CN1908628A - 血清中肌酸激酶同工酶的化学发光测定方法 - Google Patents

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王京
高淑舫
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Abstract

本发明血清中肌酸激酶同工酶的化学发光测定方法，涉及一种在生化分析中医用试剂的化学发光测定方法。现有的方法检测范围窄、灵敏度低等技术问题。解决该技术问题的主要技术方案：其特征在于在CK－M单体抗体存在下，全部CK－MM和50％CK－MB活性被抑制；利用CK催化磷酸肌酸与二磷酸腺苷反应生成三磷酸腺苷与肌酸；三磷酸腺苷及甘油经催化生成3－磷酸甘油；后者酶氧化，产生的过氧化氢经过氧化物酶作用，使化学发光物氧化而发光；肌酸激酶浓度越大发出的光信号越强；用已知浓度的肌酸激酶与测出的光信号，作出剂量－反应曲线；未知样品的肌酸激酶含量可从该曲线推算出来。它灵敏度更高、线性范围宽，适于各类医疗机构广泛应用。

Description

血清中肌酸激酶同工酶的化学发光测定方法
技术领域：本发明涉及一种医用试剂检测方法，特别涉及血清中肌酸激酶同工酶的化学发光测定方法。
背景技术：利用现代生物技术所开发的超微量测定方法，极大的推动了生物和医学各领域的各项临床和科研工作的快速发展，为人类的科学事业和社会进步作出了非凡的贡献。
上世纪七十年代由Arakawa首先发表了应用鲁米诺——过氧化物酶的化学发光反应进行酶免分析的技术，这一技术由于灵敏度高达10-18mol，可在20分钟内快速测定出结果，可简便实现完全自动化，有效期长达一年以上，无放射性和致畸物质，利于环保而受到普遍欢迎，是目前发展最迅速的检测技术。
目前，化学发光技术在免疫分析中已得到相当普及的程度，已发展为能检测多种生物活性物质的常规监床检测方法，从免疫反应方式分，该方法有两种基本类型，即化学发光免疫分析(CLIA)和免疫化学发光分析(ICMA)；从发光方式上看，一是将发光物质直接标记到抗体或抗原上，免疫反应后，在起动剂的作用下而发光，另一种是用酶标记抗体或抗原，免疫反应后，加入化学发光底物，在酶催作用下而发光。
该方法虽有突出的优点，但目前仅限于免疫分析，而在生化分析中还是空白。
肌酸激酶同工酶(CK-MB)主要存在于心肌中，检测CK-MB活力对急性心肌梗塞、甲状腺功能低下、骨骼肌损伤和休克具有重要价值。
现在普遍使用的测定血清中CK-MB的方法为比色法，先进行电泳或离子交换层析等分离，再进行酶促显色测定。该法是利用CK催化磷酸肌酸(CrP)与二磷酸腺苷(ADP)反应生成三磷酸腺苷(ATP)与肌酸(Cr)，己糖激酶(HK)催化葡萄糖与ATP反应，形成葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化葡萄糖-6-磷酸氧化，形成6-磷酸葡萄糖内酯及NADPH，NADPH生成的速率代表CK-MB活力。该法的不足之处主要有：
1、线性范围窄。由于检测光吸收，其分辨率不像化学发光那么敏感，线性范围不能完全满足临床检测的需要，对高浓度的样品需要经稀释后测定，带来一定不便。
2、灵敏度不如化学发光。化学发光是测定光信号，灵敏度要比测光吸收高出许多。
3、试剂成份复杂，操作烦琐，容易造成误差，影响测定结果的准确性。
发明内容：本发明所要解决的技术问题是一种提供能克服上述缺陷、且灵敏度高、线性范围宽、方便、安全的血清中肌酸激酶同工酶的化学发光测定方法。解决该技术问题采用的主要技术方案：血清中肌酸激酶同工酶的化学发光测定方法，其特征在于在CK-M单体抗体存在下，标本中的全部CK-MM和50％CK-MB活性被抑制，而CK-MB中的B亚基活性不受影响，将CK-B活性测定值乘以2即得CK-MB活性；利用CK催化磷酸肌酸(CrP)与二磷酸腺苷(ADP)反应生成三磷酸腺苷(ATP)与肌酸(Cr)；再用甘油激酶(GK)催化三磷酸腺苷(ATP)及甘油生成3-磷酸甘油(G-3-P)；3-磷酸甘油(G-3-P)被磷酸甘油氧化酶(GPO)氧化，并产生过氧化氢；再经过氧化物酶作用，过氧化氢使化学发光物氧化而发光；光信号的大小与肌酸激酶的浓度呈正相关，即肌酸激酶浓度越大发出的光信号越强；记录这种光信号即可推测肌酸激酶的浓度；用已知浓度的肌酸激酶与测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的肌酸激酶含量可从该曲线推算出来；所述的化学发光物为鲁米诺。本发明与现有技术相比有如下优点：用化学发光物代替显色物，达到更灵敏、更稳定、范围宽、更安全的目的。用该方法可以制备相应的定量测定血清中肌酸激酶的商品试剂盒。具体优点是：①灵敏度更高。传统方法是检测颜色深浅，而化学发光是测光信号，可一个一个光子计数，所测的最低限更小，因而灵敏度更高。②线性范围宽。测颜色的深浅的分辨率比光子计数的精度要低得多，化学发光的检测范围高达105。③安全适用。化学发光物如鲁米诺等很安全，整个检测过程无有害物出现，无论是检测或处理废物都很安全，有利于环境保护。④便于普及。本发明所制备的试剂盒，可用于全自动测量，也可用于手工或半自动测量，适宜大、中、小各层次的医疗和研究机构使用。⑤巨大的社会效益。用化学发光法测定生化指标或免疫物质，可同用一台化学发光仪，不再需要进口昂贵的生化仪，节省大量资金，不只降低了成本，对医疗机构、患者及社会均大有益处。
具体实施方式：现举例说明本发明的实施例。血清中肌酸激酶同工酶的化学发光测定方法，其特征在于在CK-M单体抗体存在下，标本中的全部CK-MM和50％CK-MB活性被抑制，而CK-MB中的B亚基活性不受影响，将CK-B活性测定值乘以2即得CK-MB活性；利用CK催化磷酸肌酸(CrP)与二磷酸腺苷(ADP)反应生成三磷酸腺苷(ATP)与肌酸(Cr)；再用甘油激酶(GK)催化三磷酸腺苷(ATP)及甘油生成3-磷酸甘油(G-3-P)；3-磷酸甘油(G-3-P)被磷酸甘油氧化酶(GPO)氧化，并产生过氧化氢；再经过氧化物酶作用，过氧化氢使化学发光物氧化而发光；光信号的大小与肌酸激酶的浓度呈正相关，即肌酸激酶浓度越大发出的光信号越强；记录这种光信号即可推测肌酸激酶的浓度；用已知浓度的肌酸激酶与测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的肌酸激酶含量可从该曲线推算出来；所述的化学发光物为鲁米诺；这便是本发明的血清中肌酸激酶同工酶的化学发光测定方法。
本发明的反应原理用式子表示如下：
一、试剂包括：
混合酶液(含抗-CK-M)；
肌酸激酶(或替代品)标准：单一或系列浓度；
底物液
二、测定程序，按下表进行，加样单位为μl。
  标准   样品
  标准   10
  样品   10
  酶液  100   100
  底物液  50   50
  混匀，室温或30~37℃温育后测量RLU
三、用适当方法处理作出剂量-反应曲线，根据样品的RLU值从该曲线求出其血清中肌酸激酶的浓度。或直接由公式求出：
CK-MB浓度＝(样品RLU/标准RLU)×标准浓度×2
四、也可用双试剂测定。
本发明的灵敏度更高：因为传统方法是检测颜色深浅，而本发明是测光信号，可一个一个光子计数，所测的最低限更小，因而灵敏度更高。线性范围宽：这是因为传统的测颜色的深浅的分辨率比光子计数的精度要低得多，本发明的化学发光检测范围高达105。安全适用：本发明的化学发光物如鲁米诺等很安全，整个检测过程无有害物出现，无论是检测或处理废物都很安全，有利于环境保护。便于普及：本发明所制备的试剂盒，可用于全自动测量，也可用于手工或半自动测量，适宜大、中、小各层次的医疗和研究机构使用。社会效益巨大：用本发明的化学发光测定方法测定生化指标或免疫物质，可同用一台化学发光仪，不再需要进口昂贵的生化仪，节省大量资金，不只降低了成本，对医疗机构、患者及社会均大有益处。本发明方法简单，适于大、中、小医疗机构广泛推广应用。

Claims (2)

1、血清中肌酸激酶同工酶的化学发光测定方法，其特征在于在CK-M单体抗体存在下，标本中的全部CK-MM和50％CK-MB活性被抑制，而CK-MB中的B亚基活性不受影响，将CK-B活性测定值乘以2即得CK-MB活性；利用CK催化磷酸肌酸(CrP)与二磷酸腺苷(ADP)反应生成三磷酸腺苷(ATP)与肌酸(Cr)；再用甘油激酶(GK)催化三磷酸腺苷(ATP)及甘油生成3-磷酸甘油(G-3-P)；3-磷酸甘油(G-3-P)被磷酸甘油氧化酶(GPO)氧化，并产生过氧化氢；再经过氧化物酶作用，过氧化氢使化学发光物氧化而发光；光信号的大小与肌酸激酶的浓度呈正相关，即肌酸激酶浓度越大发出的光信号越强；记录这种光信号即可推测肌酸激酶的浓度；用已知浓度的肌酸激酶与测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的肌酸激酶含量可从该曲线推算出来。
2、根据权利要求1所述的血清中肌酸激酶同工酶的化学发光测定方法，其特征在于所述的化学发光物为鲁米诺。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN102154443A (zh) * 2011-03-25 2011-08-17 浙江东瓯诊断产品有限公司 一种肌酸激酶mb同工酶活性测定试剂及其制备方法
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CN106461662A (zh) * 2014-04-30 2017-02-22 和光纯药工业株式会社 肌酸激酶mb同工酶的测定方法以及其中使用的试剂盒
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