CN106093386A - 一种测定肌酸激酶同工酶（ck‑mb）的试剂盒 - Google Patents
一种测定肌酸激酶同工酶（ck‑mb）的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定肌酸激酶同工酶（CK‑MB）的试剂盒。本发明针现有技术中检测肌酸激酶同工酶存在过程复杂、不适用于大批量快速检测的问题，提出以下的解决方案：一种测定肌酸激酶同工酶（CK‑MB）的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中试剂R1含有缓冲液20~180mmol/L、葡萄糖10~60mmol/L、ADP 0.1~4.0mmol/L、NADP 1~7mmol/L、NAC、5~35mmol/L、HK0.01~4.00KU/L、G‑6‑PD、0.01~3.00KU/L、其余为纯化水；其中试剂R2包含缓冲液20~180mmol/L、CrP、10~50mmol/L、防腐剂、0.01~1.0g/L、抗CK‑M抗体>2100U/L、其余为纯化水。本发明具有准确度高、操作方便等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定肌酸激酶同工酶（CK-MB）的试剂盒。
背景技术
肌酸激酶（CK）有三种主要的同工酶，即CK-MM，CK-MB，CK-BB。肌肉型（MM）主要存在于各种肌肉细胞中，脑型（BB）主要存在于脑细胞中，杂化型（MB）主要存在于心肌细胞中，肌酸激酶MB同工酶（CK-MB）是心肌酶谱中最有特异性的酶。
人体中肌酸激酶同工酶升高有以下情形：急性心肌梗死（CK-MB>0.03，可达0.12～0.38）、甲状腺功能减低症、脑血管疾病、肺部疾病、慢性醇中毒、手术后恢复期肌肉痉挛、心脏复苏后、休克、破伤风、骨骼肌损伤等同工酶分析只发现有CK-MM型，无CK-MB型、也检不出CK-BB型。药物注射（氯丙嗪、苯巴比妥、青霉素、利血平、苯妥英钠、肾上腺素、多粘菌素B）肌肉损伤可检出CK-MM型
肌酸激酶的同功酶在临床诊断中有十分重要的意义，在各种病变包括肌肉萎缩和心肌梗塞发生时，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，认为在心肌梗塞的诊断中测定肌酸激酶的活性比做心电图更为可靠。心肌梗死时，肌酸激酶在起病6小时内升高，24小时达高峰，3-4日内恢复正常。其中肌酸激酶的同工酶CK-MB诊断的特异性最高。肌酸激酶因其具有重要的生理功能和临床应用价值已引起人们广泛的重视和深入的研究。
目前，临床上用于检测肌酸激酶同工酶（CK-MB）的方法有免疫比浊法、酶联免疫吸附法和免疫抑制法等。酶联免疫吸附法检测耗时且操作复杂，不适用于大批量快速检测。胶乳增强免疫比浊法反应后会产生胶乳颗粒物的沉淀，不利于仪器的清洗，且检测精度差。
发明内容
本发明针现有技术中检测肌酸激酶同工酶存在过程复杂、不适用于大批量快速检测，检测精度不足等问题，提供一种测定肌酸激酶同工酶（CK-MB）的试剂盒。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：一种测定肌酸激酶同工酶（CK-MB）的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，所述的相互独立的试剂R1和试剂R2包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 20~180mmol/L
葡萄糖 10~60mmol/L
ADP 0.1~4.0mmol/L
NADP 1~7mmol/L
NAC 5~35mmol/L
HK 0.01~4.00KU/L
G-6-PD 0.01~3.00KU/L
其余为纯化水；
试剂R2：
缓冲液 20~180mmol/L
CrP 10~50mmol/L
防腐剂 0.01~1.0g/L
抗CK-M抗体 >2100 U/L
其余为纯化水。
作为优选方案，所述的相互独立的试剂R1和试剂R2包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 100mmol/L
葡萄糖 35mmol/L
ADP 2.0mmol/L
NADP 4.0mmol/L
NAC 20mmol/L
HK 2KU/L
G-6-PD 1.5KU/L
其余为纯化水；
试剂R2：
缓冲液 100mmol/L
CrP 25mmol/L
防腐剂 0.5g/L
抗CK-M抗体 2200 U/L
其余为纯化水。
优选的所述的缓冲液为Tris缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种组合而成。
优选的，所述的防腐剂为苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种组合而成。
优选的，本发明还提供了试剂盒的制备和使用方法，包括以下步骤：
（1）试剂R1液的配制：
（a）按照试剂R1的组分含量，配置成缓冲液；
（b）按照试剂R1的组分含量，将葡萄糖、ADP、NADP、NAC溶于步骤（a）制得的缓冲液中，搅拌均匀；
（c）按照试剂R1的组分含量，称取HK、G-6-PD溶于步骤（b）制得的液体中，搅拌均匀即可。
（2）所述的试剂R2的配制如下：
（a）按照试剂R2的组分含量，配置成缓冲液；
（b）按照试剂R2的组分含量，称取一定量的CrP溶于步骤（a）制得的缓冲液中，搅拌均匀；
（c）按照试剂R2的组分含量，称取抗CK-M抗体溶于步骤（b）制得的液体中，搅拌均匀；
（d）按照试剂R2的组分含量，称取防腐剂溶于步骤（c）制得的液体中，搅拌均
匀即可；
（3）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应，进一步优选试剂R1与试剂R2的体积比为4：1，待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1：20到1：70之间。
（4）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（5）根据吸光度变化值计算出样本中的肌酸激酶同工酶的值。
R2试剂中的抗CK-M抗体抑制CK-M亚基，即抑制CK-MM活性和CK-MB的CK-M亚单位的活性， CK-M抗体抑制CK-M活性；而CK-MB亚单位催化CrP与ADP反应产生ATP与肌酸，偶联HK及G-6-PD的催化反应。HK催化葡萄糖与ATP反应，形成G-6-P，G-6-PD催化G-6-P氧化，使NADP生成NADPH，通过 测定NADPH生成速率可计算CK-MB的活性。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1
缓冲液 100mmol/L
葡萄糖 35mmol/L
ADP 2.0mmol/L
NADP 4.0mmol/L
NAC 20mmol/L
HK 2KU/L
G-6-PD 1.5KU/L
其余为纯化水；
试剂R2：
缓冲液 100mmol/L
CrP 25mmol/L
防腐剂 0.5g/L
抗CK-M抗体 2200 U/L
其余为纯化水。
实施例2
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
（a）按照下列组分含量配制好R1试剂：
缓冲液 100mmol/L
葡萄糖 35mmol/L
ADP 2.0mmol/L
NADP 4.0mmol/L
NAC 20mmol/L
HK 2KU/L
G-6-PD 1.5KU/L
其余为纯化水；
（b）按照下列组分含量配制好R2试剂：
缓冲液 100mmol/L
CrP 25mmol/L
防腐剂 0.5g/L
抗CK-M抗体 2200 U/L
其余为纯化水。
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长340nm，副波长405nm；
（c）反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度 A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；
(d)反应方向：负反应；
4、检测步骤
（a）取200μl试剂R1与5μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入50μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；
(d)样本中肌酸激酶同工酶（CK-MB）（U/mL）=CS×（U/mL）计算出样本中的肌酸激酶同工酶（CK-MB）的活度。
表1为实施例1所制得的测定肌酸激酶同工酶（CK-MB）试剂盒对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的肌酸激酶同工酶（CK-MB）为 25.0 IU/L，测定结果见表1：
表1
| 第1次（IU/L） | 第2次（IU/L） | 第3次（IU/L） | 第4次（IU/L） | 偏差（%） | |
| 实施例1 | 25.7 | 25.4 | 25.1 | 25.4 | 1.60 |
由表1可知，本发明所制得的测定唾液酸的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高。
Claims (7)
1.一种测定肌酸激酶同工酶（CK-MB）的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其特征在于：所述的相互独立的试剂R1和试剂R2包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 20~180mmol/L
葡萄糖 10~60mmol/L
ADP 0.1~4.0mmol/L
NADP 1~7mmol/L
NAC 5~35mmol/L
HK 0.01~4.00KU/L
G-6-PD 0.01~3.00KU/L
其余为纯化水；
试剂R2：
缓冲液 20~180mmol/L
CrP 10~50mmol/L
防腐剂 0.01~1.0g/L
抗CK-M抗体 >2100 U/L
其余为纯化水。
2.如权利要求1所述的一种测定肌酸激酶同工酶（CK-MB）的试剂盒，其特征在于：所述的相互独立的试剂R1和试剂R2包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
缓冲液 100mmol/L
葡萄糖 35mmol/L
ADP 2.0mmol/L
NADP 4.0mmol/L
NAC 20mmol/L
HK 2KU/L
G-6-PD 1.5KU/L
其余为纯化水；
试剂R2：
缓冲液 100mmol/L
CrP 25mmol/L
防腐剂 0.5g/L
抗CK-M抗体 2200 U/L
其余为纯化水。
3.如权利要求1和权利要求2所述的一种测定肌酸激酶同工酶（CK-MB）的试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液为Tris缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或多种组合而成。
4.如权利要求1和权利要求2所述的一种测定肌酸激酶同工酶（CK-MB）的试剂盒，其特征在于：所述的防腐剂为苯酚、苯甲酸钠、叠氮钠中的一种或多种组合而成。
5.如权利要求1所述的一种测定肌酸激酶同工酶（CK-MB）的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒的制备和使用方法包括以下步骤：
（1）试剂R1液的配制：
（a）按照试剂R1的组分含量，配置成缓冲液；
（b）按照试剂R1的组分含量，将葡萄糖、ADP、NADP、NAC溶于步骤（a）制得的缓冲液中，搅拌均匀；
（c）按照试剂R1的组分含量，称取HK、G-6-PD溶于步骤（b）制得的液体中，搅拌均匀即可；
（2）所述的试剂R2的配制如下：
（a）按照试剂R2的组分含量，配置成缓冲液；
（b）按照试剂R2的组分含量，称取一定量的CrP溶于步骤（a）制得的缓冲液中，搅拌均匀；
（c）按照试剂R2的组分含量，称取抗CK-M抗体溶于步骤（b）制得的液体中，搅拌均匀；
（d）按照试剂R2的组分含量，称取防腐剂溶于步骤（c）制得的液体中，搅拌均
匀即可；
（3）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（4）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（5）根据吸光度变化值计算出样本中的肌酸激酶同工酶的值。
6.如权利要求5所述的一种一种测定肌酸激酶同工酶（CK-MB）的试剂盒制备和使用方法，其特征在于：所述的步骤（3）中,试剂R1与试剂R2的体积比为4：1。
7.如权利要求5所述的一种一种测定肌酸激酶同工酶（CK-MB）的试剂盒制备和使用方法，其特征在于：所述的步骤（3）中,待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1：20到1：70之间。
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