CN107782680A - 一种稳定的抗肝素脂肪酶检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶显色法脂肪酶检测试剂盒。本发明制备一种稳定的抗肝素脂肪酶检测试剂盒,该试剂盒主要是由试剂R1和试剂R2组成的液体型双试剂诊断检测试剂盒。其中试剂R1在传统配方上引入了氯仿,葡聚糖和硫酸鱼精蛋白,试剂R2中引入葡聚糖和丙三醇,通过新引入的物质达到了试剂性能质的改变。引入新配方后的脂肪酶检测试剂盒能够消除肝素和胆红素存在时对结果产生的干扰,葡聚糖系列和丙三醇的引入极大增强了试剂的稳定性能。本发明制备一种稳定抗肝素脂肪酶检测试剂盒,增强了试剂的稳定性能,同时对试剂的抗干扰能力有了较大提升,再加上试剂中所涉及到的原料都是常规原料,为试剂的大批量配置生产创造了条件。
Description
本发明制备一种稳定的抗肝素脂肪酶检测试剂盒,主要涉及临床医学检测领域,尤其涉及临床上人体中脂肪酶含量的检测。
背景技术
脂肪酶作为水解油脂的主要酶类之一,一般来说天然油脂是脂肪酶的主要底物,脂肪酶作用于油脂时,主要作用是水解油脂中脂肪酸和甘油相连的油脂键,这和其他水解酶的水解作用是不同的。脂肪酶催化作用系统是一种非均相体系,水溶性的酶催化作用发生在水不溶性底物和水的界面上,这种界面上的催化作用机制尚不是很清楚,不能简单用Michaelis2Menten 学说解释酶与底物间的反应机制。有人提出了脂肪酶在油- 水界面上定位的假设,提出了“超底物”的模型,该模型能解释脂肪酶的一些行为,但还需要进一步的实验证明和修正。此外,脂肪酶兼具有逆向催化甘油和游离脂肪酸合成甘油脂活性。
脂肪酶在临床的意义:正常人血液中脂肪酶含量极少,但是突发急性胰腺炎时,2~12h内血液种脂肪酶会显著升高,24h后会达到峰值,可达正常值上限的10倍,甚至50倍,至48~72h可能恢复正常,但随后又可持续升高8 ~ 15 天。由于血液脂肪酶在急性胰腺炎时活性升高的时间早,上升的幅度的大,持续的时间长,故其诊断价值优于淀粉酶。
目前在国内大多实验室主要以滴定法、比浊法和分光光度法为主。分光光度法目前有两类比较常用:①酶偶联显色比色法,多用1,2-甘油二酯为底物,在脂肪酶和单酸甘油酯脂肪酶的催化下,水解生成甘油和脂肪酸,甘油通过甘油激酶作用生成3- 磷酸甘油,再通过甘油磷酸氧化酶/ 过氧化物酶体系和4-AAP 色素原体系产生紫红色。于550nm 波长连续监测吸光度的变化即可计算LPS 活性。此类方法特异性高,通过双试剂也基本可解决内源性甘油的干扰问题。②1,2邻-二月桂宗甘油-3-戊二酸-(6’-甲基试卤灵)-酯设计的连续监测法。该底物在碱性环境中,在脂肪酶和辅脂肪酶作用下,水解生成1,2-邻-二月桂基甘油和戊二酸-6’-甲基试卤灵。后者不稳定,可自发分解生成戊二酸和甲基试卤灵。甲基试卤灵在581nm波长处有吸收峰,连续监测其吸光度变化可定量测定脂肪酶活性。此法具有简便、快速、灵敏。但是酶偶联显色法,工具酶的价格昂贵,而且酶来源少且不稳定,不能解决肝素和胆红素引起的干扰问题很少有厂家用这种方法。
为了解决上述问题,本发明制备一种稳定的抗肝素脂肪酶检测试剂盒,通过引入稳定剂和拮抗物质,在一定程度上解决了试剂的稳定性问题和肝素问题,同时对试剂的抗干扰能力也有一定的提高。
发明内容
本发明制备一种稳定的抗肝素脂肪酶检测试剂盒,该试剂盒在很大程度上解决了市场上同类产品暴露出的一些问题,诸如:试剂稳定性差,抗干扰能力弱,不能检测肝素样本,试剂成本价高等。本发明试剂盒意义主要是在于提供一种稳定性好,抗干扰能力强,能够检测肝素样本,价格低廉的一种新脂肪酶检测试剂盒,不仅能够满足各大型或综合性医院,同时对于乡镇医院同样使用。
检验原理
本发明制备一种稳定的抗肝素脂肪酶检测试剂盒,其反应机理主要是:1,2-邻-二月桂宗甘油-3-戊二酸-(6'-甲基试卤灵)-酯在脂肪酶作用下生成了1,2-邻-二月桂宗甘油、戊二酸和甲基试卤灵。甲基试卤灵能够引起570nm处的吸光度变化,通过监测570nm处的吸光度变化进而监测处甲基试卤灵的含量,通过甲基试卤灵的含量反映出血清中脂肪酶的含量。
应用本发明试剂盒,监测人体血清中脂肪酶含量时,其检测方法(操作以BS-800为例)如下:检测方法为速率法,因子为2200,样本量:试剂R1:试剂R2=4μL:100μL:200μL, 反应温度为37℃;读点设置为21点-27点。
本发明制备一种稳定的抗肝素脂肪酶检测试剂盒,试剂盒是由试剂R1和试剂R2组成的液体型双试剂检测试剂盒,其中试剂R1组成为:
HEPES缓冲液 0.1mol/L
牛黄脱氧胆酸钠 20-50m mol/L
氯化钾 9g/L
氯仿 2.5-10ml/L
硫酸鱼精蛋白 5-10g/L
葡聚糖-20000 2g/L
曲拉通X-405 1%。
试剂R2组成为:
酒石酸缓冲液 0.1mol/L
共脂肪酶 300-500KU/L
6’-甲基试卤灵 0.2mol/L
proclin-300 1.5ml/L
葡聚糖-2000 5g/L
丙三醇 4-10ml/L。
本发明制备一种稳定的抗肝素脂肪酶检测试剂盒,试剂中各组分的选择依据是:
HEPES缓冲液和酒石酸缓冲液主要是在反应是为生化反应提供一个相对的外环境,试剂储存时,为试剂提供一个良好的储存环境,保证试剂的有效储存。
牛黄脱氧胆酸钠作为反应中的加速剂,加速脂酶反应,保证反应的高效进行。
氯化钾主要作用是提供一个离子环境,同时为了增加试剂中盐离子效应。
氯仿主要是去除血清中因胆红素存在而引起的检测结果干扰。
硫酸鱼精蛋白是肝素分子的拮抗物,能够有效的结合肝素分子,进而去除肝素对检测结果造成影响。
葡聚糖-20000、葡聚糖-2000和丙三醇作为稳定剂,保证试剂长期稳定有效。
曲拉通X-405一种表面活性剂,有较强的去污能力。
共脂肪酶反应中所需要的反应的催化酶。
6’-甲基试卤灵反应底物,主要是用来生成甲基试卤灵这种物质。
本发明试剂盒可以应用到迪瑞、迈瑞、日立、东芝等系列的全自动化分析仪中进行自动化检测,不同系列的仪器应按照自己的仪器要求进行参数设置。
附图说明
图1 本发明试剂盒和对照试剂盒在4℃条件稳定性检测结果图谱;
图2 本发明试剂盒和对照试剂盒在37℃条件稳定性检测结果图谱;
图3 本发明试剂盒与对照试剂盒随机检测N=40个临床样本时相关性图谱;
图4 稳定性能本发明试剂盒检测结果与对照试剂检测结果对比;
图5 抗干扰性能本发明试剂盒检测结果与对照试剂检测结果对比;
图6 本发明试剂盒与对照试剂盒临床检测结果对比。
具体实施方式:
以下结合图,实施例对本发明进行说明:
实施例1
试剂R1组成为:
HEPES缓冲液 0.1mol/L
牛黄脱氧胆酸钠 25m mol/L
氯化钾 9g/L
氯仿 2.5ml/L
硫酸鱼精蛋白 7.5g/L
葡聚糖-20000 2g/L
曲拉通X-405 1%。
试剂R2组成为:
酒石酸缓冲液 0.1mol/L
共脂肪酶 300U/L
6’-甲基试卤灵 0.2mol/L
proclin-300 1.5ml/L
葡聚糖-2000 5g/L
丙三醇 5.5ml/L。
实施例2
HEPES缓冲液 0.1mol/L
牛黄脱氧胆酸钠 50m mol/L
氯化钾 9g/L
氯仿 2.5ml/L
硫酸鱼精蛋白 5g/L
葡聚糖-20000 2g/L
曲拉通X-405 1%。
试剂R2组成为:
酒石酸缓冲液 0.1mol/L
共脂肪酶 500KU/L
6’-甲基试卤灵 0.2mol/L
proclin-300 1.5ml/L
葡聚糖-2000 5g/L
丙三醇 10ml/L。
实施例3
HEPES缓冲液 0.1mol/L
牛黄脱氧胆酸钠 20-50m mol/L
氯化钾 9g/L
氯仿 4ml/L
硫酸鱼精蛋白 10g/L
葡聚糖-20000 5g/L
曲拉通X-405 1%。
试剂R2组成为:
酒石酸缓冲液 0.1mol/L
共脂肪酶 400KU/L
6’-甲基试卤灵 0.2mol/L
proclin-300 1.5ml/L
葡聚糖-2000 5g/L
丙三醇 7.5ml/L。
本发明试剂盒性能检测试验:
稳定性试验检测:
运用本发明实试剂盒(实施例1配方配制)和目前市场上流通的两家试剂盒进行对比,质控品为对照试剂中所带,使用仪器为全自动生化分析仪BS-800,本发明试剂盒参数设置如下,波长为570nm,因子为2200,读数点设置为21-27点,样本量:试剂R1:试剂R2=,4ul:100ul:200ul;对照试剂盒严格按照试剂盒操作说明书进行,检测仪器为BS-800,检测结果如图4所示。
通过图4和图1以及图2,我们发现经过120天的稳定性试验跟监测,我们发现,在4℃条件下,本发明试剂盒历时120天后,检测结果和质控品标注靶值偏差不足5%,但是对照试剂盒A和对照试剂盒B历时120天后与质控品标注靶值偏差均超出了20%;37℃条件下本发明试剂盒历时120天后检测结果与质控品标注靶值偏差不足5%,相对于对照试剂A和对照试剂B来讲,对照试剂A历时30天后检测结果与质控品偏差在10%左右,对照试剂盒B在第四天时检测结果已经偏离质控品10%。因此本发明试剂盒的在试剂稳定性方面远远超过了对照试剂盒,这位本发明试剂盒提供了一个强有力地技术支持。
抗干扰试验
我们购买市场上目前流通的试剂盒作为对照试剂,其质控品做为标准物质。购买胆红素,肝素和人工血清,分别配制成300umol/L的胆红素血清溶液和120mg/L的肝素血清溶液,称作A液和B液。然后通过倍比稀释配制成不同梯度的血清混合液,即A原液、稀释2倍、稀释4倍稀释8倍,B原液、稀释2倍、稀释4倍、稀释8倍。运用BS-800全自动生化分析仪进行测试,采用实施例2配方,测试结果如图5所示。
切记:稀释所用的稀释液必须为人工血清,防止因基质效应引起误差变化。
通过图5我们可以看出本发明试剂盒配方2和配方1在胆红素含量为300 umol/L检测结果不会产生10%的偏差,相比之下对照试剂盒只能在37.5 umol/L含量的胆红素保证检测结果的准确性。对于肝素引起的干扰,我们发现本发明配方1在肝素含量120mg/L时保证检测结果的准确性,相比之下本发明配方2在肝素含量为30mg/L时可以确保检测结果准确有效,对照试剂盒不能检测肝素样本。因此我们发现本发明试剂盒配方1在消除胆红素和肝素干扰方面展现出较强优势。这为本发明试剂盒的大量推广提供了坚实的技术基础。
临床样本检测实验
本发明试剂盒同对照试剂盒对随机N=40个样本进行测试,通过测试结果计算出本发明试剂盒与市场流通的试剂盒的相关性。本发明试剂盒采用实施例3配方进行检测,检测结果如图6所示。
通过图6和图3我们发现,本发明试剂盒与对照试剂盒相关系数r≥0.999,因此我们断定,本发明一种抗干扰能力强的同型半胱氨酸诊断检测试剂盒,完全能够胜任临床检测。在每组实施例中,三组配方我们都做了检测,每组均选择了最佳的一组,另外两组数据没有全部呈现,但是经过我们分析。实施例1配方是最佳配方。该配方配置的试剂抗干扰能力强,稳定性高,试剂配制所用的药品价格便宜,易于购买等。本发明脂肪酶诊断检测试剂盒对于同类产品无疑是一个飞跃,解决了试剂抗干扰问题,稳定性问题以及造价问题。
Claims (5)
1.制备一种稳定的抗肝素脂肪酶检测试剂盒,其特征在于该试剂盒是由试剂R1和试剂R2组成的液体型双试剂体外检测诊断试剂盒。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于该试剂盒试剂R1是由HEPES缓冲液、牛黄脱氧胆酸钠、氯化钾、胆红素拮抗物、肝素拮抗物稳定剂、曲拉通X-405组成,试剂R2是由酒石酸缓冲液、共脂肪酶、1,2邻-二月桂宗甘油-3-戊二酸-(6’-甲基试卤灵)-酯、proclin-300、稳定剂组成。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于所使用的胆红素拮抗物是氯仿。
4.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于该试剂盒中试剂R1中的肝素拮抗物是硫酸鱼精蛋白。
5.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于试剂R1中所使用的稳定剂是葡聚糖系列中的葡聚糖-20000,试剂R2中所使用的稳定剂物质是葡聚糖-2000和丙三醇。
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