CN113189337B - 一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，属于肌酸激酶检测技术领域。所述试剂盒包括试剂R0、试剂RM和试剂R1；试剂R0包括缓冲液、氯化钠、保护剂、防腐剂、肌酸激酶同工酶B亚基抗体；试剂RM包括缓冲液、包被肌酸激酶MM同工酶包被抗体的磁性微球、保护剂、表面活性剂、稳定剂、防腐剂；试剂R1包括缓冲液、包被碱性磷酸酶的肌酸激酶MM同工酶标记抗体、保护剂、表面活性剂、稳定剂、防腐剂。本申请试剂盒灵敏度高、特异性好、具有较高的线性范围和耐HOOK性，能够检测干滤血片、血清或尿液样本中的CKMM，适用范围更广。

Description

一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒
技术领域
本申请涉及肌酸激酶检测技术领域，特别涉及一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒。
背景技术
肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，主要分布于骨骼肌与心肌，其次为脑组织，对肌酸激酶进行活性测定可以用于骨骼肌疾病及心肌疾病的诊断。肌酸激酶有4种形式的同工酶，CKMM为肌型同工酶，主要分布于骨骼肌；CKMB为心型同工酶，主要分布于心肌；CKBB为脑型同工酶，主要分布于脑组织；CKMiMi为线粒体型同工酶，主要分布于心肌和骨骼肌线粒体中。其中CKMM对于肌肉损伤及新生儿Duchenne型肌营养不良具有极大的诊断价值。
CKMM为含有2个M亚基的肌酸激酶同工酶，CKMB为含有1个M亚基，1个B亚基的肌酸激酶同工酶。如果检测CKMM试剂中抗体筛选特异性不高，会产生与CKMB中M亚基的交叉反应。即使是筛选出针对M亚基的抗体，混合检测CKMM和CKMB时也会有部分CKMB被检测出，不利于特异性的检测CKMM。所以，目前相关的肌酸激酶同工酶的检测试剂盒检测特异性不高，检测线性范围较低，不能满足临床的要求。
发明内容
针对相关的肌酸激酶同工酶检测试剂盒检测特异性不高，检测线性范围较低的问题，本申请提供一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒。
本申请的一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒是通过以下技术方案得以实现的。
一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，包括试剂R0、试剂RM和试剂R1；
所述试剂R0包括20-50mmol/L缓冲液、9g/L氯化钠、0.5-1g/L保护剂、0.05-0.1g/L防腐剂、10-100mmol/L肌酸激酶同工酶B亚基抗体；
所述试剂RM包括20-50mmol/L缓冲液、0.2-2g/L包被肌酸激酶MM同工酶包被抗体的磁性微球、0.5-10g/L保护剂、1-2g/L表面活性剂、1-10g/L稳定剂、0.05-0.1g/L防腐剂；
所述试剂R1包括20-50mmol/L缓冲液、1-20ug/ml包被碱性磷酸酶的肌酸激酶MM同工酶标记抗体、0.5-10g/L保护剂、1-2g/L表面活性剂、1-10g/L稳定剂、0.05-0.1g/L防腐剂。
通过采用上述技术方案，本申请一方面采用了更高灵敏度的化学发光检测方法，另一方面加入了专门针对CKMB B亚基的抗体对CKMB进行提前封闭阻断，可有效提高检测线性范围，提高检测的特异性和灵敏性。
具体的，由于尿液中CKMM的含量比血液中的要低，需要灵敏度更高的检测试剂盒或方法对其进行检测，所以本申请采用检测灵敏度及检测精密度较高的化学发光免疫分析法对待测样品中的CKMM进行检测，较相关的肌酸激酶同工酶检测试剂采用的荧光免疫方法，更能够满足对临床尿液样本的检测。
本申请试剂盒中含有试剂R0，试剂R0中的B亚基抗体能够特异性的阻断CKMB，在加入RM和R1试剂后，确保了M亚基抗体仅能够与样品中的CKMM结合，而不与CKMB结合，从而提高了检测的特异性，而且，通过阻断CKMB可提高检测线性范围，具有更高的线性和耐HOOK效应。
本申请试剂盒中的三种抗体经过多次筛选得到，具有不同的作用。本申请抗体筛选通过化学发光法进行，结合检测天然CKMM和CKMB判断抗体的结合特性和配对，故筛选得到的抗体灵敏度较高且测定天然样本互换性较高，可直接用于试剂盒制备。其中，R0中的B亚基抗体不能与RM和R1中的M亚基抗体结合，但可与CKMB结合，可起到阻断CKMB与RM中M亚基抗体结合的作用。RM中的M亚基抗体可与R1中的M亚基抗体配对特异性识别CKMM。
综上所述，本申请通过采用化学发光免疫分析法以及在试剂盒中加入B亚基抗体阻断CKMB，可显著提高检测灵敏度，提高肌肉损伤及新生儿Duchenne型肌营养不良的诊断效率，避免病情的延误；可提高检测特异性、线性范围和HOOK限，充分避免假性结果的出现，提高检测结果的准确度和可靠度。
一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，包括试剂RM和试剂R1；
所述试剂RM包括20-50mmol/L缓冲液、10-100mmol/L肌酸激酶同工酶B亚基抗体、0.2-2g/L包被肌酸激酶MM同工酶包被抗体的磁性微球、0.5-10g/L保护剂、1-2g/L表面活性剂、1-10g/L稳定剂、0.05-0.1g/L防腐剂；
所述试剂R1包括20-50mmol/L缓冲液、1-20ug/ml包被碱性磷酸酶的肌酸激酶MM同工酶标记抗体、0.5-10g/L保护剂、1-2g/L表面活性剂、1-10g/L稳定剂、0.05-0.1g/L防腐剂。
通过采用上述技术方案，本申请试剂盒还可将上述R0试剂和RM试剂进行混合得到同时含有肌酸激酶同工酶B亚基抗体和包被肌酸激酶MM同工酶包被抗体的磁性微球的RM试剂，对待测样品进行检测时，可将样本与含有两种抗体的RM试剂反应一段时间，再加入R1试剂，从而实现通过混合一步法化学发光检测待测样品中的CKMM，检测灵敏度高、特异性好，具有较高线性范围和耐HOOK性，而且检测过程进一步简化，缩短了操作时间，提高了检测效率。
进一步的，所述试剂盒的检测样本为干滤血片、血清或尿液。
通过采用上述技术方案，采用本申请试剂盒测试干滤血片中的CKMM可对新生儿Duchenne型肌营养不良具有诊断作用，测试血清或尿液中CKMM可监测肌肉损伤情况。本申请的试剂盒能够对干滤血片、血清或尿液中的肌酸激酶MM同工酶进行检测，使用范围较现有的试剂盒更广，更能满足临床的要求。
进一步的，所述缓冲液选用磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液。
通过采用上述技术方案，本申请的缓冲液能够为抗体提供一个良好的贮存环境和工作环境，维持抗体的稳定性和活性，从而提高检测结果的准确性和可靠性，同时延长试剂盒的使用期限。
进一步的，所述保护剂选用BSA、酪蛋白和动物血清中的一种或几种。
通过采用上述技术方案，本申请在试剂中加入BSA、酪蛋白和动物血清中的一种或几种保护剂，对肌酸激酶同工酶B亚基抗体、肌酸激酶同工酶M亚基抗体起到了很好的保护作用，防止抗体活性降低甚至失活现象的发生，提高试剂盒的检测灵敏度。
进一步的，所述表面活性剂选用选用吐温20、吐温80和曲拉通100中的一种或几种。
通过采用上述技术方案，本申请在试剂中加入上述表面活性剂中的一种或几种，表面活性剂的加入可以使试剂中的各组分充分分散，试剂的均一性得到了显著的提高，沉淀的形成量显著降低。
进一步的，所述防腐剂选用选用proclin300、叠氮钠和硫柳汞中的一种或几种。
通过采用上述技术方案，本申请在试剂中还加入可以延长试剂有效性的防腐剂，延长了试剂盒的使用期限，同时还降低了假阳性结果的发生率，检测结果更加准确可靠。
进一步的，所述稳定剂选用聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、蔗糖和海藻糖中的一种或几种。
通过采用上述技术方案，本申请试剂中稳定剂联合保护剂和表面活性剂，可以提高试剂的稳定性，从而提高检测结果的准确性。
进一步的，所述试剂盒中还包括校准品，校准品选用天然CKMM冻干品。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请试剂盒采用化学发光免疫分析法，具有更高的灵敏度；
2、本申请试剂盒设有阻断CKMB的肌酸激酶同工酶B亚基抗体，确保肌酸激酶同工酶M亚基抗体仅对样品中的CKMM进行检测，检测特异性显著提高，同时通过阻断CKMB可提高检测线性范围，具有更高的线性和耐HOOK效应；
3、本申请试剂盒检测方法简单，检测时间短，检测效率较高。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
本申请的化学发光液购自北京德奥平生物技术有限公司，型号DF-01；
本申请的天然CKMM冻干品、天然CKMB冻干品购自北京德奥平生物技术有限公司。
制备例1
试剂RM的制备
(1)用移液枪量取1.5mL磁性微球(10％固含量)于相应的离心管中，在磁力架上磁吸3min，弃上清，加入5mL包被缓冲液，涡旋混匀10秒，再磁吸3min弃上清，加入4mL包被缓冲液；所述包被缓冲液为50mmol/L磷酸缓冲液；
(2)加入2mg CKMM包被抗体，涡旋10s，置于振荡器在37℃干燥箱中混匀4h(振荡器参数：1000rpm)；
(3)加入1mL的封闭液，置于振荡器在37℃干燥箱中混匀4h(振荡器参数：1000rpm)；
(4)磁吸3min，去除上清液，用10mL磁珠保存缓冲液反复颠倒20次，混合均匀；
所述磁珠保存缓冲液的成分包括20mmol/L Tris缓冲液，0.1％BSA，0.1％Tween20，0.1％聚乙二醇6000，0.01％proclin300；
(5)再次磁吸3min，去除上清液，将磁珠倒入盛有500mL磁珠保存缓冲液的烧杯中，得到试剂RM，2-8℃储存备用。
制备例2
试剂RM的制备
(1)用移液枪量取1.5mL磁性微球(10％固含量)于相应的离心管中，在磁力架上磁吸3min，弃上清，加入5mL包被缓冲液，涡旋混匀10秒，再磁吸3min弃上清，加入4mL包被缓冲液；所述包被缓冲液为50mmol/L磷酸缓冲液；
(2)加入2mg CKMM包被抗体，涡旋10s，置于振荡器在37℃干燥箱中混匀4h(振荡器参数：1000rpm)；
(3)加入1mL的封闭液，置于振荡器在37℃干燥箱中混匀4h(振荡器参数：1000rpm)；
(4)磁吸3min，去除上清液，用10mL磁珠保存缓冲液反复颠倒20次，混合均匀；
所述磁珠保存缓冲液的成分包括20mmol/L Tris缓冲液，0.1％BSA，0.1％Tween20，0.1％聚乙二醇6000，0.01％proclin300；
(5)再次磁吸3min，去除上清液，将磁珠倒入盛有500mL磁珠保存缓冲液的烧杯中，再加入30mmol/L肌酸激酶同工酶B亚基抗体，得到试剂RM，2-8℃储存备用。
制备例3
试剂R1的制备
(1)取1mg CKMM标记抗体，加入1mg EDC(EDC用水配置成10mg/mL，现用现配)，室温静置20min；
(2)取2mg碱性磷酸酶加入适量纯化水稀释到1mg/mL；加入纯化水量(mL)＝2-(2/C)，碱性磷酸酶加入体积(mL)＝2/C，其中，C(mg/mL)为碱性磷酸酶的浓度；
(3)将步骤(1)获得的混合物和步骤(2)获得的混合物进行混合，室温静置反应60min；
(4)将步骤(3)静置后得到的混合物置于7K孔径透析袋中，并置于500mL酶标记物保存缓冲液中，2-8℃放置4h进行透析，重复此步骤2次；
所述酶标记物保存缓冲液的成分包括25mmol/L Tris缓冲液，0.1％BSA，0.1％Tween20，0.1％聚乙二醇6000，0.01％proclin300；
(5)透析完成后，向透析袋中的混合物中加入酶标记物保存缓冲液至1000mL，得到试剂R1(碱性磷酸酶浓度2ug/mL)，2-8℃保存备用。
制备例4
本申请选用的肌酸激酶同工酶M亚基抗体和肌酸激酶同工酶B亚基抗体参见表1，以下抗体购自北京德奥平生物技术有限公司。
表1
Figure BDA0003044617570000051
Figure BDA0003044617570000061
(1)CKMM配对抗体的筛选
采用制备例1和制备例3的方法将表1中的肌酸激酶同工酶M亚基抗体与磁性微球进行耦联或与碱性磷酸酶耦联，并采用棋盘法将所有的CKMM抗体进行配对筛选，使用化学发光仪采用一步法对不同浓度的天然CKMM冻干品进行测定，最终筛选到灵敏度最高的一组配对抗体，即C-CKA-1-Z和C-CKA-13-B，检测灵敏度为20ng/ml。
(2)CKMB B亚基抗体的筛选
采用制备例1的方法将天然CKMB冻干品耦联至磁性微球中，采用制备例3的方法将肌酸激酶同工酶B亚基抗体与碱性磷酸酶耦联，然后将二者进行混合使用化学发光仪采用一步法进行检测，筛选得到出现信号值的5株抗体(参见表1)；将得到的5株抗体与上述耦联了磁性微球的CKMM抗体进行棋盘配对试验，筛选出不产生信号值(信号值与空白对比接近本底)的抗体，最终筛选出的B亚基阻断抗体为C-CKA-5-S，此抗体与CKMM抗体无配对反应。筛选结果参见表2。
表2
Figure BDA0003044617570000062
Figure BDA0003044617570000071
Figure BDA0003044617570000081
实施例1
一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，包括试剂R0、试剂RM和试剂R1；
所述试剂R0包括20mmol/L磷酸盐缓冲液、9g/L氯化钠、1g/L BSA、0.1g/Lproclin300、30mmol/L制备例4筛选的肌酸激酶同工酶B亚基抗体(C-CKA-5-S抗体)；
所述试剂RM采用制备例1的方法制备，其中CKMM包被抗体选用C-CKA-1-Z抗体；
所示试剂R1采用制备例3的方法制备，其中CKMM标记抗体选用C-CKA-13-B抗体。
实施例2
一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，包括试剂RM和试剂R1；
所述试剂RM采用制备例2的方法制备，其中，CKMM包被抗体选用C-CKA-1-Z抗体，肌酸激酶同工酶B亚基抗体选用C-CKA-5-S抗体；
所述试剂R1采用制备例3的方法制备，其中CKMM标记抗体选用C-CKA-13-B抗体。
对比例
一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，与实施例1不同之处在于，不包括试剂R0。
性能检测
采用本申请实施例1、2试剂盒以及对比例1试剂盒对校准品进行性能评价，包括最低检出限，线性范围，重复性，批间差，准确度，HOOK范围，交叉反应，检测结果参见表3。
本申请实施例1试剂盒的使用方法如下：向待测样本中加入50ul试剂R0，反应5min；再加入50ul试剂RM和50ul试剂R1，反应5min，加入洗脱液洗涤三次，再加入发光液，采用化学发光仪监测光子数。
本申请实施例2试剂盒的使用方法如下：向待测样本中加入50ul试剂RM，反应5min；再加入50ul试剂R1，反应5min，加入洗脱液洗涤三次，再加入发光液，采用化学发光仪监测光子数。
本申请对比例1试剂盒的使用方法如下：向待测样品中加入50ul试剂RM和50ul试剂R1，反应5min，加入洗脱液洗涤三次，再加入发光液，采用化学发光仪监测光子数。
表3
Figure BDA0003044617570000091
从表3可以看出，本申请实施例1-2试剂盒在最低检出限、线性范围和耐HOOK效应方面均显著优于对比例1试剂盒；另外，实施例1试剂盒在最低检出限、线性范围和耐HOOK效应方面又优于实施例2试剂盒。以上实验结果表明，本申请试剂盒通过采用化学发光免疫分析法以及加入B亚基抗体阻断CKMB，显著提高了检测灵敏度、特异性、线性范围和HOOK限。
本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于：包括试剂R0、试剂RM和试剂R1；
所述试剂R0包括20-50mmol/L缓冲液、9g/L氯化钠、0.5-1g/L保护剂、0.05-0.1g/L防腐剂、10-100mmol/L肌酸激酶同工酶B亚基抗体；
所述试剂RM包括20-50mmol/L缓冲液、0.2-2g/L包被肌酸激酶MM同工酶包被抗体的磁性微球、0.5-10g/L保护剂、1-2g/L表面活性剂、1-10g/L稳定剂、0.05-0.1g/L防腐剂；
所述试剂R1包括20-50mmol/L缓冲液、1-20ug/ml包被碱性磷酸酶的肌酸激酶MM同工酶标记抗体、0.5-10g/L保护剂、1-2g/L表面活性剂、1-10g/L稳定剂、0.05-0.1g/L防腐剂；
所述肌酸激酶同工酶B亚基抗体选用C-CKA-5-S抗体；所述肌酸激酶MM同工酶包被抗体选用C-CKA-1-Z抗体；所述肌酸激酶MM同工酶标记抗体选用C-CKA-13-B抗体；上述抗体均购自北京德奥平生物技术有限公司。
2.一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于：包括试剂RM和试剂R1；
所述试剂RM包括20-50mmol/L缓冲液、10-100mmol/L肌酸激酶同工酶B亚基抗体、0.2-2g/L包被肌酸激酶MM同工酶包被抗体的磁性微球、0.5-10g/L保护剂、1-2g/L表面活性剂、1-10g/L稳定剂、0.05-0.1g/L防腐剂；
所述试剂R1包括20-50mmol/L缓冲液、1-20ug/ml包被碱性磷酸酶的肌酸激酶MM同工酶标记抗体、0.5-10g/L保护剂、1-2g/L表面活性剂、1-10g/L稳定剂、0.05-0.1g/L防腐剂；
所述肌酸激酶同工酶B亚基抗体选用C-CKA-5-S抗体；所述肌酸激酶MM同工酶包被抗体选用C-CKA-1-Z抗体；所述肌酸激酶MM同工酶标记抗体选用C-CKA-13-B抗体；上述抗体均购自北京德奥平生物技术有限公司。
3.根据权利要求1或2所述的一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的检测样本为干滤血片、血清或尿液。
4.根据权利要求1或2所述的一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液选用磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液。
5.根据权利要求1或2所述的一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于：所述保护剂选用BSA、酪蛋白和动物血清中的一种或几种。
6.根据权利要求1或2所述的一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂选用吐温20、吐温80和曲拉通100中的一种或几种。
7.根据权利要求1或2所述的一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于：所述防腐剂选用proclin300、叠氮钠和硫柳汞中的一种或几种。
8.根据权利要求1或2所述的一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于：所述稳定剂选用聚乙二醇2000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、蔗糖和海藻糖中的一种或几种。
9.根据权利要求1或2所述的一种特异性检测肌酸激酶同工酶的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括校准品，校准品选用天然CKMM冻干品。
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