CN1912594A - 血清中肌酐的化学发光测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明血清中肌酐的化学发光测定方法，涉及一种在生化分析中医用试剂的化学发光测定方法。它所要解决的是现有检测范围窄、灵敏度低、操作难度大、准确性差等技术问题。解决该技术问题的主要技术方案：血清中肌酐的化学发光测定方法，其特征在于用肌酐氨基水解酶将CR水解成肌酸；再用肌酸脒基水解酶使成肌氨酸；在肌氨酸氧化酶作用下，产生过氧化氢；再经过氧化物酶作用，过氧化氢使化学发光物氧化而发光；血清中肌酐浓度越大发出的光信号越强；用已知浓度的肌酐与测出的光信号，作出剂量－反应曲线；未知样品的肌酐含量可从该曲线推算出来。它灵敏度更高、线性范围宽、安全适用、便于普及，适于大、中、小各类医疗机构广泛应用。
Description
技术领域：本发明涉及一种医用试剂检测方法，特别涉及血清中肌酐的化学发光测定方法。
背景技术：利用现代生物技术所开发的超微量测定方法，极大的推动了生物和医学各领域的各项临床和科研工作的快速发展，为人类的科学事业和社会进步作出了非凡的贡献。
上世纪七十年代由Arakawa首先发表了应用鲁米诺——过氧化物酶的化学发光反应进行酶免分析的技术，这一技术由于灵敏度高达10-18mol，可在20分钟内快速测定出结果，可简便实现完全自动化，有效期长达一年以上，无放射性和致畸物质，利于环保而受到普遍欢迎，是目前发展最迅速的检测技术。
目前，化学发光技术在免疫分析中已得到相当普及的程度，已发展为能检测多种生物活性物质的常规监床检测方法，从免疫反应方式分，该方法有两种基本类型，即化学发光免疫分析(CLIA)和免疫化学发光分析(ICMA)；从发光方式上看，一是将发光物质直接标记到抗体或抗原上，免疫反应后，在起动剂的作用下而发光，另一种是用酶标记抗体或抗原，免疫反应后，加入化学发光底物，在酶催作用下而发光。
该方法虽有突出的优点，但目前仅限于免疫分析，而在生化分析中还是空白。
肌酐(CR)存在于血液中，肌酐经肾小球滤过后不被肾小管重吸收，通过肾小管排泄。在肾脏疾初期，血清肌酐值通常不升高，至肾脏实质性损害，血清肌酐值才升高。当高至176～353NM/ML时，提示为中度至严重的肾损害。
现在普遍使用的测定血清中肌酐的方法为苦味酸盐比色法，该法是用钨酸沉淀除去血清中的蛋白，再与碱性苦味酸盐反应，生成黄红色的苦味酸肌酐复合物，进行比色测定。该法的不足之处主要有：
1、线性范围窄。由于检测光吸收，其分辨率不像化学发光那么敏感，线性范围不能完全满足临床检测的需要，对高浓度的样品需要经稀释后测定，带来一定不便。
2、灵敏度不如化学发光。化学发光是测定光信号，灵敏度要比测光吸收高出许多。
3、试剂成份复杂，操作烦琐，容易造成误差，影响测定结果的准确性。
发明内容：本发明所要解决的技术问题是一种提供能克服上述缺陷、且灵敏度高、线性范围宽、方便、安全的血清中肌酐的化学发光测定方法。解决该技术问题采用的主要技术方案：血清中肌酐的化学发光测定方法，其特征在于用肌酐氨基水解酶将CR水解成肌酸；再用肌酸脒基水解酶使成肌氨酸；在肌氨酸氧化酶作用下，产生过氧化氢；再经过氧化物酶作用，过氧化氢使化学发光物氧化而发光；光信号的大小与血清中肌酐的浓度呈正相关，即血清中肌酐浓度越大发出的光信号越强；记录这种光信号即可推测血清中肌酐的浓度；用已知浓度的肌酐与测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的肌酐含量可从该曲线推算出来；所述的化学发光物为鲁米诺；所述的肌酐也可以是尿液中的肌酐。本发明与现有技术相比有如下优点：用化学发光物代替显色物，达到更灵敏、更稳定、范围宽、更安全的目的。用该方法可以制备相应的定量测定血清肌酐的商品试剂盒。具体优点是：①灵敏度更高。传统方法是检测颜色深浅，而化学发光是测光信号，可一个一个光子计数，所测的最低限更小，因而灵敏度更高。②线性范围宽。测颜色的深浅的分辨率比光子计数的精度要低得多，化学发光的检测范围高达105。③安全适用。化学发光物如鲁米诺等很安全，整个检测过程无有害物出现，无论是检测或处理废物都很安全，有利于环境保护。④便于普及。本发明所制备的试剂盒，可用于全自动测量，也可用于手工或半自动测量，适宜大、中、小各层次的医疗和研究机构使用。⑤巨大的社会效益。用化学发光法测定生化指标或免疫物质，可同用一台化学发光仪，不再需要进口昂贵的生化仪，节省大量资金，不只降低了成本，对医疗机构、患者及社会均大有益处。
具体实施方式：现举例说明本发明的实施例。用肌酐氨基水解酶将CR水解成肌酸；再用肌酸脒基水解酶使成肌氨酸；在肌氨酸氧化酶作用下，产生过氧化氢；再经过氧化物酶作用，过氧化氢使化学发光物氧化而发光；光信号的大小与血清中肌酐的浓度呈正相关，即血清中肌酐浓度越大发出的光信号越强；记录这种光信号即可推测血清中肌酐的浓度；用已知浓度的肌酐与测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的肌酐含量可从该曲线推算出来；所述的化学发光物为鲁米诺；所述的肌酐也可以是尿液中的肌酐；这便是本发明的血清中肌酐的化学发光测定方法。
一、试剂包括：
混合酶液；
肌酐(或替代品)标准：单一或系列浓度；
底物液
二、测定程序，按下表进行，加样单位为μl。
| 标准 | 样品 | |
| 标准 | 10 | |
| 样品 | 10 | |
| 酶液 | 150 | 150 |
| 混匀，室温或37℃温育一定时间 | ||
| 底物液 | 50 | 50 |
| 混匀，室温或37℃温育后测量RLU | ||
三、用适当方法处理作出剂量-反应曲线，根据样品的RLU值从该曲线求出其血清中肌酐的浓度。或直接由公式求出：
肌酐浓度＝(样品RLU/标准RLU)×标准浓度
四、也可用双试剂测定。
本发明的灵敏度更高：因为传统方法是检测颜色深浅，而本发明是测光信号，可一个一个光子计数，所测的最低限更小，因而灵敏度更高。线性范围宽：这是因为传统的测颜色的深浅的分辨率比光子计数的精度要低得多，本发明的化学发光检测范围高达105。安全适用：本发明的化学发光物如鲁米诺等很安全，整个检测过程无有害物出现，无论是检测或处理废物都很安全，有利于环境保护。便于普及：本发明所制备的试剂盒，可用于全自动测量，也可用于手工或半自动测量，适宜大、中、小各层次的医疗和研究机构使用。社会效益巨大：用本发明的化学发光测定方法测定生化指标或免疫物质，可同用一台化学发光仪，不再需要进口昂贵的生化仪，节省大量资金，不只降低了成本，对医疗机构、患者及社会均大有益处。本发明方法简单，适于大、中、小医疗机构广泛推广应用。
Claims (3)
1、血清中肌酐的化学发光测定方法，其特征在于用肌酐氨基水解酶将CR水解成肌酸；再用肌酸脒基水解酶使成肌氨酸；在肌氨酸氧化酶作用下，产生过氧化氢；再经过氧化物酶作用，过氧化氢使化学发光物氧化而发光；光信号的大小与血清中肌酐的浓度呈正相关，即血清中肌酐浓度越大发出的光信号越强；记录这种光信号即可推测血清中肌酐的浓度；用已知浓度的肌酐与测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的肌酐含量可从该曲线推算出来。
2、根据权利要求1所述的血清中肌酐的化学发光测定方法，其特征在于所述的化学发光物为鲁米诺。
3、根据权利要求1所述的血清中肌酐的化学发光测定方法，其特征在于所述的肌酐也可以是尿液中的肌酐。
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