CN103320497A - 一种丙氨酸氨基转移酶检测试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种丙氨酸氨基转移酶检测试剂,包括稀释液和反应试剂，稀释液为缓冲液；表面活性剂；防腐剂；去胆红素干扰剂；维生素C氧化酶；反应试剂为缓冲液；L-丙氨酸；α-酮戊二酸；磷酸；丙酮酸氧化酶；焦磷酸硫胺素；氯化镁；过氧化物酶；4-氨基安替比林；色原；防腐剂；冻干保护剂。本发明检测试剂具有良好的灵敏度、准确度、精密度及线性，能完全满足临床检验要求。

Description

一种丙氨酸氨基转移酶检测试剂

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种用于POCT分析仪的丙氨酸氨基转移酶测定试剂。

背景技术

肝病是一种常见的危害性极大的疾病，对其的及时诊断及治疗对于疾病的预防及诊疗有重要作用，丙氨酸氨基转移酶（Alanineaminotransferase，ALT）主要存在于血液和相关组织中，细胞内浓度高于血清浓度1000-3000倍，只要有1%肝组织发生破坏，就可以使血清中浓度升高1倍，被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标，测定ALT的活性对中毒性肝炎、病毒性肝炎、肝硬变活动期、肝癌、阻塞性黄疸、脂肪肝、胆管炎和胆囊炎、心肌梗塞、心肌炎、心血管疾病、骨骼肌疾病、内脏和肌肉炎症性坏死等的诊断具有重要价值。目前ALT普遍采用各种大型全自动生化分析仪检测，但由于大型全自动生化分析仪设备价格高，且操作复杂，操作人员需有相关的专业知识和接受相应的培训，使用配套条件要求高，需配备稳压电源、纯水机等，并且占地面积大，维护费用高，需要专业人员定期保养，因此基层医疗机构或家庭个人都没有条件购买和使用。此外，大型医院患者多，检测手续繁琐、流程长、等待时间长，这也给患者带来了巨大的时间负担，更重要的是病人因不能得到及时诊断而贻误治疗，甚至会失去生命。

即时检验（point-of-caretesting，POCT）是一项新兴的技术领域，主要特点是快速得出结果，操作简便，容易使用和小型化。随着诊断和辅助技术的进步，以及人们对疾病的认识及治疗水平提高的要求，POCT逐渐受到关注。事实上POCT在欧美市场已逐渐成为体外诊断试剂与仪器领域的重要研究项目，已有不少产品投入市场，但这类POCT仪器目前有一个重要缺陷，就是分析仪及试剂耗材特别昂贵，对于中国这样具有庞大基层医疗系统，且试剂使用量极大的国家来说，目前欧美开发的仪器及配套试剂耗材显然都面临挑战。

微流控芯片技术是21世纪世界最为重要的前沿技术之一，它把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测及细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成到一块几十平方厘米（甚至更小）的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，是用以取代常规生物或化学实验室的各种功能的一种技术。将微流控芯片技术引入到POCT设备，开创了POCT发展的新局面，可使以往实验室繁复之全血定量、血球血清分离、血清稀释及同步测定等步骤，在芯片在线自动化作业完成，达到多种标记同步检测目的。结合微流控芯片技术的POCT分析仪兼具高准确度、低需血量、操作简单、检测试剂用量少、成本低等优点，如保生国际生医有限公司的POCT仪，Abaxis公司的Piccolo，Axis-Shield公司的Afinion等，此类POCT分析仪均可实现少量样品即可分析、操作简便、无交叉污染、可自动化作业，非常适用于中国这样具有庞大基层医疗系统且试剂使用量极大的国家。

随着“十一五”计划针对三级及二级医院基础设备的购置与加强，目前中级以上医院已具备良好的软硬件设施，但是基层医疗机构特别是卫生院、卫生所等单位其全自动生化检验仪器设施普遍不足，也没有足够数目的检验专业人员，因此建立操作简易、价格低廉、实时报告的POCT分析系统对发挥广大基层医院在疾病预防及诊疗中的作用有重要的意义。而提供一种可用于上述引入微流控芯片技术的POCT分析仪的丙氨酸氨基转移酶检测试剂成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种可用于引入微流控芯片技术的POCT分析仪的丙氨酸氨基转移酶检测试剂。

本发明可用于引入微流控芯片技术的POCT分析仪的丙氨酸氨基转移酶检测试剂是按以下技术方案实现的：

一种丙氨酸氨基转移酶检测试剂，包括稀释液和反应试剂，其中稀释液是由以下成分组成：

缓冲液（pH6.5-7.5）0.01-1.0mol/L,

表面活性剂0.1-10.0%(质量百分比),

防腐剂0.1-10.0%(质量百分比),

去胆红素干扰剂1-10mol/L或1-100KU/L,

维生素C氧化酶1-100KU/L；

其中所述反应试剂是由以下成分组成：

缓冲液（pH6.0-8.0）0.1-1.0mol/L,

L-丙氨酸20-100mol/L,

α-酮戊二酸1-10mol/L,

磷酸10-100mol/L,

丙酮酸氧化酶10-200KU/L,

焦磷酸硫胺素10-100mol/L,

氯化镁10-100mol/L,

过氧化物酶10-200KU/L,

4-氨基安替比林1-10mol/L,

色原1-10mol/L,

防腐剂0.1-1g/L,

冻干保护剂10-30g/L。

本发明所述的缓冲液可以是三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N,N-双(2-羟基乙烷磺酸)缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-(N-吗啡啉)乙磺酸钠缓冲液、4-（2-羟乙基）哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-4-丁磺酸缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-(环已胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-(环已胺)-1-丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液中的一种或几种。

所述表面活性剂为非离子表面活性剂，如选自TWEEN系列(如吐温（TWEEN）20、吐温40、吐温60、吐温80)，SPAN系列(如司班（SPAN）20、司班40、司班60、司班80)，TRITON系列(如TritonX-100、TritonX-114、TritonX-405)中具体物质的一种或几种（即可以是TWEEN系列、SPAN系列或TRITON系列中的一种具体物质，或每种系列中一种以上的具体物质，或两种或以上系列中的一种具体物质）。

所述去胆红素干扰剂为亚铁氰化钾、高铁氰化钾、胆红素氧化酶中的一种或几种。

所述色原包括酚类，如2-氯酚，2,4-二氯苯酚，4-氯酚，2,6-二氯苯酚等中的一种；和/或苯胺类似物，如N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐,N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基l)-3-甲氧基苯胺钠盐(二水合物)，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐，N-(2-羟基-3-磺丙基)-35-二甲氧基苯胺钠盐,N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺钠盐），3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸等中的一种，优选3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸。

所述防腐剂选自山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、proclin系列防腐剂（如Proclin300）中一种具体物质或尼泊金酯（如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯）中的一种具体物质。

所述冻干保护剂选海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、吐温80、曲拉通X-100、脂肪醇聚氧乙烯醚（Brij-35）中的一种或者几种。

所述ALT测定试剂中稀释液为液体状态，反应试剂为干粉状态。

所述ALT测定试剂的稀释液的制备方法如下：将所述试剂成分加入蒸馏水后混合搅匀。

所述ALT测定试剂的反应试剂的制备方法如下：将所述试剂成分加入蒸馏水后混合搅匀，将0.5-10μl反应试剂加入到反应检测槽，经冻干（行业常规技术）或2-8℃挥干24-72h。

所述ALT测定试剂的测试条件如下：温度：37℃；检测主波长510nm，副波长750nm。

本发明所述的微流控芯片技术是将基本操作单元集成到一块几十平方厘米（甚至更小）的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统的一种技术。其特点在于芯片一般分为上下两层，上层有用于加样的通孔，下层包括样品槽、稀释液槽、样品定量槽、稀释液定量槽、储液槽、多个预装有反应试剂的反应检测槽、一组用于系统校正的自检槽、一组溢流槽、多组控制流体流动的不同形状的微流道等。其检测方法一般包括以下步骤：（1）将样品溶液及稀释液经各自通孔注入到所述的样品槽及稀释液槽中；（2）启动电机旋转所述的芯片；（3）样品溶液在离心力作用下实现固液分离和定量，同时稀释液进入稀释液定量槽；（4）定量的样品与稀释液流入混合槽进行混合；（5）混合后的液体进入反应检测槽与反应试剂进行反应；（6）通过与芯片配套的检测设备在反应检测槽中进行原位检测。

所述ALT测定试剂的测定方法如下：将5-20μl样品加入到样品槽，将20-100μl稀释液加入到稀释液槽，启动电机，37℃反应1min后记录吸光度A1，继续反应5-9min后记录吸光度A2。

所述ALT测定试剂的反应原理为：样本先与稀释液进行混合孵育，以去除样本中的胆红素、维生素C及血脂等干扰物质，混合液进入反应检测槽后，反应试剂中的丙氨酸和α-酮戊二酸在样本中ALT的存在下，通过反应生成谷氨酸和丙酮酸，而丙酮酸与磷酸在丙酮酸氧化酶,硫胺素焦磷酸及镁离子的存在下生成过氧化氢。在过氧化氢酶催化下,过氧化氢与4-氨基安替比林及色原反应会呈色，监测吸光度的生成速率，即可计算出ALT的活力单位。

本发明的优点和有益效果：本发明的试剂具有良好的灵敏度、准确度、精密度及线性，能完全满足临床检验要求。本发明的试剂可用于引入微流控芯片技术的POCT分析仪，从而实现操作简易、价格低廉、实时报告的POCT分析系统的建立。

附图说明

图1ALT线性结果。

图2ALT方法学比对结果。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明作出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1

稀释液：

三羟甲基氨基缓冲液（pH7.0）0.1mol/L

TWEEN805%

Proclin3000.1%

胆红素氧化酶1KU/L

维生素C氧化酶1KU/L

反应试剂：

三羟甲基氨基缓冲液（pH6.0）0.1mol/L

L-丙氨酸20mol/L

α-酮戊二酸1mol/L

磷酸20mol/L

丙酮酸氧化酶20KU/L

焦磷酸硫胺素10mol/L

氯化镁10mol/L

过氧化物酶10KU/L

4-氨基安替比林1mol/L

N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠2mol/L

山梨酸钾0.1g/L

牛血清白蛋白5g/L

实施例2

稀释液：

三羟甲基氨基缓冲液（pH7.5）0.5mol/L

TRITONX-1005%

对羟基苯甲酸甲酯1%

亚铁氰化钾1mol/L

维生素C氧化酶2KU/L

反应试剂：

3-(N-吗啡啉)乙磺酸钠缓冲液（pH7.2）0.5mol/L

L-丙氨酸20mol/L

α-酮戊二酸5mol/L

磷酸10mol/L

丙酮酸氧化酶50KU/L

焦磷酸硫胺素20mol/L

氯化镁10mol/L

过氧化物酶50KU/L

4-氨基安替比林3mol/L

N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺2mol/L

Proclin3001g/L

海藻糖10g/L

实施例3

稀释液：

3-吗啉丙磺酸缓冲液（pH6.5）1.0mol/L

SPAN2010%

苯甲酸钠1%

高铁氰化钾10mol/L

维生素C氧化酶10KU/L

反应试剂：

哌嗪-N,N-双(2-羟基乙烷磺酸)缓冲液（pH8.0）1mol/L

L-丙氨酸50mol/L

α-酮戊二酸2mol/L

磷酸50mol/L

丙酮酸氧化酶100KU/L

焦磷酸硫胺素50mol/L

氯化镁100mol/L

过氧化物酶100KU/L

4-氨基安替比林5mol/L

N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐5mol/L

Proclin3001g/L

脂肪醇聚氧乙烯醚10g/L

下面结合表格对本发明实施例1所得试剂的性能进行说明。

1、精密度

表1、精密度评估结果

2、线性

以标准血清样品外添加不同浓度的分析物进行检测，ALT线性结果图见图1。

3、方法学比对试验

与全自动生化分析仪上测定的ALT结果值进行比较，结果如图2，其中X轴代表全自动生化分析仪日立7180上测定数据，Y轴代表引入微流控芯片技术的POCT分析仪（台湾保生国际，Amishield，TMO-100）上测定数据。

4、检测灵敏度

侦测极限的评估方法用10-20个空白检品讯号强度的标准差，及3-15个最低非零检品讯号强度的标准差，用统计软件EPEvaluatorrelease6计算所得。实验结果显示本发明试剂有不错的灵敏度，能完全符合美国临床实验室改进修正法规。

表2试剂检测灵敏度

从上述检测结果可知，本发明试剂具有良好的灵敏度、准确度、精密度及线性，能完全满足临床检验要求。

Claims (10)

1.一种丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其特征在于：包括稀释液和反应试剂，其中稀释液是由以下成分组成：

缓冲液（pH6.5-7.5）0.01-1.0mol/L,

表面活性剂0.1-10.0%(质量百分比),

防腐剂0.1-10.0%,

去胆红素干扰剂1-10mol/L或1-100KU/L,

维生素C氧化酶1-100KU/L；

其中所述反应试剂是由以下成分组成：

缓冲液（pH6.0-8.0）0.1-1.0mol/L,

L-丙氨酸20-100mol/L,

α-酮戊二酸1-10mol/L,

磷酸10-100mol/L,

丙酮酸氧化酶10-200KU/L,

焦磷酸硫胺素10-100mol/L,

氯化镁10-100mol/L,

过氧化物酶10-200KU/L,

4-氨基安替比林1-10mol/L,

色原1-10mol/L,

防腐剂0.1-1g/L,

冻干保护剂10-30g/L。

2.根据权利要求1所述的丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其特征在于：所述缓冲液为三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N,N-双(2-羟基乙烷磺酸)缓冲液、3-三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸缓冲液、哌嗪-N,N-双(2-羟基乙烷磺酸)缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸钠缓冲液、3-(N-吗啡啉)乙磺酸钠缓冲液、4-（2-羟乙基）哌嗪-1-2-羟基丙磺酸缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-4-丁磺酸缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸缓冲液、3-(环已胺)-2-羟基-1-丙磺酸缓冲液、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸缓冲液、3-(环已胺)-1-丙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸缓冲液中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其特征在于：所述表面活性剂为选自TWEEN系列中一种具体物质、SPAN系列一种具体物质、TRITON系列中一种具体物质中的一种或者几种。

4.根据权利要求1所述的丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其特征在于：所述去胆红素干扰剂为亚铁氰化钾、高铁氰化钾、胆红素氧化酶中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的丙氨酸氨基转移酶检测试剂酶测定试剂，其特征在于：所述色原为酚类和/或苯胺类似物中的一种或3-羟基-2,4,6-三碘苯甲酸。

6.根据权利要求5所述的丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其特征在于：所述酚类为2-氯酚，2,4-二氯苯酚，4-氯酚，2,6-二氯苯酚；所述的苯胺类似物为N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐,N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基l)-3-甲氧基苯胺钠盐(二水合物)，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺钠盐，N-(2-羟基-3-磺丙基)-35-二甲氧基苯胺钠盐,N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺钠盐。

7.根据权利要求1所述的丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其特征在于：所述防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、亚硝酸钠、proclin系列防腐剂中一种具体物质或尼泊金酯中一种具体物质。

8.根据权利要求7所述的丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其特征在于：所述的proclin系列防腐剂为Proclin300；所述的尼泊金酯为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯或对羟基苯甲酸异丁酯。

9.根据权利要求1所述的丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其特征在于：所述冻干保护剂为海藻糖、蔗糖、牛血清白蛋白、吐温80、曲拉通X-100、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种或者几种。

10.根据权利要求1所述的丙氨酸氨基转移酶检测试剂，其特征在于：所述的丙氨酸氨基转移酶检测试剂中的稀释液为液体状态，反应试剂为干粉状态。

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