CN104391029A - 一种用于测定碱性磷酸酶活性的电化学方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于测定碱性磷酸酶活性的电化学方法及该方法中所使用的电化学传感器。所述方法包括：制备半胱氨酸和铜离子修饰的电极；绘制特定浓度的焦磷酸根离子底物下，碱性磷酸酶的酶活浓度与相对电流强度的标准曲线；将已知酶活浓度的碱性磷酸酶溶液换成含碱性磷酸酶的待测样品，进行循环伏安扫描，得到相对电流强度，根据所述标准曲线计算得到待测样品中碱性磷酸酶的活性浓度。本发明利用半胱氨酸、焦磷酸根离子与铜离子可逆竞争配位原理，制备了用于测定碱性磷酸酶活性的电化学传感器，利用所述电化学传感器能够对碱性磷酸酶活性进行快速、简单、准确测定。

Description

一种用于测定碱性磷酸酶活性的电化学方法

技术领域

本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种用于测定碱性磷酸酶活性的电化学方法。

背景技术

碱性磷酸酶(ALP)是生物体内一种很常见的生物酶，广泛存在于生物体内各个部位(如：小肠、肝、骨骼、肾、胎盘等)。正常成年人血清内碱性磷酸酶的含量为40～150IU/L。其主要功能是将对应底物水解去磷酸化来维持生物体内正常的新陈代谢。研究表明，碱性磷酸酶过高或过低都会引发一系列疾病，如：原发性肝癌、胸腺癌、乳腺癌、前列腺炎、骨细胞癌以及糖尿病等等。因此，能够快速，简单测定碱性磷酸酶活性在临床医学上具有重要的生理、病理意义。

碱性磷酸酶的催化原理是和底物上的磷酸基团作用，水解生成磷酸根和羟基自由基。底物结构不同，催化活性不同。在众多碱性磷酸酶底物中，焦磷酸根离子(PPi)因其具有比较宽的pH测定范围而备受关注。文献报道，碱性磷酸酶通过水解焦磷酸根离子能够有效抑制焦磷酸钙沉积(CPPD)以及软骨钙沉积(Chondrocalcinosis)等疾病。因此，以焦磷酸根为底物来测定碱性磷酸酶活性具有重要的生理意义。

由于焦磷酸根本身的电化学性质不活泼，传统以焦磷酸根离子为底物测定碱性磷酸酶活性的方法主要以荧光、紫外可见或可视化检测为主。这些方法虽然灵敏度高，但由于需要合成复杂的具有光学信号的化合物、易受限于量子产率及干扰物影响，在实际应用中存在局限性。电化学方法由于具有仪器设备简单、电子转移快速、灵敏等优点，被广泛应用于生物传感领域。迄今为止，快速，简单，准确测定以焦磷酸根离子为底物的碱性磷酸酶活性的电化学方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于测定碱性磷酸酶活性的电化学方法。

本发明所提供的用于测定碱性磷酸酶活性的电化学方法，包括下述步骤：

1)制备半胱氨酸和铜离子修饰的电极；

2)将所述半胱氨酸和铜离子修饰的电极放置于磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后，加入焦磷酸根离子溶液和碱性磷酸酶溶液，搅拌均匀得到具有特定焦磷酸根离子浓度和已知酶活浓度的检测溶液，作用一段时间后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度，依此方法，测得一系列检测溶液的一系列已知酶活浓度对应的一系列的相对电流强度值，绘制在所述特定浓度的焦磷酸根离子底物作用下，碱性磷酸酶的酶活浓度与测得的相对电流强度的标准曲线，并进行非线性拟合，得到拟合方程；

3)将所述半胱氨酸和铜离子修饰的电极放置于磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后，加入焦磷酸根离子溶液和含有碱性磷酸酶的待测样品，搅拌均匀得到含待测样品的检测溶液，所述含待测样品的检测溶液中的焦磷酸根离子浓度与步骤2)中检测溶液中的焦磷酸根离子浓度相等，作用与步骤2)中的作用时间相等的时间后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度，将所述相对电流强度带入步骤2)得到的拟合方程中，经计算得到待测样品中碱性磷酸酶的活性浓度。

上述方法步骤1)中，所述半胱氨酸和铜离子修饰的电极是按照包括下述步骤的方法制备得到的：将电极预处理后在硫酸溶液中活化，然后将活化好的电极浸泡在半胱氨酸溶液中，得到表面修饰有半胱氨酸分子的电极；再将所述修饰有半胱氨酸分子的电极浸泡在铜离子溶液中，即得半胱氨酸和铜离子修饰的电极。

其中，所述电极为金电极或银电极。所述电极的直径为1mm-2mm。

所述预处理为在使用前将所述电极经抛光洗净处理。

所述活化用硫酸溶液的浓度为0.05M-10M，具体可为0.5M；所述活化的时间为1min-10min,具体可为5min。

所述半胱氨酸溶液的浓度为5mM-20mM,具体可为10mM，所述浸泡的时间为10min-60min,具体可为30min。

所述铜离子溶液的浓度为5μM-20μM，具体可为10μM，所述浸泡的时间为1min-10min,具体可为5min。

所制备的电极表面上半胱氨酸分子与铜离子之间通过络合作用连接；所述铜离子与半胱氨酸分子络合比为1：(1-3)，具体可为1:2。

上述方法步骤2)中，所述磷酸缓冲溶液的摩尔浓度为0.01M-0.1M，具体可为0.05M。

步骤2)中，所述检测溶液中的焦磷酸根离子的特定浓度为1μM～5μM，具体可为4μM。

所述检测溶液中的碱性磷酸酶的已知酶活浓度依次为0U/L、0.2U/L、0.6U/L、1.2U/L、1.8U/L、2.4U/L、3.0U/L和3.6U/L，其中，U的定义为：以4-硝基苯磷酸为底物，在pH＝9.8、37℃条件下，单位时间内将1μmol底物转化成1当量的产物所需的酶量。(Note:one unit of ALP is defined as the amount of enzyme at catalyzes thehydrolysis of 1 μmol of 4-nitrophenyl phosphate in at pH 9.8and 37℃)

当所述检测溶液中的焦磷酸根离子的特定浓度为4μM时，所述作用的时间为30min-40min。

上述方法步骤3)中，所述待测样品具体可为血清、骨骼滑液、肝脏组织液。

在上述电化学方法中所使用的用于测定碱性磷酸酶活性的电化学传感器也属于本发明的保护范围。

所述电化学传感器为半胱氨酸和铜离子修饰的电极。

所述半胱氨酸和铜离子修饰的电极是按照包括下述步骤的方法制备得到的：将电极预处理后在硫酸溶液中活化，然后将活化好的电极浸泡在半胱氨酸溶液中，得到表面修饰有半胱氨酸分子的电极；再将所述修饰有半胱氨酸分子的电极浸泡在铜离子溶液中，即得半胱氨酸和铜离子修饰的电极。

本发明利用半胱氨酸、焦磷酸根离子与铜离子可逆竞争配位原理，制备了用于测定碱性磷酸酶活性的电化学传感器，利用所述电化学传感器对焦磷酸根离子(底物)具有很好的选择性，能够对碱性磷酸酶活性进行快速、简单、准确测定。

本发明操作简单、重复性好、对操作人员无特殊技术要求。另外，其样品需求量小，成本低，响应时间快，易于实现实际生物样品测定。

附图说明

图1为本发明基于半胱氨酸、焦磷酸根离子与铜离子可逆竞争配位原理电化学测定碱性磷酸酶活性的工作原理。

图2为金电极在硫酸溶液中活化的循环伏安曲线。

图3为金电极表面成功自组装半胱氨酸分子的循环伏安曲线。

图4为金电极表面成功修饰上半胱氨酸和铜离子的循环伏安曲线。

图5为所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极对不同种类阴离子的选择性。

图6为所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极对焦磷酸根离子响应的标准曲线。

图7为时间对碱性磷酸酶活性测定的影响曲线。

图8为加入的碱性磷酸酶的酶活性浓度与测得的相对电流强度的标准曲线。

图9为不同浓度抑制剂对碱性磷酸酶活性的影响曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明基于半胱氨酸、焦磷酸根离子与铜离子可逆竞争配位原理电化学测定碱性磷酸酶活性的工作原理如图1所示。

实施例1、半胱氨酸和铜离子修饰的金电极的制备

1)金电极预处理并在硫酸溶液中活化

采用直径为1.5mm的金电极作为工作电极，在使用前电极先经抛光洗净处理。具体过程为：电极首先在抛光布上依次用直径为0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末浆抛光打磨，然后用二次去离子水清洗，并分别在二次去离子水和乙醇中超声处理5min除去残留三氧化二铝粉末，最后再用二次去离子水清晰，并在氮气下干燥待用。处理过的金电极在5mL 0.5M硫酸溶液中进行连续循环伏安扫描，扫描电位窗为0.3V～1.7V。

图2为金电极在硫酸溶液中活化的循环伏安曲线。

当电极在1.0V电位附近出现三个连续依次降低的金氧化峰，即可认为电极表面处理干净，达到最佳活化状态。

2)金电极表面修饰半胱氨酸分子和铜离子

将活化好的金电极放在5mL 10mM半胱氨酸溶液中浸泡30min,然后用二次去离子水冲洗，并用氮气吹干，进行循环伏安扫描。图3为半胱氨酸分子成功组装到金电极表面的循环伏安曲线。

将修饰了半胱氨酸分子的金电极放入5mL 10μM铜离子溶液中浸泡5min,取出用二次去离子水冲洗，除去电极表面多余吸附的铜离子，氮气吹干即得到半胱氨酸和铜离子修饰的金电极，图4为金电极表面成功修饰上半胱氨酸和铜离子的循环伏安曲线。

实施例2、半胱氨酸和铜离子修饰的金电极对不同种类阴离子的选择性研究

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后依次加入1mL 20μM F^-、Cl^-、Br^-、CO₃ ^2-、HCO₃ ^-、SO₄ ^2-、CH₃COO^-、NO₃ ^-、H₂PO₄ ^-、HPO₄ ^2-、PPi等不同种类阴离子，进行循环伏安扫描。

图5为所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极对不同种类阴离子的选择性。

由图5可知，制备得到的半胱氨酸和铜离子修饰的金电极对焦磷酸根离子(PPi)有很好的选择性。

实施例3、半胱氨酸和铜离子修饰的金电极对焦磷酸根离子响应的标准曲线

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后分别加入不同浓度1mL的1μM焦磷酸根离子溶液、1mL的5μM焦磷酸根离子溶液、1mL的10μM焦磷酸根离子溶液、1mL的15μM焦磷酸根离子溶液、1mL的20μM焦磷酸根离子溶液、1mL的25μM焦磷酸根离子溶液、和1mL的30μM焦磷酸根离子溶液，搅拌均匀，得到检测溶液，放置5min,进行循环伏安扫描。图6为所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极对焦磷酸根离子响应的标准曲线。

由图6可知，当加入的焦磷酸根离子的浓度在5μM～25μM范围内时(即检测溶液中的焦磷酸根离子的浓度在1μM～5μM范围内)，该半胱氨酸和铜离子修饰的金电极对焦磷酸根离子呈线性响应，因此用加入浓度在5μM～25μM范围(即检测溶液中的焦磷酸根离子的浓度在1μM～5μM范围)内的焦磷酸根离子作为底物。

实施例4、时间对碱性磷酸酶催化活性测定的影响

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后加入1mL的由1mL 20μM焦磷酸根离子溶液和100μL 120U/L碱性磷酸酶溶液组成的混合液，分别作用5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min后进行循环伏安扫描。

图7为时间对碱性磷酸酶活性测定的影响曲线，在0min～30min范围内随着时间增加，测得的相对电流强度逐渐降低，表明测得的碱性磷酸酶活性数值逐渐增加；30min后，测得的碱性磷酸酶活性数值达到稳定值，由此确定焦磷酸根离子和碱性磷酸酶的作用时间至少为30min时测得的相对电流强度表征的碱性磷酸酶活性数值才具有很高的准确性。

实施例5、绘制碱性磷酸酶的酶活性浓度与测得的相对电流强度的标准曲线

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后加入1mL的由1mL 20μM焦磷酸根离子溶液和100μL 0U/L碱性磷酸酶溶液组成的混合液，搅拌均匀得到检测溶液(检测溶液中，焦磷酸根离子的浓度为4μM，碱性磷酸酶的酶活浓度为0U/L)，作用30min后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度；

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后加入1mL的由1mL 20μM焦磷酸根离子溶液和100μL 10U/L碱性磷酸酶溶液组成的混合液，搅拌均匀得到检测溶液(检测溶液中，焦磷酸根离子的浓度为4μM，碱性磷酸酶的酶活浓度为0.2U/L)，作用30min后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度；

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后加入1mL的由1mL 20μM焦磷酸根离子溶液和100μL 30U/L碱性磷酸酶溶液组成的混合液，搅拌均匀得到检测溶液(检测溶液中，焦磷酸根离子的浓度为4μM，碱性磷酸酶的酶活浓度为0.6U/L)，作用30min后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度；

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后加入1mL的由1mL 20μM焦磷酸根离子溶液和100μL 60U/L碱性磷酸酶溶液组成的混合液，搅拌均匀得到检测溶液(检测溶液中，焦磷酸根离子的浓度为4μM，碱性磷酸酶的酶活浓度为1.2U/L)，作用30min后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度；

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后加入1mL的由1mL 20μM焦磷酸根离子溶液和100μL 90U/L碱性磷酸酶溶液组成的混合液，搅拌均匀得到检测溶液(检测溶液中，焦磷酸根离子的浓度为4μM，碱性磷酸酶的酶活浓度为1.8U/L)，作用30min后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度；

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后加入1mL的由1mL 20μM焦磷酸根离子溶液和100μL 120U/L碱性磷酸酶溶液组成的混合液，搅拌均匀得到检测溶液(检测溶液中，焦磷酸根离子的浓度为4μM，碱性磷酸酶的酶活浓度为2.4U/L)，作用30min后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度；

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后加入1mL的由1mL 20μM焦磷酸根离子溶液和100μL 150U/L碱性磷酸酶溶液组成的混合液，搅拌均匀得到检测溶液(检测溶液中，焦磷酸根离子的浓度为4μM，碱性磷酸酶的酶活浓度为3.0U/L)，作用30min后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度；

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后加入1mL的由1mL 20μM焦磷酸根离子溶液和100μL 180U/L碱性磷酸酶溶液组成的混合液，搅拌均匀得到检测溶液(检测溶液中，焦磷酸根离子的浓度为4μM，碱性磷酸酶的酶活浓度为3.6U/L)，作用30min后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度；

图8为加入的碱性磷酸酶的酶活浓度与测得的相对电流强度的标准曲线。

进行Origin非线性拟合(三次多项式拟合)得到拟合方程：Y＝0.46-0.0048×X+2.04×10^-5×X²-2.06×10^-8×X³(R＝0.9883)(其中X代表操作中加入的碱性磷酸酶的酶活浓度，Y代表测得的相对电流强度)。

由图8可知，上述操作条件下，受底物量的限制，能够测得的检测溶液中的最大酶活浓度为2.4U/L。

实施例6、不同浓度抑制剂对碱性磷酸酶催化活性的影响

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后分别加入1mL的由1mL 20μM焦磷酸根离子溶液、100μL120U/L碱性磷酸酶溶液和100μL 1M盐酸胍溶液组成的混合液，搅拌均匀，作用40min后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度；

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后分别加入1mL的由1mL 20μM焦磷酸根离子溶液、100μL120U/L碱性磷酸酶溶液和100μL 2M盐酸胍溶液组成的混合液，搅拌均匀，作用40min后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度；

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后分别加入1mL的由1mL 20μM焦磷酸根离子溶液、100μL120U/L碱性磷酸酶溶液和100μL 3M盐酸胍溶液组成的混合液，搅拌均匀，作用40min后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度；

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后分别加入1mL的由1mL 20μM焦磷酸根离子溶液、100μL120U/L碱性磷酸酶溶液和100μL 4M盐酸胍溶液组成的混合液，搅拌均匀，作用40min后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度；

将所述半胱氨酸和铜离子修饰的金电极放置于4mL 0.05M磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后分别加入1mL的由1mL 20μM焦磷酸根离子溶液、100μL120U/L碱性磷酸酶溶液和100μL 5M盐酸胍溶液组成的混合液，搅拌均匀，作用40min后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度。

图9为不同浓度抑制剂对碱性磷酸酶催化活性的影响曲线，随着抑制剂浓度增加，碱性磷酸酶活性逐渐降低。

综上，本发明充分利用了半胱氨酸、焦磷酸根离子与铜离子可逆竞争配位原理，以焦磷酸根离子为底物，成功实现了对碱性磷酸酶活性的电化学测定。该方法具有操作简单、快速、样品需求量少、重复性好等优点，为实际生物样品中碱性磷酸酶活性的测定提供了一种简单、便捷的方法。

Claims (9)

1.一种用于测定碱性磷酸酶活性的电化学方法，包括下述步骤：

1)制备半胱氨酸和铜离子修饰的电极；

2)将所述半胱氨酸和铜离子修饰的电极放置于磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后，加入焦磷酸根离子溶液和碱性磷酸酶溶液，搅拌均匀得到具有特定焦磷酸根离子浓度和已知酶活浓度的检测溶液，作用一段时间后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度，依此方法，测得一系列检测溶液的一系列已知酶活浓度对应的一系列的相对电流强度值，绘制在所述特定浓度的焦磷酸根离子底物作用下，碱性磷酸酶的酶活浓度与测得的相对电流强度的标准曲线，并进行非线性拟合，得到拟合方程；

3)将所述半胱氨酸和铜离子修饰的电极放置于磷酸缓冲溶液中进行循环伏安扫描，稳定后，加入焦磷酸根离子溶液和含有碱性磷酸酶的待测样品，搅拌均匀得到含待测样品的检测溶液，所述含待测样品的检测溶液中的焦磷酸根离子浓度与步骤2)中检测溶液中的焦磷酸根离子浓度相等，作用与步骤2)中的作用时间相等的时间后，进行循环伏安扫描，记录测得的相对电流强度，将所述相对电流强度带入步骤2)得到的拟合方程中，经计算得到待测样品中碱性磷酸酶的活性浓度。

2.根据权利要求1所述的电化学方法，其特征在于：步骤1)中，所述半胱氨酸和铜离子修饰的电极是按照包括下述步骤的方法制备得到的：将电极在硫酸溶液中活化，然后将活化好的电极浸泡在半胱氨酸溶液中，得到表面修饰有半胱氨酸分子的电极；再将所述修饰有半胱氨酸分子的电极浸泡在铜离子溶液中，即得半胱氨酸和铜离子修饰的电极。

3.根据权利要求2所述的电化学方法，其特征在于：所述半胱氨酸和铜离子修饰的电极的制备中，所述电极为金电极或银电极；

所述电极的直径为1mm-2mm；

所述活化用硫酸溶液的浓度为0.05M-10M；所述活化的时间为1min-10min；

所述半胱氨酸溶液的浓度为5mM-20mM；所述浸泡的时间为10min-60min；

所述铜离子溶液的浓度为5μM-20μM；所述浸泡的时间为1min-10min；

所制备的电极表面上半胱氨酸分子与铜离子之间通过络合作用连接；所述铜离子与半胱氨酸分子络合比为1：(1-3)。

4.根据权利要求1所述的电化学方法，其特征在于：步骤2)中，所述磷酸缓冲溶液的摩尔浓度为0.01M-0.1M；

所述焦磷酸根离子的特定浓度为1μM～5μM中的任意值；

所述碱性磷酸酶的已知酶活性浓度依次为0U/L、0.2U/L、0.6U/L、1.2U/L、1.8U/L、2.4U/L、3.0U/L和3.6U/L。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的电化学方法，其特征在于：所述焦磷酸根离子的特定浓度为4μM，所述作用的时间为30min-40min。

6.根据权利要求1所述的电化学方法，其特征在于：步骤3)中，所述待测样品为血清、骨骼滑液或肝脏组织液。

7.一种用于测定碱性磷酸酶活性的电化学传感器，其特征在于：所述电化学传感器为半胱氨酸和铜离子修饰的电极。

8.根据权利要求7所述的电化学传感器，其特征在于：所述半胱氨酸和铜离子修饰的电极是按照包括下述步骤的方法制备得到的：将电极预处理后在硫酸溶液中活化，然后将活化好的电极浸泡在半胱氨酸溶液中，得到表面修饰有半胱氨酸分子的电极；再将所述修饰有半胱氨酸分子的电极浸泡在铜离子溶液中，即得半胱氨酸和铜离子修饰的电极。

9.根据权利要求8所述的电化学传感器，其特征在于：所述电极为金电极或银电极；

所述电极的直径为1mm-2mm；

所述活化用硫酸溶液的浓度为0.05M-10M；所述活化的时间为1min-10min；

所述半胱氨酸溶液的浓度为5mM-20mM；所述浸泡的时间为10min-60min；

所述铜离子溶液的浓度为5μM-20μM；所述浸泡的时间为1min-10min；

所制备的电极表面上半胱氨酸分子与铜离子之间通过络合作用连接；所述铜离子与半胱氨酸分子络合比为1：(1-3)。