrophoretic stacking technology with contactless conductivity detection
CN116087363A (zh) 一种吸附型疫苗中羧甲基葡聚糖含量的检测方法
Alwael et al. Liquid chromatographic profiling of monosaccharide concentrations in complex cell-culture media and fermentation broths
Cao et al. Rapid and sensitive analysis of baclofen by high-performance liquid chromatography with UV-Vis and FD detection
Bian et al. Spectrofluorometric determination of total bilirubin in human serum samples using tetracycline-Eu3+
CN115524425A (zh) 一种检测血清和血浆中脂溶性维生素的试剂盒及检测方法
JP2016080542A (ja) 多糖類の測定方法及び測定装置
CN114814044A (zh) 一种检测血液中儿茶酚胺及其代谢物含量的方法
CN112924566B (zh) 一种同时检测酶促反应液中甘氨酸和丝氨酸的方法
Indorf et al. Comparison of HPLC methods for the determination of amino sugars in soil hydrolysates
CN109001345B (zh) 测定垃圾渗滤液中全氟辛酸浓度的高效液相色谱荧光检测法
Chen et al. Chemiluminescence flow sensor with immobilized reagent for the determination of pyrogallol based on potassium hexacyanoferrate (III) oxidation
CN114487227B (zh) 一种用于单糖分析的高效液相法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant