CN1912591A - 体液中α－L－岩藻糖苷酶的化学发光测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明体液中α－L－岩藻糖苷酶的化学发光测定方法，涉及一种在生化分析中医用试剂的化学发光测定方法。现有的方法检测范围窄、灵敏度低、全自动生化仪昂贵等技术问题。解决该技术问题的主要技术方案：体液中α－L－岩藻糖苷酶的化学发光测定方法，其特征在于α－L－岩藻糖苷酶催化MG－CNP－α－L－FUCOSIDE水解，产生M和G及CNP和α－L－岩藻糖；G经GOD作用生成过氧化氢；经HRP催化使化学发光物发光；用已知浓度的α－L－岩藻糖苷酶与测出的光信号，作出剂量－反应曲线；未知样品的α－L－岩藻糖苷酶含量可从该曲线推算出来。它灵敏度更高、线性范围宽、成本低，便于普及，适于大、中、小各类医疗机构广泛应用。

Description

体液中α-L-岩藻糖苷酶的化学发光测定方法

技术领域：本发明涉及一种医用试剂检测方法，特别涉及体液中α-L-岩藻糖苷酶的化学发光测定方法。

背景技术：利用现代生物技术所开发的超微量测定方法，极大的推动了生物和医学各领域的各项临床和科研工作的快速发展，为人类的科学事业和社会进步作出了非凡的贡献。

上世纪七十年代由Arakawa首先发表了应用鲁米诺——过氧化物酶的化学发光反应进行酶免分析的技术，这一技术由于灵敏度高达10^-18mol，可在20分钟内快速测定出结果，可简便实现完全自动化，有效期长达一年以上，无放射性和致畸物质，利于环保而受到普遍欢迎，是目前发展最迅速的检测技术。

目前，化学发光技术在免疫分析中已得到相当普及的程度，已发展为能检测多种生物活性物质的常规监床检测方法，从免疫反应方式分，该方法有两种基本类型，即化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)和免疫化学发光分析(Immunochemiluminometricassay，ICMA)；从发光方式上看，一是将发光物质直接标记到抗体或抗原上，免疫反应后，在起动剂的作用下而发光，另一种是用酶标记抗体或抗原，免疫反应后，加入化学发光底物，在酶催作用下而发光。

该方法虽有突出的优点，但目前仅限于免疫分析，而在生化分析中还是空白。

现在普遍使用的测定体液中α-L-岩藻糖苷酶(AFU)的方法为比色法，该法是利用α-L-岩藻糖苷酶催化MG-CNP-α-L-FUCOSIDE水解，产生M和G及CNP和α-L-岩藻糖，用比色法测定吸光度的变化速率，从而计算血清中的α-L-岩藻糖苷酶的浓度。该法的不足之处主要有：

1、线性范围窄。由于检测对颜色的变化分辨率不像化学发光那么敏感，线性范围不能完全满足临床检测的需要，对高浓度的样品需要经稀释后测定，带来一定不便。

2、灵敏度不如化学发光。酶法是比颜色的深浅，而化学发光是测定光信号，灵敏度要高出许多。

3、只能用仪器操作。有的是测定酶促反应的速率，对时间要求十分严格，手工或半自动操作均难达到要求，只能使用全自动设备进行。

4、全自动生化仪昂贵。目前使用的全自动生化仪几乎全为进口，设备十分昂贵，大多在几十万到几百万之间，中小医院难以承受，普及使用受到限制。

发明内容：本发明所要解决的技术问题是一种提供能克服上述缺陷、且灵敏度高、线性范围宽、方便、安全的体液中α-L-岩藻糖苷酶的化学发光测定方法。解决该技术问题采用的主要技术方案：体液中α-L-岩藻糖苷酶的化学发光测定方法，其特征在于α-L-岩藻糖苷酶催化MG-CNP-α-L-FUCOSIDE水解，产生M和G及CNP和α-L-岩藻糖；G经GOD作用生成过氧化氢；经HRP催化使化学发光物发光；用已知浓度的α-L-岩藻糖苷酶与测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的α-L-岩藻糖苷酶含量可从该曲线推算出来；所述的α-L-岩藻糖苷酶为血清中的α-L-岩藻糖苷酶；所述的化学发光物为鲁米诺。本发明与现有技术相比有如下优点：用化学发光物代替显色物，达到更灵敏、更稳定、范围宽、更安全的目的。用该方法可以制备相应的定量测定α-L-岩藻糖苷酶的商品试剂盒。具体优点是：①灵敏度更高。传统方法是检测颜色深浅，而化学发光是测光信号，可一个一个光子计数，所测的最低限更小，因而灵敏度更高。②线性范围宽。测颜色的深浅的分辨率比光子计数的精度要低得多，化学发光的检测范围高达10⁵。③安全适用。化学发光物如鲁米诺等很安全，整个检测过程无有害物出现，无论是检测或处理废物都很安全，有利于环境保护。④便于普及。本发明所制备的试剂盒，可用于全自动测量，也可用于手工或半自动测量，适宜大、中、小各层次的医疗和研究机构使用。⑤巨大的社会效益。用化学发光法测定生化指标或免疫物质，可同用一台化学发光仪，不再需要进口昂贵的生化仪，节省大量资金，不只降低了成本，对医疗机构、患者及社会均大有益处。

具体实施方式：现举例说明本发明的实施例。α-L-岩藻糖苷酶催化MG-CNP-α-L-FUCOSIDE水解，产生M和G及CNP和α-L-岩藻糖；G经GOD作用生成过氧化氢；经HRP催化使化学发光物发光；用已知浓度的α-L-岩藻糖苷酶与测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的α-L-岩藻糖苷酶含量可从该曲线推算出来；所述的α-L-岩藻糖苷酶为血清中的α-L-岩藻糖苷酶；所述的化学发光物为鲁米诺；这便是本发明的体液中α-L-岩藻糖苷酶的化学发光测定方法。

本发明的反应原理用式子表示如下：

一、试剂配制：

Good’S缓冲液，含MG-CNP-α-L-Fucoside；

α-L-岩藻糖苷酶标准(或替代品)：单一或系列浓度；

底物液。

二、测定程序，按下表进行，加样单位为μl。

	标准	样品
			标准	10
样品		10
			缓冲液	100	100
底物液	50	50
			混匀，室温或37℃温育后测量RLU

三、用适当方法处理作出剂量-反应曲线，根据样品的RLU值从该曲线求出其血清中α-L-岩藻糖苷酶的浓度。或直接由公式求出：

α-L-岩藻糖苷酶浓度＝(样品RLU/标准RLU)×标准浓度

四、也可用双试剂测定。

五、参考值(37℃)：5.0～40.0U/L；5.0～36.0U/L(两步法)

α-L-岩藻糖苷酶，货号049660；3.2mol/L硫酸铵，含NaH₂PO₄和柠檬酸盐，pH6.0。

本发明的灵敏度更高：因为传统方法是检测颜色深浅，而本发明是测光信号，可一个一个光子计数，所测的最低限更小，因而灵敏度更高。线性范围宽：这是因为传统的测颜色的深浅的分辨率比光子计数的精度要低得多，本发明的化学发光检测范围高达10⁵。安全适用：本发明的化学发光物如鲁米诺等很安全，整个检测过程无有害物出现，无论是检测或处理废物都很安全，有利于环境保护。便于普及：本发明所制备的试剂盒，可用于全自动测量，也可用于手工或半自动测量，适宜大、中、小各层次的医疗和研究机构使用。社会效益巨大：用本发明的化学发光测定方法测定生化指标或免疫物质，可同用一台化学发光仪，不再需要进口昂贵的生化仪，节省大量资金，不只降低了成本，对医疗机构、患者及社会均大有益处。本发明方法简单，适于大、中、小医疗机构广泛推广应用。

Claims (2)

1、体液中α-L-岩藻糖苷酶的化学发光测定方法，其特征在于α-L-岩藻糖苷酶催化MG-CNP-α-L-FUCOSIDE水解，产生M和G及CNP和α-L-岩藻糖；G经GOD作用生成过氧化氢；经HRP催化使化学发光物发光；用已知浓度的α-L-岩藻糖苷酶与测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的α-L-岩藻糖苷酶含量可从该曲线推算出来；所述的α-L-岩藻糖苷酶为血清中的α-L-岩藻糖苷酶。

2、根据权利要求1所述的体液中α-L-岩藻糖苷酶的化学发光测定方法，其特征在于所述的化学发光物为鲁米诺。